專利名稱：可阻礙幽門螺旋桿菌生長的朝鮮泡菜乳酸菌群及以此防止胃腸紊亂的高功能食品的制作方法
技術領域：
本發明涉及能夠抑制幽門螺旋桿菌(Helicobactor pylori)生長的朝鮮泡菜乳酸細菌，以及以此能夠保護胃腸道的高功能食品，特別是涉及一種高功能食品，其包含能夠抑制幽門螺旋桿菌附著于胃腸道胃黏膜組織并抑制其生長的朝鮮泡菜乳酸細菌，因而能夠有效預防和治療胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍。
背景技術：
胃腸道疾病是世界上發生范圍最廣的疾病，其治療藥物形成了最大的單一市場(抗潰瘍藥物158億美元(1999))。
1983年，微生物學家Marchall和Warren首先在B-型胃炎患者的胃黏膜活組織檢查中發現了鱗蘚菌(ichthyosis bacteria)，培養該細菌發現它是一種彎曲菌屬(campylobacter genus)相關的新菌種，從那以后，圍繞幽門螺旋桿菌和上消化道疾病(如胃炎和胃潰瘍)的相關研究越來越活躍。幽門螺旋桿菌是一種革蘭氏陰性桿菌，周圍帶有由纖細的膜形成的鞭毛，能夠分泌大量脲酶并且通過排泄物～口的途徑傳播，由于它在1994年被世界衛生組織(WHO)確認為致癌物質，因此吸引了全球范圍的關注。
已知幽門螺旋桿菌的致病機制是細菌通過食品進入到胃內腔，憑借高速游動的鞭毛穿透胃黏膜，并且分泌大量脲酶，使黏膜的pH值升高到堿性狀態。幽門螺旋桿菌寄生在胃上皮細胞上層和胃黏膜細胞之間的區域，引起反常的胃泌激素分泌，進而導致胃酸大量產生，最終形成炎癥和潰瘍。因此，據最新提供的報道，幽門螺旋桿菌是引起胃腺癌的重要因素，WHO將幽門螺旋桿菌認定為I型致癌物質。
據報導，幽門螺旋桿菌感染在發展中國家特別流行，包括韓國。據Paek等的報導，將近80％或更多的韓國人有感染幽門螺旋桿菌的嫌疑(Paek Seungchul等，Korean Microbial Society Paper，2545-52，1990)。因此，迫切需要開發一種能治療和預防幽門螺旋桿菌感染的方法。
使用抗生素進行化學治療是現今最常用的治療微生物感染疾病的方法，該方法雖然在短期有效，但令人憂慮的是可能產生微生物的抗藥菌株。
另外，Rauws等將鉍制劑(bismuth preparations)、阿莫西林(amoxicillin)和甲硝噠唑(metronidazole)三種抗菌藥同時給藥，進行針對幽門螺旋桿菌的抗菌治療，獲得較好的效果(Rauws EAJ，Langenberg W，Houthoff JH，Zanen HC和Tytgat GHJ，Gastroenterol，9433-40，1988)。Borody等將鉍制劑、四環素(tetracycline)和甲硝噠唑同時施加于胃潰瘍患者，其報導的有效率為80％左右(Borody T，Lenne J和Moore-Jones D，Gastroenterol，98A24，1990)，因此施加這三種抗生素成為最常用的治療幽門螺旋桿菌感染的方法。然而，其各種副作用也有報導，比如腹瀉、反流性食管炎(reflux oesophagitis)、對正常腸內菌的抑制，以及由于持續的抗生素治療產生了抗藥菌株。
最近，乳酸細菌發酵材料在預防和治療胃腸疾病中的功能吸引了越來越多的關注，而且許多針對益生的乳酸桿菌的研究也正在進行，該細菌能夠抑制人致病菌的生長。乳酸細菌是發酵產物，它們能產生與細菌素相關的抗生原料以及乳酸、醋酸和過氧化氫。Marie-HelenCoconier等培養了一種人嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)菌株LB，在體外能夠產生抗幽門螺旋桿菌的抗生素，并且在體外已證實其培養物上清液能抑制幽門螺旋桿菌附著到人的胃腸細胞，還能在小鼠體內防止脲酶活化和抑制貓幽門螺旋桿菌(H.felis)感染(Marie-HelenCoconier等，Environ.Microbiol，11月，4573-4580，1998)。
另外，Yuji Aida M.T.等已經證實，在口服過唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)的無菌鼠中，幽門螺旋桿菌感染被抑制，美國專利No.5,578,392中描述了約氏乳桿菌(L.johnsonii)抑制幽門螺旋桿菌附著到胃腸細胞的功能。
另外，根據Canducci等所用處方，使用滅活的人嗜酸乳桿菌的培養液，同時使用抗生素raveprazol、克拉霉素(clarithromycin)和阿莫西林進行治療，結果增加了幽門螺旋桿菌的殺滅率(Canducci F.等，Aliment Pharmacol.Ther，141625-1629，2000)。
同樣，韓國專利申請號為1999-0040387的專利公布了一種幽門螺旋桿菌抗體，以及包含乳球菌屬(Lactococcus sp.)HY 49、酪乳桿菌(Lactobacillus Casei)HY 2782、長雙歧桿菌(bifidobacterium longum)HY 8001等的食品都顯示了抑制幽門螺旋桿菌的功能。
因此，需要能夠預防幽門螺旋桿菌附著到胃腸道并且抑制其生長的材料和方法，并且研制出包含這些材料的食品和藥品。
發明內容
本發明的目的是提供一種保護胃腸道的高功能朝鮮泡菜乳酸細菌，它能抑制幽門螺旋桿菌的生長并抑制其附著到胃腸道，朝鮮泡菜乳酸細菌是從朝鮮泡菜中分離獲得的，是韓國人的乳酸細菌主要供應源，賦予傳統食品有益的功能。
本發明的另一個目的在于提供一種保護胃腸道的高功能的食品，包含能有效預防和治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍的朝鮮泡菜乳酸細菌。
本發明的另一個目的在于提供一種保護胃腸道的高功能朝鮮泡菜，包含能有效預防和治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍的朝鮮泡菜乳酸細菌。
本發明的另一個目的在于提供一種能夠預防和治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍藥物，包含朝鮮泡菜乳酸細菌。
為了達到這些目的，本發明提供了能抑制幽門螺旋桿菌生長并抑制其附著到胃腸道的朝鮮泡菜乳酸細菌。
本發明還提供了一種包含朝鮮泡菜乳酸細菌的保護胃腸道的高功能食品，能抑制幽門螺旋桿菌生長，并且能夠有效預防和治療胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍。
本發明還提供了一種包含朝鮮泡菜乳酸細菌的保護胃腸道的高功能朝鮮泡菜，能抑制幽門螺旋桿菌的生長，并且能夠有效預防和治療胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍。
本發明還提供了一種能夠預防和治療胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍的藥物，包含能夠抑制幽門螺旋桿菌生長的朝鮮泡菜乳酸細菌。
具體實施例方式
下面將對本發明進行詳細解釋。
由于朝鮮泡菜的成分是卷心菜和蘿卜等，并且包含了許多乳酸細菌，因此泡菜具有很多有用的功能，包括抗突變和抗癌等。朝鮮泡菜發酵中涉及的微生物包括胚芽乳桿菌(L.plantarum)、短乳桿菌(L.brevis)、乳球菌屬(Lactococcus)、嗜檸檬酸明串球菌屬(Leuconostoc)、鏈球菌屬(Streptococcus)、片球菌屬(Pediococcus)等，隨著發酵階段的不同，形成的總微生物區系中菌的種類和組分比例也不同。
在對抑制幽門螺旋桿菌生長的朝鮮泡菜乳酸細菌的研究中，本發明的發明人證實，在泡菜發酵過程涉及的微生物中，抑制幽門螺旋桿菌生長的朝鮮泡菜乳酸細菌同時還抑制其附著到胃腸道，從而完善了本發明。
本發明提供了抑制幽門螺旋桿菌生長并抑制其附著到胃腸道的朝鮮泡菜乳酸細菌。
朝鮮泡菜乳酸細菌優選的分離和鑒定條件為以常規方法發酵泡菜，在1～40℃貯藏90天或其pH值到達約3.0；更優選的條件為在1～25℃熟化90天，或30～40℃熟化30天。
乳酸細菌是這樣分離得到的從常規方法制作的泡菜中提取樣品，在MRS瓊脂培養基上培養，選擇到588個能抑制幽門螺旋桿菌生長的泡菜乳酸細菌，接著選擇能夠抑制幽門螺旋桿菌附著到胃腸道的泡菜乳酸細菌。
泡菜乳酸細菌優選在泡菜發酵過程產生的乳酸細菌中尋找，嗜檸檬酸明串球菌屬和乳桿菌屬種，更優選的，它們選自由嗜檸檬酸明串球菌EUG4427(KCCM-10274)、乳桿菌EUG6017(KCCM-10273)、乳桿菌EUG4066(KCCM-10270)、乳桿菌EUG4048(KCCM-10271)和乳桿菌EUG6404(KCCM-10272)所組成的組中的一種或多種。
從朝鮮泡菜中分離獲得的嗜檸檬酸明串球菌屬種或乳桿菌屬種能抑制寄生在胃黏膜組織中的幽門螺旋桿菌生長，并抑制其附著到胃腸道，對于殺滅幽門螺旋桿菌以及預防再感染非常有效。
同時，這里發揮功能的乳酸細菌并非來源于人的腸內或牛奶發酵產物，而是來自于朝鮮泡菜，它是韓國人的主要乳酸細菌供應源。只要將細菌加入到傳統的朝鮮泡菜和其他食品中即可獲得該功能，而功能性乳酸細菌供給來源也可多樣化。所以，本發明也提供了一種保護胃腸道的高功能食品，包含從朝鮮泡菜中獲得的嗜檸檬酸明串球菌屬種或乳桿菌屬種，它能有效預防和治療胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍。
包含泡菜乳酸細菌并能夠抑制幽門螺旋桿菌生長和附著到胃腸道的功能性食品可以是發酵劑如培養液，或可是凍干乳酸細菌粉添加到各種食品中，如飲料、發酵牛奶、豆腐、發酵的大豆醬(soybean paste)、研磨發酵的大豆獲得的豆醬湯(bean-paste soup)、果子凍等。并且，在乳酸細菌的功能不被抑制的前提下，這些食品的制備方式不受限制，而且根據營養需要和消費者的喜好等，還可以加入其他常用的食品添加成分。
本發明還提供了一種保護胃腸道的高功能泡菜，包含從泡菜中獲得的嗜檸檬酸明串球菌屬種或乳桿菌屬種，能有效預防和治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍。
含有能抑制幽門螺旋桿菌生長和附著到胃腸道的泡菜乳酸細菌的朝鮮泡菜，可以在制備時向泡菜作料中加入泡菜乳酸細菌培養液或凍干的乳酸細菌粉作為發酵劑，而且優選加入凍干的乳酸細菌粉以保持泡菜品質。
包含泡菜乳酸細菌的具有胃腸道保護高功能的朝鮮泡菜的制備條件如溫度、pH值、工藝方法等在乳酸細菌功能不被抑制的條件下不受特別限制，而且根據營養需要和消費者的喜好等，還可以加入其他常用的食品添加成分。
本發明還提供了一種用于預防和治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍的藥物，包含從泡菜中獲得的嗜檸檬酸明串球菌屬種或乳桿菌屬種。該藥物可以制備成凝膠、懸浮液、噴霧劑、片劑或液劑。
本發明將在下面提供的實施例中作進一步的詳細描述，然而，以下的實施例僅用于說明本發明，不是對本發明的限制。
實施例實施例1分離能夠抑制幽門螺旋桿菌生長的泡菜乳酸細菌為了在體外從泡菜乳酸細菌中選出能夠抑制幽門螺旋桿菌生長的乳酸細菌，先將泡菜乳酸細菌分離出來，再從中挑選出能夠抑制幽門螺旋桿菌的乳酸細菌。
(泡菜乳酸細菌的分離)使用常規的方法制備朝鮮泡菜，從分別貯藏在1℃、4℃、8℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下的朝鮮泡菜中以每24小時或48小時的間隔取出樣品，持續90天或到pH到達約3.0時(其中1～25℃條件下熟化90天，30～40℃條件下熟化30天)。將從泡菜中提取的樣品在MRS瓊脂培養基上，37℃培養72小時。
(抑制幽門螺旋桿菌生長的乳酸細菌的分離)將幽門螺旋桿菌懸浮液涂布在含10％馬血清的布魯氏瓊脂上并干燥5分鐘，然后用牙簽轉移法(tooth-picking method)，將培養在MRS瓊脂培養基上的近48,000個乳酸細菌的菌落轉移到涂布有幽門螺旋桿菌懸浮液的布魯氏菌瓊脂上，在10％CO2分壓下37℃培養72小時，選出588個形成透明環的乳酸細菌菌落。
實施例2挑選能夠抑制幽門螺旋桿菌附著到細胞系的乳酸細菌(初次挑選)針對實施例1選出的588種能夠在體外抑制幽門螺旋桿菌生長的泡菜乳酸細菌，研究它們抑制幽門螺旋桿菌附著到Kato III胃癌細胞的活性，選出具有抑制能力的乳酸細菌。
幽門螺旋桿菌#26695分離自一個患有胃炎和胃潰瘍的韓國人的胃中，是從Kyungsang大學藥學院獲得的；人Kato III胃癌細胞是從韓國細胞系庫(Korean Cell Line Bank)獲得的。
首先，通過測定呈色脲酶反應液(一種測定幽門螺旋桿菌數量的指示劑)在625nm的吸光度(A625)，得出幽門螺旋桿菌附著到細胞上的個數，選擇能使附著的幽門螺旋桿菌數降低到106或更低的乳酸細菌，結果獲得如表1所示70種乳酸細菌(如果A625的值是1.7或更低，則幽門螺旋桿菌計數為106或更低)。
表1
(第二次挑選)在初次實驗里選出了70個菌株，進行重復試驗并且同時選擇具有高的抑制幽門螺旋桿菌附著活性的菌株。在這些乳酸細菌中，選擇到35個能使幽門螺旋桿菌附著數降低到約105或更低的菌株，見表2。
表2(第三次挑選)從二次挑選中獲得的35個乳酸細菌，再次進行重復試驗，選出22個菌株，顯示在表3中。
表3實施例3菌株的鑒定根據BIOLOG試劑盒和Bergey手冊，對實施例1和2挑選到的22個乳酸細菌菌株進行鑒定的結果顯示在表4中。
注鏈球桿菌(Streptobacillus)，球桿菌(Coccobacillus)，短棒桿菌(Short rod)，長棒桿菌(Long rod)表4如表4所示，一種嗜檸檬酸明串球菌類菌株被BIOLOG系統鑒定出，并且21種乳桿菌類菌株被Bergey手冊提供的方法鑒定出，它們都具有抑制幽門螺旋桿菌附著到細胞的特性。
(四次挑選)將三次挑選獲得的22個菌株進行第三次重復試驗，選出9個具有高抑制活性的菌株。本階段的挑選不是根據抑制活性高低的順序來進行，而是根據細菌的形態來進行劃分和選擇，選擇結果見表5。
表5(末次挑選)將前述挑出的9個乳酸菌株進行第四次重復試驗，每種形態的細菌各選出1個，最后挑出5個菌株，顯示在表6中。
表6如表6所示，最后選出的5個菌株中，嗜檸檬酸明串球菌屬種的菌株被命名為嗜檸檬酸明串球菌EUG4427(KCCM-10274)，4種乳桿菌屬種的菌株分別被命名為乳桿菌EUG6017(KCCM-10273)，乳桿菌EUG4066(KCCM-10270)，乳桿菌EUG4048(KCCM-10271)，以及乳酸菌EUG6404(KCCM-10272)。這5個菌株在2001年5月16日以上述名稱保藏于韓國微生物保藏中心(Korean MicrobialPreservation Center)。
實施例4通過泡菜乳酸細菌培養肉湯測定對幽門螺旋桿菌的生長抑制從實施例3中選出的嗜檸檬酸明串球菌EUG4427(KCCM-10274)、乳桿菌EUG6017(KCCM-10273)、乳桿菌EUG4066(KCCM-10270)、乳桿菌EUG4048(KCCM-10271)以及乳桿菌EUG6404(KCCM-10272)分別在37℃，MRS液體培養基中培養48小時，然后離心獲得上清。
制備25ml的添加10％馬血清布魯氏菌瓊脂培養基的瓊脂平板，干燥，其上涂布0.5ml幽門螺旋桿菌懸浮液(1×108CFU/mL)，干燥5分鐘。
培養基用滅菌的軟木錐打孔，將每種菌株的100μl的離心上清液引入，并且在10％CO2分壓下，37℃培養72小時，測定它們形成的透明環的尺寸。使用MRS液體培養基取代上清液作為對照。乳酸細菌在體外對幽門螺旋桿菌的生長抑制結果顯示在表7中。
表7如表7所示，從實施例3中分離得到的5種朝鮮泡菜乳酸細菌上清液的培養結果顯示，產生的透明環的半徑在2.5mm到4.5mm之間，表明本發明的朝鮮泡菜乳酸細菌具有突出的抑制幽門螺旋桿菌生長的活性。
實施例5對幽門螺旋桿菌附著到胃癌細胞的抑制人Kato III胃癌細胞在37℃，10％CO2條件下，在含10％FBS的RPMI1640培養基上培養。幽門螺旋桿菌在37℃、10％CO2條件下，在含10％馬血清的布魯氏菌瓊脂培養基上培養48小時，然后收集菌落并懸浮在鹽水中。將0.5ml的1×106Kato III懸浮液和0.25ml乳酸細菌培養液在37℃下反應30分鐘，反應的同時緩慢搖動。將MRS液體培養基取代培養液作為對照。
將0.25ml的幽門螺旋桿菌懸浮液(1×108CFU/mL)加入上述反應液，繼續反應90分鐘，然后用鹽水洗滌三次，每次用1000rpm離心5分鐘。接著通過脲酶實驗來測定附著到Kato III上的幽門螺旋桿菌數量。
脲酶能夠分解尿素而產生氨，產生的氨可使用苯酚/硝普鹽和堿性次氯酸鹽來定量。如果脲酶存在，反應液體從無色轉變為亮藍色，通過測定625nm的吸光度來測定脲酶的活性。幽門螺旋桿菌的數量則依據脲酶活性來計算，當幽門螺旋桿菌數量為104～107時，本實驗的標準曲線顯示為線性區域。
實施例3獲得的5種泡菜乳酸細菌抑制幽門螺旋桿菌附著到人胃癌細胞的活性顯示在表8中。
表8從表8可以證實，實施例3獲得的5種泡菜乳酸細菌僅僅使少量的幽門螺旋桿菌附著到Kato III人胃癌細胞上，表明本發明的5種從泡菜中獲得的乳酸細菌能夠抑制幽門螺旋桿菌附著到胃腸道。
實施例6保護胃腸道的高功能泡菜的制備將實施例3獲得的嗜檸檬酸明串球菌EUG4427(KCCM-10274)、乳桿菌EUG6017(KCCM-10273)、乳桿菌EUG4066(KCCM-10270)、乳桿菌EUG4048(KCCM-10271)以及乳桿菌EUG6404(KCCM-10272)進行凍干并制成粉狀，將一種或多種菌株混合，然后以每千克朝鮮泡菜含106-1011，較適宜為1010，的細菌與泡菜作料混合，然后通過常規的方法制備保護胃腸道的高功能朝鮮泡菜。
本發明的泡菜乳酸細菌能夠抑制寄生在胃黏膜組織的幽門螺旋桿菌附著到胃腸道，并且抑制其生長，因此對于殺滅幽門螺旋桿菌和預防再感染非常有效。另外，包含泡菜乳酸細菌的能夠保護胃腸道的朝鮮泡菜對于預防和治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍非常有效。
另外，乳酸細菌并非來源于人的體內或牛奶發酵產物，帶有所需功能的乳酸細菌而是來源于朝鮮泡菜，朝鮮泡菜是韓國人的主要乳酸細菌供給來源。因此，所述的功能可以添加到傳統食品朝鮮泡菜中以及其他食品中，使功能性的乳酸細菌供給來源更加多樣化。
關于微生物保藏的說明(細則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
關于微生物保藏的說明(細則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
關于微生物保藏的說明(細則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
關于微生物保藏的說明(細則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
關于微生物保藏的說明(細則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
權利要求
1.抑制幽門螺旋桿菌生長并且抑制其附著到胃腸道的朝鮮泡菜乳酸細菌。
2.根據權利要求1所述的朝鮮泡菜乳酸細菌，其中朝鮮泡菜乳酸細菌是從朝鮮泡菜中分離出來的，該泡菜從開始制備后在1～40℃下熟化90天或至pH值達到約3.0。
3.據權利要求1所述的朝鮮泡菜乳酸細菌，其中該朝鮮泡菜乳酸細菌屬于嗜檸檬酸明串球菌屬種(Leuconostoc species)或乳桿菌屬種(Lactobacillusspecies)。
4.根據權利要求1或2所述的朝鮮泡菜乳酸細菌，其中該朝鮮泡菜乳酸細菌是一種或多種選自如下細菌所組成的組中嗜檸檬酸明串球菌EUG4427(KCCM-10274)、乳桿菌EUG6017(KCCM-10273)、乳桿菌EUG4066(KCCM-10270)、乳桿菌EUG4048(KCCM-10271)以及乳桿菌EUG6404(KCCM-10272)。
5.一種可用于預防和治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍的功能性食品，包含權利要求1至4中任何一項所述的朝鮮泡菜乳酸細菌。
6.一種可用于預防和治療胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍的保護胃腸道的高功能朝鮮泡菜，包含權利要求1至4中任何一項所述的朝鮮泡菜乳酸細菌。
7.一種可用于預防和治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍的藥物，包含權利要求1至4中任何一項所述的朝鮮泡菜乳酸細菌。
全文摘要
本發明涉及抑制幽門螺旋桿菌生長的朝鮮泡菜乳酸細菌和包含這些細菌的食品，特別涉及一種包含能抑制幽門螺旋桿菌附著到胃腸道并抑制其生長的朝鮮泡菜乳酸細菌的保護胃腸道的高功能食品。本發明的朝鮮泡菜乳酸細菌能抑制寄生在胃黏膜組織的幽門螺旋桿菌附著到胃腸道，并抑制其生長，因此對于殺滅幽門螺旋桿菌以及預防再感染非常有效。另外，包含朝鮮泡菜乳酸細菌的保護胃腸道的高功能食品對于預防和治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍非常有效。
文檔編號C12N1/20GK1514875SQ02810130
公開日2004年7月21日 申請日期2002年5月14日 優先權日2001年5月17日
發明者金昶坤, 曹長鉉, 李泳善, 金明國, 尹源泰 申請人:尤金科學株式會社