專利名稱：啟動子的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種能夠方便地以低成本及高水平表達目的基因產物的新啟動子，且涉及一種用該啟動子生產蛋白質的方法。
背景技術：
表達系統用來根據目的，通過基因工程來生產有用的基因產物。在所述表達系統方面，使用已建立了其培養技術的諸如微生物細胞(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母等等)、動物細胞、昆蟲細胞和植物細胞的宿主以及適合于所述宿主的啟動子。在這些表達系統中，使用大腸桿菌作為宿主且用lac啟動子或其衍生物的一種表達系統，由于操作上的方便因而是最常用的系統之一。
然而，使用lac啟動子或其衍生物的表達系統的缺點在于工業上它是不便的；因為它需要誘導基因表達來表達基因產物。例如，誘導由lac啟動子、tac啟動子或諸如此類的啟動子進行基因表達，則需要使用一種昂貴的試劑——異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。因此，這樣的系統的缺點在于它對工業規模的操作不利。
同樣，使用一種利用來源于木糖操縱子的啟動子且用芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌作為宿主的表達系統。但是，該系統對工業規模的操作不利，因為它需要添加木糖來誘導表達。
通常使用利用λ噬菌體啟動子的溫度誘導的表達載體。
然而，通過溫度誘導過量表達重組基因產物在下列方面可能是不利的(a)難以快速完成溫度的加速，(b)由于培養溫度較高，形成不溶性內涵體的可能性增加，以及
(c)熱激時在大腸桿菌中誘導幾種蛋白酶。
已知枯草桿菌作為穩定期特異性的反應，產生及分泌許多分解代謝酶，例如淀粉酶和蛋白酶。如果宿主能夠利用穩定期特異性的表達機制而僅僅在宿主生長完全后的穩定期期間表達基因，則可能減少該宿主的負擔，且可能有效地表達外源基因。但是，尚未建立利用這樣一種機制的基因表達技術。
因此，希望有無需人工誘導基因表達而能夠有效表達的技術。
發明目的本發明主要目的是提供無需人工誘導基因表達而能夠以穩定期特異性方式以高水平表達基因的啟動子、重組DNA、基因表達用載體、表達載體及轉化細胞；以及提供一種可方便而低成本地實施的、生產蛋白質的方法以及一種供該方法用的試劑盒。
發明概述概述本發明如下[1]一種分離的DNA，所述分離的DNA選自(a)具有SEQ ID NO1-6中的任何一種的核苷酸序列的、在革蘭氏陽性細菌中以穩定期特異性方式顯示出啟動子活性的分離的DNA或其片段，和(b)在嚴謹性條件下可與(a)的DNA或其片段雜交的、在革蘭氏陽性細菌中以穩定期特異性方式顯示出啟動子活性的分離的DNA；[2]按照[1]的分離的DNA，所述分離的DNA在被置于外源基因的上游時，則能夠在沒有誘導物的情況下以穩定期特異性方式使該外源基因表達；[3]一種重組DNA，其中由[1]限定的DNA和外源基因的配置使得所述外源基因可以表達；[4]按照[3]的重組DNA，其中所述外源基因為選自編碼蛋白質的核酸、編碼反義RNA的核酸以及編碼核酶的核酸的核酸；[5]一種基因表達用載體，所述載體包含由[1]限定的DNA；[6]按照[5]的基因表達用載體，其中所述載體是選自質粒載體、噬菌體載體和病毒載體的一種載體；[7]一種表達載體，所述表達載體包含由[3]限定的重組DNA；[8]按照[7]的表達載體，其中所述載體是選自質粒載體、噬菌體載體和病毒載體的一種載體；[9]一種轉化細胞，所述轉化細胞含有由[3]限定的重組DNA或由[7]限定的表達載體；[10]一種用于生產蛋白質的方法，所述方法包括培養由[9]限定的轉化細胞；并從所產生的培養物中收集蛋白質，以及[11]一種用于生產蛋白質的試劑盒，所述試劑盒含有由[1]限定的DNA或由[5]限定的表達基因用載體。
發明詳述可以將來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) DB104(Gene，83215-233(1989))的、含有一種位于一種以穩定期特異性方式表達的基因之可讀框(ORF)上游的元件、且顯示出啟動子活性的DNA用作本發明的DNA。本發明基于本發明人的意外發現——如果將外源基因(也稱為目的基因)置于所述DNA的下游，則在沒有表達誘導物的情況下，可以高水平(即每升培養基100-500mg)地表達目的基因的產物。
本發明的DNA包括具有SEQ ID NO1-6的核苷酸序列的DNA。本發明的DNA優選是在革蘭氏陽性細菌中以穩定期特異性方式顯示出啟動子活性的分離的DNA，更優選是在下面描述的在芽孢桿菌屬細菌或大腸桿菌中以穩定期特異性方式顯示出啟動子活性的分離的DNA。
按照本發明，“啟動子”包括位于轉錄起始點(+1)上游約10-30個堿基對的一個Pribnow框、一個TATA框或一個類似于TATA框的區域，且負責使RNA聚合酶能從正確位置開始轉錄的功能。所述啟動子不一定限制于這樣的區域或周圍區域，而是除了該區域外，所述啟動子還可包含結合除RNA聚合酶之外的蛋白質結合所必需的供控制表達用的區域。當用于本文時，術語“啟動子區”是指包含按照本發明的啟動子的區域。
當用于本文時，術語“啟動子活性”表示當把通過將基因置于啟動子下游使得能夠表達該基因而獲得的構成物引入到宿主中時，所述啟動子具有在該宿主內或在宿主之外生產該基因的表達產物的能力與功能。
通常，可以用包括下述步驟的方法來測量“啟動子活性”，該方法包括(1) 將待測量的DNA連接到編碼可被容易地定量或觀測的蛋白之基因(在下文也稱之為報道基因)上游的步驟；(2) 將所產生的構成物引入到宿主中的步驟；(3) 培養所產生的轉化細胞從而表達該蛋白的步驟；以及(4) 測量所表達的蛋白量的步驟。例如，通過將假定具有啟動子序列的一段序列連接到報道基因的上游，將所述構成物引入到宿主中，并觀測該宿主內或宿主外所述基因產物的表達；則可以測定“啟動子活性”的存在。表達的觀測值作為所述啟動子在所導入的宿主中的啟動子活性的一個指標。
當用于本文時，“穩定期特異性啟動子”是指僅僅在對數生長期之后的穩定期期間指導轉錄的啟動子。“穩定期特異性啟動子”可以只在穩定期期間、在沒有用誘導物例如IPTG誘導的情況下，表達置于所述啟動子下游的基因。
只要具有SEQ ID NO1-6的核苷酸序列的分離DNA的片段以穩定期特異性方式顯示出啟動子活性，則本發明的DNA包括這樣的分離DNA的片段。可以適當地選擇“片段”，使得該片段以穩定期特異性方式顯示出啟動子活性。用上述的包括步驟(1)至(4)的方法，則可選擇這樣的片段。
本發明的DNA還包括具有在SEQ ID NO1-6的任一種核苷酸序列中至少一個核苷酸且特別是一個或數個核苷酸被取代、缺失、插入或添加的核苷酸序列、且具有穩定期特異性方式的啟動子活性的DNA。一般而言，如果具有短序列的DNA有至少一個核苷酸的突變(取代、缺失、插入或添加)，則該DNA的活性可能被改變。然而，如果用上述的包括步驟(1)至(4)的方法觀測到“有突變的DNA”以穩定期特異性方式的啟動子活性，則本發明包括所述“有突變的DNA”。所述突變或者可以是天然發生的突變，或者可以是人工引入的突變。
可按照常規的定點誘變法等等，來引入人工突變。可使用的定點誘變法的實例包括利用琥珀突變的缺口雙鏈體法(Nucleic AcidsResearch，129441-9456(1984))，利用dut(dUTP酶)基因和ung(尿嘧啶-DNA糖基化酶)基因缺陷之宿主的Kunkel法(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the USA，82488-492(1985))以及利用琥珀突變的PCR法(WO 98/02535)。
本發明也包括這樣的分離的DNA，所述分離的DNA在嚴謹性條件下可與本發明DNA的互補鏈雜交，或者例如用基于本發明DNA而按照常規方法設計并化學合成的寡核苷酸探針或引物而獲得，且最好在革蘭氏陽性細菌中，具有穩定期特異性方式的啟動子活性例如，用上述的包括步驟(1)至(4)的方法觀測到穩定期特異性方式的啟動子活性的DNA，可以被選擇作為這樣的DNA。只要所述寡核苷酸探針在嚴謹性條件下與所述DNA雜交或與具有互補于所述DNA的核苷酸序列的DNA雜交，那么對于所述寡核苷酸探針的核苷酸序列則沒有特別的限制。
“嚴謹性條件”的示例為文獻例如Sambrook等，Molecular cloning，A laboratory manual 2ndedition，1989，Cold Spring Harbor LaboratoryPress中描述的那些嚴謹性條件。例如，嚴謹性條件為在含有6×SSC(1×SSC0.15 M NaCl、0.015 M檸檬酸鈉，pH 7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt’s(0.1％的牛血清白蛋白(BSA)、0.1％的聚乙烯吡咯烷酮、0.1％的Ficoll 400)和100μg/ml鮭精DNA的溶液中，于所用探針的Tm-25℃的溫度，保溫過夜。
只要所述引物在常規PCR所用的條件下能夠退火到所述DNA或具有互補于所述DNA的核苷酸序列的DNA上，從而起始用DNA聚合酶的延伸反應，那么對于所述引物的核苷酸序列也沒有特別的限制。
例如按照下面的公式，可確定寡核苷酸探針或引物的TmTm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)其中，N是寡核苷酸探針或引物的鏈長，％G+C為寡核苷酸探針或引物中鳥嘌呤殘基加胞嘧啶殘基的含量。
如果寡核苷酸探針或引物的鏈長少于18個核苷酸，則可以估算Tm；例如，按殘基A+T(腺嘌呤加胸腺嘧啶)數目乘以2(℃)之積與殘基G+C殘基數目乘以4(℃)之積的和，即[(A+T)×2+(G+C)×4]，來估算Tm。
雖然并不打算限制本發明，但為了避免非特異性的雜交或退火，理想的是寡核苷酸探針或引物的鏈長優選為6個或6個以上的核苷酸、更優選為10個或10個以上的核苷酸。而且，考慮到寡核苷酸的合成，理想的是所述長度優選為100個或100個以下的核苷酸、更優選為30個或30個以下的核苷酸。
對于本領域技術人員，寡核苷酸的設計是已知的，例如可參照Labo Manual PCR，第13-16頁，1996(Takara Shuzo)。另一方面，可使用市售的軟件，例如OLIGOTMPrimer Analysis軟件(Takara Shuzo)。
可按照已知的方法來合成寡核苷酸。例如，可以按照亞磷酰胺法，用394型DNA合成儀(Applied Biosystems)來合成寡核苷酸。另一方面，為了合成，可以用磷酸三酯法、H-膦酸酯法、硫代膦酸酯法等等。
使用本發明的DNA，提供一種重組DNA；在所述重組DNA中，本發明DNA和外源基因的配置使得可以表達所述外源基因。本發明包括這樣的重組DNA。
外源基因的實例包括但不限于編碼蛋白質(例如酶、細胞因子或抗體)的核酸、編碼反義RNA的核酸以及編碼核酶的核酸。所述外源基因之起源的實例包括但不限于微生物(例如細菌、酵母、放線菌、絲狀真菌、子囊菌和擔子菌)、植物、昆蟲和動物。此外，可以隨目的而定，使用人工合成的基因。
具體地講，外源基因的實例包括但不限于白介素(IL)1至12的基因，干擾素(IFN)α、β和γ的基因，腫瘤壞死因子(TNF)的基因，集落刺激因子(CSF)的基因，促紅細胞生成素的基因，轉化生長因子(TGF)-β的基因，免疫球蛋白(Ig)的基因，組織纖溶酶原激活物(t-PA)的基因，尿激酶的基因以及Western firefly熒光素酶的基因。
當用于本文時，“核酶”是指切割特定蛋白的mRNA從而阻止所述蛋白翻譯的核酸。可以在編碼特定蛋白的基因序列的基礎上設計核酶。例如，用FEBS Letter，228228-230(1988)中描述的方法，可制備錘頭型核酶。按照本發明的核酶包括切割特定蛋白的mRNA從而阻止所述蛋白翻譯的任何一種核酶，而不管所述核酶的類型(例如錘頭型、發夾型或三角形)。
即使不人工誘導基因的表達，本發明的DNA也顯示出能夠高水平表達基因的啟動子活性。因此，對于作為編碼蛋白質之核酸的外源基因的表達，本發明DNA是特別優選的。
此外，用本發明的DNA，提供一種含有本發明DNA的基因表達用載體。本發明則包括這樣的基因表達用載體。
用本發明的基因表達用載體，有可能以每升培養基100-500mg的水平表達蛋白質(作為目的基因產物的一個實例)；因為所述載體包含本發明的DNA。可以容易地、根據預期效用而表達目的基因產物。
可以將質粒載體、噬菌體載體或病毒載體或者構成所述載體一部分的載體片段，用作本發明的基因表達用載體中的載體。可以根據待用作宿主的細胞，適當地選擇所述載體或載體片段。
對于可被用作宿主的細胞，則沒有特別的限制。例如，可以用革蘭氏陽性細菌。革蘭氏陽性細菌的實例包括已建立了轉化系統的芽孢桿菌屬的細菌。雖然并不打算限制本發明，但具體可使用枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus tearothermophilus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)或種名未定的芽孢桿菌(Bacillus sp.)。可以將通過誘變這樣的芽孢桿菌屬細菌而獲得的細菌用作宿主。同樣，可以將大腸桿菌用作宿主。已建立了大腸桿菌的轉化系統，產生了具有不同基因型的大腸桿菌細胞，并且它們都是容易得到的。因此，大腸桿菌被廣泛地用作轉化的宿主。雖然并不打算限制本發明，但具體的實例包括來源于大腸桿菌K-12的菌株HB101、C600、JM109、DH5α、DH10B、XL-1BlueMRF’和TOP10F。可以將通過誘變這樣的大腸桿菌細胞而獲得的菌株用作宿主。
如果將枯草桿菌屬的細菌用作宿主，則所述載體的實例包括質粒載體例如pHY、pUB110和pE194，以及噬菌體載體例如105和Spβ。如果用大腸桿菌作為宿主，則所述載體的實例包括質粒載體例如pUC18、pUC19、pBluescript和pET，以及噬菌體載體例如λ噬菌體載體(例如λgt10和λgt11)。通過適當選擇這樣的載體，并使本發明的DNA結合到所述載體中，則可構建能夠以穩定期特異性方式表達外源基因的本發明的基因表達用載體。
為了構建本發明的基因表達用載體，可以使用Molecular cloning，Alaboratory manual 2nd(上述)中描述的或諸如此類的技術。另一方面，例如可按照下面實施例中描述的構建步驟來進行構建。
本發明的基因表達用載體可包含一個終止子(例如rrnBT1T)、一個選擇標記基因等等。
選擇標記基因包括氨芐青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因和四環素抗性基因。
本發明的基因表達用載體可以根據目的基因產物的預期效用而包含下述元件。例如，為了簡化分離目的基因產物的步驟，所述載體可包含一段能夠以與異源蛋白(例如谷胱甘肽S-轉移酶或麥芽糖結合蛋白)的融合蛋白形式表達的序列；或可包含一段能夠以添加了組氨酸尾或諸如此類的蛋白形式表達的標志序列。
此外，本發明提供一種包含上述重組DNA的表達載體。這樣的表達載體被本發明所包括。本發明的表達載體包括通過使目的基因結合到上述基因表達用載體中而獲得的構成物。
可以將上面關于基因表達用載體而描述的載體用于本發明的表達載體。
通過(a)使所述重組DNA結合到一種合適的載體中，(b)使目的基因結合到一種基因表達用載體中，或(c)將目的基因連接到基因表達用的載體片段上，則可構建本發明的表達載體。
用本發明的重組DNA或表達載體，同樣可以提供含有所述重組DNA或所述表達載體的轉化細胞。
可將上面描述的“可用作宿主的細胞”用作宿主。
例如，可按照在下述文獻中描述的方法，將重組DNA引入到宿主中；所述下述文獻即Idenshikougaku Jikken，第12-23頁，JapanRadioisotope Association(編輯)(1991)；Virology，52456(1973)；Molecular and Cellular Biology，72745(1987)；Journal of the NationalCancer Institute，41351(1968)；或EMBO Journal，1841(1982)。
例如，可按照自發感受態法(Idenshikougaku Jikken，第12-23頁，Japan Radioisotope Association(編輯)(1991))、磷酸鈣法(Molecular andCellular Biology，72745(1987))、電穿孔法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，817161(1984))、DEAE-葡聚糖法(Methods in Nucleic Acids Research，第283頁，Karam等(編輯)(1991)CRC Press)或脂質體法(BioTechniques，6682(1989))，將表達載體引入到宿主中。
使用本發明的轉化細胞，提供一種生產蛋白質的方法，所述方法包括培養轉化細胞、且從所產生的培養物中收集蛋白質。本發明包括這樣的“生產蛋白質的方法”。
具體地講，可以用包括下述步驟的方法來生產蛋白質(I)用下述(a)或(b)轉化宿主細胞的步驟，(a)一種重組DNA，其中編碼蛋白質的核酸置于本發明DNA的下游，使得所述核酸可被表達；或(b)一種包含所述重組DNA的載體；以及(II)培養按(I)而獲得的轉化細胞、并從所產生的培養物中收集蛋白質的步驟。
可根據用作宿主的細胞、待表達蛋白的性質等等，適當地選擇培養轉化細胞的方法。
可以用常規的純化蛋白質的方法來純化如此獲得的蛋白質。這樣的純化方法的實例包括鹽析、離子交換層析、疏水層析、親和層析以及凝膠過濾層析。
可構建生產蛋白質用的試劑盒，所述試劑盒包含本發明的DNA或者本發明的基因表達用載體，所述試劑盒可以用于本發明的生產蛋白質的方法。用這樣的試劑盒，可更方便地生產蛋白質。
實施例下面的實施例更詳細地闡明了本發明，但不應解釋為這些實施例限制本發明的范圍。
下面描述了按照本發明使用的枯草芽孢桿菌菌株之間的關系及其特性。
枯草芽孢桿菌Marburg 168在重組DNA實驗中通常用作枯草芽孢桿菌宿主之菌株的親代菌株。
枯草芽孢桿菌DB104枯草芽孢桿菌Marburg 168的衍生菌株中的一種需要組氨酸的菌株。除所述輔源營養之外的突變(nprR2、nprE18、aprED3)與UOT1285的相應突變是等同的。
枯草芽孢桿菌UOT1285枯草芽孢桿菌Marburg 168的衍生菌株中的一種需要色氨酸和賴氨酸的菌株。除所述輔源營養之外的突變(nprR2、nprE18、aprED3)與DB104的相應突變是等同的。
實施例1用枯草芽孢桿菌DNA芯片篩選以穩定期特異性方式表達的基因使用枯草芽孢桿菌基因組之數據庫(http//genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi)中的DNA序列信息，來設計PCR的引物；使得對枯草芽孢桿菌的所有可讀框，都可擴增出幾乎全長的可讀框。用這些引物、來自枯草芽孢桿菌Marburg 168的基因組DNA(Molecular & General Genetics，15265-69(1977))以及TaKaRaEx Taq(Takara Shuzo)或TaKaRa Z-Taq(Takara Shuzo)，在96孔板中進行PCR。
純化所產生的PCR產物。通過瓊脂糖凝膠電泳來檢查純度和大小；然后，通過測量每個樣品的吸光度，來計算所述DNA的濃度。
通過異丙醇沉淀而濃縮如此獲得的DNA片段的溶液。按照WO00/26404中描述的方法，濃度分別為1.0μg/mL的各種DNA片段固定到載玻片上，從而制備DNA芯片。
在50ml的2×SG(1.6％的營養肉湯、0.05％的MgSO4·7H2O、0.2％KCl、1mM的Ca(NO3)2·4H2O、0.1mM MnCl2·4H2O、0.001mM的FeSO4·7H2O、0.1％的葡萄糖)中于37℃培養枯草芽孢包桿菌UOT1285(Journal of General Microbiology，1351335-1345(1989))。在培養開始后的3小時、4小時或5小時，取出一部分培養物；并通過離心收集細胞。將如此獲得的細胞懸浮于TRIZOL Reagent(Gibco BRL)中。向所述懸浮液中添加玻璃珠。用Mini-BeadBeater(Biospec Products)破裂細胞。按照TRIZOL Reagent所附帶的方案，通過氯仿抽提及異丙醇沉淀，來回收RNA。用無RNA酶的DNA酶I(Takara Shuzo)處理所回收的RNA，然后，通過苯酚/氯仿抽提，繼之以乙醇沉淀，來回收RNA。結果獲得約90-100μg的RNA。將所述RNA用作作為模板的RNA。
用15μg按上面描述方法制備的作為模板的RNA和Cy3-dUTP(Amersham Pharmacia Biotech)進行逆轉錄酶反應，以制備Cy3-標記的cDNA探針。
使按照上述方法制備的DNA芯片于室溫下在預雜交溶液(4×SSC、0.2％SDS、5×Denhardt溶液、1mg/ml變性鮭精DNA)中預雜交2小時，用2×SSC洗滌，繼之以用0.2×SSC洗滌，然后干燥。接著，使用按上述方法制備的Cy3-標記的cDNA探針，在雜交溶液中于65℃進行雜交過夜；所述雜交溶液除了變性鮭精DNA濃度變為0.1mg/ml外，其組成與預雜交溶液的組成相同。雜交之后，用含有0.2％SDS的2×SSC于55℃洗滌所述DNA芯片達30分鐘(兩次)，并于65℃將其洗滌5分鐘(一次)，且在0.05×SSC中于室溫洗滌5分鐘；然后干燥。
用DNA芯片分析儀Affymetrix 418 Array Scanner(Affymetrix)，對經過雜交的DNA芯片進行熒光檢測。將通過熒光檢測而獲得的信號強度如下以固相中的色階表示藍色＜綠色＜黃色＜橙黃色＜紅色＜白色。
用表達數據分析軟件ImaGene(BioDiscovery)，按照所述軟件所附的說明書，對如此獲得的圖象數據進行信號強度的測量與分析。比較用rRNA之信號作為內標而校正過的、用數字表示的Cy3信號強度值，并測定枯草芽孢桿菌各個生長期的基因表達信號。結果，有在培養3小時后觀測到強表達信號的基因，有在培養5小時后觀測到強表達信號的基因等等。因此，顯示出所述可讀框的表達方式顯然是相互不同的。
為了更詳細地研究表達信號的差異，通過用培養3小時后的表達信號除培養4或5小時后的表達信號計算相對表達水平的比率，來確定表達水平的生長期特異性。在表1中顯示了有代表性基因的結果。
表1
正如從表1中所看到的，在培養5小時后即在穩定期期間，有表達水平顯著升高的基因。
實施例2用枯草芽孢桿菌的大膜片(macromembrane)來篩選以穩定期特異性方式表達的基因通過用15μg實施例1中制備的作為模板的RNA和DIG-11-dUTP(Roche Diagnostics)進行逆轉錄酶反應，來制備地高辛配基(在下文稱之為DIG)-標記的cDNA探針。
然后，用DIG-標記的cDNA探針來進行與枯草芽孢桿菌DNA陣列(Eurogentec，在下文稱之為大膜片；來源于枯草芽孢桿菌Marburg 168的推定的可讀框)的雜交。至于雜交，在42℃于DIGEasyHyb Granules(Roche Diagnostics)溶液中預雜交達30分鐘，然后，在42℃雜交過夜。用DIG洗滌與阻斷緩沖液(Wash and Block Buffer)以及檢測試劑盒(Detection kit)(兩者都得自Roche Diagnostics)進行檢測。
在感光膠片上顯出檢測的結果。用圖像分析軟件Adobe Photoshop(Adobe)，將所述結果的圖像收入圖像分析儀Model GS-700 ImagingDensitometer(BioRed)中。用圖像分析軟件MultiAnalyst(Bio-Red)，按照所述軟件所附的說明書，來測量與分析所述信號的強度。根據數字表示的DIG信號強度，來測定基因在枯草芽孢桿菌各個生長期的表達信號。結果，有在培養3小時后觀測到強表達信號的基因，有在培養5小時后觀測到強表達信號的基因等等。因此，顯示出所述可讀框的表達方式顯然是互不相同的。
為了更詳細地研究表達信號的差異，通過用培養3小時后的表達信號除培養4或5小時后的表達信號計算相對表達水平的比率，來確定表達水平的生長期特異性。在表2中顯示了有代表性基因的結果。
表2
正如從表2中所看到的，在培養5小時后即在穩定期期間，有表達水平顯著升高的基因。
實施例3穩定期特異性啟動子的篩選為了篩選穩定期特異性的啟動子，如實施例1和實施例2中所述，進行了兩輪相應的篩選；根據結果，來總體判斷表達水平在培養5小時后即在穩定期期間顯著升高的基因，且挑選出下面的23種基因，并將其用于下面的實驗；所述基因為acoA、acoL、iolJ、sigF、sipW、spoIIB、spoIIIAH、spoIVA、yabS、ybcO、ybcP、ybcQ、ybcS、ybcT、ybdA、ybdD、yfiA、ygaB、yjdB、yngJ、yobH、yqxA以及yrzF。
通過連接外源基因到來自所述23種以穩定期特異性方式表達的基因、推測含有所述基因的啟動子區的DNA片段上，構建外源基因表達用的載體，進行穩定期特異性啟動子的篩選。
使用市售的用于凝膠純化和質粒純化的酶以及用于凝膠純化和質粒純化的試劑盒，來構建所述基因表達用載體。除非另有說明，按照Molecular cloning，A laboratory manual 2nd(Sambrook等，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press)中描述的方法，進行操作。
為了擴增包含以穩定期特異性方式表達的所述23種基因之上游區的、大約180bp的DNA片段，設計了總共46種引物。所述DNA片段中的所述區位于所述基因SD序列的上游，且推測這些區包含啟動子。根據實施例1中描述的枯草芽孢桿菌基因組數據庫(http//genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi)的序列，來進行設計。另外，為了簡化擴增后的操作，在所設計的各個引物的兩側，添加了限制性內切酶KpnI和EcoRI的位點。
準備從中擴增推測含有啟動子區的DNA片段的基因、擴增用的引物以及顯示所述引物序列的SEQ ID NO(在園括號中)如下acoA基因，引物aAF1(SEQ ID NO7)和aAR1(SEQ ID NO8)；spoIIB基因，引物spBF1(SEQ ID NO9)和spBR1(SEQ ID NO10)；ybcO基因，引物ybOF1(SEQ ID NO11)和ybOR1(SEQ ID NO12)；yjdB基因，引物yjBF1(SEQ ID NO13)和pjBR1(SEQ ID NO14)；yngJ基因，引物ynJF1(SEQ ID NO15)和ynJR1(SEQ ID NO16)；以及yrzE基因，引物yrEF1(SEQ ID NO17)和yrER1(SEQ ID NO18)。
用ISOPLANT試劑盒(Nippon Gene)，按照所述試劑盒所附的說明書，由枯草芽孢桿菌DB104(Gene，83215-233(1989))制備基因組DNA。
用作為模板的所述基因組DNA與如上所述設計的引物，如下進行PCR94℃達30秒、50℃達1分鐘以及72℃達1分鐘的循環20個。
在下面，使用如上所述擴增的、推測含有啟動子的23種DNA片段。
將來源于WO 98/56926中描述的激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)的超耐熱蛋白酶PFUS的基因，用作用來篩選穩定期特異性啟動子的外源基因。
枯草芽孢桿菌DB104/pSPO124ΔC(FERM BP-6294)是一株WO98/56926中描述的含有質粒pSPO124ΔC的菌株，質粒pSPO124ΔC包含超耐熱蛋白酶PFUS的基因。在5ml含有10μg/ml卡那霉素的LB培養基中，于37℃培養枯草芽孢桿菌DB104/pSPO124ΔC過夜。然后用QIAGEN Plasmid Mini試劑盒(Qiagen)，按照所述試劑盒所附的說明書，由所收集的細胞制備出質粒pSPO124ΔC。在這種情況下，于37℃處理懸浮于添加了4mg/ml濃度的溶菌酶的緩沖液P1中的細胞達30分鐘；緩沖液P1是所述試劑盒所附的緩沖液。
用作為模板的質粒pSPO124ΔC和引物PLF1(SEQ ID NO19)與PLR1(SEQ ID NO20)，通過PCR，擴增一種5448 bp的DNA片段。所述片段不僅包含所述SD序列以及編碼來自枯草芽孢桿菌的枯草蛋白酶之aprE基因的分泌信號，而且包含超耐熱蛋白酶PFUS的結構基因。在下面，將這種片段用作載體片段。
作為一個實例，下面描述了關于包含yngL基因之啟動子區的DNA片段的操作。
用限制性內切酶KpnI和EcoRI(兩者都來自Takara Shuzo)消化所擴增的、推測包含yngJ基因之啟動子區的DNA片段，并將其純化。將所述DNA片段與用限制性內切酶KpnI和EcoR I消化的載體片段混合，并使其連接。用所述反應混合物轉化枯草芽孢桿菌DB104。將轉化的細胞涂布在含有1％脫脂乳和10μg/ml卡那霉素的LB平板上。在37℃保溫所述平板達16小時。
為了從所產生的卡那霉素抗性轉化子中選擇出其中插入了所述180bp DNA片段的克隆，設計了可用來擴增含有所述啟動子區的DNA片段的引物UBF1(SEQ ID NO21)和SBPR1(SEQ ID NO22)。用這兩種引物的組合以及TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)，在含有1mM PMSF的反應混合物中如下進行PCR94℃達30秒、55℃達1分鐘以及72℃達1分鐘的循環20個。
如此，選擇出其中插入了所述180bp DNA片段的克隆。由所選的轉化子制備質粒，并將其稱為pND20。
對其它22種DNA片段進行類似的操作。于是，在得到了轉化子的克隆之中，得到了啟動子序列不同于pND20中的啟動子序列的18個克隆。由所述這些轉化子制備了總計19類的質粒。
實施例4用穩定期特異性表達載體生產超耐熱蛋白酶(1) 用包含超耐熱蛋白酶PFUS之基因的質粒轉化的枯草芽孢桿菌細胞的培養及粗酶溶液的制備枯草芽孢桿菌DB104/pND20是通過將實施例3中制備的包含超耐熱蛋白酶PFUS基因的質粒pND20引入到枯草芽孢桿菌DB104中而產生的菌株。在37℃于1ml含有10μg/ml卡那霉素的TKRBS1培養基(20mg/ml的聚胨、2mg/ml的酵母膏、10mg/ml的肉膏、40mg/ml的葡萄糖、20μg/ml的FeSO4·7H2O、20μg/ml的MnSO4.5H2O以及2μg/ml的ZnSO4.7H2O)中，培養枯草芽孢桿菌DB104/pND20。在開始培養后4、7、10或13天，收集100μl的培養物。在95℃加熱所述培養物達30分鐘，然后離心收集上清液。將所述上清液用作粗酶溶液。
使用含有其它18種質粒中的一種的枯草芽孢桿菌DB104，以類似的方式制備粗酶溶液。
(2)生產超耐熱蛋白酶之能力的比較通過光譜測量由使用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA(Sigma)作為底物的酶之水解反應產生的對硝基苯胺，來確定超耐熱蛋白酶PFUS的活性。
具體地講，用100mM的磷酸緩沖液(pH7.0)適當地稀釋準備測定酶活性的酶制劑。將50μl在100mM磷酸緩沖液(pH7.0)中含有1mM濃度的Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA的溶液加入到50μl樣品溶液中。讓混合物在95℃反應30分鐘。然后，在冰上使所述反應混合物冷卻而終止反應。測量在405nm的吸光度，從而確定所產生的對硝基苯胺的量。
將所述酶的一個單位定義為在95℃時1分鐘內產生1μmol對硝基苯胺的酶量。
假定超耐熱蛋白酶PFUS的比活為9.5單位/mg蛋白，則根據所測定的酶活性來計算表達的酶蛋白的量。
用實施例4-(1)中制備的粗酶溶液作為酶制劑，測定超耐熱蛋白酶的活性。結果，用六種質粒(pND1、pND6、pND10、pND19、pND20、pND23)，觀測到超耐熱蛋白酶PFUS的表達。在SEQ ID NOS1-6中，顯示了結合到這六種質粒中的啟動子區的核苷酸序列。在表3中顯示了用這六種質粒而觀測到的表達水平。在表3中，結果以規定用枯草芽孢桿菌DB104/pSPO124ΔC所觀測到的表達水平為1時的相對值表示。
表3
正如從表3中所看到的，與使用pSPO124ΔC所觀測到的表達水平相比，使用pND6、pND10和pND20，觀測到超耐熱蛋白酶PFUS表達水平升高(pND6，大約1.2倍；pND10，大約1.5倍或更高；pND20，大約2倍或更高)。使用pND6，則在培養早期的第4天，幾乎沒觀測到超耐熱蛋白酶PFUS的表達。在培養晚期的第10天，所述表達水平則高于使用pSPO124ΔC所觀測到的表達水平。
至于用以觀測到超耐熱蛋白酶PFUS表達的質粒，在表4中顯示了按天計算的達到超耐熱蛋白酶PFUS最高表達水平的培養期和生產力以及啟動子所來源的基因名稱。表4中的生產力以每升培養基中的mg量來表示。
表4
正如從表4中所看到的，與pSPO124ΔC的結果相比，使用pND6、pND10和pND20，則在較短的培養期(以天計算)內生產出較大量的超耐熱蛋白酶PFUS。
實施例5用穩定期特異性表達載體生產堿性蛋白酶、硝基苯磷酸酶、吡咯烷酮羧肽酶和甲硫氨酰氨肽酶(1)載體的制備通過PCR，擴增除去了作為報道基因的蛋白酶PFUS基因的區域，即擴增包含啟動子區、SD序列、分泌信號以及所述載體的區域。在所述PCR中，使用引物NDF1(SEQ ID NO23)與NDR1(SEQ ID NO24)，而且使用上面實施例3中構建的質粒pND1、pND6、pND10、pND19和pND23中的一種或pSPO124ΔC(對照)作為模板。用限制性內切酶SpeI和MluI(兩者都得自Takara Shuzo)消化所擴增的片段，并將其純化。在下面，將這些片段用作載體片段。
(2)報道基因的制備及表達載體的構建(i)堿性蛋白酶基因從National Institute of Technology and Evaluation得到含有來自超級嗜熱菌Aeropyrum pernix K1的堿性蛋白酶基因的質粒A2GR7310。通過用所述質粒作為模板以及用引物AP1F1(SEQ ID NO25)與AP1R1(SEQ ID NO26)進行PCR，來擴增編碼堿性蛋白酶的區域。用限制性內切酶SpeI和MluI(兩者都得自Takara Shuzo)消化所擴增的片段，并將其純化。在下面，將這片段用作報道基因片段。
在SEQ ID NO33中，顯示了來自A.pernix、用作報道基因的堿性蛋白酶基因的核苷酸序列。
通過將報道基因片段分別連接到來源于pND6、pND10和pSPO124ΔC的載體片段上而獲得的重組質粒(表達載體)，則相應地被稱為pND6A1、pND10A1和pSPOA1。
(ii)硝基苯磷酸酶基因從National Institute of Technology and Evaluation得到含有來自超級嗜熱菌Aeropyrum pernix K1的硝基苯磷酸酶基因的質粒A2GR0030。通過用所述質粒作為模板以及用引物AP7F1(SEQ IDNO27)與AP7R1(SEQ ID NO28)進行PCR，來擴增編碼硝基苯磷酸酶的區域。用限制性內切酶SpeI和MluI(兩者都得自Takara Shuzo)消化所擴增的片段，并將其純化。在下面，將這片段用作報道基因片段。
在SEQ ID NO34中，顯示了來自A.pernix的、被用作報道基因的硝基苯磷酸酶基因的核苷酸序列。
通過將所述報道基因片段分別連接到來源于pND10、pND23和pSPO124ΔC的載體片段上而獲得的重組質粒(表達載體)，則相應地被稱為pND10A7、pND23A7和pSPOA7。
(iii)吡咯烷酮羧肽酶基因從National Institute of Technology and Evaluation獲得含有來自超級嗜熱菌Pyrococcus horikoshii OT3的吡咯烷酮羧肽酶基因的質粒2708。通過用所述質粒作為模板以及用引物PH1F1(SEQ ID NO29)與PH1R1(SEQ ID NO30)進行PCR，來擴增編碼吡咯烷酮羧肽酶的區域。用限制性內切酶SpeI和MluI(兩者都得自Takara Shuzo)消化所擴增的片段，并將其純化。在下面，將這片段用作報道基因片段。
在SEQ ID NO35中，顯示了來自P.horikoshii的、被用作報道基因的吡咯烷酮羧肽酶基因的核苷酸序列。
通過將所述報道基因片段分別連接到來源于pND10、pND19和pSPO124ΔC的載體片段上而獲得的重組質粒(表達載體)，則相應地被稱為pND10P1、pND19P1和pSPOP1。
(iv)甲硫氨酰氨肽酶基因從National Institute of Technology and Evaluation獲得一種來自超級嗜熱菌Pyrococcus horikoshii OT3的甲硫氨酰氨肽酶基因的PCR擴增片段PH0628PCR。通過用所述片段作為模板以及用引物PH2F1(SEQID NO31)與PH2R1(SEQ ID NO32)進行PCR，來擴增編碼甲硫氨酰氨肽酶的區域。用限制性內切酶SpeI和MluI(兩者都得自Takara Shuzo)消化所擴增的片段，并將其純化。在下面，將這一片段用作報道基因片段。
在SEQ ID NO36中，顯示了來自P.horikoshii的、被用作報道基因的甲硫氨酰氨肽酶基因的核苷酸序列。
通過將所述報道基因片段分別連接到來源于pND1、pND19和pSPO124ΔC的載體片段上而獲得的重組質粒(表達載體)，則相應地被稱為pND1P2、pND19P2和pSPOP2。
(3)轉化子的制備及報道基因的表達用在實施例5-(2)中構建的各種表達載體，轉化枯草芽孢桿菌DB104。將轉化的細胞涂布在含有1％脫脂乳和10μg/ml卡那霉素的LB平板上。在37℃保溫所述平板達16小時。
從所產生的卡那霉素抗性轉化子中，選擇出其中插入了編碼所述酶的基因之一的克隆；并在37℃于1ml含有10μg/ml卡那霉素的TKRBS1培養基中培養。將培養10天(在堿性蛋白酶的情況下只培養7天)后收集的培養物于95℃加熱30分鐘，并離心收集上清液。將所述上清液用作粗酶溶液(酶制劑)。
(4)活性的測定(i)堿性蛋白酶用明膠(Nacalai Tesque)作為底物，如下測定堿性蛋白酶的活性。
用50mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)適當地稀釋準備測定酶活性的酶制劑。使所述稀釋液與SDS-PAGE加樣緩沖液混合。讓所述混合物于室溫靜置30分鐘或更長時間，然后，使其在含有SDS和0.05％明膠的10％聚丙烯酰胺凝膠上電泳。電泳后，用50mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)洗滌所述凝膠。使經洗滌的凝膠在95℃于50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中保溫達3小時。然后，在冰上冷卻所述反應混合物以終止反應。用考馬斯藍使所述凝膠著色。運用圖像分析軟件Adobe Photoshop(Adobe)，將所述凝膠的圖像轉變成圖像文件；且使用NIH圖像軟件，用數字來表示活性信號。
(ii)硝基苯磷酸酶用對硝基苯磷酸(Sigma)作為底物，如下測定硝基苯磷酸酶的活性。
用含有1mM ZnCl2的100mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)，適當地稀釋準備測定酶活性的酶制劑。將50μl在含有1mM ZnCl2的100mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)中含有濃度2mM的對硝基苯磷酸的溶液加到50μl樣品溶液中。使所述混合物在95℃反應10分鐘。然后，在冰上冷卻所述反應混合物以終止反應。用Piper Phosphate Assay Kit(試劑盒)(Molecular Probe)，通過測量由于544nm的激發而產生的590nm的熒光發射，來測定所產生的游離磷酸的量。
(iii)吡咯烷酮羧肽酶用焦谷氨酸4-甲基-香豆滿基(coumaryl)-7-酰胺(在下文稱之為Pyr-MCA；Peptide Institute)作為底物，如下測定吡咯烷酮羧肽酶的活性。
用含有10mM DTT與1mM EDTA的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)，適當地稀釋準備測定酶活性的酶制劑。將50μl在含有10mM DTT與1mM EDTA的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中含有濃度0.2mM的Pyr-MCA的溶液加到50μl樣品溶液中。使所述混合物在95℃反應30分鐘；然后，在冰上冷卻所述反應混合物以終止反應。通過測量由于355nm的激發而導致的460nm的熒光發射，來測定所產生的MCA的量。
將所述酶的一個單位定義為在95℃1分鐘內產生1μmol的MCA的酶量。
(iv)甲硫氨酰氨肽酶用Met-Ala-Ser(Bachem)作為底物，如下測定甲硫氨酰氨肽酶的活性。
用含有0.5mM CoCl2的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)，適當地稀釋準備測定酶活性的酶制劑。將45μl在含有0.5mM CoCl2的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)中含有濃度1mM的Met-Ala-Ser的溶液加到5μl樣品溶液中。使所述混合物在75℃反應5分鐘。然后，在冰上冷卻所述反應混合物，并向其中加入10μl 100mM的EDTA而終止所述反應。向所述混合物中加入50μl的混合物A(含有0.18mg/ml L-氨基酸氧化酶、50μg/ml過氧化物酶和0.18mg/ml鄰聯二茴香胺的100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5))。使所述混合物在37℃反應10分鐘。然后，在冰上冷卻所述反應混合物以終止反應。測定在450nm的吸光度。
(5)生產能力的比較根據如實施例5-(4)中所述而測定的酶制劑的酶活性，來計算培養物中所包含的總的酶活性。
將使用具有aprE基因啟動子的表達載體(pSPOA1、pSPOA7、pSPOP1或pSPOP2)所觀測到的表達水平規定為1。在表5中顯示了各種表達載體的相對表達水平。
表5報道基因 載體啟動子 相對表達水平A.pernix pND6A1 spoIIB 6.16堿性蛋白酶 pND10A1 ybcO23.8pSPOA1 aprE1.00A.pernix pND10A7 ybcO2.29硝基苯磷酸酶 pND23A7 yrzE1.68pSPOA7 aprE1.00P.horikoshii pND10P1 ybcO1.43吡咯烷酮羧肽酶 pND19P1 yjdB3.73pSPOP1 aprE1.00P.horikoshii pND1P2 acoA1.81甲硫氨酰氨肽酶 pND19P2 yjdB1.98pSPOP2 aprE1.00
工業應用性本發明提供無需誘導基因表達而能夠以穩定期特異性方式高水平表達基因的啟動子。
序列表的獨立文本SEQ ID NO1pND1上的啟動子區。
SEQ ID NO2pND6上的啟動子區。
SEQ ID NO3pND10上的啟動子區。
SEQ ID NO4pND19上的啟動子區。
SEQ ID NO5pND20上的啟動子區。
SEQ ID NO6pND23上的啟動子區。
SEQ ID NO7用于擴增acoA基因的啟動子序列的引物aAF1。
SEQ ID NO8用于擴增acoA基因的啟動子序列的引物aAR1。
SEQ ID NO9用于擴增spoIIB基因的啟動子序列的引物spBF1。
SEQ ID NO10擴增spoIIB基因的啟動子序列的引物spBR1。
SEQ ID NO11用于擴增ybcO基因的啟動子序列的引物ybOF1。
SEQ ID NO12用于擴增ybcO基因的啟動子序列的引物ybOR1。
SEQ ID NO13用于擴增yjdB基因的啟動子序列的引物ykBF1。
SEQ ID NO14用于擴增yjdB基因的啟動子序列的引物yjBR1。
SEQ ID NO15用于擴增yngJ基因的啟動子序列的引物ynJF1。
SEQ ID NO16用于擴增yngJ基因的啟動子序列的引物ynJR1。
SEQ ID NO17用于擴增yrzE基因的啟動子序列的引物yrEF1。
SEQ ID NO18用于擴增yrzE基因的啟動子序列的引物yrER1。
SEQ ID NO19引物PLF1。
SEQ ID NO20引物PLR1。
SEQ ID NO21引物UBF1。
SEQ ID NO22引物SBPR1。
SEQ ID NO23引物NDF1。
SEQ ID NO24引物NDR1。
SEQ ID NO25用于擴增堿性蛋白酶基因編碼區的引物AP1F1。
SEQ ID NO26用于擴增堿性蛋白酶基因編碼區的引物AP1R1。
SEQ ID NO27擴增硝基苯磷酸酶基因編碼區的引物AP7F1。
SEQ ID NO28擴增硝基苯磷酸酶基因編碼區的引物AP7R1。
SEQ ID NO29擴增吡咯烷酮羧肽酶基因編碼區的引物PH1F1。
SEQ ID NO30擴增吡咯烷酮羧肽酶基因編碼區的引物PH1R1。
SEQ ID NO31擴增甲硫氨酰氨肽酶基因編碼區的引物PH2F1。
SEQ ID NO32擴增甲硫氨酰氨肽酶基因編碼區的引物PH2R1。
序列表<110>寶酒造株式會社(Takara Shuzo Co.，Ltd.)<120>啟動子<130>663087<150>JP 2001-72802<151>2001-03-14<160>36<170>Patentln Ver.2.1<210>1<211>180<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pND1上的啟動子區序列。
<400>1gtcaaaggcc gggtgatatc cggtcttttt tttgcatgct gtaaaacgag acaaatgaat 60cagtttgaga caaaacgaga cacacgtctc aaactgtctc caaagtgaag atgagaagac 120tgattttacg ggctcaaaag actggcacac ttcttgcatt tataatggtg aaccctaaat 180<210>2<211>190<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pND6上的啟動子區序列。
<400>2ccgcagggag cattttagcc tatttatacg gtgactctat catttctttt tatatcaaaa 60tggcattggg ctgactgctg aaaaatttga cgaacgtttt ttggacaagg cgacaaaagt 120cttgttcttt ttttctttgc ctgtgctaaa gtgtgtagca tgaaaagccg acaagaacgg 180tcaagcaaat190
<210>3<211>180<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pND10上的啟動子區序列。
<400>3ctgtttttct cgagaggata gcttgtcagc ttttctattt ttaaagggtt aaaatattct 60atttatacta attaatgtaa tttttaggat aatatacaaa atccccctta cttcgacaat 120tgcaatctgg tattatcgta tcgcatggga gctatgtcaa tagactctat gcaaaaattg 180<210>4<211>184<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pND19上的啟動子區序列。
<400>4tgctattaac attttaagga tggccattct ctctcagcaa ttttccatca taaatacaaa 60ctctgtgcag ggcacacaat attcttagct caaatcaatt gatcgttcac atattattaa 120catttattta caaggaaaat aattactttt attgaattgt tatagtgcaa gacaaaaaac 180ttta 184<210>5<211>180<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pND20上的啟動子區序列。
<400>5ttcccggctt tatcaaaggg ccaagttatt gcgtttacga tatggatggt atgcgcctac 60tgcatgtatt tgctcatccc gctgatatta tcacataaaa aatgattcag ttttaatttt 120cagacttttc ttgtcaggga atgattatag aactcgccta ataggatgtt acaaagatgt 180<210>6
<211>180<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pND23上的啟動子區序列。
<400>6tgaccaatat cacaaaatac aatacgactg tgcgaaacgc aatagtgaga agctcttcca 60ttatgcacct ccaactcatt ataggttgca acaaaatgat caatttatgt aagaaaaacc 120gattgcattt cacaaagctt ttacgtctaa ttcatgggat aagggaatac atttttacaa 180<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物aAF1的序列，用于擴增acoA基因的啟動子序列。
<400>7gggggaattc gtcaaaggcc gggtgata 28<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物aAR1的序列，用于擴增acoA基因的啟動子序列。
<400>8ggggggtacc atttagggtt caccatta28<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物spBF1的序列，用于擴增spo11B基因的啟動子序列。
<400>9gggggaattc ccgcagggag cattttag28<210>10<211>28<212>DNA<213>人T序列<220>
<223>人工序列的描述引物spBR1的序列，用于擴增spollB基因的啟動子序列。
<400>10ggggggtacc atttgcttga ccgttgtt28<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物yb0F1的序列，用于擴增ybc0基因的啟動子序列。
<400>11gggggaattc ctgtttttct cgagagga28<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物yb0R1的序列，用于擴增ybc0基因的啟動子序列。
<400>12ggggggtacc caatttttgc atagagtc28<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物yjBF1的序列，用于擴增yjdB基因的啟動子序列。
<400>13gggggaattc tgctattaac attttaag 28<210>14<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物yjBR1的序列，用于擴增yjdB基因的啟動子序列。
<400>14ggggggtacc taaagttttt tgtcttgc 28<210>15<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物ynJF1的序列，用于擴增yngJ基因的啟動子序列。
<400>15gggggaattc ttcccggctt tatcaaag 28<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物ynJR1的序列，用于擴增yngJ基因的啟動子序列。
<400>16ggggggtacc acatctttgt aacatcct 28<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物yrEF1的序列，用于擴增yrzE基因的啟動子序列。
<400>17gggggaattc tgaccaatat cacaaaat 28<210>18<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物yrER1的序列，用于擴增yrzE基因的啟動子序列。
<400>18ggggggtacc ttgtaaaaat gtattccc 28<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物PLF1的序列。
<400>19ggggggtacc caaaaggaga gggggatccg 30<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物PLR1的序列。
<400>20gggggaattc ttaggaacgt acagacggc29<210>21<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物UBF1的序列。
<400>21aaaggctttt aagccgtctg 20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物SBPR1的序列。
<400>22cctgcgcaga catgttgctg 20<210>23<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物NDF1的序列。
<400>23ggtgacgcgt aagctttaat gcggtagtt29<210>24<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物NDR1的序列。
<400>24ggggactagt cctccggcag cctgcgcag29
<210>25<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物AP1F1的序列，用于擴增堿性蛋白酶基因的編碼區。
<400>25gaggactagt ggtcgctgta gtaactgg 28<210>26<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物AP1R1的序列，用于擴增堿性蛋白酶基因的編碼區。
<400>26ggggacgcgt cagcttgaga cggcagtc 28<210>27<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物AP7F1的序列，用于擴增硝基苯基磷酸酶基因的編碼區。
<400>27gaggactagt gtttgcggat ctagacggcg tgata 35<210>28<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物AP7R1的序列，用于擴增硝基苯基磷酸酶基因的編碼區。
<400>28ggggacgcgt cacccccctc tgcagaactc gctga 35<210>29<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物PH1F1的序列，用于擴增吡咯烷酮羧肽酶基因的編碼區。
<400>29gaggactagt gaagatctta ttgactgg 28<210>30<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物PH1R1的序列，用于擴增吡咯烷酮羧肽酶基因的編碼區。
<400>30ggggacgcgt cacctgagtt gtgatgaatg 30<210>31<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物PH2F1的序列，用于擴增甲硫氨酰氨肽酶基因的編碼區。
<400>31gaggactagt ggatgttgac aagcttattg 30<210>32<211>30
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物PH2R1的序列，用于擴增甲硫氨酰氨肽酶基因的編碼區。
<400>32ggggacgcgt cattccgttg ttacagtcac 30<210>33<211>1323<212>DNA<213>Aeropyrum pernix<400>33gtggtcgctg tagtaactgg tgtaattcag gtgggaacta agatcgcggc tattgcgatc 60gcgctgatct tcattctgcc tctcttccct gtttatacgg gatcggcggc tggggctagc 120acggttgtga tagctaagat taatcctgag gagtttaacc ctaaggcggt ggaggctctt 180cagggcaagg taatatatgt tgctgatctg gcccccgttg ctataattag cataccagga 240aaggctgtag gcctgctctc taaactacct ggtgttgtca gcgtttccga ggacggcgtg 300gtccaggcta tggccaagcc gccgtgggct ggcggcggga ataagtctca gcctgccgag 360gtcctgcctt ggggtgtcga ctatatcgat gccgagctag tatggcccga tggggttacc 420ggctgggttg acgttaacgg tgacggggac ggcgagatag aggttgccgt tattgacact 480ggtgtcgata aggaccatcc cgaccttgca ggcaacattg tctgggggat atctgttttg 540aacggcagga tatcctccaa ctaccaggat agaaacggcc acggtacaca cgtaacgggc 600actgtagccg ccatagacaa cgatataggg gtgatagggg ttgcacacag cgtggagatc 660tacgccgtta aagctctcgg taacgggggt tacggcagct ggagcgacct tataatagct 720atagaccttg ctgtgaaggg gccggacggc gtaattgacg ctgatggaga tggcgtcgtc 780gctggggatc cagacgatga tgctccagag gttatctcca tgagcctagg tgggagcagc 840ccaccaccag aactccacga cgttatcaag gcggcgtaca accttggaat aactattgtc 900gcagcagcgg gtaacgacgg ggcggacagc ccctcatacc ctgcagccta ccctgaggta 960atagcggtag gcgctataga cgagaacggc aacgtaccta gctggagcaa tagaaaccct 1020gaggttgctg cacctggagt gaacatacta agcacctacc ccgacgatac ctatgaggag 1080ctgagcggca ctagcatggc gactccacac gtgtcaggga ctgtggctct aatacaggct 1140gccaggctgg ccgctggcct ccctctactc cctccgggaa gcgagagtga cactactcca 1200gacaccgtga ggggcgtact gcatactact gctactgacg cgggagaccc aggctacgat 1260agcctgtatg gatacggtat catagacgcc tatgacgccg tgcagactgc cgtctcaagc 1320tga1323<210>34
<211>768<212>DNA<213>Aeropyrum pernix<400>34gtgtttgcgg atctagacgg cgtgatatgg cttgggcagg aacctataga ggataaccta 60gtagtgctta ggactctggc gagcgagggt aggcttgtgg ttctcactaa taattcgacg 120cgaagtagga gagtttacgc ggctatgctc gagagggtgg gcctcgacat agagcccggg 180aggatagtaa cgagcgccta cagcgccgcc gtcctgctga agaaaaagct gggaccatcc 240accgccctgg ttgtagggga ggaggggctg gttgaagagc ttgctgtgga gggccatgta 300gtggcgagct cgagcgacaa catcgacgtt gatgcggtgg tcgtcggcct cgacaggaac 360ctcacctatg ggaagctggc gagggctgcc tccgcaatac acagcgggag ccttttcgtg 420gcgacgaacc tcgaccacgc cctaccaacc cccagaggcc tcataccagg tgcaggatcc 480attgtggctc ttctggagaa ggcaacgggg gtcaagcctg cgattgtcgc tgggaagccg 540tccaggggct tggccgaggt tctagagagc cttttcaagc cggtcaggcc cctcgtggtg 600ggtgatagga tagatactga cgtggagttc gccagggcct ggggtgttga ttctcttctc 660gtgctcactg gcctctacag gggtgtcagc atagaggagg cttctaggaa ggctggggag 720ggggtgaggg ttgccaggag tctcagcgag ttctgcagag gggggtag 768<210>35<211>621<212>DNA<213>Pyrococcus horikoshii<400>35atgaagatct tattgactgg ctttgagccc tttggaggtg acgataagaa tcccactatg 60gatatagttg aagctctaag cgaaaggata cctgaggtcg ttggggagat actacccgta 120tccttcaaga gggctagaga aaagctcctc aaggtacttg acgatgttag gccagatata 180accataaacc tgggcttggc cccaggaaga acgcacatat ccgttgagag agtagccgtg 240aacatgatag atgcgaggat tccggataat gatggagagc aaccgaagga tgaacccata 300gtcgagggag gacctgcagc ttattttgca acaataccca ctagggagat agtcgaagag 360atgaagaaga acggcattcc agcggttctc tcttacacgg ctggaactta tctctgcaat 420ttcgccatgt atttaacctt acacacatca gctaccaagg gatatcccaa gattgctggc 480ttcatacacg ttccctacac tccggatcaa gtcctggaga aaaagaatac tccgagcatg 540tctctagatt tagaaataaa gggagtggag atagcaataa gggttgctca gagcgcgcta 600cattcatcac aactcaggta g621<210>36<211>888<212>DNA<213>Pyrococcus horikoshii
<400>36atggatgttg acaagcttat tgaagccggt aaaatagcta aaaaggttag agaagaagcc 60gttaaacttg caaagccagg agtttcgctc ttggaactgg cagagaaaat tgagagtaga 120atagttgaac ttggaggtaa gccagctttt ccggcaaacc tttccctaaa tgaggtcgct 180gcccactaca ctccttacaa gggagatcaa actgttctca aagagggaga ctatctaaag 240atagatttgg gagttcatat agatggatac atagctgata ctgctgtaac cgttagggtt 300ggaatggatt ttgatgaact tatggaagct gctaaagaag ccctggaaag cgcaatttca 360gttgcaaggg ccggtgtcga agttaaagaa ctcgggaaag caatagaaaa tgaaattagg 420aagagaggct ttaaccccat tgtaaacctt agtgggcata aaatagagag gtacaagctt 480catgctgggg taagcatccc caatatctac agaccccacg ataactatgt cctccaggaa 540ggagatgtct ttgcaataga accctttgca acaacgggtg cggggcaagt tatagaagtt 600ccccccacgt taatatacat gtacgtcagg gatgccccag tcaggatggc ccaagccagg 660tttctgcttg ctaagataaa gagggagtac aagacacttc cctttgctta taggtggttg 720caaggagaga tgcccgaagg gcagttaaaa ctagccttaa gatccctgga gagatccggg 780gccttgtacg gttaccctgt gctaagggag ataaggggag gaatggtcac gcagttcgag 840catacaataa tagttgaaaa agactccgtg actgtaacaa cggaatga 888
權利要求
1.一種分離的DNA，所述分離的DNA選自(a)具有SEQ ID NO1-6中的任何一種的核苷酸序列且在革蘭氏陽性細菌中以穩定期特異性方式顯示出啟動子活性的分離的DNA或其片段，和(b)在嚴謹性條件下可與(a)的DNA或其片段雜交且在革蘭氏陽性細菌中以穩定期特異性方式顯示出啟動子活性的分離的DNA。
2.按照權利要求1的分離的DNA，所述分離的DNA在被置于外源基因的上游時，能夠以穩定期特異性方式使所述外源基因表達。
3.一種重組DNA，其中由權利要求1限定的DNA和外源基因的配置使得所述外源基因可以表達。
4.按照權利要求3的重組DNA，其中所述外源基因為選自編碼蛋白質的核酸、編碼反義RNA的核酸以及編碼核酶的核酸的核酸。
5.一種基因表達用載體，所述載體包含由權利要求1限定的DNA。
6.按照權利要求5的基因表達用載體，其中所述載體是選自質粒載體、噬菌體載體和病毒載體的一種載體。
7.一種表達載體，所述表達載體包含由權利要求3限定的重組DNA。
8.按照權利要求7的表達載體，其中所述載體是選自質粒載體、噬菌體載體和病毒載體的一種載體。
9.一種轉化細胞，所述轉化細胞含有由權利要求3限定的重組DNA或由權利要求7限定的表達載體。
10.一種用于生產蛋白質的方法，所述方法包括培養由權利要求9限定的轉化細胞；并且從所產生的培養物中收集蛋白質。
11.一種用于生產蛋白質的試劑盒，所述試劑盒含有由權利要求1限定的DNA或由權利要求5限定的表達基因用載體。
全文摘要
分離的DNA，所述分離的DNA是具有由序列表中SEQ ID NO1－6中的任何一種表示的堿基序列或其片段、且在革蘭氏陽性細菌中顯示出穩定期特異性啟動子活性的DNA。
文檔編號C12N1/15GK1507490SQ0280973
公開日2004年6月23日 申請日期2002年3月13日 優先權日2001年3月14日
發明者下條智子, 高藏晃, 落合一賴, 淺田起代藏, 加滕郁之進, 之進, 代藏, 賴 申請人:寶生物工程株式會社