用于特異地檢測金黃色葡萄球菌的培養基和使用這種培養基進行鑒定和/或計數的方法

專利名稱：用于特異地檢測金黃色葡萄球菌的培養基和使用這種培養基進行鑒定和/或計數的方法
描述本發明涉及用于特異地檢測金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和/或用于區別凝固酶陽性葡萄球菌與凝固酶陰性葡萄球菌的培養基，這使得可能分離葡萄球菌屬的細菌和鑒定金黃色葡萄球菌種，該培養基使用至少一種酶底物。本發明還涉及用于鑒定和可選擇地計數金黃色葡萄球菌的方法，該方法使用這樣的培養基。
在1999年，葡萄球菌屬包括43個種和亞種，在人類中發現有其中的17種。這些種的大部分在人中是機會致病菌，其在發生由于創傷或醫療產品的直接植入的皮膚損傷時顯示出高風險。此外，金黃色葡萄球菌種是經常在一些患者中發現的細菌，這些患者必須接受包括裝置如注射器或導管在內的醫院治療。因此檢測這種日益與醫院疾病有關的病原菌的存在具有極大的價值。
在葡萄球菌中，金黃色葡萄球菌毫無疑問地是最有毒力的種，因為其產生大量的細胞外酶和毒素。它可能是許多病理病癥的原因，這些病癥從簡單的瘭疽至最嚴重的感染如敗血癥、心內膜炎、肺病或骨關節感染，這些病癥的預后不是非常樂觀的。
另外，只有5個種(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)和人葡萄球菌(Staphylococcushominis))代表了至少1％的在臨床中心分離得到的病原菌株，它們獨自地代表了超過98％的最通常遇到的葡萄球菌菌株。其他種很少遇到而且相對無病原性。
在細菌學中，常規的是將這些以產生凝固酶為特征的金黃色葡萄球菌種與其他“凝固酶陰性”種進行對比。
常規的用于區分金黃色葡萄球菌與非金黃色葡萄球菌的葡萄球菌的方法是基于搜索游離的凝固酶和DNA酶，和基于獲得旨在證明存在血纖蛋白原親和因子、A蛋白和莢膜抗原的乳膠上的凝集作用。
應當注意到其他具有潛在病原性的葡萄球菌菌種能夠表達凝固酶。
凝固酶陽性種如下金黃色葡萄球菌、中間葡萄球菌(Staphylococcus intermedius)、豬葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、海豚葡萄球菌(Staphylococcus delphinis)、水獺葡萄球菌(Staphylococcus lutrae)和施氏葡萄球菌(Staphylococcus schleiferi)。
存在有用于在選擇性培養基上進行培養以評測金黃色葡萄球菌的存在的技術。它們為下列培養基·Chapman高鹽培養基(含有75％的NaCl)通常對于金黃色葡萄球菌和水解甘露醇的葡萄球菌具有選擇性。這些細菌使得培養基由紅色變成黃色。特別地，一些微生物和D組腸球菌(Enterococcus)能夠在該培養基上產生同樣的反應；因此檢定過氧化氫酶是必需的(對于鏈球菌(Streptococcus)是陰性的)。
·Baird Parker培養基(含有亞碲酸鉀和氯化鋰作為選擇劑)用于分離和計數食品中凝固酶陽性葡萄球菌，其使得可能證明凝固酶的活性。在該培養基上，金黃色葡萄球菌和其他凝固酶陽性種的菌落顯示出黑色的中心，周圍環繞不透明的環。其他微生物能夠在該培養基上生長。這主要包括下列類群革蘭氏陽性球菌腸球菌屬和李斯特氏菌(Listeria)屬的，革蘭氏陰性桿菌變形菌(Proteus)屬和假單胞菌(Pseudomonas)屬的。
事實上，使用Chapman高鹽培養基技術的金黃色葡萄球菌的檢測缺乏靈敏度(當菌種以低數量存在于待測試生物樣品中時證實所尋找的該菌種的能力)和尤其缺乏特異性(在含有其他菌種的待測試生物樣品中檢測所尋找的菌種的能力)。
類似地，使用Baird-Parker培養基技術的金黃色葡萄球菌的檢測缺乏靈敏度和特異性。因此，某些不屬于金黃色葡萄球菌種的菌株(尤其是施氏葡萄球菌和腐生葡萄球菌)也能夠給出周圍環繞發亮暈圈的菌落。也有可能的是，一些金黃色葡萄球菌的菌株不表達所尋找的酶活性或者不在培養基上生長，因為它們可能以太少的數量存在于生物樣品中和/或它們可能被培養基中具有太大選擇性的成分抑制。
因此，可以理解用Baird-Parker和Chapman培養基的檢測只能給出推測的診斷并需要其他測試來確認。目前，對于鑒定金黃色葡萄球菌所需的附加的處理增加了分析的持續時間和成本。其需要眾多的試劑和具有相關資格的人員的參與。
也可能使用基于葡糖苷酶的底物，其使得可能依賴所使用的分子的構型來檢測α-葡糖苷酶活性或者β-葡糖苷酶活性。
使用α-葡糖苷來鑒定各種葡萄球菌菌種是已經知道的。可是，研究由各種葡萄球菌菌種引起的這些糖的酸化通常不會允許金黃色葡萄球菌的簡單鑒定，因為其不夠特異(例如在麥芽糖、松二糖、蔗糖、海藻糖的情況下)或者不夠靈敏(例如在甲基-α-葡糖苷、棉子糖、松二糖的情況下)(Bascomb S.和Manafi M.1998，酶測試在需氧和兼性厭氧革蘭氏陽性球菌的表征和鑒定中的用途(Use of enzyme tests incharacterization and identification of aerobic and facultativelyanaerobic Gram positive cocci)，Clin.Microbiolo1.Rev.11318-340)(Kloos WE.等人1982，使用API Staph-IDENT的葡萄球菌菌種的鑒定(Identification of Staphylococcus Species with the API Staph-IDENT)，System.J.Clin.Microbiol.16(3)509-516)。這種事態不會傾向于鼓勵研究科學家們在這種類型的α-葡糖苷酶活性上繼續工作。
另一方面，近來的出版物提到用β-葡糖苷酶活性進行工作的優點。這例如為專利EP-B-0.741.797的案例，其描述了在選擇性培養基上區分葡萄球菌屬的細菌和其他細菌的方法，該方法使用兩個基于吲哚氧基的生色底物，這使得可能檢測葡萄球菌的磷酸酶活性和其他細菌屬的β-葡糖苷酶活性。
與凝膠培養基上葡萄球菌的檢測相比較，根據那個專利只可能區分葡萄球菌和其他屬的細菌，而我們的發明能夠區別金黃色葡萄球菌和其他葡萄球菌屬的細菌。
在Gaillot O.等人的文章“用于從人臨床樣品中分離和推測鑒定金黃色葡萄球菌的新型生色培養基CHROMagar Staph.aureus的評測”(Evaluation of CHROMagar Staph.aureus，a new chromogenicmedium，for isolation and presumptive identification ofStaphylococcus aureus from human clinical specimens)(2000，J.Clin.Microbio1.38，4，1587-1591)中，描述和評測了一種用于分離葡萄球菌和鑒定金黃色葡萄球菌的的生色培養基CHROMagar(商標)Staph.aureus，其使用使得金黃色葡萄球菌顯示紫色的生色底物。理論上，隨后檢測同一屬的其他種時，它們顯示藍色或無色。這種用途基本上是由β-葡糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、β-半乳糖苷酶和磷酸酶活性形成的，還有抑制劑去鐵胺(Deferoxamine)，其使得可能區分金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。此外，在此專題上已經申請了一個專利申請WO-A-00/53799。那個專利申請提出一個用于檢測金黃色葡萄球菌的培養基，其結合了至少下列兩種在上述專利申請EP-B-0.741.797中已經描述過的生色劑·5-溴-6-氯-3-吲哚氧基磷酸酯，磷酸酶活性，和·5-溴-4-氯-3-吲哚氧基葡糖苷，β-葡糖苷酶活性。
實際上，該新的文獻簡單地和本質上向色素原中添加了稱為去鐵胺的生長抑制劑。該去鐵胺使得可能更清楚地區別金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。目前，去鐵胺作為表皮葡萄球菌的生長抑制劑已經是熟知的，但不是對于其他葡萄球菌菌種(Lindsay J.A.，Aravena-romanM.A.，Riley T.V.，通過測試對于去鐵胺的敏感性來鑒定來自血液培養物的表皮葡萄球菌和人葡萄球菌(Identification of Staphylococcusepidermidis and Staphylococcus hominis from blood cultures by testingsusceptibility to desferrioxamine)，European J.of Clin.Microbiol.etInf.Diseases，1993，12卷，127-131頁)。
與CHROMagar(商標)Staph.aureus培養基相比較，我們的培養基使得可能更容易地區分金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，這兩個種在CHROMagar(商標)培養基上產生具有同樣顏色的菌落。這是由于磷酸酶底物缺乏特異性造成的，其對于金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是陽性的，還由于去鐵胺對于表皮葡萄球菌的抑制只是部分的這一事實。
應當注意到，根據我們的發明只是通過檢測α-葡糖苷酶活性就已經能夠分開金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌，它們是三種臨床分離得到的主要葡萄球菌菌種。
實際上和出乎意料的是，發明者們已證明基于α-葡糖苷的底物能夠形成金黃色葡萄球菌的靈敏而特異的鑒定。特別地，通過選擇操作條件和/或特殊的α-葡糖苷酶底物和/或結合至少第二種能夠限定反應培養基的酶底物，可能的是·區別最常分離到的主要凝固酶陽性葡萄球菌菌種(基本上是金黃色葡萄球菌和中間葡萄球菌)和最常存在的凝固酶陰性葡萄球菌(基本上是表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和腐生葡萄球菌)，和/或·特異地鑒定金黃色葡萄球菌。
例如，在特異性和在本發明的實踐方面中的增進可通過添加至少第二種酶底物來獲得。因此，該增進可通過下列程序來獲得首先，檢測α-葡糖苷酶活性，金黃色葡萄球菌強烈地表達出該活性，而其他葡萄球菌菌種則很弱地表達；其次，檢測由大多數葡萄球菌表達的但不由金黃色葡萄球菌表達的β-葡糖醛酸糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶和/或β-葡糖苷酶活性，這是所使用的底物的功能。這第二個活性使得可能更清楚地區分金黃色葡萄球菌和葡萄球菌屬的其他種。
為了達到這種效果，本發明涉及用于檢測金黃色葡萄球菌和/或凝固酶陽性葡萄球菌的培養基，其含有金黃色葡萄球菌培養基和至少一種用于證明α-葡糖苷酶活性的酶底物。
用于證明α-葡糖苷酶活性的酶底物為生色劑或熒光劑。
根據實施的第一個變化，用于證明α-葡糖苷酶活性的生色劑或熒光劑是基于吲哚氧基或基于傘形酮的，以便能夠進行金黃色葡萄球菌和凝固酶陽性葡萄球菌的檢測。
根據實施的第一個變化，該培養基使用下列生色劑·6-溴-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，·5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，·5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷，·6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，和/或·4-甲基傘形酮-α-D-葡糖苷。
根據實施的第二個變化，用于證明α-葡糖苷酶活性的生色劑為基于萘酚的，以便能夠進行金黃色葡萄球菌的檢測。
根據實施的第二個變化，該培養基使用下列生色劑2-萘基-α-D-吡喃葡糖苷。
根據一個實施方案，培養基使用至少兩種不同的酶底物，優選的為兩種生色劑，一種用于證明α-葡糖苷酶活性，另一種用于檢測糖苷酶(osidase)(β-葡糖苷酶和/或β-葡糖醛酸糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)和/或酯酶(酯酶/脂酶和/或磷酸酶和/或硫酸酯酶)和/或肽酶和/或凝固酶活性。
另外，培養基使用選自下列對的兩種生色劑·5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷聯合5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷，或·5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷聯合6-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷酸，或·6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷聯合5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷酸，或·6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷聯合5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷。
優選地，培養基使用至少一種促進葡萄球菌屬的細菌生長的抑制劑，如氯化鋰(LiCl)、疊氮化鈉(NaN3)、粘菌素、兩性霉素、氨曲南、結腸霉素(colimicin)、氯化鈉(NaCl)或去鐵胺。
根據實施的一個變化，培養基使用抑制劑的混和物，其包括促進葡萄球菌屬的細菌生長的四種抑制劑，這些抑制劑為·LiCl，·O/129，·氨曲南，和·兩性霉素。
根據另一個變化，培養基優選地以100-300mg/L的濃度使用麥芽糖。
本發明也涉及用于在含有至少一個種的細菌的樣品中鑒定一種或多種金黃色葡萄球菌種的細菌的方法，其包括下列步驟·用所有或部分樣品接種如上所述的培養基，和·培育接種的培養基以便產生足夠大小的細菌菌落，從而來觀察該培養基中所使用的并已經反應的每個生色劑的顯色或每個熒光劑的熒光。
該方法也可能計數樣品中一種或多種金黃色葡萄球菌種的細菌；在這種情況下，進行第三個步驟，其為計數由與金黃色葡萄球菌種的細菌相關的顯色或熒光鑒定出的菌落。
實驗1由多種基于吲哚氧基衍生物的生色標記所組成的多種α-葡糖苷酶底物的評測在含有下列物質的基底(base)中制備下面的培養基·每升11克(g/L)的蛋白胨，·0.65g/L的TRIS緩沖液，和·14g/L的瓊脂，同時結合有描述于下面表1中的生色α-葡糖苷酶底物
表1使用的生色α-葡糖苷酶底物的縮寫將α-葡糖苷酶底物以200g/L的濃度溶解在二甲亞砜中。向四個融化的培養基中加入足夠的體積以獲得100mg/L的最終底物濃度。將來源于bioMérieux國際保藏的微生物以0.5 MacFarland的懸浮液接種于每一個培養基上，它們各自接種三個板。可是，用來源于對于公眾可用的保藏(例如ATCC或NCTC)的微生物所獲得的結果能夠給出相同的結果。將培養皿于37℃培育48小時。在24和48小時的培育時間之后用肉眼檢查菌落。注意顯色以及該顯色的強度。
在下面的表2中以及在隨后的表中，C表示培育之后菌落的顯色，I表示顯色的強度，符號“-”與缺乏顏色或強度意義相同，和最后TI表示培育時間。應當注意到，顯色的強度是人為標度，但是其對于測試的所有生物樣品和所有培養基是共同的。這種標度對于該實驗以及對于所有隨后的實驗是有效的。其可以下面的方法來定義·0相應于缺乏活性，·0.1相應于存在微量的顯色，·0.5相應于存在非常淺淡的顯色，·1相應于存在弱強度的清晰顯色，·1.5相應于存在介于顯色1和2中間的顯色，·2相應于存在中等強度的真顯色，·2.5相應于存在介于顯色2和3中間的顯色，·3相應于存在強顯色，·3.5相應于存在介于顯色3和4中間的顯色，·4相應于存在非常強的顯色。
結果給出在下面的表2中
表2由多種基于吲哚氧基衍生物的生色標記所組成的多種α-葡糖苷酶底物的評測對于底物5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，在24小時于葡萄球菌菌株之間獲得了顯色強度的差異，這使得可能鑒定金黃色葡萄球菌和能夠區別金黃色葡萄球菌和葡萄球菌屬的其他種。在48小時，不確定性就可能存在于金黃色葡萄球菌和木糖葡萄球菌之間。
對于其他三種底物，培育時間在下面的意義上沒有影響，即在24小時與在48小時一樣，顯色強度的差異使得可能鑒定金黃色葡萄球菌和能夠將其與葡萄球菌屬的其他種區別開來。
可是，要注意的是，使用三種底物6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷、6-溴-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷時金黃色葡萄球菌菌株和木糖葡萄球菌菌株(凝固酶陰性)之間的強度差異更加顯著，其給出了標記顏色和培養基顏色之間更好的對比，并比5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷更特異。
實驗2通過在凝膠培養基中直接檢測α-葡糖苷酶活性和另一種糖苷酶活性來區分金黃色葡萄球菌和同一屬的種在含有下列物質的基底中制備下面的培養基·每升11克(g/L)的蛋白胨，·0.65g/L的TRIS緩沖液，和·14g/L的瓊脂，同時結合有兩種生色底物，其中一種使得可能檢測α-葡糖苷酶活性。這些復合底物給出在下面的表3中
表3生色α-葡糖苷酶底物和對于其他酶活性特異的生色底物的多種組合的縮寫每個α-葡糖苷酶的原溶液以200g/L在二甲亞砜中制備。向四個融化的培養基中加入足夠的體積以獲得每個α-葡糖苷酶底物100mg/L的最終濃度。同時將足夠體積的上述用于每一個其他糖苷酶活性的底物加入四個培養基中，其濃度依賴于底物為50-200mg/L。將來源于bioMérieux國際保藏的微生物以0.5 MacFarland的懸浮液接種于每一個培養基上，它們各自接種三個板。將培養皿于37℃培育48小時。在24和48小時的培育之后用肉眼檢查形成的菌落。注意顯色以及該顯色的強度。
結果給出在下面的表4中
表2多種底物組合的評測上面的結果顯示出，在測試的所有生色底物對的情況下，培育24小時之后能夠區別金黃色葡萄球菌和其他最通常遇到的種(表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌等等)。
使用顏色的范圍和/或使用顏色強度研究底物對A、B、C和D，它們中的每一個使得可能區別多種葡萄球菌菌種。首先，顯色的差異使得可能明確地檢測出木糖葡萄球菌；其次，對于金黃色葡萄球菌而獲得的最高水平的顏色強度使得可能將其與具有同樣顯色的同一屬的其他種區分開來。
只有中間葡萄球菌種會在使用底物對A時的48小時引起問題；可是，在培育的24小時無不確定性，這更為有利，因為鑒定周期越短培養基越有效。中間葡萄球菌是凝固酶陽性葡萄球菌菌種，不能通過大多數的鑒定方法(尤其是在Chapman、Baird Parker和CHROMagar(商標)Staph aureus培養基上)將其與金黃色葡萄球菌區別開來。
實驗3一種我們的含有實驗2中描述的底物混和物的培養基與商購可得的培養基的比較研究下面用于檢測生物樣品中金黃色葡萄球菌的存在的培養基可以從下列公司獲得·來自CHROMagar公司(巴黎，法國)的CHROMagar Staphaureus培養基(索引號TA600)，和·來自bioMérieux公司(Marcy l’Etoile，法國)的Chapman培養基(索引號43311)和Baird Parker培養基(索引號43521)。
在下面的表5中給出的培養基的縮寫如下·A相應于含有實驗2中描述的混和物A的培養基，·B相應于CHROMagar Staph aureus培養基，其用于分離葡萄球菌和用于通過菌落的桃紅色顯色來鑒定金黃色葡萄球菌種，而其他葡萄球菌菌種給出青綠色或者為無色，·C相應于Chapman培養基，其用于分離金黃色葡萄球菌和水解甘露醇的葡萄球菌，這些細菌將培養基中存在的顏色指示劑從紅色變為黃色，和·D相應于Baird Parker培養基，其用于分離和表征金黃色葡萄球菌，該細菌在24小時內產生具有黑色中心并周圍環繞發亮環帶(稱為暈圈)的特征性菌落，這相當于凝固酶的檢測。
將臨床測試中最通常遇到的屬于12種葡萄球菌菌種的36個菌株在上述培養基中進行測試。將來源于bioMérieux國際保藏的這些微生物以0.5 MacFarland的懸浮液接種于每一個培養基上，它們各自接種三個板。將培養皿于37℃培育48小時。在24和48小時的培育之后用肉眼檢查形成的菌落。根據實施例1中描述的方法和標度標注我們的培養基上和CHROMagar Staph aureus生色培養基上的菌落的顯色。對于讀取Chapman培養基，符號“-”相應于有色指示劑沒有變化，在菌落周圍瓊脂保持紅色(甘露醇-菌株)；符號“+”相應于有色指示劑有變化，在菌落周圍瓊脂變成黃色(甘露醇+菌株)。對于讀取Baird Parker培養基，符號“-”相應于在菌落周圍沒有發亮的暈圈(凝固酶-菌株)；符號“+”相應于在該菌落周圍存在有發亮的暈圈(凝固酶+菌株)。
在下面的表5中，顯色相應于培育之后菌落的顯色；首字母“C.M.”表示培育之后在菌落周圍Chapman培養基的顯色；“暈圈”表示培育之后在菌落周圍Baird Parker培養基的發亮環帶；最后，符號“No”表示根據培養基通過特異性顯色或暈圈來鑒定的每個種的菌株數量。
表5根據本發明的培養基與商購可得的培養基的比較金黃色葡萄球菌的所有菌株在根據本發明的培養基上和在CHROMagar Staph aureus與Chapman培養基上得到了鑒定。另外，中間葡萄球菌(凝固酶陽性種)的菌株在根據本發明的我們的培養基上以及在CHROMagar Staph aureus與Baird Parker培養基上得到了鑒定。結果也顯示出在根據本發明的培養基上和在Baird Parker培養基上沒有鑒定出假陽性。還要注意到，在CHROMagar Staph aureus培養基上和在Chapman高鹽培養基(含有75％的NaCl)上不可能區別金黃色葡萄球菌和某些凝固酶陰性種。因此，進行旨在證明存在該金黃色葡萄球菌的附加測試是必需的。
該實驗證明了根據本發明的方法的特異性和可靠性。
實驗4用含有基于萘酚衍生物的α-葡糖苷酶底物的培養基進行各種操作條件的評測下面的實驗在液體培養基中和在基于萘酚衍生物的生色底物存在的條件下進行。
將培養基和底物分裝入由bioMérieux公司(Marcy l’Etoile，法國)生產的API“galleries”(商標)中。
這些“galleries”構成了用于在微生物中搜尋酶活性的半定量方法，并使得可能快速和同時研究19種酶活性。每個“galleries”包含有20個杯形器，其中分裝有含有酶底物的溶液。這些酶測定通過將65μl 5-6McFarland的細菌懸浮液分裝入每個杯形器中來進行。
每個杯形器的顯色強度在37℃培育4小時之后和在添加下列合適的試劑之后用肉眼進行檢查ZYM A(索引號70470)和ZYM B(索引號70480)，它們可以從上面提到的bioMérieux獲得。顯色強度直接與被酶水解的底物的數量成比例。
然后根據下面的分類在結果表單上給顯色強度的值進行打分分數0相應于陰性反應；分數5相應于最大強度的反應；分數1、2、3和4表明顯色的中間水平，并由此表明酶活性的中間水平。關于該打分的更詳細的信息可以在由同名的“galleries”所提供的API讀取標度中找到。
與實驗1或2中一樣，微生物來源于bioMérieux國際保藏。
尋找的酶活性和相應的萘酚衍生物底物描述于下面的表6中
表6用由萘酚衍生物組成的生色底物所尋找的酶活性的列表酶活性的結果給出在下面的表7中
表7α-葡糖苷酶活性檢測為陽性的金黃色葡萄球菌與其他葡萄球菌菌種相比較的鑒定根據上面表7中的結果，只有用2-萘基-α-D-吡喃葡糖苷底物檢測由金黃色葡萄球菌菌株強烈表達的α-葡糖苷酶活性才使得可能區別該凝固酶陽性種和其他葡萄球菌菌種。對于其他酶活性，金黃色葡萄球菌菌株和其他種的菌株之間的顯色強度差異具有低得多的顯著性，這使得難以區別各種菌種。應當注意到，在基于萘酚的生色底物的情況下，區別凝固酶陽性葡萄球菌如中間葡萄球菌是不可能的。其他葡萄球菌即腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌是凝固酶陰性的。
實驗5使用其他非生色底物如熒光底物的α-葡糖苷酶的檢測下面的培養基在實驗1中描述的培養基基底中配制，但是無瓊脂并存在有熒光底物來替代生色底物。為了強調使用熒光底物來證明凝固酶陽性葡萄球菌菌種的優點，比較了表8中描述的四種熒光底物對于下列酶活性的特異性
表8測試的熒光底物的縮寫將底物溶解在實驗1和2中使用的溶劑中，每個底物的最終濃度為每升培養基200mg。
將各種液體培養基分裝入支持物的杯形器中，支持物有銀行信用卡大小并對于bioMérieux公司的自動化VITEK2(商標)系統是特異的。整合了培育器的VITEK2系統可操作從接種至結果報道的所有步驟。只是0.5McFarland的接種物的制備由操作者使用濁度計來進行，對于每一個菌株直接在對于系統特異的管中進行測試。該自動化系統使得可能在19個小時內以規則的15分鐘間隔通過濁度測定法讀取細菌的生長和通過熒光讀取酶活性。
和實驗1、2和4中一樣，所研究的菌株為bioMérieux國際保藏的一部分。
下面的表9中給出的結果表示以小時計的對于獲得可用儀器測量的熒光最大水平所需的培育時間
表9概括了對于獲得每一個菌株的每種酶活性的熒光最大水平所需要的培養時間結果的分析顯示出，通過用基于傘形酮的熒光底物檢測α-葡糖苷酶活性可能來區別凝固酶陽性種(金黃色葡萄球菌和中間葡萄球菌)和凝固酶陰性種(表皮葡萄球菌、木糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌和溶血葡萄球菌)，它是作為讀取時間的函數的。特別地，α-葡糖苷酶水解4-MU-α-GLU使得可能對于凝固酶陽性葡萄球菌菌株在培育的8小時之前獲得熒光最大水平，對于凝固酶陰性菌株在培育的10小時之后獲得熒光最大水平。
對于所研究的三種其他底物，看來難以區別凝固酶陽性葡萄球菌菌株和凝固酶陰性葡萄球菌如表皮葡萄球菌，因為達到這些菌種的熒光最大水平的時間與凝固酶陽性種給出的時間非常接近，乃至實際上是相同的。
該實施例清楚地舉例說明了用熒光底物檢測α-葡糖苷酶活性的一個優點。
實驗6根據本發明的酶底物與可增進α-葡糖苷酶的檢測的抑制劑的混和物為了進一步增強我們的底物的特異性進行了許多研究。在設想的解決方法中，添加抑制劑導致了相當令人驚訝和特別有利的解決方法。
設想了某些抑制劑的組合，因為沒有抑制劑可以獨自地使葡萄球菌的檢測能夠得到增強。在這些之中，大多數阻止了本領域的技術人員繼續沿著這些線路來尋找解決方法，屬于這種情況的例如·第一個組合是三種抑制劑的組合，即氯化鋰LiCl(2g/L)、兩性霉素(0.005g/L)和氨曲南(0.008g/L)。葡萄球菌的生長非常輕微地受到這三種化合物的影響；另一方面，對于檢測的酶活性(α-葡糖苷酶和β-葡糖醛酸糖苷酶)無影響。
·抑制劑混和物的第二個組成與前述的測試相同，只是LiCl(于3g/L-7g/L變化)和氨曲南(同時于0.008g/L-0.003g/L變化)的濃度同時進行了修改(交叉濃度范圍的制備)。當LiCl的濃度增加時，葡萄球菌的生長減少。對于氨曲南沒有觀察到該影響，濃度的增加沒有干擾細菌的生長。關于酶活性，抑制劑(無論怎樣的濃度)沒有影響α-葡糖苷酶和β-葡糖醛酸糖苷酶的檢測。當抑制劑的濃度增加時，選擇性得到了增強，但是葡萄球菌的繁殖力降低了。
·首先用粘菌素和其次通過增加氨曲南的濃度來完成前述的抑制劑混和物。與向培養基中添加粘菌素一起的該增加基本上不影響葡萄球菌的生長。此外，因為在前述測試中鑒定的臨界種在這些新的條件下被抑制，所以增強了選擇性。在氨曲南存在的情況下α-葡糖苷酶的檢測靈敏度非常輕微地降低了，無論所使用的濃度為多少(0-32mg/L)。
·培養基性能水平、葡萄球菌與非葡萄球菌的繁殖力和酶活性的表達于存在前述測試中定義的抑制劑混和物(LiCl、氨曲南、兩性霉素和粘菌素)的情況下進行了評測，但是是對于更廣泛的菌株樣品進行的評測。向培養基中添加這四種選擇劑只引起了葡萄球菌生長的非常輕微的降低，和總體上沒有影響金黃色葡萄球菌中α-葡糖苷酶的表達水平。另一方面，β-葡糖醛酸糖苷酶活性的檢測/表達在存在這些抑制劑的情況下明顯地改變了。選擇性仍然不是完美的，尤其是關于李斯特氏菌、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumanii)和芽孢桿菌(Bacillus)。
·接著，加入弧菌抑制劑化合物O/129，增加氨曲南的濃度(32mg/L)，從抑制劑混和物中除去粘菌素，和表征β-葡糖苷酶活性。下面的實驗在下列培養基中進行-20.1g/L的蛋白胨，-0.65g/L的Tris緩沖液，-14g/L的瓊脂，-0.125g/L的6-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷，-0.100g/L的5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷，-0.0018g/L的氯化錳，和-4g/L的丙酮酸鈉。
此外，抑制劑的混和物具有下列組分-5g/L的LiCl，-0.010g/L的O/129，-0.032g/L的氨曲南，和-0.005g/L的兩性霉素。
所有培養基的性能水平令人驚訝的好。特別地，葡萄球菌菌種的生長是適當的。此外，α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶活性的檢測沒有受到抑制劑的影響，和由于抑制了非葡萄球菌(李斯特氏菌、不動桿菌、克雷伯氏菌等等)的生長，所以選擇性水平是令人滿意的。
實驗7通過添加麥芽糖來增強對于弱接種物的靈敏度下面的實驗在含有下列物質的培養基中進行-20.1g/L的蛋白胨，-0.65g/L的Tris緩沖液，-14g/L的瓊脂，-0.125g/L的6-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷，-0.100g/L的5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷，-0.004g/L的氯化錳，-4g/L的丙酮酸鈉，
-4g/L的氯化鋰，-0.032g/L的氨曲南，-0.002g/L的兩性霉素，和-最終濃度為0或0.1或0.3或0.4g/L的麥芽糖。
將麥芽糖以例如100g/L的濃度溶解在水中，然后向三個融化的培養基中加入足夠的體積以獲得上述的最終濃度。將來源于bioMérieux國際保藏的葡萄球菌菌株以稀釋至1/30000的0.5MacFarland的懸浮液各自接種于每一個生色培養基上(在整個培養皿的表面進行密集的垂直劃線)。將培養皿于37℃培育48小時。在18、24和48小時的培育之后用肉眼檢查菌落，并給菌落的顯色強度打分。
在測試的濃度中，用100和300mg/L的麥芽糖獲得了最好的結果；這些為因此在下面的表10中給出的濃度。盡管用400mg/L的麥芽糖獲得的結果相當好，但是由于一些其他的凝固酶陰性葡萄球菌也具有α-葡糖苷酶活性從而可能會有假陽性。
表10麥芽糖對于葡萄球菌α-葡糖苷酶活性的影響的評測標記顯色并給這些顯色的強度打分。讀取的標度與上面用于表2和4的一樣。
麥芽糖因此活化了金黃色葡萄球菌和尤其是臨界菌株(3、4、5和6)的α-葡糖苷酶的表達，從而使得這些菌株能夠在含有麥芽糖的培養基上產生綠色/亮綠色菌落，然而這些菌落在無麥芽糖的情況下會保持白色，這就會有如上面解釋的給出非金黃色葡萄球菌鑒定的風險。
混雜的下列揭示α-葡糖苷酶的生色底物可以從下列公司獲得·來自BIOSYNTH(Staad，瑞士)的5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，索引號為B-7230，·上面提到的來自BIOSYNTH的6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，具有索引號C-5015，和·6-溴-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，其合成在Inalco公司的專利WO 99/50438中進行了描述，和·2-萘基-α-D-吡喃葡糖苷，其對于本領域的技術人員來說是熟知的，并可從例如Sigma公司獲得。
揭示α-葡糖苷酶的熒光底物4-甲基傘形酮-α-D-葡糖苷對于本領域的技術人員來說是熟知的，并可從例如Sigma公司獲得。
關于5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷，其可以下列途徑進行合成具有下面分子式的5-溴-4-氯-1-甲基吲哚-3-基-α-D-葡糖苷 可從5-溴-4-氯-3-吲哚基乙酸酯或從5-溴-4-氯吲哚基1，3-二乙酸酯獲得。
步驟15-溴-4-氯-N-甲基-3-吲哚基乙酸酯的合成將3mmol的上述的這個或那個酯溶解在35ml的無水二乙脂中，并通過添加過量的醚中的重氮甲烷-三氟化硼復合物在1位氮上進行甲基化。用1M鹽酸提取有機相，然后用水洗滌并干燥(Na2SO4)。除去溶劑，然后將剩余物在五氧化二磷存在的情況下在真空中干燥從而獲得0.62g的產物。
步驟25-溴-4-氯-1-甲基-3-吲哚基-α-D-葡糖苷的合成A.將上面獲得的N甲基化的乙酸酯(0.6g，2mmol)溶解在無水的乙酸乙酯中，然后在氬氣環境下通過添加過量的甲醇氨水進行水解。于環境溫度16小時之后，通過在減壓的條件下進行蒸發來除去溶劑和過量的氨，固體剩余物無需進一步的純化而直接進行糖基化。
B.將5-溴-4-氯-1-甲基吲哚-3-基溶解在二氯甲烷中，并于0℃用五乙酸葡萄糖酯的二氯甲烷溶液(1.45g，5mmol/20ml)進行處理，然后用溶解在二氯甲烷中的氯化錫(2mmol)進行處理，同時進行攪拌。讓該反應持續過夜，然后通過與1M冰冷的鹽酸一起攪拌來分離產物。在除去錫鹽之后，有機相通過PHASE-SEP紙進行過濾，并通過MgSO4進行干燥。在TLC中，于UV下檢測到兩個點。在硅膠柱上的第一次分離(以二氯甲烷-乙酸乙酯作為洗脫劑)之后，兩種化合物在甲醇鈉的甲醇溶液存在的情況下分別進行脫乙酰化，從而得到α-和β-葡糖苷的混和物。
C.α形式看來是主要的，剩余的β-葡糖苷可以通過下列方法除去，即將其溶解在熱水中，然后冷卻至37℃，并在β-葡糖苷酶存在的條件下進行溫育。過濾溶液并用醚提取靛藍色素。剩余的水溶液在減壓的條件下進行蒸發，然后進行凍干，從而獲得α-葡糖苷(120mg)。
揭示β-葡糖醛酸糖苷酶的生色底物6-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷酸可以從BIOSYNTH(Staad，瑞士)獲得，索引號為C-5050。
也揭示β-葡糖醛酸糖苷酶的生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷酸可以從BIOSYNTH獲得，索引號為B-7400。
揭示β-半乳糖苷酶的生色底物6-氯-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷可以從BIOSYNTH獲得，索引號為C-5000。
揭示β-葡糖苷酶的生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷可以從BIOSYNTH獲得，索引號為B-7250。
權利要求
1.用于檢測金黃色葡萄球菌和/或凝固酶陽性葡萄球菌的培養基，其含有金黃色葡萄球菌培養基和至少一種用于證明α-葡糖苷酶活性的酶底物。
2.根據權利要求1所述的培養基，其特征在于用于證明α-葡糖苷酶活性的酶底物為生色劑或熒光劑。
3.根據權利要求2所述的培養基，該培養基用于檢測金黃色葡萄球菌和凝固酶陽性葡萄球菌，其特征在于用于證明α-葡糖苷酶活性的生色劑或熒光劑是基于吲哚氧基或基于傘形酮的。
4.根據權利要求2或3所述的培養基，其特征在于使用下列物質作為生色劑·6-溴-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，·5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，·5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷，·6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，和/或·4-甲基傘形酮-α-D-葡糖苷。
5.根據權利要求2所述的培養基，該培養基用于檢測金黃色葡萄球菌，其特征在于用于證明α-葡糖苷酶活性的生色劑是基于萘酚的。
6.根據權利要求2或5中所述的培養基，其特征在于使用下列物質作為生色劑2-萘基-α-D-吡喃葡糖苷。
7.根據權利要求1-6中任何一項所述的培養基，其特征在于使用至少兩種不同的酶底物，優選的為兩種生色劑，一種用于證明α-葡糖苷酶活性，另一種用于檢測糖苷酶(β-葡糖苷酶和/或β-葡糖醛酸糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)和/或酯酶(酯酶/脂酶和/或磷酸酶和/或硫酸酯酶)和/或肽酶和/或凝固酶活性。
8.根據權利要求7所述的培養基，其特征在于使用選自下列對的兩種生色劑·5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷聯合5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷，或·5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷聯合6-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷酸，或·6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷聯合5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷酸，或·6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷聯合5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷。
9.根據權利要求1-8中任何一項所述的培養基，其特征在于使用至少一種促進葡萄球菌屬的細菌生長的抑制劑，如氯化鋰(LiCl)、疊氮化鈉(NaN3)、粘菌素、兩性霉素、氨曲南、結腸霉素、氯化鈉(NaCl)和去鐵胺。
10.根據權利要求1-9中任何一項所述的培養基，其特征在于使用抑制劑的混和物，該混和物包括促進葡萄球菌屬的細菌生長的四種抑制劑，這些抑制劑為·LiCl，·O/129，·氨曲南，和·兩性霉素。
11.根據權利要求1-10中任何一項所述的培養基，其特征在于使用了麥芽糖，該麥芽糖優選地以100-300mg/L的濃度使用。
12.用于在含有至少一個種的細菌的樣品中鑒定一種或多種金黃色葡萄球菌種的細菌的方法，其包括下列步驟·用所有或部分樣品接種根據權利要求1-11中任何一項所述的培養基，和·培育接種的培養基以便產生足夠大小的細菌菌落，從而來觀察該培養基中所使用的并已經反應的每個生色劑的顯色或每個熒光劑的熒光。
13.根據權利要求12所述的方法，該方法也使得可能計數樣品中一種或多種金黃色葡萄球菌種的細菌，其特征在于進行第三個步驟，該步驟為計數由與金黃色葡萄球菌種的細菌相關的顯色或熒光鑒定出的菌落。
全文摘要
本發明涉及用于特異地檢測金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和/或用于區別凝固酶陽性葡萄球菌與凝固酶陰性葡萄球菌的培養基，這使得可能分離葡萄球菌屬的細菌和鑒定金黃色葡萄球菌種，該培養基使用至少一種酶底物，優選的為生色劑或熒光劑，更加優選的為基于吲哚氧基或基于萘酚的試劑。本發明還涉及用于鑒定和可選擇地計數金黃色葡萄球菌的方法，該方法使用這樣的培養基。該培養基由金黃色葡萄球菌培養基和至少一種用于證明α－葡糖苷酶活性的酶底物組成。本發明在診斷領域中找到了首選的應用。
文檔編號C12Q1/04GK1518602SQ02809158
公開日2004年8月4日 申請日期2002年3月29日 優先權日2001年3月30日
發明者C·科特, S·奧倫加, A·雷, C 科特, 準 申請人:拜奧默里克斯股份有限公司