專利名稱：編碼淀粉降解酶的核酸分子的制作方法
技術領域：
本發明涉及編碼淀粉降解酶的核酸分子。此外，本發明涉及載體、用此處描述的核酸分子轉化的宿主細胞和植物細胞及含有該細胞的植物。此外，描述了制備用所述核酸分子轉化的轉基因植物的方法。
植物器官中淀粉的降解是在若干方面影響植物產品的可用性的過程。依賴于植物物種和器官類型，人們可能想要抑制淀粉降解或相反地增加淀粉降解。淀粉降解的減少在如飼料植物中可能有益，特別是在那些通過青貯飼料或干燥來保存的植物中。淀粉含量的增加將導致干物質相當大的增加，它也將擴大C∶N比例，從而解決由狹窄的C∶N比例所導致的問題。這些問題包括發酵過程，該過程可因由于窄的C∶N比例導致的植物器官過高的pH值而發生，并可損壞青貯飼料。此外，反芻動物瘤胃中的氣體聚積，尤其是那些發生于春天的，同樣由在該生長期生長并給動物喂食的草中窄的C∶N比例所導致。
淀粉的減少在水果中也可能有益。在多數水果中，淀粉短暫聚積并在水果熟化中被調動，即轉變為糖。如果可能抑制該淀粉降解過程，將有可能增加水果中干物質的含量。這在用于生產調味蕃茄醬的番茄的情況中特別有益，因為這將減少蒸發過度的水所另外必需的能量用量。
同樣對于葡萄，淀粉降解的減少可能有益，因為增加的淀粉含量將對葡萄的糖含量產生正影響。
此外，淀粉降解的減少或抑制在馬鈴薯塊莖中可能有益，特別是對于所謂的“冷甜化(cold-sweetening)”，其發生于塊莖的貯藏低溫時以抑制發芽。冷甜化歸因于淀粉向葡萄糖和果糖，即所謂的還原糖的轉化，后者將在油炸過程中導致不利的褐變反應。
此外，淀粉降解的減少對用于生產雜交種子而生成雄性不育植物也有益。具體地，可能通過抑制起作用的基因而特定地抑制花粉中的淀粉降解而生產雄性不育植物，這是因為花粉管的生長和卵細胞的受精在大多數植物中是由淀粉降解供能的能量依賴性過程。
另一方面，存在一些情況，其中增加植物器官中的淀粉降解有益，如當植物器官用于生產乙醇時。然而，這些情況下淀粉的降解應該僅發生于某些時間段內，即在實際的生產過程中。
因而，在某些植物或植物器官中能夠修飾淀粉降解具有重要性。
然而，為了能夠以正的或負的方式影響淀粉在植物中的降解，特別是通過基因工程，必需得到編碼在淀粉降解中起作用的蛋白質的DNA序列，特別是在那些想要修飾其中淀粉降解的器官中。
因此，本發明根本的技術問題是提供編碼參與淀粉降解的蛋白質的核酸分子。
該問題通過提供由權利要求表征的實施方案而解決。
因此，本發明涉及編碼參與淀粉降解的蛋白質的核酸分子，該核酸分子選自(a) 編碼至少蛋白質的成熟形式的核酸分子，該蛋白質包含在SEQ ID NO2、4、6或8中所示的氨基酸序列；(b) 包含在SEQ ID NO1、3、5或7中所示的核苷酸序列或相應的核糖核苷酸序列的核酸序列；(c) 編碼蛋白質的核酸分子，其氨基酸序列與在SEQ ID NO2、4、6或8中所示的氨基酸序列具有至少40％的同源性；(d) 互補鏈與如在(a)或(b)中所限定的核酸分子雜交的核酸分子；(e) 包含編碼蛋白質的生物活性片段的核苷酸序列的核酸分子，該蛋白質由如在(a)、(b)、(c)或(d)中任何一項所限定的核酸分子編碼；及(f) 其核苷酸序列由于遺傳密碼的簡并性而從如在(b)、(c)、(d)或(e)中任何一項所限定的核酸分子的序列衍生的核酸分子。
因此，本發明涉及編碼參與淀粉降解的蛋白質的核酸分子，該分子優選編碼包含在SEQ ID NO2、4、6或8中所示氨基酸序列的蛋白質。
上述的核酸分子SEQ ID NOs1、3、5或7編碼參與并強烈影響淀粉降解的蛋白質。它們是用功能性篩選試驗進行鑒定和分離的，該試驗采用聚積直鏈α-1，4-葡聚糖的大腸桿菌(E.coli)品系(參見實施例1)。利用這些分子的幫助，現在可能在植物細胞內修飾淀粉降解(正或負地)。
迄今為止，對于大多數植物器官尚未描述過編碼參與淀粉降解或起始淀粉降解的酶的序列。在這點上，谷粒的胚乳是唯一得到充分理解的植物系統。對于所有其他的植物器官，迄今為止尚不知道哪個蛋白質負責淀粉降解。其中主要的原因是植物器官中主要的淀粉水解活性位于沒有淀粉存在的亞細胞區室中。淀粉在質體中合成和降解。然后由淀粉水解釋放的產物從質體中輸出以在細胞中進一步利用。在這一點上，胚乳組織是例外，因為在熟化中它失去了其細胞和亞細胞的完整性。結果，質體外的酶可接近淀粉顆粒并可降解淀粉。
術語“參與淀粉降解”指單獨的酶在淀粉分解中起作用。這種分解可以不同途徑發生，如通過從淀粉中多糖鏈的非還原性或還原性末端去除葡萄糖殘基、麥芽糖或麥芽糖寡糖。
該去除可通過如水解，即將去除的基團轉移到水分子上(如內切水解酶(endohydrolase)、外切水解酶(exohydrolase))、或通過磷酸解(phosphorylysis)，即將去除的基團轉移到磷酸分子上(如磷酸化酶，如從葡聚糖鏈的非還原性末端釋放葡萄糖-1-磷酸分子的α-1，4-葡聚糖磷酸化酶)而實現。
或者，該去除可通過由葡聚糖裂解酶所利用的反應機制來實現，通過該機制，優選來自葡聚糖鏈的非還原性末端的葡萄糖殘基轉變為被釋放的1，5-脫水-果糖。
優選，術語“參與淀粉降解”指可在實施例1所描述的功能性試驗中鑒定為具有淀粉降解活性的蛋白質。這種試驗具體包含下面的步驟(a) 將編碼蛋白質的核酸分子轉化入大腸桿菌品系中，后者在含有葡萄糖的培養基中生長后聚積大量的α-1，4-葡聚糖，優選轉化入大腸桿菌品系KV832(Kiel等人，Molecular & General Genetics 207(1987)，294-301)中，該品系是在編碼糖原分支酶的glgB基因中含有插入物的突變體，并用表達具有改變的別構性質的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(pACAG；Koβmann等人，Planta 208(1999)，503-511)的質粒所轉化(Creuzat-Sigal等人，在Biochemistry of the glycosidelinkage，Ed.Piras，Pontis；Academic Press，New York(1972)，647-680)；(b) 將轉化的細菌涂布在含有葡萄糖的培養基并生長；(c) 用碘蒸氣對細菌菌落進行染色；(d) 確定用在步驟(a)中提到的核酸分子轉化的細菌菌落是否顯示比未轉化的對照菌落較淺的藍色著色，或者是否它們根本不顯示著色，對照菌落由于存在直鏈α-1，4-葡聚糖而顯示用碘蒸氣染色時深的藍色著色，較淺的藍色著色或缺乏著色指示蛋白質的淀粉或葡聚糖降解活性。
本發明特別涉及含有在SEQ ID NOs1、3、5或7中的任何一項所示的核苷酸序列或其部分的核酸分子，并優選涉及包含在SEQ IDNOs1、3、5或7中的任何一項所示的編碼區或相應的核糖核苷酸序列的分子。
此外，本發明涉及編碼參與淀粉降解的蛋白質的核酸分子，且其互補鏈與上述分子之一雜交。
本發明也涉及編碼下述蛋白質的分子，該蛋白質與在SEQ IDNO2、4、6或8中任何一項所示的完整氨基酸序列具有同源性，即具有至少40％的一致性，優選至少60％，優選至少70％，尤其優選至少80％且特別地為至少90％的一致性，該蛋白質參與淀粉降解。
本發明也涉及編碼參與淀粉降解的蛋白質的核酸分子，且其序列由遺傳密碼的簡并性而衍生自上述核酸分子的核苷酸序列。
本發明也涉及具有與上述序列的全部或部分互補的序列的核酸分子。
描述于SEQ ID NO1的核酸序列(此處也稱為CSD12)是來自馬鈴薯的全長cDNA序列，其具有編碼277個氨基酸的多肽的831個堿基對的可讀框。對氨基酸序列的計算機分析(Emanuelsson等人，Protein Science 8(1999)，978-984；http//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)鑒定了質體轉運肽(plastidic transit peptide)并顯示轉運肽和成熟蛋白質之間的切割位點位于殘基56和57之間。因而，成熟蛋白質包含221個氨基酸。預測的未加工蛋白質的分子量為31.9kDa，且預測的成熟蛋白質分子量為25.5kDa。
描述于SEQ ID NO3中的核酸序列(此處也稱為CSD23)是來自馬鈴薯的全長cDNA克隆，包含有編碼294個氨基酸的多肽的882個核苷酸的可讀框。該多肽的預測的分子量為34.1kDa。
序列比較揭示除不具有任何被鑒定功能的擬南芥(Arabidopsis)EST之外與數據庫中的其他已知序列不具有顯著的同源性。
描述于SEQ ID NO5中的核酸序列(此處也稱為SHI)是來自馬鈴薯的全長cDNA克隆，包含編碼790個氨基酸殘基的多肽的2370bp的可讀框。編碼的蛋白質具有86.6kDa的預測分子量。通過表達含有SHI蛋白質的前100個氨基酸和GFP蛋白質的嵌合蛋白質可顯示向質體進行轉位的轉運肽存在于前100個氨基酸中，因為嵌合蛋白質被轉運到葉綠體中了。SEQ ID NO5的核苷酸序列在核苷酸水平上顯示與未鑒定的ESTs，來自番茄的(AW 093761、AW 928571、AW038351)、棉花(AW 727818)、白楊(AI 164445)、大豆(AI 988543)和玉米(AW 566133)具有一些同源性。
含有SEQ ID NO5的反義構建體的轉基因馬鈴薯植物不再動員其葉片上過渡淀粉，導致所謂的“淀粉過剩”表型。當在大腸桿菌中表達時，當支鏈淀粉溶解并與表達SHI的大腸桿菌細胞提取物溫育時，SHI序列(SEQ ID NO5)導致支鏈淀粉的快速降解。薄層層析揭示SHI活性導致不同長度的麥芽糖寡糖的釋放，如麥芽糖、麥芽三糖和麥芽四糖。
描述于SEQ ID NO7中的核酸分子顯示與編碼質體β-淀粉酶的序列具有同源性(Lao等人，Plant J.20(1999)，519-527)。
SEQ ID NO7是包含編碼545個氨基酸殘基的多肽的1635bp長的可讀框的全長cDNA克隆。預測的分子量為61kD。盡管通過計算機分析不能鑒定質體轉運肽，但是用來自豌豆的分離的葉綠體的輸入實驗顯示該蛋白質事實上被輸入到葉綠體中。因此，將該蛋白質稱為馬鈴薯的質體靶向的β-淀粉酶(ppt-β-淀粉酶)。
含有SEQ ID NO7的反義構建體的轉基因馬鈴薯植物顯示所謂的“淀粉過剩”表型，這意味著它們不再能夠動員在其葉片中生產的過渡淀粉。
在本發明中，術語“雜交”指在常規雜交條件(也稱為“低嚴緊性條件”)的雜交，優選為在嚴緊性條件(也稱為“高度嚴緊性條件”)下，例如描述于Sambrook等人，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，2ndedition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY中的。在一個尤其優選的含意中，術語“雜交”指在下述條件下發生的雜交雜交緩沖液2×SSC；10×Denhardt試劑(Fikoll400+PEG+BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mM Na2HPO4；250μg/ml鯡魚精子DNA；50μg/ml tRNA；或0.25M磷酸鈉緩沖液，pH7.2；1mM EDTA7％SDS雜交溫度T ＝60℃洗滌緩沖液2×SSC；0.1％SDS洗滌溫度T ＝60℃與本發明的核酸分子雜交的核酸分子原則上編碼參與淀粉降解的來自任何表達這種蛋白質的生物的蛋白質。
與本發明的分子雜交的核酸分子可例如從植物的基因組文庫或cDNA文庫進行分離。或者，它們可通過基因工程或化學合成來制備。
這種核酸分子可利用本發明的分子或這種分子的部分或這種分子的反向互補物來鑒定和分離，如通過根據標準方法的雜交(參見如Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY)。
具有與在SEQ ID NOs1、3、5或7中所示核苷酸序列或其部分相同或基本相同的核酸分子可例如用作雜交探針。用作雜交探針的片段也可為由通常的合成技術制備的合成片段，且其序列基本上與根據本發明的核酸分子的序列一致。
與本發明的核酸分子雜交的分子也包含上述編碼參與淀粉降解的蛋白質的核酸分子的片段、衍生物和等位基因變體。在此處，將片段理解為指長度足以編碼所述的蛋白質之一的核酸分子的部分，其中的蛋白質優選參與淀粉降解。關于這一點，術語衍生物指與上述核酸分子在一個或多個位置有區別且顯示與這種序列具有高度同源性的分子的序列。在這種情況下，同源性指至少40％的序列一致性，特別是至少60％的一致性，優選為至少65％，更優選為至少70％，更加優選為至少80％，特別為至少85％，進一步優選為至少90％，且特別優選為至少95％。最優選的同源性指至少n％的序列一致性，其中n是40和100間的整數，即40≤n≤100。上述核酸分子的衍生物，如通過缺失、替代、插入和/或重組產生。
優選，同源性的程度通過將各個序列與SEQ ID NO1、3、5或7的編碼區的核苷酸序列進行比較而確定。當進行比較的序列不具有相同的長度時，同源性程度優選指與較長序列中的核苷酸殘基相同的較短的序列中核苷酸殘基的百分數。同源性程度可常規使用已知的計算機程序來確定，如由[在European Molecular Biology Laboratory，Meyerhofstrasse 1，D 69117 Heidelberg，德國]Julie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和Toby Gibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE)發布的ClustalW程序(Thompson等人，Nucleic Acids Research 22(1994)，4673-4680)。ClustalW也可從幾個網址下載，包括IGBMC(Institut de Génétique et de BiologieMoléculaire et Cellulaire，B.P.163，67404 Illkirch Cedex，法國；ftp//ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和EBI(ftp//ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)和所有與EBI(European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，英國)鏡像的站點。
當利用ClustalW程序版本1.8來確定一個特定的序列是否與根據本發明的參考序列具有如90％的一致性時，對于DNA比對的設置以如下的方式進行設置KTUPLE＝2，TOPDIAGS＝4，PAIRGAP＝5，DNAMATRIXIUB，GAPOPEN＝10，GAPEXT＝5，MAXDIV＝40，TRANSITIONS未加權的。
對于用ClustalW程序版本1.8進行蛋白質序列比對，設置如下KTUPLE＝1，TOPDIAGS＝5，WINDOW＝5，PAIRGAP＝3，GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.05，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40，MATRIX＝GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。
此外，同源性優選地指編碼的蛋白質與在SEQ ID NO2、4、6或8中所示的氨基酸序列顯示至少40％的序列一致性，更優選至少60％，更加優選至少80％，特別至少90％，且特別優選至少95％序列一致性。最優選的同源性指至少n％的序列一致性，其中n是40和100間的整數，即40≤n≤100。
至于SEQ ID NO1(CSD12)，同源性優選指編碼的蛋白質與SEQID NO2的氨基酸序列具有至少62.5％的序列一致性，更優選至少65％，更加優選至少70％，且特別優選至少95％。
至于SEQ ID NO3(CSD23)，同源性優選指編碼的蛋白質與SEQID NO4的氨基酸序列具有至少87％的序列一致性，更優選至少90％，更加優選至少95％，且特別優選至少97％。
至于SEQ ID NO5(SHI)，同源性優選指編碼的蛋白質與SEQID NO6的氨基酸序列具有至少65％的序列一致性，更優選至少75％，更加優選至少86％，進一步優選至少95％，且特別優選至少99％。
至于SEQ ID NO7，同源性優選指當與SEQ ID NO8的序列比較時，編碼的蛋白質具有至少81％的序列一致性，更優選至少85％，更加優選至少95％，且特別優選至少97％。
此外，同源性指在相應的核酸分子或因而編碼的蛋白質之間有功能和/或結構的同等性。與上述分子之一同源的及代表這些分子的衍生物的核酸分子通常是這些代表具有相同生物學功能的修飾的分子的變異。它們或者是天然存在的變異，例如來自其他微生物的序列，或者是突變，且該突變可天然形成或可由專門的誘變而產生。此外，該變異可為合成生產的序列。等位基因變體可為如天然發生的變體或合成生產的變體或由重組DNA技術生產的變體。
由本發明的核酸分子之一的不同變體編碼的蛋白質具有某些它們共有的特征。這些特征包括如酶活性、分子量、免疫反應性、構象等，及物理性質如在凝膠電泳中的遷移行為、層析行為、沉降系數、溶解性、光譜性質、穩定性、pH最適值、溫度最適值等。
由本發明的核酸分子之一編碼的蛋白質的一個特征是它們參與淀粉降解。該活性可由上述的試驗進行估計。
或者，淀粉降解活性可通過用聚丙烯酰胺凝膠電泳在含有直鏈淀粉或支鏈淀粉的凝膠中于非變性條件下對表達蛋白質的細胞的蛋白質或蛋白質提取物進行分離并隨后在魯戈氏溶液中將凝膠進行染色而檢驗。具有淀粉降解活性的蛋白質降解存在于凝膠中的直鏈淀粉和/或支鏈淀粉，并因而導致凝膠中其位置較淺的著色。
此外，淀粉降解活性可通過將直鏈淀粉或支鏈淀粉溶液與源自要檢驗的表達蛋白質的細胞的提取物進行溫育并隨后用碘對其進行染色而證實。如果蛋白質不具有淀粉降解活性，那么溶液將顯示紫色著色。如果蛋白質具有淀粉降解活性，那么看不到著色或僅可看到弱的紫色著色。
在由SEQ ID NO3(CSD23)編碼的蛋白質或其同源物的情況下，編碼的蛋白質具有水解活性的性質。此外，這種蛋白質特征在于它僅降解直鏈的非分支的葡聚糖，但不降解支鏈淀粉。該性質可如實施例3和7所述進行檢驗，如通過在不連續的PAGE中分離表達蛋白質的細胞的可溶性蛋白質組分，該PAGE用分別含有直鏈淀粉和支鏈淀粉的凝膠作為分離膠，并且用碘對凝膠進行染色。由SEQ ID NO3編碼的蛋白質或其同源物僅可降解直鏈淀粉而不能降解支鏈淀粉(同樣參見
圖11)，這可由對凝膠的負染色來檢測。
在由SEQ ID NO5(SHI)編碼的蛋白質或其同源物的情況下，編碼的蛋白質具有水解活性的性質。這可顯示于如在實施例10和圖14所述的不連續的PAGE中。這種蛋白質進一步表征為其降解支鏈淀粉的能力(參見圖14和15)，且特別是溶解的支鏈淀粉。該性質可容易地通過將蛋白質與支鏈淀粉溶液進行溫育并隨后用碘對其進行染色來檢驗。藍色著色的喪失指示支鏈淀粉的降解。此外，SHI蛋白質具有其活性導致麥芽糖寡糖從淀粉中釋放的性質，優選為麥芽糖、麥芽三糖和/或麥芽四糖。這可通過將蛋白質與可溶性淀粉進行溫育并用薄層層析(TLC)對淀粉降解產物進行分離來證實，如實施例3和10所述及圖16所示。
SHI蛋白質同樣優選具有α-淀粉酶活性。該活性可如實施例特別是實施例3和11所述進行檢驗。優選，通過用在非還原末端進行阻斷的對硝基苯基麥芽七糖(p-nitrophenyl-maltoheptaose)作為底物并確定蛋白質是否將其用作底物來檢驗。
SHI蛋白質進一步優選表征為包含質體導向序列及其被轉運到葉綠體中，特別是分離的葉綠體中的能力。后一性質可通過進行于實施例4和12所述的輸入實驗來檢驗。
在SEQ ID NO5的情況下，當從氨基酸序列進行計算時，編碼的蛋白質(SHI)優選具有80～90kDa的分子量，優選為82～88kDa，更優選為83～87kDa，且更優選為約86kDa。
在由SEQ ID NO7(ppt-β-淀粉酶)編碼的蛋白質或其同源物的情況下，編碼蛋白質表征為它具有β-淀粉酶活性。該活性可如實施例3所述進行檢驗。優選通過估計蛋白質是否降解通過糖苷鍵在還原末端連接到對硝基苯基的麥芽糖寡糖。具體地，β-淀粉酶的特定底物是非阻斷的對硝基苯基麥芽五糖(PNPG5)。β-淀粉酶活性也可通過將蛋白質與溶解的淀粉或與未加工的馬鈴薯淀粉顆粒進行溫育并用薄層層析(TLC)對反應產物進行分離來檢驗。β-淀粉酶活性的產物僅是麥芽糖，而α-淀粉酶產生如一系列的麥芽糖寡糖(參見實施例3和圖4)。
此外，根據本發明的β-淀粉酶蛋白質優選表征為包含質體靶序列和其被輸入到葉綠體特別是分離的葉綠體中的能力。后一性質可通過進行如實施例4所述的輸入實驗來檢驗。
此外，編碼的蛋白質，特別是由SEQ ID NO5和SEQ ID NO7編碼的那些及其同源物顯示如下特征性質，即其活性經過如反義方法而減少的植物顯示所謂的“淀粉過剩”的表型，這意味著它們不再能夠動員在其葉片中合成的淀粉(過渡淀粉)。這意味著這種植物在其葉片中顯示淀粉的積累。該性質可如實施例5和13所述進行檢驗。具體地，將植物的源葉片在黑暗中放置不同的時間段，然后用碘進行染色以確定其淀粉含量。在黑暗中不能動員過渡淀粉的植物葉片顯示藍色著色，至少與相應的野生型植物中可能發生的相比，這些葉片中的藍色著色較強，或長時間在黑暗中之后著色明顯(參見圖8、19、20和21)。
此外，葉片中過渡淀粉的聚積也可通過用酶確定葉片中淀粉的含量來進行檢驗。這可以如Müller-Rber等人所述(EMBO J.11(1992)，1229-1238)進行。當與相應的野生型植物的葉片相比時，其中根據本發明的SHI蛋白質或β-淀粉酶的活性減少的植物葉片優選顯示淀粉含量中至少50％的增加，更優選至少100％，更加優選至少200％，甚至更優選至少400％，且特別優選至少600％(參見如圖9和23)。此外，具有減少的根據本發明的SHI蛋白質或β-淀粉酶活性的植物葉片比相應的野生型植物的相應葉片可存活更長的黑暗期(參見圖22)。
本發明的核酸分子可為DNA分子，如基因組DNA或cDNA。此外，本發明的核酸可為RNA分子。本發明的核酸分子可例如從天然來源獲得或者可合成或通過重組技術進行生產。
本發明的核酸分子使得能夠制備宿主細胞，該宿主細胞產生高純度和/或足夠量的參與淀粉降解的蛋白質，且使得可制備基因工程處理的植物，該植物具有這些蛋白質修飾的活性。在本發明的框架中，術語“高純度”指根據本發明的蛋白質顯示至少80％的純度程度，優選至少90％，更優選至少95％。
在優選的實施方案中，本發明的核酸分子源自植物，優選源自淀粉貯藏型植物，更優選源自茄科(Solanaceae)植物，且特別優選源自馬鈴薯(Solanum tuberosum)。
本發明也涉及與本發明的核酸分子特異雜交的寡核苷酸。這種寡核苷酸優選具有至少10個核苷酸的長度，特別為至少15個核苷酸，且特別優選至少50個核苷酸。它們表征為它們與本發明的核酸分子特異雜交，也就是說它們不或者僅在非常小的程度上與編碼其他蛋白質的核酸序列進行雜交，特別是其他的淀粉降解酶。本發明的寡核苷酸可例如用作擴增技術如PCR反應的引物，或者用作雜交探針以分離相關的基因。
此外，本發明涉及載體，特別是質粒、粘粒、病毒、噬菌體和其他基因技術中常用的載體，該載體含有一個本發明上述的核酸分子。在本發明優選的實施方案中，本發明的載體適合于轉化植物細胞。特別優選，這種載體允許本發明的核酸分子，可能連同側翼相接的調節區一起整合入植物細胞的基因組中。其例子為可用于土壤桿菌(Agrobacteria)介導的基因轉移的二元(binary)載體，且一些該載體已商業可購得。
在另一個優選的實施方案中，將載體中含有的核酸分子連接到調節元件中以確保在原核或真核細胞中可翻譯的或不可翻譯的(如反義的或核酶)RNA的轉錄和合成。
本發明的核酸分子在原核或真核細胞中，如大腸桿菌中的表達是引起關注的，因為該表達允許對由這些分子編碼的酶的生物學和/或酶學活性進行更精確的表征。此外，可能在沒有干擾酶的那些原核或真核細胞中表達該蛋白質。此外，可能用分子生物學常用的方法將不同的突變插入到核酸分子中(參見如Sambrook等人，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)，從而導致可能具有修飾的生物學性質的蛋白質的合成。在一方面，就此而論可能生產缺失突變體，其中核酸分子通過從編碼DNA序列的5’或3’末端進行漸進的缺失而生產，且該核酸分子導致相應縮短的蛋白質的合成。例如這種核苷酸序列5’末端的缺失使得能夠鑒定氨基酸序列，該氨基酸序列是可能存在并負責蛋白質的分泌或在質體、液泡、線粒體或質外體中的定位。
這允許蛋白質的專門制備，通過去除相應的序列而不再分泌而保持于相應的宿主生物的細胞內或由于其他信號序列的添加而定位于其他區室，如質體、線粒體、液泡。
另一方面，在某些位置上點突變的引入也可以考慮，在該位置上氨基酸序列的修飾可例如影響蛋白質/酶的生物學和/或酶學活性或控制。如此，例如可能生產下面的突變體，該突變體具有修飾的立體和區域選擇性或修飾的Km值，或者該突變體不再受通常存在于細胞內且由別構調節或共價修飾來實現的控制機制的控制。
此外，可制備具有修飾的底物或產物特異性的突變體。此外，可能制備具有修飾的活性-溫度特性的突變體。
此外，在植物中表達的情況下，本發明的核酸分子中的插入突變使得由本發明的核酸分子編碼的蛋白質的基因表達速率和/或活性能夠增加。
對于在原核細胞中的基因工程，可將本發明的核酸分子或這種分子的部分引入到質粒中，該質粒允許通過DNA序列重組進行誘變或序列修飾。標準方法(參見如Sambrook等人，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY，USA)使得能夠進行堿基交換或添加天然或合成的序列。DNA片段可通過向片段中應用連接物和連接體而相互連接。此外，可使用遺傳工程措施提供適當的限制位點或去除多余的DNA或限制位點。在那些其中插入、缺失或替代是可能的情況下，可使用體外誘變、“引物修補”、限制或連接。通常，實施序列分析、限制分析和其他生物化學和分子生物學方法作為分析方法。
本發明的另一個實施方案涉及宿主細胞，特別是用本發明的上述核酸分子或本發明的載體轉化的原核或真核細胞，且涉及從這種轉化的細胞傳代下來并含有本發明的核酸分子或載體的細胞。根據另一個優選的實施方案，宿主細胞是微生物細胞。在本發明的范圍內，術語“微生物”包含細菌和所有如定義于Schlegel的“AllemeineMikrobiologie”(Georg Thieme Verlag，1985，1-2)的原生生物(如真菌、特別是酵母、藻類)。本發明優選的實施方案涉及藻類細胞和屬于曲霉屬(Aspergillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、糖酵母菌屬(Saccharomyces)或畢赤酵母屬(Pichia)的宿主細胞(Rodriguez，Journal of Biotechnology 33(1994)，135-146，Romanos，Vaccine，Vol.9(1991)，901以及下列等等)。本發明特別優選的實施方案涉及大腸桿菌細胞。用于生產重組蛋白質的這種宿主細胞的構建可用本領域技術人員公知的方法來實施。
在本發明的一個優選的實施方案中，本發明的宿主細胞不顯示干擾性的酶活性，如那些多糖形成和/或多糖降解酶的活性。
對不同表達系統的總的概述包含于如Methods in Enzymology153(1987)，385-516、Bitter等人(Methods in Enzymology 153(1987)，516-544)和Sawers等人(Applied Microbiology and Biotechnology 46(1996)，1-9)，Billman-Jacobe(Current Opinion in Biotechnology 7(1996)，500-4)，Hockney(Trends in Biotechnology 12(1994)，456-463)，Griffiths等人(Methods in Molecular Biology 75(1997)，427-440)中。對酵母表達系統的總的概述由如Hensing等人(Antonievan Leuwenhoek 67(1995)，261-279)，Bussineau等人(Developmentsin Biological Standardization 83(1994)，13-19)，Gellissen等人(Antonie van Leuwenhoek 62(1992)，79-93)，Fleer(Current Opinionin Biotechnology 3(1992)，486-496)，Vedvick(Current Opinion inBiotechnology 2(1991)，742-745)和Buckholz(Bio/Technology 9(1991)，1067-1072)提供。
表達載體已廣泛描述于文獻中。通常，它們不僅含有選擇標記基因和確保在選擇的宿主中復制的復制起點，而且含有細菌或病毒啟動子，及大多數情況下轉錄的終止信號。在啟動子和終止信號之間有至少一個使得編碼DNA序列能夠插入的限制位點或多位點接頭。可將天然控制相應基因轉錄的DNA序列用作啟動子序列，如果它在選擇的宿主生物中有活性。然而，該序列也可換為其他的啟動子序列。可能使用產生基因的組成型表達的啟動子和允許對下游基因的表達進行專門控制的誘導型啟動子。具有這些性質的細菌和病毒啟動子序列詳細描述于文獻中。用于在微生物(例如大腸桿菌、啤酒糖酵母(S.cerevisiae))中表達的調節序列充分描述于文獻中。允許下游基因特別高表達的啟動子是如T7啟動子(Studier等人，Methods in Enzymology 185(1990)，60-89)、lacUV5、trp、trp-lacUV5(Deboer等人，in Rodriguezand Chamberlin(Eds)，Promoters，Structure and Function；Praeger，New York，(1982)，462-481；Deboer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)，21-25)、lp1、rac(Boros等人，Gene 42(1986)，97-100)。通常，蛋白質的量在微生物生長周期的從中期向上到大約對數期的結束期間最大。因此，誘導型啟動子優選地用于蛋白質的合成。這些啟動子經常比組成型啟動子導致更高的蛋白質產量。高度組成型啟動子的使用導致克隆的基因的連續轉錄和翻譯，并因而經常導致其他基本細胞功能的能量喪失，其影響為細胞生長減慢(Bernard R.Glick/JackJ.Pasternak，Molekulare Biotechnologie(1995)，SpektrumAkademischer Verlag GmbH，Heidelberg，Berlin，Oxford，p.342)。因此，為了獲得最適量的蛋白質，經常使用兩個階段的過程。首先，將宿主細胞在最適條件下培養到相對高的細胞密度。在第二個步驟中，然后依賴于所用的啟動子的類型而誘導轉錄。關于這一點，可由乳糖或IPTG(＝異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導的tac啟動子特別適合(deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983)，21-25)。轉錄的終止信號也描述于文獻中。
用編碼參與淀粉降解的蛋白質的DNA的轉化宿主通常可用標準方法實施，如描述于Sambrook等人(Molecular CloningALaboratory Course Manual，2ndedition(1989)Cold Spring HarborPress，New York；Methods in Yeast Genetics，A Laboratory CourseManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1990)。宿主細胞在滿足所用的特定宿主細胞需要的營養培養基上培養，特別是關于pH值、溫度、鹽濃度、通氣、抗生素、維生素、痕量元素等。
此外，本發明涉及由本發明的核酸分子編碼的蛋白質及其生物活性片段，以及其制備方法，其中根據本發明的宿主細胞在允許蛋白質合成的條件下培養，且蛋白質隨后從培養的細胞和/或培養基中分離。
根據優選的實施方案，本發明的蛋白質是重組生產的蛋白質。在本發明的范圍內，這是通過將編碼蛋白質的DNA序列插入到宿主細胞內并在那里進行表達而制備的蛋白質。然后該蛋白質可從宿主細胞和/或培養基中分離。
本發明的核酸分子現在使得能夠制備宿主細胞，該宿主細胞生產高純度和/或足夠量的本發明的重組蛋白質。在本發明的框架中，術語“高純度”指根據本發明的蛋白質顯示至少80％的純度，優選至少90％，更優選至少95％。
由宿主細胞生產的蛋白質可用常規純化方法進行純化，如沉淀、離子交換層析、親和層析、凝膠過濾、HPLC反相層析等。
在宿主細胞中表達的本發明的核酸分子的修飾使得能夠在宿主細胞內生產多肽，該多肽由于特別的性質而較容易從培養基中分離。因而，要表達的蛋白質可作為與額外的多肽序列的融合蛋白質而表達，其特定的結合性質允許用親和層析對融合蛋白質進行分離(如Hopp等人，Bio/Technology 6(1988)，1204-1210；Sassenfeld，TrendsBiotechnol.8(1990)，88-93)。
此外，本發明也涉及特異性識別根據本發明的蛋白質的抗體。該抗體可為單克隆或多克隆抗體，且可根據本領域眾所周知的方法制備。術語“抗體”也包含仍然保持了結合特異性的抗體的片段。
本發明的核酸分子的提供使得可能通過基因工程制備含有并表達本發明的核酸分子的植物細胞。
因此，本發明也涉及用本發明的核酸分子或本發明的載體轉化的轉基因植物細胞，或從這些細胞傳代下來的轉基因植物細胞，該核酸分子在允許植物細胞中可翻譯的mRNA的轉錄的調節元件的控制之下。
本發明的蛋白質活性通過如相應核酸分子表達的引入打開了生產具有增加的淀粉降解的植物細胞的能力。因此，通過植物細胞中本發明的核酸分子的表達，可能的是表達以前不存在于野生型細胞中的淀粉降解活性，或者通過額外的表達增加已經存在于野生型細胞中的淀粉降解活性。在這點上，特別引起關注的是增加谷類的胚乳中的淀粉降解活性，特別是用于生產乙醇如啤酒的谷類中。特別地一個例子為大麥。此外，可能根據技術人員公知的方法修飾本發明的核酸分子以獲得本發明的酶，該酶具有如修飾的溫度依賴性或底物或產物特異性。這種方法已更詳細地描述于上述不同的內容中。
將DNA插入到植物宿主細胞中可用多種技術。這些技術包括用根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或發根病農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)作為轉化劑用T-DNA轉化植物細胞、原生質體融合、注射、DNA電穿孔、用生物彈射擊(biolistic)方法插入DNA和其他可能的方法。
農桿菌屬介導的植物細胞轉化的應用已被廣泛研究，并充分描述于EP 120 516；Hoekema，InThe Binary Plant Vector System，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam(1985)，Chapter V；Fraley等人，Crit.Rev.Plant Sci.4(1993)，1-46和An等人，EMBOJ.4(1985)，277-287。關于馬鈴薯的轉化，參見如Rocha-Sosa等人(EMBO J.8(1989)，29-33)。
單子葉植物依靠基于農桿菌屬的載體的轉化也已有所描述(Chan等人，Plant Mol.Biol.22(1993)，491-506；Hiei等人，Plant J.6(1994)271-282；Deng等人，Science in China 33(1990)，28-34；Wilmink等人，Plant Cell Reports 11(1992)，76-80；May等人，Bio/Technology13(1995)，486-492；Conner和Dormisse，Int.J.Plant Sci.153(1992)，550-555；Ritchie等人，Transgenic Res.2(1993)，252-265)。轉化單子葉植物的另一種系統為用生物彈射擊方法的轉化(Wan和Lemaux，Plant Physiol.104(1994)，37-48；Vasil等人，Bio/Technology 11(1993)，1553-1558；Ritala等人，Plant Mol.Biol.24(1994)317-325；Spencer等人，Theor.Appl.Genet.79(1990)，625-631)、原生質體轉化、部分透化的細胞的電穿孔、DNA經由玻璃纖維的插入。特別地，玉米的轉化已重復描述于文獻中(參見如WO 95/06128，EP 0 513 849，EP 0465 875，EP 292435；Fromm等人，Biotechnology 8，(1990)，833-844；Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2，(1990)，603-618；Koziel等人，Biotechnology 11(1993)，194-200；Moroc等人，Theor.Appl.Genet.80，(1990)，721-726)。
其他類型谷類成功的轉化也已有所描述，如大麥(Wan和Lemaux，如上；Ritala等人，如上；Krens等人，Nature 296(1982)，72-74)和小麥(Nehra等人，Plant J.5(1994)，285-297)。通常，植物細胞中有活性的任何啟動子都適合于在植物細胞中表達核酸分子。該啟動子可以以下方式進行選擇，即在本發明的植物中的表達組成型發生或僅于特定的組織中、在植物發育的特定的時間或在由外部影響確定的時間發生。該啟動子對于該植物可為同源或異源的。
適當的啟動子為如花椰菜花葉病毒的35S RNA的啟動子(參見如US-A-5,352,605)和導致其自身組成型表達的泛素-啟動子(參見如US-A-5,614,399)、導致其自身在馬鈴薯的塊莖中特異性表達的patatin基因啟動子B33(Rocha-Sosa等人，EMBO J.8(1989)，23-29)或確保僅在光合活性組織中表達的啟動子，如ST-LS1啟動子(Stockhaus等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)，7943-7947；Stockhaus等人，EMBO J.8(1989)2445-2451)、Ca/b-啟動子(參見如US-A-5,656,496，US-A-5,639,952，Bansal等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)，3654-3658)和核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)SSU啟動子(參見如US-A-5,034,322；US-A-4,962,028)或確保胚乳特異性表達的啟動子，如來自小麥的谷蛋白啟動子(HMW啟動子)(Anderson，Theoretical and Applied Genetics 96，(1998)，568-576，Thomas，Plant Cell 2(12)，(1990)，1171-1180)、來自水稻的谷蛋白啟動子(Takaiwa，Plant Mol.Biol.30(6)(1996)，1207-1221，Yoshihara，FEBS Lett.383(1996)，213-218，Yoshihara，Plant andCell Physiology 37(1996)，107-111)、來自玉米的shrunken啟動子(Maas，EMBO J.8(11)(1990)，3447-3452，Werr，Mol.Gen.Genet.202(3)(1986)，471-475，Werr，Mol.Gen.Genet.212(2)，(1988)，342-350)、USP啟動子、菜豆蛋白啟動子(Sengupta-Gopalan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)，3320-3324，Bustos，Plant Cell 1(9)(1989)，839-853)或來自玉米的玉米醇溶蛋白基因的啟動子(Pedersen等人，Cell 29(1982)，1015-1026；Quatroccio等人，PlantMol.Biol.15(1990)，81-93)。然而，也可使用僅在通過外部影響確定的一個時間點活化的啟動子(參見如WO 93/07279)。就此而論，允許簡單誘導的熱休克蛋白的啟動子可具有特別的重要性。此外，可使用種子特異性啟動子如來自蠶豆(Vicia faba)的USP啟動子，該USP啟動子確保在蠶豆和其他植物中的種子特異性表達(Fiedler等人，Plant Mol.Biol.22(1993)，669-679；Bumlein等人，Mol.Gen.Genet.225(1991)，459-467)。此外，也可使用果實特異性的啟動子，如WO91/01373中所述的。
此外，可存在終止序列，該終止序列用于正確地終止轉錄并向轉錄物添加聚腺苷酸尾巴，該尾巴據信具有使轉錄物穩定的功能。這種元件描述于文獻中(參見如Gielen等人，EMBO J.8(1989)，23-29)并可隨意替代。
本發明的轉基因植物細胞與其他的天然存在的植物細胞可通過它們含有本發明的核酸分子的事實而區別開來，該核酸分子或者不天然存在于這些細胞中，或者如果天然存在于這些細胞中時，通過它們含有這種核酸分子的一個額外拷貝或多數額外拷貝而區別開來，這些拷貝在它/它們天然存在/不存在的位點整合入基因組。這可通過如DNA印跡分析來證實。此外，本發明的這種轉基因植物細胞與天然存在的植物細胞區別在于它們含有至少一個穩定整合入其基因組的本發明的核酸分子的拷貝。
此外，本發明的植物細胞優選與天然存在的植物細胞區別在于至少一個下述性質如果插入的本發明的核酸分子對于植物細胞是異源的，那么轉基因植物細胞就具有所插入的本發明的核酸分子的轉錄物。后者可通過如RNA印跡分析來檢測。本發明的植物細胞優選地含有由所插入的本發明的核酸分子編碼的蛋白質。這可通過如免疫方法來顯示，特別是通過蛋白質印跡分析。
當與相應的野生型細胞相比時，根據本發明的植物細胞優選顯示來自本發明的核酸分子的轉錄物至少10％的量增加，優選至少20％，更優選至少50％，甚至更優選至少70％且甚至更優選至少100％的。
而且，當與相應的野生型細胞相比時，根據本發明的蛋白質的量在該植物細胞中顯示至少10％，優選至少20％，更優選至少50％，甚至更優選至少70％且甚至更優選至少100％的增加。
在優選的實施方案中，當與相應的野生型細胞相比時，根據本發明的植物細胞進一步表征為它們顯示根據本發明的蛋白質的活性中至少10％，優選至少20％，更優選至少50％，甚至更優選至少70％且甚至更優選至少100％的增加。淀粉降解活性可如上所述進行確定。
可根據本領域技術人員公知的方法將轉基因植物細胞再生為完整植物。
本發明也涉及通過再生本發明的轉基因植物細胞可獲得的植物。此外，它涉及含有上述轉基因植物細胞的植物。
轉基因植物原則上可為任何植物物種的植物，也就是說，它們可為單子葉和雙子葉植物。該植物優選為人們為了經濟目的、特別是為了營養或技術、特別為了工業目的而培養的有用植物，例如用于生產乙醇的植物。它們優選為貯藏淀粉的植物，例如谷類物種(黑麥、大麥、燕麥、小麥、谷子、西米等)、水稻、豌豆、marrow pea、木薯(cassava)和馬鈴薯；番茄、油菜、大豆、大麻、亞麻、向日葵、豇豆或木薯(arrowroot)、纖維形成植物(如亞麻、大麻、棉花)、貯藏油的植物(如油菜、向日葵、大豆)和貯藏蛋白質的植物(如豆科植物、谷類、大豆)。本發明也涉及水果植物或樹和棕櫚，如葡萄。此外，本發明涉及飼料植物(如飼料和牧場植物如草、苜蓿、三葉草、黑麥草(ryegrass))和蔬菜植物(如馬鈴薯、萵苣、菊苣)和裝飾植物(如郁金香、風信子)。優選貯藏淀粉的植物。特別優選甘蔗和甜菜及馬鈴薯植物、玉米、水稻、小麥和番茄植物。
在植物中表達核酸分子，原則上存在如下可能性，即合成的蛋白質可定位于植物細胞的任何區室(如細胞質、質體、液泡、線粒體)或植物的任何區室(如質外體)中。為了實現在特別的區室的定位，編碼區在需要時必須連接確保在相應區室定位的DNA序列。所用的信號序列必須各自以與編碼酶的DNA序列相同的讀框安排。
為了確保在質體中的定位，可能使用下面的轉運肽之一在Jansen等人(Current Genetics 13(1988)，517-522)中包含的菠菜的質體鐵氧化還原蛋白NADP+氧化還原酶(FNR)的轉運肽。特別地，可使用在此處公開的cDNA序列的核苷酸-171～165范圍的序列，該序列包含5’非翻譯區及編碼轉運肽的序列。另一個例子是玉米蠟質蛋白質的轉運肽，該轉運肽包括成熟蠟質蛋白質的前34個氨基酸殘基(Klsgen等人，Mol.Gen.Genet.217(1988)，155-161)。也可能使用不具有成熟蛋白質的前34個氨基酸的該轉運肽。此外，可使用核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(Wolter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)，846-850；Nawrath等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994)，12760-12764)的、NADP蘋果酸脫氫酶的(Gallardo等人，Planta 197(1995)，324-332)的、谷光甘肽還原酶的(Creissen等人，Plant J.8(1995)，167-175)的或R1蛋白質(Lorberth等人，NatureBiotechnology 16，(1988)，473-477)的信號肽。
為了確保在液泡中的定位，可考慮使用下面的轉運肽之一patatin蛋白質的N-末端序列(146個氨基酸)(Sonnewald等人，Plant J.1(1991)，95-106)或由Matsuoka und Neuhaus，Journal ofExperimental Botany 50(1999)，165-174；Chrispeels und Raikhel，Cell 68(1992)，613-616；Matsuoka und Nakamura，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 88(1991)，834-838；Bednarek und Raikhel，Plant Cell 3(1991)，1195-1206；Nakamura und Matsuoka，Plant Phys.101(1993)，1-5所描述的信號序列。
為了確保在線粒體中的定位，可以例如考慮使用由Braun等人(EMBO J.11，(1992)，3219-3227)描述的轉運肽。
為了確保在質外體中的定位，可以考慮使用下面的轉運肽之一蛋白酶抑制劑II-基因(Keil等人，Nucleic Acid Res.14(1986)，5641-5650；von Schaewen等人，EMBO J.9(1990)，30-33)的、來自解淀粉歐文氏桿菌(Erwinia amylovora)的果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因(Geier和Geider，Phys.Mol.Plant Pathol.42(1993)，387-404)的、來自馬鈴薯(Solanum tuberosum)的編碼前33個氨基酸的patatin基因B33片段(Rosahl等人，Mol Gen.Genet.203(1986)，214-220)的或一個由Oshima等人(Nucleic Acid Res.18(1990)，181)描述的信號序列。
在SEQ ID Nos1、5和7中顯示的核酸序列編碼質體蛋白質。
本發明的進一步的主題是生產用本發明的核酸分子進行基因工程改造的轉基因植物細胞和轉基因植物的方法，且與非轉化的野生型細胞/非轉化的野生型植物相比，該細胞和植物顯示增加的淀粉降解活性。在該方法中，由本發明的核酸分子編碼的蛋白質的表達和/或活性與相應的野生型細胞/野生型植物相比是增加的。特別地，這種方法包含根據本發明的核酸分子在植物細胞中的表達。根據本發明的核酸分子優選連接確保其在植物細胞中的表達的啟動子。在特別優選的實施方案中，該方法包含將根據本發明的核酸分子引入到植物細胞中并從該細胞再生植物。
表達的增加可如通過RNA印跡分析或蛋白質印跡分析來檢測。活性的增加可通過檢驗源自植物細胞的蛋白質提取物的淀粉降解活性來檢測。淀粉降解活性例如可如上所述或如本申請的實施所述例進行測量。
本發明也涉及本發明植物的繁殖材料。術語“繁殖材料”包含那些適用于無性或有性繁殖地產生后代的植物成分。無性繁殖的適當方法為如扦插、愈傷組織培養、根狀莖或塊莖。其他的繁殖材料包括如果實、種子、幼苗、原生質體、細胞培養物等。優選的繁殖材料是塊莖和種子。本發明也涉及本發明的植物的可收獲部分，如果實、種子、塊莖或根狀莖。
此外，在根據本發明的核酸分子的協助下，目前也可能生產具有減少的根據本發明的蛋白質的活性的植物細胞和植物，并從而導致淀粉降解的減少。該活性的減少可例如通過本發明的核酸分子的反義表達、適當的核酶的表達、共抑制作用、RNA干涉、通過所謂的“體內誘變”、抗體表達或通過顯性失活突變體的表達來實現。優選地，活性的減少通過抑制編碼本發明的淀粉降解酶的內源基因的表達而實現。
術語“淀粉降解的減少”優選指與相應的野生型細胞相比時，至少一種本發明的核酸分子的轉錄物的數量減少至少10％，更優選至少20％，更加優選至少50％，甚至更加優選至少70％，且特別優選至少90％。
在另一個優選的實施方案中，術語“淀粉降解的減少”指與相應的野生型細胞相比時，至少一種本發明的蛋白質的量減少至少10％，更優選至少20％，更加優選至少50％，甚至更加優選至少70％，且特別優選至少90％。
此外，“淀粉降解的減少”優選指與相應的野生型植物相比時，淀粉降解在基本所有的細胞、器官、組織或植物部分中減少了或僅在某些細胞、器官、組織或植物部分中減少。減少最優選指與相應的野生型細胞相比時，至少一種本發明的淀粉降解酶的活性減少至少10％，更優選至少20％，更加優選至少50％，特別為至少70％，且最優選至少90％。在特別優選的實施方案中，植物細胞或植物中的淀粉降解被完全抑制。本發明的蛋白質的淀粉降解活性可如實施例所述進行確定。
關于由SEQ ID NO7或其同源物編碼的根據本發明的蛋白質，顯示這種蛋白質活性減少，優選低于在低于相應野生型植物中可檢測水平的約50％的水平的轉基因植物展示至少一種下面的特征(i) 源葉片當在黑暗中保存不同時間間隔時，與在相同條件下培養的相應野生型植物的葉片相比具有較高的淀粉含量(即淀粉降解減少了)；(ii) 植物的源葉片當生長于光照中時，與在相同條件下生長的相應野生型植物的葉片相比具有較高的淀粉含量，特別是它們具有野生型植物的至少150％，更優選至少180％，且更加優選至少240％的淀粉含量。
關于由SEQ ID NO5或其同源物編碼的根據本發明的蛋白質，與相應野生型植物相比顯示減少這種蛋白質活性的轉基因植物展示至少一種下面的特征(i) 源葉片當在黑暗中保存不同時間間隔時，與在相同條件下培養的相應野生型植物的葉片相比具有較高的淀粉含量(即淀粉降解減少了)；(ii) 植物的源葉片當生長于光照中時，與在相同條件下生長的相應野生型植物的葉片相比具有較高的淀粉含量，特別是它們具有野生型植物的至少300％，優選至少350％，更優選至少400％，更加優選至少600％，且特別優選至少800％的淀粉含量；(iii) 這些植物的葉片與來自相應的野生型植物的葉片相比在黑暗中可存活更長時間。
編碼反義RNA的DNA分子以及這些反義分子也是本發明的目的，該反義RNA與本發明的DNA分子的轉錄物或相應基因組序列的內含子序列互補。為了在植物細胞轉錄中導致反義作用，這種DNA分子具有至少15bp的長度，優選長度超過100bp且最優選長度超過500bp，但通常短于5000bp，優選短于2500bp。
本發明進一步涉及在植物細胞表達中導致RNA合成的DNA分子，該RNA由于共抑制作用減少編碼所述蛋白質的本發明的核酸分子的表達。這種DNA分子可包含本發明核酸分子的編碼區或其部分和/或相應基因組序列的內含子序列。本發明也涉及由此編碼的RNA分子。共抑制的一般原則和相應方法為本領域技術人員眾所周知，并描述于如Jorgensen(Trends Biotechnol.8(1990)，340-344)、Niebel等人(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995)，91-103)、Flavell等人(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995)，43-56)、Palaqui和Vaucheret(Plant.Mol.Biol.29(1995)，149-159)、Vaucheret等人(Mol.Gen.Genet.248(1995)，311-317)和de Borne等人(Mol.Gen.Genet.243(1994)，613-621)、Smith(Curr.Biol.7(1997)，R793-R795)和Taylor(Plant Cell 9(1997)，1245-1249)。
為了以上述的反義方法或用共抑制方法在植物細胞中抑制根據本發明的核酸分子的表達，優選使用顯示與編碼根據本發明的蛋白質的相應內源存在的基因的核苷酸序列具有至少90％的同源性程度的DNA分子，更優選至少93％，更加優選至少95％，且最優選至少98％。
本發明另外涉及編碼RNA的DNA分子，該RNA當在植物細胞中表達后導致本發明的編碼所述蛋白質的核酸分子的表達由于RNA干涉(RNAi)而減少。編碼的RNA同樣屬于本發明的范圍。
與用反義技術相似的作用可通過生產表達適當的以介導RNA干涉(RNAi)作用的構建體的植物轉基因植物而實現。因而，雙鏈RNA的形成導致以序列特異方式抑制基因表達。更具體地，在RNAi構建體中，包含要失活的基因編碼區的有義部分(或其具有或不具有非翻譯區的部分)由相應的反義序列部分相繼。在兩個部分之間，可插入不必源自相同基因的內含子。在轉錄后，RNAi構建體形成了典型的發夾結構。與本發明的方法一致，RNAi技術可如由Smith(Nature 407(2000)，319-320)或Marx(Science 288(2000)，1370-1372)所述進行實施。
在進一步的實施方案中，本發明涉及編碼具有核酶活性的RNA分子的DNA分子以及這些編碼的RNA分子，該RNA分子特定地切割本發明的DNA分子的轉錄物。
核酶是能夠切割RNA分子和特定的目標序列的催化活性的RNA分子。依靠重組DNA技術，可能改變核酶的特異性。有多種類型的核酶。對于目標在于對某些基因的轉錄物的進行特定切割的實踐應用，優選使用兩種不同類型的核酶的代表物。第一類由屬于I組內含子核酶類型的核酶組成。第二組由展示作為特有的結構特征，所謂的“錘頭”基元的核酶組成。對目標RNA分子的特異性識別可通過改變該基元側翼的序列而修飾。通過與目標分子中序列的堿基配對，這些序列確定發生催化反應并因而切割目標分子的位置。由于對于有效切割的序列要求低，所以原則上可能對實際上每一種所需RNA分子開發特定的核酶。
為了生產編碼特異性切割本發明DNA分子轉錄物的核酶的DNA分子，可例如將編碼核酶催化結構域的DNA序列在兩側與目標酶序列的同源DNA序列進行連接。例如編碼催化結構域的序列可為SCMo病毒的衛星DNA的催化結構域(Davies等人，Virology 177(1990)，216-224)或TobR病毒的衛星DNA的催化結構域(Steinecke等人，EMBO J.11(1992)，1525-1530；Haseloff和Gerlach，Nature 334(1988)，585-591)。催化結構域側翼的DNA序列優選源自本發明上述的DNA分子。核酶表達的一般原則和方法描述于如EP-B1 0 321 201中。植物細胞中核酶的表達描述于如Feyter等人(Mol.Gen.Genet.250(1996)，329-338)中。
植物細胞中根據本發明的蛋白質活性的減少也可通過所謂的“體內誘變”(也已知為“雜合體(chimeraplasty)”)來實現。在該方法中，將雜交的RNA/DNA寡核苷酸雜合體引入到細胞中(Kipp等人，PosterSession at the 5th International Congress of Plant Molecular Biology，1997年9月21日-27日，新加坡；Dixon和Arntzen，“轉基因植物中的代謝工程(Metabolic Engineering in Transgenic Plants)”Keystone研討會上的會議報告，Copper Mountain，CO，USA，TIBTECH 15(1997)，441-447；國際專利申請WO 95/15972；Kren等人，Hepatology25(1997)，1462-1468；Cole-Strauss等人，Science 273(1996)，1386-1389；Zhu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(1999)，8768-8773)。RNA/DNA寡核苷酸的DNA成分的一部分與在植物細胞中內源存在的且編碼根據本發明的蛋白質的核苷酸序列同源，但展示突變或在同源區內包含異源部分。由于與內源序列同源的RNA/DNA寡核苷酸區域與這些序列的堿基配對，并伴隨著同源重組，所以在寡核苷酸的DNA成分中含有的突變可引入到植物細胞基因組中。這導致根據本發明的蛋白質的活性的減少。
此外，編碼特異性識別植物細胞中根據本發明的蛋白質，即這種蛋白質的特定片段或抗原決定部位的抗體的核酸分子可用于抑制該蛋白質的活性。這些抗體可為單克隆抗體、多克隆抗體或合成抗體以及抗體片段，如Fab、Fv或scFv片段等。單克隆抗體可通過如最初在Khler和Milstein(Nature 256(1975)，495)和Galfré(Meth.Enzymol.73(1981)3)中描述的技術來制備，該方法包含將小鼠骨髓瘤細胞與源自被免疫的哺乳動物的脾細胞融合。此外，針對前述肽的抗體或其片段可通過用描述于如Harlow和Lane“Antibodies，A LaboratoryManual”，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988中的方法獲得。抗體或抗體樣分子的在植物中的表達可通過本領域眾所周知的方法實現，如全長的抗體(Düring，Plant.Mol.Biol.15(1990)，281-293；Hiatt，Nature 342(1989)，469-470；Voss，Mol.Breeding 1(1995)，39-50)、Fab-片段(De Neve，Transgenic Res.2(1993)，227-237)、scFvs(Owen，Bio/Technology 10(1992)，790-794；Zimmermann，Mol.Breeding 4(1998)，369-379；Tavladoraki，Nature 366(1993)，469-472)和dAbs(Benvenuto，Plant Mol.Biol.17(1991)，865-874)已成功地表達于煙草、馬鈴薯(Schouten，FEBS Lett.415(1997)，235-241)或擬南芥(Arabidopsis)中，達到了高達總蛋白質6.8％的表達水平(Fiedler，Immunotechnology 3(1997)，205-216)。
此外，編碼根據本發明的蛋白質的突變型的核酸分子可用于干擾野生型蛋白質的活性。這種突變型優選喪失其淀粉降解活性并可通過在蛋白質的氨基酸序列中缺失、替換和/或添加氨基酸的途徑衍生自相應的野生型蛋白質。這種蛋白質的突變型除喪失激酶活性之外，可顯示增加的底物親和力和/或升高的細胞內穩定性，例如歸因于插入了在細胞環境中使蛋白質穩定的氨基酸。這些突變型可為天然存在的，或優選為遺傳改造的突變體。
此外，對于本領域技術人員顯而易見的是上述的反義、核酶、RNA干涉、共抑制、體內誘變、抗體表達和顯性突變作用也可用于減少如下基因的表達編碼調節蛋白質如控制本發明的蛋白質表達的轉錄因子或如對于本發明蛋白質的活化所必需的蛋白質的基因。
由本發明的公開內容同樣顯而易見的是上述策略的任何組合都可用于生成轉基因植物，該轉基因植物由于在其細胞中有一和多種上述外源核酸分子而顯示與相應的源植物相比減少的淀粉降解活性。這種組合可通過例如使轉基因植物進行雜交而將相應的核酸分子(共)轉化入植物細胞、植物組織或植物中而完成，該轉基因植物已通過本發明的上述方法的不同實施方案而生成。同樣地，用本發明的方法可獲得的植物可與其他轉基因植物進行雜交，從而獲得增加的淀粉積累和其他遺傳改造的性狀的組合，如逆境耐受性或修飾的淀粉生物合成。
在進一步的實施方案中，本發明涉及含有上述DNA分子的載體，該DNA分子在植物中的表達導致本發明的蛋白質活性的減少，具體涉及其中所述DNA分子與確保其在植物細胞中轉錄的調節元件連接的載體。
此外，本發明涉及含有所述的DNA分子或載體的宿主細胞。該宿主細胞可為原核細胞如細菌細胞，或真核細胞。真核宿主細胞優選為植物細胞。
此外，本發明涉及轉基因植物細胞，其中外源核酸分子的存在或表達導致編碼根據本發明的蛋白質的內源基因表達的減少或完全抑制。
在優選的實施方案中，外源核酸分子選自(a) 編碼可導致編碼根據本發明的蛋白質的內源基因表達減少的反義-RNA或RNAi構建體的DNA分子；(b) 可經由共抑制作用而導致編碼根據本發明的蛋白質的內源基因表達減少的DNA分子；(c) 編碼核酶的DNA分子，該核酶可特異性切割編碼根據本發明的蛋白質的內源基因的轉錄物；和(d) 經由體內誘變而引入的核酸分子，其導致在編碼根據本發明的蛋白質的內源基因中的突變或異源序列的插入，從而導致根據本發明的蛋白質表達的減少或導致無活性蛋白質的合成。
這些轉基因植物細胞可根據眾所周知的技術再生為完整的植物。因而，本發明也涉及可通過從所述的轉基因植物細胞再生而獲得的植物以及含有所述的轉基因植物細胞的植物。
此外，本發明涉及由所述DNA分子編碼的反義RNA分子以及具有核酶活性的RNA分子和導致共抑制作用或RNA干涉的RNA分子，這些RNA分子可通過如轉錄而獲得。
本發明進一步的主題是生產轉基因植物細胞的方法，該細胞與非轉化的細胞相比顯示減少的淀粉降解。在該方法中，由本發明的核酸分子編碼的蛋白質的量或活性在植物細胞中是減少的，該蛋白質在細胞中以內生形式存在。
在優選的實施方案中，該減少依靠反義作用實現。為此目的，本發明的DNA分子或其部分以反義的方向與確保在植物細胞中轉錄的啟動子和可能與確保轉錄終止以及轉錄物的聚腺苷酸化的終止信號相連接。也可能使用相應的基因組序列的內含子序列。為了確保在植物中起有效反義作用，合成的反義RNA應展示最小長度為15個核苷酸，優選為至少100個核苷酸，且最優選為至少500個核苷酸。此外，編碼反義RNA的DNA序列應該關于要轉化的植物物種同源。
在進一步的實施方案中，由本發明的DNA分子編碼的蛋白質的量減少通過核酶作用實現。核酶的基本作用以及編碼這種RNA分子的DNA分子構建體已經描述如上。為了在轉基因植物中表達具有核酶活性的RNA，使編碼核酶的上述DNA分子與確保在植物中轉錄的DNA元件連接，具體而言為啟動子和終止信號。在植物細胞中合成的核酶導致本發明的DNA分子轉錄物的切割，該轉錄物以內生形式存在于植物細胞中。
減少本發明核酸分子編碼的蛋白質量的進一步的可能操作是共抑制。因此，通過本發明的該方法可獲得的植物細胞是進一步的主題。這些植物細胞表征為其由本發明DNA分子編碼的蛋白質量減少，且與野生型細胞相比它們顯示減少的淀粉降解。
同樣，淀粉降解的這種減少可通過在植物細胞中實施RNA干涉作用而實現。為此目的，可將編碼RNAi構建體的DNA分子克隆入含有在植物細胞中表達所必需的控制元件的適當表達載體中，該RNAi構建體對于本發明核酸分子的轉錄物具有特異性且可根據上述RNA干涉工作原理來制備。
優選，轉基因細胞與相應的非轉化細胞相比顯示編碼根據本發明蛋白質的轉錄物的量減少至少10％，更優選至少20％，更加優選至少50％，甚至更加優選至少70％，且最優選至少90％。該轉錄物的量可通過如RNA印跡分析進行確定。此外，該細胞優選地顯示根據本發明的蛋白質量的相應減少。這可通過如免疫學方法如蛋白質印跡分析來確定。
或者，植物細胞當與相應的非轉化細胞相比時，顯示根據本發明蛋白質活性減少至少10％，更優選為至少20％，更加優選至少50％，甚至更加優選至少70％，且最優選至少90％。本發明的蛋白質的活性可通過如在實施例中描述的進行確定。
通過減少細胞中本發明蛋白質的量，該細胞顯示淀粉降解的減少，這在如背景部分中描述的某些情況為有益。通過利用適當的啟動子，淀粉降解活性的減少可在所有或基本所有的植物細胞中發生，或可限制于植物的某些器官、細胞類型或組織中，可由外部因子誘導或僅發生于植物的某些發育階段。
此外，本發明涉及通過再生所述植物細胞而可獲得的植物以及含有根據本發明的所述的細胞的植物。
原則上，轉基因植物可為任何植物物種的植物，即它們可為單子葉和雙子葉植物。優選，該植物為人們為商業目的培養的有用植物，特別是為營養目的或技術的，特別為工業目的，例如用于生產酒精的植物。它們優選為淀粉貯藏植物，例如谷類物種(黑麥、大麥、燕麥、小麥、谷子、西米等)、水稻、豌豆、marrow pea、木薯和馬鈴薯；番茄、油菜、大豆、大麻、亞麻、向日葵、豇豆或竹芋、纖維形成植物(如亞麻、大麻、棉花)、貯藏油的植物(如油菜、向日葵、大豆)和貯藏蛋白質的植物(如豆科植物、谷類、大豆)。本發明也涉及水果植物或樹和棕櫚，如葡萄。此外，本發明涉及飼料植物(如飼料和牧場植物如草、苜蓿、三葉草、黑麥草(ryegrass))和蔬菜植物(如馬鈴薯、萵苣、菊苣)和裝飾植物(如郁金香、風信子)。優選貯藏淀粉植物。特別優選甘蔗和甜菜及馬鈴薯植物、玉米、水稻、小麥和番茄植物。
本發明也涉及含有根據本發明的轉基因植物的本發明植物的繁殖材料。對于術語“繁殖材料”的定義見上。
最后，本發明也涉及根據本發明的蛋白質在洗滌劑或沖洗劑中作為淀粉降解劑的用途以及涉及包含根據本發明蛋白質的洗滌劑或沖洗劑。衣服的變臟經常由食品導致。該食品可含有淀粉，該淀粉處于相互粘著的狀態。含有淀粉降解酶的洗滌劑應能夠降解淀粉，然后該淀粉可從臟的纖維中去除。該機制支持清潔程序。相同的機制也支持對臟的碟碗的清潔，尤其當使用洗碗機時。在洗碗機中，器皿不是機械地以將干燥的食品從器皿上刮去而清潔的。當使用水池替代洗碗機時，沖洗中的淀粉降解酶也應該能夠支持對碟碗的清潔。
這些和其他的實施方案已被公開并對技術人員顯而易見，并包含于本發明的說明和實施例中。關于上述方法、手段和應用之一的額外的文獻可從現有技術獲得，如從公共圖書館中通過用如電子方法獲得。該目的等可由公共數據庫滿足，如可經由英特網在如地址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html獲得的“medline”。其他數據庫和地址對于技術人員是已知的且可從英特網獲得，如在地址http//www.lycos.com之下。關于生物技術中的專利和專利申請的原始資料和信息的總結包含于Berks，TIBTECH 12(1994)，352-364中。
此外，在此處無論那里出現的術語“和/或”包括“和”、“或”和“由該術語相聯的全部或任何其他的元件組合”的意思。
所有上述提及的專利公開內容、出版物和數據庫條目均特定地在此處整體引用作為參考，如同每一個單獨的專利、出版物或條目具體單獨引用作為參考。
圖1表示在用碘蒸氣染色之后的表達ppt-β-淀粉酶序列或空的pSK載體的大腸桿菌菌株KV832。盡管含有空載體的細胞染為藍色，但表達ppt-β-淀粉酶的細胞不染色，顯示細胞中的直鏈葡聚糖被ppt-β-淀粉酶所降解。
圖2表示通過用含有支鏈淀粉的分離膠的不連續PAGE對ppt-β-淀粉酶水解活性的確定。作為負對照，將總的可溶性蛋白質從表達空的pET28a載體的大腸桿菌菌株BL21-CodonPlusTMRIL中分離(泳道1和2和7和8)。在后面的4個泳道中，總的可溶性蛋白質從表達pHIS-ppt-β-淀粉酶的大腸桿菌菌株BL21-CodonPlusTMRIL中分離(泳道3～6)。ppt-β-淀粉酶的水解活性可通過在用碘溶液染色之后的凝膠的負染色來檢測，顯示支鏈淀粉是降解的。箭頭顯示ppt-β-淀粉酶的活性。
圖3表示pHIS-BMY融合蛋白質的pHIS-ppt-β-淀粉酶活性。
來自含有pHIS-ppt-β-淀粉酶融合蛋白質的誘導細胞的大腸桿菌可溶性蛋白質組分的水解活性以PNPG5作為β-淀粉酶的底物，以PNPG7作為α-淀粉酶的底物，且以對硝基苯基糖苷作為α-葡萄糖苷酶的底物。作為對照，使用來自含有空載體pET28a的誘導細胞的大腸桿菌可溶性蛋白質組分。
圖4表示將未加工的可溶性馬鈴薯淀粉與pHIS-ppt-β-淀粉酶融合蛋白質溫育之后的水解產物。
使來自含有pHIS-ppt-β-淀粉酶融合蛋白質的誘導細胞和來自含有空載體pET28a的誘導細胞的大腸桿菌可溶性蛋白質組分與10g L-1未加工的或者可溶性的馬鈴薯淀粉溫育12小時。形成的產物通過TLC進行分離并通過用硫酸碳化而染色。標準化合物；G1，Glc；G2-G7，鏈長為2～7個Glc殘基的麥芽糖寡糖。泳道1；pHIS-ppt-β-淀粉酶蛋白質加未加工的淀粉，泳道2；含有空載體的細胞加未加工的淀粉，泳道3；pHIS-ppt-β-淀粉酶蛋白質加可溶性淀粉，泳道4；含有空載體加可溶性淀粉。
圖5表示PPT-BMYI的質體導向。
使豌豆葉綠體與35S-標記的PPT-BMYI蛋白質進行溫育。泳道1含有用于輸入試驗的體外翻譯的前體蛋白(pre-protein)。泳道2含有從與放射性標記的體外翻譯產物進行溫育之后回收的葉綠體分離的蛋白質。泳道3含有來自與標記的前體蛋白進行溫育并用蛋白酶嗜熱芽孢桿菌蛋白酶進行后處理的葉綠體蛋白質。泳道4如泳道3所給出的，只是葉綠體用嗜熱芽孢桿菌蛋白酶和去污劑Triton X-100進行后處理。千道爾頓(kilodalton)的蛋白質分子量標記在右邊給出。pre，前體蛋白；m，成熟蛋白質。α-ppt-β-淀粉酶的葉片顯示淀粉過剩表型。
圖6表示PPT-BMYI反義品系顯示mRNA量和β-淀粉酶活性的減少。
(a) 對于4℃貯藏了1日的PPT-BMYI反義品系的源葉片中mRNA的量進行了RNA凝膠印跡分析。使20μg從不同組織分離的總RNA在凝膠分離及隨后將RNA轉移到尼龍膜上之后用PPT-BMYcDNA探針進行雜交。
(b) 在黑暗期開始后2個小時確定馬鈴薯源葉片中的β-淀粉酶活性。來自PPT-BMYI反義品系的源葉片中的植物材料用PNPG5測定β-淀粉酶活性。結果為5個單獨的酶提取物的平均數±SE。*指不同轉基因品系(#8、#10、#11和#28)與相應的野生型(wt)值在5％的水平上的顯著差異(Students t-檢驗)。
圖7表示與未轉化的對照相比在PPT-BMYI反義品系中的β-淀粉酶活性百分比。
圖8表示α-ppt-β-淀粉酶品系#8、#10、#11、#28的葉片和未轉化的對照的葉片，這些葉片用鋁箔覆蓋72小時以使其處于黑暗中。之后，將葉片用碘溶液對淀粉進行染色。72小時之后，野生型葉片和品系#28的葉片中的淀粉被降解了，而品系#8、#10和#11中的葉片仍然含有淀粉。
圖9表示在黑暗/光照期結束時PPT-BMYI反義品系#8、#10、#11、#28和野生型的15周齡源葉片中淀粉含量。實心的柱(closed bar)代表在光照期結束時的淀粉含量；空心的柱(open bar)代表在光照期結束時的淀粉含量。淀粉含量為每m2己糖當量mmol。
圖10表示在用碘蒸氣染色之后表達CSD23序列或空的pSK載體的大腸桿菌菌株KV832。盡管含有空載體的細胞染為藍色，但表達CSD23蛋白質的細胞不染色，這顯示CSD23蛋白質在細胞中降解直鏈葡聚糖。
圖11表示通過用含有直鏈淀粉的分離膠的不連續PAGE對CSD23蛋白質水解活性的確定。作為負對照，將總的可溶性蛋白質從表達空的pSK載體的大腸桿菌菌株DH5α中分離(泳道1～3)。在后面的4個泳道中，總的可溶性蛋白質從表達CSD23蛋白質的大腸桿菌菌株DH5α中分離(泳道3～7)。作為正對照，總的可溶性蛋白質從表達馬鈴薯的另一個β-淀粉酶同工型(CF-β)(Scheidig，1987)的大腸桿菌菌株DH5α中分離(泳道8～10)。SHI蛋白質和β-淀粉酶的水解活性可通過在用碘溶液染色之后的凝膠的負染色來檢測，顯示直鏈淀粉被降解。
圖12表示在用碘蒸氣染色之后表達CSD12序列或空的pSK載體的大腸桿菌菌株KV832。盡管含有空載體的細胞染為藍色，但表達CSD12的細胞染為較淺的藍色，這顯示CSD12蛋白質在細胞中降解直鏈葡聚糖。
圖13表示在用碘蒸氣染色之后表達SHI序列或空的pSK載體的大腸桿菌菌株KV832。盡管含有空載體的細胞染為藍色，但表達SHI蛋白質的細胞不染色，這顯示SHI蛋白質在其中降解直鏈葡聚糖。
圖14表示通過用含有支鏈淀粉的分離膠的不連續PAGE對SHI蛋白質水解活性的確定。作為負對照，總的可溶性蛋白質從表達空的pSK載體的大腸桿菌菌株DH5α中分離(泳道1～3)。在后面的4個泳道中，總的可溶性蛋白質從表達SHI蛋白質的大腸桿菌菌株DH5α中分離(泳道3～7)。作為正對照，總的可溶性蛋白質從表達馬鈴薯的另一個β-淀粉酶同工型(CF-β)(Scheidig，1987)的大腸桿菌菌株DH5α中分離(泳道8～10)。SHI蛋白質和β-淀粉酶的水解活性可通過在用碘溶液染色之后的凝膠的負染色來檢測，這顯示支鏈淀粉被降解。
圖15使200μl表達SHI蛋白質或空的pSK載體的大腸桿菌DH5α細胞的總可溶性蛋白質與200μl支鏈淀粉溶液溫育24小時。隨后將溶液用碘染色以顯示支鏈淀粉的降解。左邊為負對照(表達空載體的大腸桿菌DH5α細胞的總可溶性蛋白質+支鏈淀粉)，右邊為表達SHI蛋白質的大腸桿菌DH5α細胞的總可溶性蛋白質+支鏈淀粉。盡管在負對照中支鏈淀粉被碘染色，但與SHI蛋白質溫育的支鏈淀粉被降解了且不被碘染色。
圖16表示可溶性馬鈴薯淀粉與SHI蛋白質溫育之后的水解產物。
將來自含有SHI蛋白質的誘導細胞的和來自含有空載體pSK的細胞的大腸桿菌可溶性蛋白質組分各自與10g L-1的可溶性馬鈴薯淀粉進行溫育。形成的產物通過TLC進行分離并通過用硫酸碳化來染色。標準化合物；G1，Glc；G2-G7，鏈長為2～7個Glc殘基的麥芽糖寡糖。作為正對照，總的可溶性蛋白質從表達馬鈴薯的另一個β-淀粉酶同工型(CF-β)(Scheidig，1987)的大腸桿菌菌株DH5α中分離并如上所述與可溶性淀粉進行溫育。
1.標準2.，5.和8.表達空載體pSK的大腸桿菌DH5α細胞的可溶性蛋白質組分+可溶性淀粉3.，6.和9.表達SHI蛋白質的大腸桿菌DH5α細胞的可溶性蛋白質組分+可溶性淀粉4.，7.和10.表達CF-β蛋白質的大腸桿菌DH5α細胞的可溶性蛋白質組分+可溶性淀粉11.標準2、3和4的溫育時間為室溫4小時，5、6和7為6小時，且8、9和10為8小時。
圖17表示SHI蛋白質具有α-淀粉酶活性。
來自含有SHI蛋白質的誘導細胞的大腸桿菌可溶性蛋白質組分的水解活性以PNPG5作為β-淀粉酶的底物，以PNPG7作為α-淀粉酶的底物，且以對硝基苯基糖苷作為α-葡萄糖苷酶的底物。作為對照，使用了來自含有空載體pSK的誘導細胞的大腸桿菌可溶性蛋白質組分。
圖18表示SHI的質體導向。
將豌豆葉綠體與35S-標記的SHI 100GFP蛋白質進行溫育。泳道1含有用于輸入試驗的體外翻譯的前體蛋白。泳道2含有在與放射性標記的體外翻譯產物溫育之后回收的葉綠體中分離的蛋白質。泳道3含有來自與標記的前體蛋白和用蛋白酶嗜熱芽孢桿菌蛋白酶后處理的葉綠體中的蛋白質。泳道4同泳道3，只是葉綠體用嗜熱芽孢桿菌蛋白酶和去污劑Triton X-100進行后處理。千道爾頓的蛋白質分子量標記在右邊給出。pre，前體蛋白；m，成熟蛋白質。
圖19表示對α-SHI短馬鈴薯植物葉片中過渡淀粉降解的確定。與野生型相比，3個品系在調動過渡葉淀粉的能力中顯示有差異。將α-SHI短品系#46、#51、#56、#58和野生型的葉片用鋁箔覆蓋64小時以使其處于黑暗中。之后將葉片用碘溶液對淀粉進行染色。64小時之后，野生型和品系#46葉片的淀粉被降解，而品系#51、#56和#58的葉片中仍含有淀粉。
圖20表示對α-SHI短煙草植物葉片中過渡淀粉降解的確定。與野生型相比，3個品系在調動過渡葉淀粉的能力中顯示有差異。將α-SHI短品系#18、#31、#37、#46、#47和野生型的葉片用鋁箔覆蓋12小時以使其處于黑暗中。之后將葉片用碘溶液對淀粉進行染色。12小時之后，野生型葉片中的淀粉被降解，而品系#18、#31、#37、#46和#47的葉片中仍含有淀粉。
圖21表示對α-SHIL700馬鈴薯植物葉片中過渡淀粉降解的確定。與野生型相比，4個品系在調動過渡葉淀粉的能力中顯示有差異。將α-SHIL700品系#16、#41、#46、#53和野生型的葉片用鋁箔覆蓋72小時以使其處于黑暗中。之后將葉片用碘溶液對淀粉進行染色。72小時之后，野生型葉片中的淀粉被降解，而品系#16、#41、#46和#53的葉片中仍含有淀粉。
圖22表示α-SHI短的反義的葉片在置于黑暗中14天之后有生活力。
將SHI短的反義植物(品系#51、#56和#58)的源葉片和未轉化的對照的源葉片用鋁箔覆蓋14天。盡管未轉化的葉片死亡，但反義品系#51、#56和#58(從左到右)的葉片仍然有生活力。
圖23表示在黑暗/光照期結束時α-SHI短的反義品系#46、#51、#56、#58和野生型的15周齡源葉片中的淀粉含量。空心的柱(openbar)代表在光照期結束時的淀粉含量；實心的柱(closed bar)代表在黑暗期結束時的淀粉含量。淀粉含量為每m2己糖當量mmol。
圖24示意性地表示ppt-β-淀粉酶的反義構建體。
圖25示意性地表示含有全長SHI cDNA的2.3kb片段的SHI蛋白質的反義構建體。
圖26示意性地表示含有SHI cDNA的1.2 kb片段的SHI蛋白質的反義構建體。
圖27示意性地表示CSD12蛋白質的反義構建體。
圖28示意性地表示CSD23蛋白質的反義構建體。
下面的實施例闡明了本發明。
實施例1編碼淀粉降解酶的cDNA的克隆對于分離編碼淀粉降解酶的cDNA，使用了功能性篩選方法。創建2個馬鈴薯λZapII cDNA文庫。一個從馬鈴薯源葉片mRNA制備(在光照結束前2小時和之后額外的2小時，每30分鐘收獲一次葉片)，另一個通過用λZapII cDNA合成試劑盒(Stratagene)從于4℃貯藏10天的馬鈴薯塊莖制備。然后根據生產商的流程通過體內大量切除而將λZapII cDNA文庫轉變為質粒文庫。
對于功能性篩選，使用不具有糖原分支酶活性的突變的大腸桿菌品系(KV832)。將該品系用含有大腸桿菌glgC16基因的質粒pACYC-184(New England Biolabs)進行轉化，該glgC16基因編碼酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的非調節的形式(Creuzat-Sigal等人，在Biochemistry of the glycoside linkage，Eds.Piras和Pontis；New York，USA，Academic Press(1972)，647-680)。該質粒命名為pACAG且其構建體描述于Kossmann等人(Planta 208/1999，503-511)中。當表達glgC16時，KV832積聚大量的直鏈葡聚糖，且因此當生長于補充了1％(w/v)葡萄糖的YT培養基上時，菌落暴露于碘蒸氣時染為藍色。
將含有pACAG的KV832細胞用質粒文庫轉化以獲得35000cfu，并于37℃生長于含有1％(w/v)的葡萄糖、1mM IPTG和適當的抗生素的固體YT培養基上過夜。然后將細胞用碘蒸氣進行染色。將顯示淺藍色染色或根本沒有染色的菌落(參見如圖1)分離并提取其中的質粒。該表型通過用KV832∷pACAG的再轉化進行證實。鑒定了許多質粒并在用限制性內切酶消化后分為不同的類型。來自各個類型的不同質粒的插入物的DNA序列用商業上可購得的服務進行了確定。
實施例2從馬鈴薯分離編碼ppt-β-淀粉酶的cDNA對根據實施例1分離的質粒之一的插入物的序列分析顯示它編碼β-淀粉酶，并對其進行了進一步的分析。該質粒含有1635bp的可讀框，編碼具有61 kD預測分子量的蛋白質(參見SEQ ID Nos7和8)。認為該序列是全長，因為在5’非翻譯區中緊靠在預測的起始密碼子前發現了終止密碼子。該蛋白質與植物葉綠體外β-淀粉酶有高的氨基酸相似性，然而與這些β-淀粉酶相比它也具有N-末端的延長。最近鑒定的來自擬南芥的β-淀粉酶也含有N-末端的延長(Lao等人，Plant J.20(1999)，519-527)。該研究的作者可顯示該β-淀粉酶導向于葉綠體，并指定為蛋白質CT-BMY，即葉綠體導向的β-淀粉酶。
實施例3功能性分析顯示ppt-β-淀粉酶是活性的β-淀粉酶為了證實在實施例2中描述的ppt-β-淀粉酶是否具有β-淀粉酶活性，使融合到提供His-標簽的序列的全長cDNA在大腸桿菌中進行表達。為了分離重組ppt-β-淀粉酶蛋白質，將ppt-β-淀粉酶cDNA克隆入pET表達系統中。編碼ppt-β-淀粉酶蛋白質的序列通過PCR(5’引物5’-gtccgcggatccATGACTTTAACACTTCAATC-3’；小寫的核苷酸添加以形成BamHI位點；將T7引物用作3’引物)用Pfu-TurboDNA聚合酶(Stratagene)進行擴增。將結果所得的PCR產物用BamHI和XhoI進行消化，并連接入表達載體pET28a(Novagen)中以生成pHIS-ppt-β-淀粉酶，該淀粉酶在N-末端含有6×His-標簽。
編碼的pHIS-ppt-β-淀粉酶融合蛋白質的表達于37℃由IPTG誘導在大腸桿菌BL21-CodonPlusTMRIL感受態細胞(Stratagene)中進行。總的可溶性蛋白質從誘導的細胞中制備，該誘導的細胞僅含有空的表達載體，或者含有載體pHIS-ppt-β-淀粉酶。來自100ml細胞培養物的大腸桿菌細胞在離心后收集，并重懸于400μL緩沖液中，該緩沖液含有50mM Mops-KOH，pH7.5，20mM MgCl2，2mM CaCl2，1mM EDTA和0.1％(v/v)β-巰基乙醇。加入約400μL的玻璃珠(直徑為0.25-0.5mm)，并在冰上有停頓地將細胞在30秒內漩渦振蕩4次以裂解細胞。在20000g于4℃離心15分鐘之后，對含有可溶性蛋白質組分的大腸桿菌裂解產物進行測定。β-淀粉酶和α-淀粉酶的活性通過用來自Megazyme(Sydney，澳大利亞)的測定試劑盒檢測麥芽糖寡糖的降解而確定，該麥芽糖寡糖在還原端通過糖苷鍵連接對硝基苯基基團。為了確定α-葡糖苷酶的活性，將對硝基苯基糖苷用作底物。為了確定大腸桿菌裂解產物中的β-淀粉酶活性，將50μL裂解產物與225μL 100mM的Mes-KOH，pH6.2，1mM EDTA和0.1％(v/v)β-巰基乙醇混合。測定通過加入25μL底物和偶聯酶(終濃度為0.4mM寡糖和2.5單位α-葡糖苷酶)而開始，并在40℃進行10分鐘之后通過加入2.5體積的1％(w/v)Trizma-堿(Sigma)而終止。活性作是以為在410nm分光光度測定的釋放的p-nitrophenolate而確定。
對于植物材料中β-淀粉酶活性的確定，將冰凍的葉片(leaf disc)在150μL緩沖液中進行提取，該緩沖液含有50mM的Mops-KOH，pH7.5，20mM MgCl2，2mM CaCl2，1mM EDTA和0.1％(v/v)β-巰基乙醇，3％(w/v)PEG-8000和2％(w/v)聚乙烯聚吡咯烷酮。將樣品于4℃和20000g離心10分鐘，并將上清夜用于β-淀粉酶活性的測量。將25μL植物提取物與250μL含有100mM的Mes-KOH，pH6.2，1mM EDTA和0.1％(v/v)β-巰基乙醇的緩沖液進行混合。β-淀粉酶活性通過檢測麥芽糖寡糖的降解而確定，該麥芽糖寡糖在還原端通過糖苷鍵連接對硝基苯基基團。β-淀粉酶的特定底物是非阻斷的對硝基苯基麥芽五糖(PNPG5)。結果顯示來自含有pHIS-ppt-β-淀粉酶的誘導細胞的可溶性蛋白質組分與PNPG5反應，而那些來自含有空的pET28a載體的對照的不反應。為了進一步研究催化活性，同樣將PNPG7和對硝基苯基糖苷用作底物。PNPG7是在非還原端化學阻斷的對硝基苯基麥芽七糖，用于檢測α-淀粉酶的活性，對硝基苯基糖苷是可用于確定α-葡糖苷酶活性的底物。結果表示于圖3中。對于兩種底物，在含有pHIS-ppt-β-淀粉酶和空載體的誘導細胞之間未檢測到差異。這證實ppt-β-淀粉酶僅有β-淀粉酶，且不具有其他的淀粉分解活性。
同樣可能通過用含有支鏈淀粉的分離膠經不連續的PAGE來顯示pHIS-ppt-β-淀粉酶的水解活性。為此目的，將酶用含有支鏈淀粉的分離膠經不連續的PAGE進行分離，如Hill等人(Plant Cell Environ.19(1996)，1223-1237)所描述。分離膠(0.75mm)含有7.5％(w/v)的聚丙烯酰胺(30∶0.8)(丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺)、0.6％(w/v)的馬鈴薯支鏈淀粉或直鏈淀粉(Sigma)和375mM Tris-HCl(pH8.8)。積層膠含有3％(w/v)的聚丙烯酰胺和63mM Tris-HCl(pH6.8)。將凝膠于4℃在30mA的恒定電流(兩個凝膠)中電泳1.5小時(MiniProtean 2 system，Bio-Rad)。電泳后，將凝膠在水中洗滌兩次，并于20℃在含有0.1mM的Mes-KOH(pH6.2)、2mM CaCl2和0.1％(v/v)β-巰基乙醇的緩沖液中溫育1.5小時。然后將凝膠在水中洗滌10分鐘，并用碘染色以檢測支鏈淀粉或直鏈淀粉的降解。這些實驗的結果顯示于圖2中。
β-淀粉酶活性的產物僅為麥芽糖，而α-淀粉酶產生例如一系列麥芽糖寡糖。為了顯示對于pHIS-ppt-β-淀粉酶也是如此，將可溶性蛋白質組分與溶解的淀粉或與未加工的馬鈴薯淀粉顆粒進行溫育，且產物在TLC-平板上分離。為此目的，使50μL大腸桿菌裂解產物在含有100mM的Mes-KOH，pH6.2、1mM EDTA、0.1％(v/v)β-巰基乙醇的緩沖液中與1％(w/v)可溶性未加工的馬鈴薯淀粉或支鏈淀粉(Sigma)進行溫育。將反應混合物加入到TLC平板上(Silicagel F60，Merck)。將平板用含有異丙醇∶丁醇∶水(12∶3∶4)的洗脫液顯影兩次。將葡萄糖和麥芽糖寡糖(2～7個葡萄糖殘基)的混合物用作標準。形成的產物通過用10％(v/v)的H2SO4濕潤平板的碳化來顯現。或者，對反應混合物用碘溶液進行染色以顯示可溶性淀粉或支鏈淀粉的降解。結果顯示于圖4中。在兩種情況下，水解產物均為麥芽糖，證明pHIS-ppt-β-淀粉酶蛋白質能夠降解溶解的淀粉和馬鈴薯淀粉顆粒。
實施例4將ppt-β-淀粉酶輸入到分離的葉綠體中為了確定ppt-β-淀粉酶蛋白質是否含有質體導向序列，進行了體外蛋白質輸入實驗。根據生產商的說明書(Promega)，將ppt-β-淀粉酶cDNA在體外進行轉錄并將產物在TNT網織紅細胞裂解產物體系中進行翻譯，在其中使用35S甲硫氨酸以產生35S-標記的ppt-β-淀粉酶前體。如所預測的，ppt-β-淀粉酶的前體蛋白具有約61 kD的分子量。將葉綠體從豌豆葉片中分離，如Bartlett等人(Methods in ChloroplastsMolecular Biology；Eds.Edelmann，Hallick和Chua；Amsterdam，荷蘭；Elsevier Biochemical Press(1982)，1081-1091)所描述。蛋白質輸入試驗在輸入緩沖液(250mM山梨糖醇、10mM甲硫氨酸、25mM葡糖酸鉀、2mM MgSO4、50mM Hepes-KOH，pH8.0和0.2％(w/v)的BSA)中于25℃光照30分鐘而進行，該緩沖液在300μL終體積中含有放射性標記的體外合成的前體蛋白質，及與200μg葉綠素相當的純化的細胞器。
將一種組分用2.5μL嗜熱芽孢桿菌蛋白酶(1mg/mL)和10μL 0.1M的CaCl2在冰上處理20分鐘。第二個組分的處理額外地含有1％(v/v)Triton X-100。蛋白酶處理通過加入10μL 0.5M的EDTA來終止。未破裂的葉綠體通過在4500g離心8分鐘而經過45％(v/v)的珀可墊(Percoll cushion)再次分離，在50mM Hepes和0.33M山梨糖醇pH8.0中洗滌，并重懸于2×SDS樣品緩沖液中。該蛋白質是通過電泳(Laemmli，Nature 227(1970)，680-685)和隨后通過放射自顯影來分析。結果顯示于圖5中。
當分離的完整豌豆葉綠體與35S-標記的PCT-BMYI在ATP和適當的輸入條件存在時下溫育時，發現幾乎所有添加的前體蛋白都被加工成約55kD的蛋白質了。蛋白酶嗜熱芽孢桿菌蛋白酶向反應混合物中的加入消化了上清夜中的前體蛋白，而已輸入到葉綠體中并被加工的成熟蛋白質則被保護并得以保持。當去污劑與嗜熱芽孢桿菌蛋白酶一起加入時，所有標記的蛋白質都被消化了，該去污劑破壞質體膜的完整性并使免受蛋白水解的輸入蛋白質終止。
實施例5具有減少的ppt-β-淀粉酶活性的轉基因植物顯示淀粉過剩表型為了研究ppt-β-淀粉酶的生理學作用，尤其在關于過渡淀粉降解中，用反義構建體(α-ppt-β-淀粉酶)生成了具有減少的ppt-β-淀粉酶活性的轉基因馬鈴薯植物；參見圖24。為此目的，將2.1kb長的ppt-β-淀粉酶BamHI/XhoI片段從pSK載體中切出。將該片段的末端用T4 DNA連接酶填充以生成平頭末端。然后將該片段以關于花椰菜花葉病毒35S啟動子相反的方向經SmaI限制位點克隆到植物表達載體pBinAR中(Hfgen和Willmitzer，Plant Sci.66(1990)，221-230)，并用農桿菌(Agrobacterium)介導的基因轉移轉化入馬鈴薯植物變種Désirée中(Rocha-Sosa等人，EMBO J.66(1989)，23-29)。馬鈴薯載培種Désirée從Saatzucht Fritz Lange KG(Bad Schwartau，德國)獲得。將組織培養中的植物以16小時光照/8小時黑暗的模式于22℃置于補充了2％(w/v)的蔗糖的MS培養基上(Murashige和Skoog，Physiol.Plant 15(1962)，473-497)。將馬鈴薯植物從組織培養物中轉移出并在溫室中以16小時白天和8小時黑夜的模式生長于土壤中。在于4℃放置了一天的源葉片中，篩選70個植物在ppt-β-淀粉酶mRNA水平的減少。在這70個植物中，3個品系(#8、#10、#11)與未轉化的對照相比顯示mRNA水平的強減少，而品系#27和#28在這一點上不顯示差異(參見圖6a)。將品系#8、#10、#11和#28被選擇來進行進一步的研究。為了顯示ppt-β-淀粉酶mRNA水平的減少導致ppt-β-淀粉酶活性的減少，將PNPG5得到用作特定的β-淀粉酶底物。用PNPG5的結果顯示在光照期后兩小時收獲的品系#8、#10、#11中的源葉片中的β-淀粉酶活性約為未轉化的對照的30-50％，而#28的活性與對照無顯著差異(參見圖6b和圖7)。
為了估計在過渡淀粉降解中的差異，將15周齡的溫室生長的植物的源葉片用鋁箔覆蓋以使其處于黑暗中。在不同的時間點，將葉片用碘染色以確定淀粉含量。具體地，將葉片于80℃在80％的乙醇中脫色并隨后用魯戈氏溶液進行染色以顯現淀粉含量。在野生型葉片和那些來自品系#28的葉片中，在36小時之后淀粉完全降解，而來自品系#8、#10、#11的葉片仍然含有足夠的淀粉，從而它們在碘存在時染為藍色。即使在在黑暗中經過72小時延長的時間之后，具有最強的ppt-β-淀粉酶活性減少的品系(#10和#11)仍含有顯著量的淀粉(參見圖8)。
葉片中的淀粉含量也經酶學確定。α-ppt-β-淀粉酶植物(品系#8、#10、#11)中的葉片淀粉含量與未轉化的對照相比非常高。在光照期的結束，與未轉化的對照相比，品系#8的植物在其源葉片中含有多180％的淀粉，品系#10和#11的植物含有約多240％的淀粉。淀粉含量如由Müller-Rber等人(EMBO J.11(1992)，1229-1238)所描述的來確定。結果顯示于圖9中。
實施例6從馬鈴薯分離編碼淀粉降解酶的cDNA(CSD23)對于CSD23 cDNA的分離，使用如在實施例1中描述的程序。當該cDNA在大腸桿菌菌株KV832中于適當的條件下表達時，該細胞不再被碘蒸氣染為藍色(參見圖10)。
對CSD 23 cDNA插入物的序列分析顯示它編碼迄今為止未知的蛋白質。該質粒含有882bp的可讀框(參見SEQ ID NO3)，編碼具有預測分子量為34.1kD的蛋白質。據認為該序列是全長，因為在5’非翻譯區中緊靠在預測的起始密碼子前發現了一個終止密碼子。該蛋白質與擬南芥的未知蛋白質T05165(登錄號T05165)享有高的氨基酸相似性(85.6％)。
實施例7CSD23具有水解活性為了證實CSD23蛋白質是否具有水解活性，使CSD23蛋白質在大腸桿菌菌株DH5α中進行表達。蛋白質的表達于37℃在大腸桿菌DH5α菌株(Bethesda Research Laboratories)中進行，以IPTG誘導。總的可溶性蛋白質從誘導的細胞中制備，該誘導的細胞僅含有空的pSK載體，或者含有包含編碼蛋白質序列的pSK載體。來自100ml細胞培養物的大腸桿菌細胞在離心后收集，并重懸于400μL緩沖液中，該緩沖液含有50mM Mops-KOH，pH7.5，20mM MgCl2，2mMCaCl2，1mM EDTA和0.1％(v/v)β-巰基乙醇。加入約400μL的玻璃珠(直徑為0.25-0.5mm)，并在冰上有停頓地將細胞在30秒內漩渦振蕩4次以裂解細胞。在20000g于4℃離心15分鐘之后，對含有可溶性蛋白質組分的大腸桿菌裂解產物進行測定。在用IPTG對在pSK載體中含有CSD23序列的細胞培養物進行誘導之后，將可溶性蛋白質組分進行分離。作為對照，將可溶性蛋白質從僅表達空pSK載體的細胞中分離(如對ppt-β-淀粉酶所述分離可溶性蛋白質組分)。將蛋白質組分用含有直鏈淀粉的分離膠以不連續的PAGE來檢測水解性CSD23的活性。結果顯示于圖11中。與對照的可溶性蛋白質組分相反，表達CSD23細胞的可溶性蛋白質組分能夠降解凝膠中的直鏈淀粉。此外，使用了含有支鏈淀粉的分離膠，但在這些凝膠中未檢測到水解活性，這顯示CSD23僅降解直鏈葡聚糖，而不降解分支的葡聚糖。
對于植物轉化載體α-CSD23的構建，將1kb長的CSD23的XbaI/Asp718片段從pSK載體中切除。然后將該片段以關于花椰菜花葉病毒35S啟動子相反的方向在植物表達載體pBinAR中進行克隆(Hfgen和Willmitzer，在上述引文中)；參見圖28。
再生成顯示CSD23轉錄物水平減少的轉基因植物。
實施例8從馬鈴薯分離編碼淀粉降解酶的cDNA(CSD12)對于CSD12 cDNA的分離，使用如實施例1中所描述的程序。當CSD12在大腸桿菌菌株KV832中于適當的條件下表達時，該細胞不再被碘蒸氣染藍色(參見圖12)。CSD12 cDNA測定序列顯示于SEQ IDNO1中。
該蛋白質與擬南芥的未知蛋白質(登錄號.AAF01527)共享高的氨基酸相似性(83％)。
對于植物轉化載體α-CSD12的構建，將900bp長的CSD12的EcoRI/Asp718片段從pSK載體中切出。然后將該片段以關于花椰菜花葉病毒35S啟動子相反的方向在植物表達載體pBinAR中進行克隆(Hfgen和Willmitzer，在上述引文中)；參見圖27。
實施例9從馬鈴薯分離編碼淀粉降解酶的cDNA(SHI)對于SHI cDNA的分離，使用如實施例1中所描述的程序。當SHI在大腸桿菌菌株KV832中于適當的條件下表達時，該細胞不再被碘蒸氣染藍色(參見圖13)。分離的cDNA不包含全長的cDNA。將指定為SHI短型的該片段用于植物轉化載體α-SHI短型的構建。然后將SHI短型序列用作探針以標準篩選方法分離全長的cDNA SHI。對生成的馬鈴薯，使用葉片λZapII cDNA文庫進行篩選(文庫如上所述)。全長的SHI cDNA含有2370bp長的可讀框，該可讀框編碼790個氨基酸的多肽(參見SEQ ID NO5)。編碼的蛋白質具有86.6kD的預測分子量。該預測的蛋白質與未知的擬南芥蛋白質F14O13.17(登錄號BAB03016)共享高的氨基酸相似性(53％)。
實施例10SHI具有水解活性為了證實SHI蛋白質是否具有水解活性，使SHI蛋白質在大腸桿菌菌株DH5α中進行表達。蛋白質的表達于37℃在大腸桿菌DH5α菌株(Bethesda Research Laboratories)中進行，以IPTG誘導。總的可溶性蛋白質從誘導的細胞中制備，該誘導的細胞僅含有空的pSK載體，或者含有包含編碼蛋白質序列的pSK載體。來自100ml細胞培養物的大腸桿菌細胞在離心后收集，并重懸于400μL緩沖液中，該緩沖液含有50mM Mops-KOH，pH7.5，20mM MgCl2，2mM CaCl2，1mM EDTA和0.1％(v/v)β-巰基乙醇。加入約400μL的玻璃珠(直徑為0.25-0.5mm)，并在冰上有停頓地將細胞在30秒內漩渦振蕩4次以裂解細胞。在20000g于4℃離心15分鐘之后，對含有可溶性蛋白質組分的大腸桿菌裂解產物進行測定。將蛋白質組分用于檢測水解性SHI活性。
可以用含有支鏈淀粉的分離膠以不連續的PAGE來顯示SHI蛋白質的水解活性。結果顯示于圖14中。與對照相反，表達SHI的細胞的可溶性蛋白質組分能夠降解凝膠中的支鏈淀粉。此外，可顯示重組SHI蛋白質能夠降解溶解的支鏈淀粉。為了顯示該結果，使支鏈淀粉溶液與表達SHI的細胞的可溶性蛋白質組分進行溫育。作為對照，使用表達空載體的細胞的蛋白質組分。在室溫溫育6個小時之后，使溶液用碘溶液進行染色以顯示支鏈淀粉的降解。該實驗的結果顯示于圖15中。
當可溶性蛋白質組分與可溶性馬鈴薯淀粉進行溫育時，重組SHI蛋白質產生了一系列的麥芽糖寡糖(參見圖16)。這是通過在TLC-平板上分離產物而顯示的。由α-淀粉酶產生了相同系列的麥芽糖寡糖，這顯示SHI蛋白質具有α-淀粉酶活性。薄層層析如對于ppt-β-淀粉酶所述進行。
實施例11SHI具有α-淀粉酶活性如對所述的ppt-β-淀粉酶所述，對SHI蛋白質的水解活性進行了研究。結果顯示于圖17中。結果顯示來自含有SHI蛋白質的誘導細胞的可溶性蛋白質組分與PNPG7反應，而來自含有空pSK載體的對照的不反應。為了進一步研究催化活性，同樣將PNPG5和對硝基苯基糖苷用作底物。對于兩種底物，在含有SHI蛋白質和空載體的誘導細胞之間未檢測到差異。這證實SHI蛋白質僅有α-淀粉酶活性，且不具有其他的淀粉分解活性。
實施例12SHI蛋白質被輸入到分離的葉綠體中為了確定SHI蛋白質是否含有質體導向序列，如實施例4所述進行體外蛋白質輸入實驗。對于該實驗使用了其中編碼SHI前100個氨基酸的SHI序列以符合讀框的方式融合綠色熒光蛋白的構建體。當該構建體轉錄并在體外翻譯時，可能顯示放射性標記的蛋白質產物被輸入到葉綠體中(參見圖18)。這些數據證明SHI蛋白質的前100個氨基酸能夠介導轉運過程。
輸入實驗如上所述進行。
實施例13具有減少的SHI活性的轉基因植物顯示淀粉過剩表型為了研究SHI蛋白質的生理學作用，尤其是關于過渡淀粉的降解，用兩個不同的反義構建體生成了具有減少的SHI活性的轉基因馬鈴薯和轉基因煙草植物。一個構建體包含在35S-啟動子控制之下的SHI短序列(α-SHI短型)。對于該載體的構建，將1.2kb長的SHIBamHI/XhoI片段從含有初級分離的SHI序列的pSK載體中切除。將該片段的末端用T4 DNA連接酶填充以生成平頭末端。然后將該片段以關于花椰菜花葉病毒35S啟動子相反的方向經SmaI限制位點在植物表達載體pBinAR中進行克隆(Hfgen和Willmitzer，在上述引文中)；參見圖26。第二個構建體包含在葉特異性的L700啟動子控制之下的全長SHI cDNA的2.3kb長的片段(α-SHIL700)。對于該載體的構建，將2.3kb長的SHI Asp718/XbaI片段從含有全長SHI序列的pSK載體中切除。然后將該片段以關于L700啟動子相反的方向在植物表達載體pBinAR L700中進行克隆(Hfgen和Willmitzer，在上述引文中)；參見圖25。將兩個構建體用于如上所述馬鈴薯植物細胞的轉化。煙草僅用α-SHI短型構建體進行轉化。
(a) α-SHI短型馬鈴薯植物為了估計過渡淀粉降解中的差異，將15周齡的溫室生長植物的源葉片用鋁箔覆蓋以使其處于黑暗中。在不同的時間點，對葉片用碘進行染色以確定淀粉含量。在野生型葉片和那些來自品系#46的葉片中，黑暗64小時之后淀粉完全降解了，而那些來自品系#51、#56和#58的葉片仍然含有足夠的淀粉，從而它們在碘存在時染為藍色(參見圖19)。
葉片中的淀粉含量也經酶學確定。與未轉化的對照相比，α-SHI短型植物葉片中的淀粉含量(品系#51、#56和#58)非常高。在光照期的結束時，與未轉化的對照相比，品系#51的植物在其源葉片中含有多412％的淀粉，品系#56的植物含有多367％的淀粉，且品系#58的含有多約814％的。
(b) 葉片的生活力對于α-SHI短型馬鈴薯植物品系#51、#56和#58的葉片而言，可顯示這些品系的葉片在14天的黑暗期后仍然有生活力。為了顯示該情況，將葉片在黑暗中放置所顯示的時間段。盡管野生型植物的葉片死亡，但品系#51、#56和#58的葉片仍然有生活力。在品系#58的葉片中可顯示最好的結果(參見圖22)。
(c) α-SHI短型煙草植物為了估計過渡淀粉降解中的差異，將10周齡的溫室生長植物的源葉片用鋁箔覆蓋以使其處于黑暗中。在12小時的黑暗后，對葉片用碘進行染色以確定淀粉含量。在野生型葉片中，在黑暗中放置12小時之后淀粉完全降解了，而那些來自品系#18、#31、#37、#46和#47的葉片仍然含有足夠的淀粉，從而它們在碘存在時染為藍色(參見圖20)。
(d) α-SHI L700煙草植物為了估計過渡淀粉降解中的差異，將15周齡的溫室生長植物的源葉片用鋁箔覆蓋以使其處于黑暗中。在不同的時間點，對葉片用碘進行染色以確定淀粉含量。在野生型葉片中，在黑暗中放置72小時之后淀粉完全降解了，而那些來自品系#16、#41、#46和#53的葉片仍然含有足夠的淀粉，從而它們在碘存在時染為藍色(參見圖21)。
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<141>
<160> 8<170> PatentIn Ver.2.1<210> 1<211> 834<212> DNA<213> 馬鈴薯<220>
<221> CDS<222> (1)..(834)<400> 1atg aga gct ctc tgg aac tcc acc tgc ttg tcc cca gtt caa aat aat48Met Arg Ala Leu Trp Asn Ser Thr Cys Leu Ser Pro Val Gln Asn Asn1 5 10 15cca ttg tta ttc tct cgt tca agc aag aaa tat gcg aat tcc tta tgc96Pro Leu Leu Phe Ser Arg Ser Ser Lys Lys Tyr Ala Asn Ser Leu Cys20 25 30aat ttc acc aac aaa tcc ttc cag att tct tgc aaa ctt cca gaa agt 144Asn Phe Thr Asn Lys Ser Phe Gln Ile Ser Cys Lys Leu Pro Glu Ser35 40 45gaa gtt aaa gag aac cat gct aga tcc agt agt aat aag aag atg gag 192Glu Val Lys Glu Asn His Ala Arg Ser Ser Ser Asn Lys Lys Met Glu50 55 60gaa tac aac tta gct atg aag aga atg atg agg aat cct tat gaa tat 240Glu Tyr Asn Leu Ala Met Lys Arg Met Met Arg Asn Pro Tyr Glu Tyr65 70 75 80cac cat gaa ctt gga atg aac tac aca ttg ata aca gaa gat cta att 288His His Glu Leu Gly Met Asn Tyr Thr Leu Ile Thr Glu Asp Leu Ile85 90 95gtt ggc tcc cag cct cag aaa att gaa gat ata gat tat ttg aag gaa 336Val Gly Ser Gln Pro Gln Lys Ile Glu Asp Ile Asp Tyr Leu Lys Glu100 105 110gag gag aac gta gct ttt ata cta aac ttg cag cag gac aaa gat att 384Glu Glu Asn Val Ala Phe Ile Leu Asn Leu Gln Gln Asp Lys Asp Ile115 120 125gag ttt tgg gga ata gac ctc cag tct atc gtt aca aga tgt tca gag 432Glu Phe Trp Gly Ile Asp Leu Gln Ser Ile Val Thr Arg Cys Ser Glu
130 135 140ctt gga att cat cac atg aga agg cct gca aga gat ttt gat cca gat480Leu Gly Ile His His Met Arg Arg Pro Ala Arg Asp Phe Asp Pro Asp145 150 155 160tcc ctg agg agt gta tta cct aaa gct gtt tca tca ctg gag tgg gcg528Ser Leu Arg Ser Val Leu Pro Lys Ala Val Ser Ser Leu Glu Trp Ala165 170 175att tca gaa gga aaa gga aga gtg tat gta cat tgc act gct gga ttg576Ile Ser Glu Gly Lys Gly Arg Val Tyr Val His Cys Thr Ala Gly Leu180 185 190gga agg gcc cct gct gtt tca att gct tat atg ttc tgg ttc tgt ggg624Gly Arg Ala Pro Ala Val Ser Ile Ala Tyr Met Phe Trp Phe Cys Gly195 200 205atg gat cta aat aca gct tat gat aca ctc gtt tca aag aga ccc tgt672Met Asp Leu Asn Thr Ala Tyr Asp Thr Leu Val Ser Lys Arg Pro Cys210 215 220ggg ccc aac aaa agg tca ata cag gga gct act tat gat ttg gct aaa720Gly Pro Asn Lys Arg Ser Ile Gln Gly Ala Thr Tyr Asp Leu Ala Lys225 230 235 240aat gat cag tgg aag gag ccc ttt gag aat ctg cca gat tat gcc ttt768Asn Asp Gln Trp Lys Glu Pro Phe Glu Asn Leu Pro Asp Tyr Ala Phe245 250 255gcg gat gta gca gat tgg gag agg aaa ctg att caa gat cgt gtg cga816Ala Asp Val Ala Asp Trp Glu Arg Lys Leu Ile Gln Asp Arg Val Arg260 265 270gcc ctt cgt gac act tga834Ala Leu Arg Asp Thr275<210> 2<211> 277<212> PRT<213> 馬鈴薯<400> 2Met Arg Ala Leu Trp Asn Ser Thr Cys Leu Ser Pro Val Gln Asn Asn1 5 10 15Pro Leu Leu Phe Ser Arg Ser Ser Lys Lys Tyr Ala Asn Ser Leu Cys20 25 30Asn Phe Thr Asn Lys Ser Phe Gln Ile Ser Cys Lys Leu Pro Glu Ser35 40 45Glu Val Lys Glu Asn His Ala Arg Ser Ser Ser Asn Lys Lys Met Glu50 55 60Glu Tyr Asn Leu Ala Met Lys Arg Met Met Arg Asn Pro Tyr Glu Tyr65 70 75 80His His Glu Leu Gly Met Asn Tyr Thr Leu Ile Thr Glu Asp Leu Ile85 90 95Val Gly Ser Gln Pro Gln Lys Ile Glu Asp Ile Asp Tyr Leu Lys Glu100 105 110Glu Glu Asn Val Ala Phe Ile Leu Asn Leu Gln Gln Asp Lys Asp Ile
115 120 125Glu Phe Trp Gly Ile Asp Leu Gln Ser Ile Val Thr Arg Cys Ser Glu130 135 140Leu Gly Ile His His Met Arg Arg Pro Ala Arg Asp Phe Asp Pro Asp145 150 155 160Ser Leu Arg Ser Val Leu Pro Lys Ala Val Ser Ser Leu Glu Trp Ala165 170 175Ile Ser Glu Gly Lys Gly Arg Val Tyr Val His Cys Thr Ala Gly Leu180 185 190Gly Arg Ala Pro Ala Val Ser Ile Ala Tyr Met Phe Trp Phe Cys Gly195 200 205Met Asp Leu Asn Thr Ala Tyr Asp Thr Leu Val Ser Lys Arg Pro Cys210 215 220Gly Pro Asn Lys Arg Ser Ile Gln Gly Ala Thr Tyr Asp Leu Ala Lys225 230 235 240Asn Asp Gln Trp Lys Glu Pro Phe Glu Asn Leu Pro Asp Tyr Ala Phe245 250 255Ala Asp Val Ala Asp Trp Glu Arg Lys Leu Ile Gln Asp Arg Val Arg260 265 270Ala Leu Arg Asp Thr275<210> 3<211> 885<212> DNA<213> 馬鈴薯<220>
<221> CDS<222> (1)..(885)<400> 3atg gac ttc gct agt atg gac cgt gca caa ctc act atg gtg gga tca 48Met Asp Phe Ala Ser Met Asp Arg Ala Gln Leu Thr Met Val Gly Ser1 5 10 15ggg ttt tct gct ttg ctt tca atg cat ttc aca ata cag ctc ttg tca 96Gly Phe Ser Ala Leu Leu Ser Met His Phe Thr Ile Gln Leu Leu Ser20 25 30caa cac ctg ttc ttc tgg aaa aac cca aag gag caa aag gca ata atc144Gln His Leu Phe Phe Trp Lys Asn Pro Lys Glu Gln Lys Ala Ile Ile35 40 45atg att ata tgt atg gct cca ctt tat gcc att gac tcg ttt gtg ggt192Met Ile Ile Cys Met Ala Pro Leu Tyr Ala Ile Asp Ser Phe Val Gly50 55 60ttg tta gat att cgt gga agc aaa aca ttt ttc atg ttt cta gac tca240Leu Leu Asp Ile Arg Gly Ser Lys Thr Phe Phe Met Phe Leu Asp Ser65 70 75 80gtt aaa gaa tgc tac gag gct gtg gca att gcc aaa ttt ttg gct ttg288Val Lys Glu Cys Tyr Glu Ala Val Ala Ile Ala Lys Phe Leu Ala Leu85 90 95atg tat agt aat ttg aat ata tcc atc agc aaa aac att gtg cct gat336Met Tyr Ser Asn Leu Asn Ile Ser Ile Ser Lys Asn Ile Val Pro Asp
100 105 110gaa atc aag ggg agg gaa att cat cat tcc ttt cca atg act cta ttt384Glu Ile Lys Gly Arg Glu Ile His His Ser Phe Pro Met Thr Leu Phe115 120 125cag ccc cgc act gct cgc tta gat cac cgg aca ctg aaa ctt ctc aag432Gln Pro Arg Thr Ala Arg Leu Asp His Arg Thr Leu Lys Leu Leu Lys130 135 140cat tgg aca tgg cag ttt gtc atc atc cgt cca gca tgc tct atc ttg480His Trp Thr Trp Gln Phe Val Ile Ile Arg Pro Ala Cys Ser Ile Leu145 150 155 160atg atc acg tta cag att ctt ggg ttg tat ccg agt tgg ctc agc tgg528Met Ile Thr Leu Gln Ile Leu Gly Leu Tyr Pro Ser Trp Leu Ser Trp165 170 175acg ttt acc atc att ctc aat att tca ttc tca gtg gcc atg tac tcc576Thr Phe Thr Ile Ile Leu Asn Ile Ser Phe Ser Val Ala Met Tyr Ser180 185 190ttg gtt gtt ttc tac cat gtt ttc tca aag gaa ctg cag cca cac aaa624Leu Val Val Phe Tyr His Val Phe Ser Lys Glu Leu Gln Pro His Lys195 200 205cca ctt tca aag ttc atc tgc atc aaa ggg ata gtt ttc ttc agc ttt672Pro Leu Ser Lys Phe Ile Cys Ile Lys Gly Ile Val Phe Phe Ser Phe210 215 220tgg cag ggg ttg ctg gtt aaa att cta gtc tcg tgg gga att atc aaa720Trp Gln Gly Leu Leu Val Lys Ile Leu Val Ser Trp Gly Ile Ile Lys225 230 235 240tct cac cat ttt tgg ttg gat gtg gag cac ctt cag gaa gcc att cag768Ser His His Phe Trp Leu Asp Val Glu His Leu Gln Glu Ala Ile Gln245 250 255aat gtt tta att tgt gtg gag atg gtt ttc ttt tct gtt atg cag caa816Asn Val Leu Ile Cys Val Glu Met Val Phe Phe Ser Val Met Gln Gln260 265 270tat gca tac cat gtg gct cct tac agt ggt gat gtc gaa gca aag ttg864Tyr Ala Tyr His Val Ala Pro Tyr Ser Gly Asp Val Glu Ala Lys Leu275 280 285aaa ctg aaa aag gat gac taa885Lys Leu Lys Lys Asp Asp290 295<210> 4<211> 294<212> PRT<213> 馬鈴薯<400> 4Met Asp Phe Ala Ser Met Asp Arg Ala Gln Leu Thr Met Val Gly Ser1 5 10 15Gly Phe Ser Ala Leu Leu Ser Met His Phe Thr Ile Gln Leu Leu Ser
20 25 30Gln His Leu Phe Phe Trp Lys Asn Pro Lys Glu Gln Lys Ala Ile Ile35 40 45Met Ile Ile Cys Met Ala Pro Leu Tyr AlaIle Asp Ser Phe Val Gly50 55 60Leu Leu Asp Ile Arg Gly Ser Lys Thr Phe Phe Met Phe Leu Asp Ser65 70 75 80Val Lys Glu Cys Tyr Glu Ala Val Ala Ile Ala Lys Phe Leu Ala Leu85 90 95Met Tyr Ser Asn Leu Asn Ile Ser Ile Ser Lys Asn Ile Val Pro Asp100 105 110Glu Ile Lys Gly Arg Glu Ile His His Ser Phe Pro Met Thr Leu Phe115 120 125Gln Pro Arg Thr Ala Arg Leu Asp His Arg Thr Leu Lys Leu Leu Lys130 135 140His Trp Thr Trp Gln Phe Val Ile Ile Arg Pro Ala Cys Ser Ile Leu145 150 155 160Met Ile Thr Leu Gln Ile Leu Gly Leu Tyr Pro Ser Trp Leu Ser Trp165 170 175Thr Phe Thr Ile Ile Leu Asn Ile Ser Phe Ser Val Ala Met Tyr Ser180 185 190Leu Val Val Phe Tyr His Val Phe Ser Lys Glu Leu Gln Pro His Lys195 200 205Pro Leu Ser Lys Phe Ile Cys Ile Lys Gly Ile Val Phe Phe Ser Phe210 215 220Trp Gln Gly Leu Leu Val Lys Ile Leu Val Ser Trp Gly Ile Ile Lys225 230 235 240Ser His His Phe Trp Leu Asp Val Glu His Leu Gln Glu Ala Ile Gln245 250 255Asn Val Leu Ile Cys Val Glu Met Val Phe Phe Ser Val Met Gln Gln260 265 270Tyr Ala Tyr His Val Ala Pro Tyr Ser Gly Asp Val Glu Ala Lys Leu275 280 285Lys Leu Lys Lys Asp Asp290<210> 5<211> 2923<212> DNA<213> 馬鈴薯<220>
<221> CDS<222> (76)..(2445)<400> 5gaattcggca cgagattttt agggtttttg gatgaggatt taagaggaaa gatttgattt 60ttttgaggat tttgg atg gcg tca gct cag gta cta aaa aag caa gag cat 111Met Ala Ser Ala Gln Val Leu Lys Lys Gln Glu His1 5 10ttg caa gct ggg aaa aag aag cta gag gaa ttt cgt aag aag aga gca159Leu Gln Ala Gly Lys Lys Lys Leu Glu Glu Phe Arg Lys Lys Arg Ala15 20 25gca gag aag gct aaa aag aca act tca aat agt caa cag ctt gcc tct207Ala Glu Lys Ala Lys Lys Thr Thr Ser Asn Ser Gln Gln Leu Ala Ser
30 35 40gat gga ggc gtt gat aat caa cat tca gga aat gaa cac act aga act255Asp Gly Gly Val Asp Asn Gln His Ser Gly Asn Glu His Thr Arg Thr45 50 55 60aag gac tcc agt gga gct gct aca tct gat gct gtt ggc aga tct gtt303Lys Asp Ser Ser Gly Ala Ala Thr Ser Asp Ala Val Gly Arg Ser Val65 70 75cta aag cca tct gaa gta cat gct aag cat gat ttt gcg aag cct gat351Leu Lys Pro Ser Glu Val His Ala Lys His Asp Phe Ala Lys Pro Asp80 85 90ctt acc cag aag tct gat tta att ttt cct agt gat gct agt gct ggt399Leu Thr Gln Lys Ser Asp Leu Ile Phe Pro Ser Asp Ala Ser Ala Gly95 100 105gct acg cct agt ttg cac aaa tac tat gat gat gct gtt gtt aaa gcc447Ala Thr Pro Ser Leu His Lys Tyr Tyr Asp Asp Ala Val Val Lys Ala110 115 120aac agt tat gat ttt ggc tct tcc atc tca gca ttg tct cgt tta gaa495Asn Ser Tyr Asp Phe Gly Ser Ser Ile Ser Ala Leu Ser Arg Leu Glu125 130 135 140aat aaa ggg tct aga agt gat gag aat ctt aag gtt tct caa aca gta543Asn Lys Gly Ser Arg Ser Asp Glu Asn Leu Lys Val Ser Gln Thr Val145 150 155agt gat act tat gac aac act ggg aag agg gag agt gat ggg gcc tta591Ser Asp Thr Tyr Asp Asn Thr Gly Lys Arg Glu Ser Asp Gly Ala Leu160 165 170gaa agt gtt cca ttt ggg ttt gcg act aac cac tct aca gcc act ttt639Glu Ser Val Pro Phe Gly Phe Ala Thr Asn His Ser Thr Ala Thr Phe175 180 185cct cca ttc ctc aat aat gac aga act tcc agt cat ttc act tat gat687Pro Pro Phe Leu Asn Asn Asp Arg Thr Ser Ser His Phe Thr Tyr Asp190 195 200gat atg ggt aaa cgc ata tcg gag gag agc cat gca aag gat ctt tct735Asp Met Gly Lys Arg Ile Ser Glu Glu Ser His Ala Lys Asp Leu Ser205 210 215 220gta act aat gat ggt act tct cat gct ttt ccg gct aat gta tca cct783Val Thr Asn Asp Gly Thr Ser His Ala Phe Pro Ala Asn Val Ser Pro225 230 235tca aat cca ttc ggg tct cgt gac gac aaa cca cgt tat aca gat cgc831Ser Asn Pro Phe Gly Ser Arg Asp Asp Lys Pro Arg Tyr Thr Asp Arg240 245 250tgg gct agt gac atg act tcc gct tca tat ggt gat tat gtt ccc ggt879Trp Ala Ser Asp Met Thr Ser Ala Ser Tyr Gly Asp Tyr Val Pro Gly255 260 265gct acc acg gac cca caa ttt tat cct gaa gtt ggg aga aat gtt gct927Ala Thr Thr Asp Pro Gln Phe Tyr Pro Glu Val Gly Arg Asn Val Ala
270 275 280ggt gtg gga tct aat aat ttt gta gtg cct gat aaa gga tac atc cag 975Gly Val Gly Ser Asn Asn Phe Val Val Pro Asp Lys Gly Tyr Ile Gln285 290 295 300tta aac agc tct ggt ctt cac tca act aaa act tct tct tgg aca tcg1023Leu Asn Ser Ser Gly Leu His Ser Thr Lys Thr Ser Ser Trp Thr Ser305 310 315gac tcc aag tat gat ggt ttt agt ttt gat gct aga agt tct tct agt1071Asp Ser Lys Tyr Asp Gly Phe Ser Phe Asp Ala Arg Ser Ser Ser Ser320 325 330tac tca cag atg tct aca ctc aca gct ggg gcg act ggg agg aga act1119Tyr Ser Gln Met Ser Thr Leu Thr Ala Gly Ala Thr Gly Arg Arg Thr335 340 345cca tct ttc ctt gat tcc atc aac att tca aaa gtc tct gct gta tcc1167Pro Ser Phe Leu Asp Ser Ile Asn Ile Ser Lys Val Ser Ala Val Ser350 355 360cct ccc tca ata gga tca gtt act aca gac aca tat gac tca atg gct1215Pro Pro Ser Ile Gly Ser Val Thr Thr Asp Thr Tyr Asp Ser Met Ala365 370 375 380tac cct agg gac act ctg ggt tta tca aat tct gag aac ttg aca aat1263Tyr Pro Arg Asp Thr Leu Gly Leu Ser Asn Ser Glu Asn Leu Thr Asn385 390 395tct tca aaa ttt tct ggt aat ggg tca gat ctg tac aag cat gct gtt1311Ser Ser Lys Phe Ser Gly Asn Gly Ser Asp Leu Tyr Lys His Ala Val400 405 410gag aaa gat atg ggc aac ttg gac aac aga cat cca ttt tat tca cag1359Glu Lys Asp Met Gly Asn Leu Asp Asn Arg His Pro Phe Tyr Ser Gln415 420 425aag caa aat gaa gat ttt gct gca tta gaa cag cat att gaa gat tta1407Lys Gln Asn Glu Asp Phe Ala Ala Leu Glu Gln His Ile Glu Asp Leu430 435 440aca caa gag aag ttc tct cta caa cgt gct ctt gag gct tcg cga act1455Thr Gln Glu Lys Phe Ser Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ala Ser Arg Thr445 450 455 460cta gca gag tct cta gct gct gaa aat tca act ctg aca gat agt tat1503Leu Ala Glu Ser Leu Ala Ala Glu Asn Ser Thr Leu Thr Asp Ser Tyr465 470 475aat caa cag gga agt ttt gtt ggc caa cta aaa gct gag atg gag agg1551Asn Gln Gln Gly Ser Phe Val Gly Gln Leu Lys Ala Glu Met Glu Arg480 485 490ttg caa gag gag att aaa gcc cat ctg ggt gag ctt gaa gct gtg aaa1599Leu Gln Glu Glu Ile Lys Ala His Leu Gly Glu Leu Glu Ala Val Lys495 500 505atg gaa tat gca aat gta caa ttg gaa tgt aat gct gct gat gag cgt1647Met Glu Tyr Ala Asn Val Gln Leu Glu Cys Asn Ala Ala Asp Glu Arg
510 515 520gcc aag tta ttg gct tct gaa gtg att ggc ttg gaa gag aag gca ctt1695Ala Lys Leu Leu Ala Ser Glu Val Ile Gly Leu Glu Glu Lys Ala Leu525 530 535 540cgt cta aga tct aat gag ctt aaa ctg gag aaa gaa ttg gag aag tca1743Arg Leu Arg Ser Asn Glu Leu Lys Leu Glu Lys Glu Leu Glu Lys Ser545 550 555caa gct gaa atg tct tct tac aag aag aaa att gct agc ctt gaa aaa1791Gln Ala Glu Met Ser Ser Tyr Lys Lys Lys Ile Ala Ser Leu Glu Lys560 565 570gat cgt caa gat ctg caa tca aca atc gat gct tta aag gaa gaa aag1839Asp Arg Gln Asp Leu Gln Ser Thr Ile Asp Ala Leu Lys Glu Glu Lys575 580 585aag ctc ttg caa tcc aaa ttc cta aaa gct tct gct aat gga aag tca1887Lys Leu Leu Gln Ser Lys Phe Leu Lys Ala Ser Ala Asn Gly Lys Ser590 595 600gtt gat cct agc agg aat atg cct aca aaa ata gat gta tca act tct1935Val Asp Pro Ser Arg Asn Met Pro Thr Lys Ile Asp Val Ser Thr Ser605 610 615 620aca gag gat ctt cgt gaa gat aat atc gca agt ggt acc ata aat gac1983Thr Glu Asp Leu Arg Glu Asp Asn Ile Ala Ser Gly Thr Ile Asn Asp625 630 635act aat atg gtt ggt att gat ggc ccc acc acc tct tcc cta ccc gat2031Thr Asn Met Val Gly Ile Asp Gly Pro Thr Thr Ser Ser Leu Pro Asp640 645 650ttt ggg cag ttt agt ctc gga agt ttg tca ccg gcc att cct cca gat2079Phe Gly Gln Phe Ser Leu Gly Ser Leu Ser Pro Ala Ile Pro Pro Asp655 660 665cag att agg atg atc caa aac att aat aca tta att tct gag tta gcc2127Gln Ile Arg Met Ile Gln Asn Ile Asn Thr Leu Ile Ser Glu Leu Ala670 675 680ttg gag aaa gac gaa tta aca aaa gcc ctg tca gtt gaa tca tct cag2175Leu Glu Lys Asp Glu Leu Thr Lys Ala Leu Ser Val Glu Ser Ser Gln685 690 695 700cgc tct aca ttg aag gag tta aac agc gac tta act cgg aag ctt gaa2223Arg Ser Thr Leu Lys Glu Leu Asn Ser Asp Leu Thr Arg Lys Leu Glu705 710 715gtt caa aca caa aga ttg gag ctt tta act gct caa agc atg gca aat2271Val Gln Thr Gln Arg Leu Glu Leu Leu Thr Ala Gln Ser Met Ala Asn720 725 730gaa aac agc caa gca aga caa cca gat gca gtg tct gta cat gac aat2319Glu Asn Ser Gln Ala Arg Gln Pro Asp Ala Val Ser Val His Asp Asn735 740 745atg cca tat gct gat gac aat atg caa tat gct gat gaa gga gat gag2367Met Pro Tyr Ala Asp Asp Asn Met Gln Tyr Ala Asp Glu Gly Asp Glu
750 755 760gtg gtg gaa cgg gta ttg gga tgg atc atg aaa cta ttt cct gga ggg2415Val Val Glu Arg Val Leu Gly Trp Ile Met Lys Leu Phe Pro Gly Gly765 770 775 780cca tca aga cga cga acc agc aag ctt ctt taatctccat ggcaagagta 2465Pro Ser Arg Arg Arg Thr Ser Lys Leu Leu785 790caatgatgag ttatttctgc gaaaagctgg tctttttctc ctctccagcc ctgcattttt 2525ggtagccaaa cggagtccgg attttgtata ttatccatgg tttatacaca cacattgcat 2585tcttttcccc cagaagaagc aaattgtatc taagaggcat tttggaagat ggaattagct 2645gttctcgaca gttttggcaa taaaacatga ccgtgttgtt tacaagagaa tccatttatc 2705aaacgttgta atgaagatca gatgtgttta gttgtcaatc atgagagaaa aaaaacttca 2765aatgtttctt acttttcatg tggaaatgat gtttagatct tttgacattg tattcgttat 2825gttgtatttg ttgaaagctg gggcttaaga aaagcccaat atatcaaaaa gatgattttg 2885gccgtccttt gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa aactcgag 2923<210> 6<211> 790<212> PRT<213> 馬鈴薯<400> 6Met Ala Ser Ala Gln Val Leu Lys Lys Gln Glu His Leu Gln Ala Gly1 5 10 15Lys Lys Lys Leu Glu Glu Phe Arg Lys Lys Arg Ala Ala Glu Lys Ala20 25 30Lys Lys Thr Thr Ser Asn Ser Gln Gln Leu Ala Ser Asp Gly Gly Val35 40 45Asp Asn Gln His Ser Gly Asn Glu His Thr Arg Thr Lys Asp Ser Ser50 55 60Gly Ala Ala Thr Ser Asp Ala Val Gly Arg Ser Val Leu Lys Pro Ser65 70 75 80Glu Val His Ala Lys His Asp Phe Ala Lys Pro Asp Leu Thr Gln Lys85 90 95Ser Asp Leu Ile Phe Pro Ser Asp Ala Ser Ala Gly Ala Thr Pro Ser100 105 110Leu His Lys Tyr Tyr Asp Asp Ala Val Val Lys Ala Asn Ser Tyr Asp115 120 125Phe Gly Ser Ser Ile Ser Ala Leu Ser Arg Leu Glu Asn Lys Gly Ser130 135 140
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Leu Ala Ala Glu Asn Ser Thr Leu Thr Asp Ser Tyr Asn Gln Gln Gly465 470 475 480Ser Phe Val Gly Gln Leu Lys Ala Glu Met Glu Arg Leu Gln Glu Glu485 490 495Ile Lys Ala His Leu Gly Glu Leu Glu Ala Val Lys Met Glu Tyr Ala500 505 510Asn Val Gln Leu Glu Cys Asn Ala Ala Asp Glu Arg Ala Lys Leu Leu515 520 525Ala Ser Glu Val Ile Gly Leu Glu Glu Lys Ala Leu Arg Leu Arg Ser530 535 540Asn Glu Leu Lys Leu Glu Lys Glu Leu Glu Lys Ser Gln Ala Glu Met545 550 555 560Ser Ser Tyr Lys Lys Lys Ile Ala Ser Leu Glu Lys Asp Arg Gln Asp565 570 575Leu Gln Ser Thr Ile Asp Ala Leu Lys Glu Glu Lys Lys Leu Leu Gln580 585 590Ser Lys Phe Leu Lys Ala Ser Ala Asn Gly Lys Ser Val Asp Pro Ser595 600 605Arg Asn Met Pro Thr Lys Ile Asp Val Ser Thr Ser Thr Glu Asp Leu610 615 620Arg Glu Asp Asn Ile Ala Ser Gly Thr Ile Asn Asp Thr Asn Met Val625 630 635 640Gly Ile Asp Gly Pro Thr Thr Ser Ser Leu Pro Asp Phe Gly Gln Phe645 650 655Ser Leu Gly Ser Leu Ser Pro Ala Ile Pro Pro Asp Gln Ile Arg Met660 665 670Ile Gln Asn Ile Asn Thr Leu Ile Ser Glu Leu Ala Leu Glu Lys Asp675 680 685Glu Leu Thr Lys Ala Leu Ser Val Glu Ser Ser Gln Arg Ser Thr Leu690 695 700Lys Glu Leu Asn Ser Asp Leu Thr Arg Lys Leu Glu Val Gln Thr Gln705 710 715 720Arg Leu Glu Leu Leu Thr Ala Gln Ser Met Ala Asn Glu Asn Ser Gln725 730 735Ala Arg Gln Pro Asp Ala Val Ser Val His Asp Asn Met Pro Tyr Ala740 745 750Asp Asp Asn Met Gln Tyr Ala Asp Glu Gly Asp Glu Val Val Glu Arg755 760 765Val Leu Gly Trp Ile Met Lys Leu Phe Pro Gly Gly Pro Ser Arg Arg770 775 780
Arg Thr Ser Lys Leu Leu785 790<210> 7<211> 2102<212> DNA<213> 馬鈴薯<220>
<221> CDS<222> (65)..(1699)<400> 7ctgcaggcaa aaaaatacac attctgttta tatattttct attatcaaaa aacagaaat60agaa atg act tta aca ctt caa tca tca gct tct ttt atc aat ttc aaa 109Met Thr Leu Thr Leu Gln Ser Ser Ala Ser Phe Ile Asn Phe Lys1 5 10 15gaa acc aaa ggt gtt aaa gca cct gat gag ttc tta gga atg gtt tct157Glu Thr Lys Gly Val Lys Ala Pro Asp Glu Phe Leu Gly Met Val Ser20 25 30ttt gca caa gcc aag cca tca tgc cgg cta gtc gcg aaa agt tcg atg205Phe Ala Gln Ala Lys Pro Ser Cys Arg Leu Val Ala Lys Ser Ser Met35 40 45caa gaa gct caa ctc tcc cat gag aga atc atg gaa gtg aag aaa att253Gln Glu Ala Gln Leu Ser His Glu Arg Ile Met Glu Val Lys Lys Ile50 55 60gag aaa aga gag aag cta cat gag tta cca gct aat cac agc aat aga301Glu Lys Arg Glu Lys Leu His Glu Leu Pro Ala Asn His Ser Asn Arg65 70 75agt aca agg gta cct gtt ttt gtg atg ctt cca ctt gac acc atg act349Ser Thr Arg Val Pro Val Phe Val Met Leu Pro Leu Asp Thr Met Thr80 85 90 95atg gga ggg aac ttg aac agg cca cga gcg atg aat gcg agt ttg atg397Met Gly Gly Asn Leu Asn Arg Pro Arg Ala Met Asn Ala Ser Leu Met100 105 110gcg ttg aaa agt tct gga gct gaa ggg gtg atg gtg gat gct tgg tgg445Ala Leu Lys Ser Ser Gly Ala Glu Gly Val Met Val Asp Ala Trp Trp115 120 125gga ttg gtg gag aaa gat gga cct ttg aag tat aat tgg gaa gga tat493Gly Leu Val Glu Lys Asp Gly Pro Leu Lys Tyr Asn Trp Glu Gly Tyr130 135 140gct gag ctt gta aag atg tgt caa gaa cat gga ttg aag ctt caa gtt541Ala Glu Leu Val Lys Met Cys Gln Glu His Gly Leu Lys Leu Gln Val145 150 155gtc atg tct ttt cat cag tgt gga gga aat gtt gga gat tct tgc agt589Val Met Ser Phe His Gln Cys Gly Gly Asn Val Gly Asp Ser Cys Ser160 165 170 175
att cct cta cct cca tgg gta ctt gaa gaa atc agc aag aat cct gac637Ile Pro Leu Pro Pro Trp Val Leu Glu Glu Ile Ser Lys Asn Pro Asp180 185 190ctt gtc tac aca gat aga tca ggc cgg aga aat cct gag tat cta tcc685Leu Val Tyr Thr Asp Arg Ser Gly Arg Arg Asn Pro Glu Tyr Leu Ser195 200 205tta ggt tgt gat atg tta cca gta ctc aaa gga aga aca cca att caa733Leu Gly Cys Asp Met Leu Pro Val Leu Lys Gly Arg Thr Pro Ile Gln210 215 220gta tac acc gac tat atg agg agc ttc aga gaa aga ttc aac gaa tac781Val Tyr Thr Asp Tyr Met Arg Ser Phe Arg Glu Arg Phe Asn Glu Tyr225 230 235ttg gga aac gtc ata gtg gaa atc caa gtg gga atg ggt cct tgt gga829Leu Gly Asn Val Ile Val Glu Ile Gln Val Gly Met Gly Pro Cys Gly240 245 250 255gag cta aga tat cca gcc tat cca gaa agc aat ggt aca tgg agg ttt877Glu Leu Arg Tyr Pro Ala Tyr Pro Glu Ser Asn Gly Thr Trp Arg Phe260 265 270cct gga att gga gaa ttc caa tgc tat gac aag tac atg gga gct tca925Pro Gly Ile Gly Glu Phe Gln Cys Tyr Asp Lys Tyr Met Gly Ala Ser275 280 285ttg gca gca gtg gcc aag gca gct gga aag gat gac tgg ggc cag gga973Leu Ala Ala Val Ala Lys Ala Ala Gly Lys Asp Asp Trp Gly Gln Gly290 295 300ggg cct cat gat tct ggg aag tac aac cag ttt cct gag gat act gga 1021Gly Pro His Asp Ser Gly Lys Tyr Asn Gln Phe Pro Glu Asp Thr Gly305 310 315ttt ttc cag agg gat gga aca tgg aac agt gaa tat gga cag ttc ttc 1069Phe Phe Gln Arg Asp Gly Thr Trp Asn Ser Glu Tyr Gly Gln Phe Phe320 325 330 335cta gag tgg tat tca gga aag cta ctg gaa cat ggt gac aga ata cta 1117Leu Glu Trp Tyr Ser Gly Lys Leu Leu Glu His Gly Asp Arg Ile Leu340 345 350gca gca gga gaa agt ata tac caa gga act ggg gct aaa cta tct gga 1165Ala Ala Gly Glu Ser Ile Tyr Gln Gly Thr Gly Ala Lys Leu Ser Gly355 360 365aag gta gct ggg att cat tgg cat tac aat act aga tca cat gct gca 1213Lys Val Ala Gly Ile His Trp His Tyr Asn Thr Arg Ser His Ala Ala370 375 380gag tta act tca gga tat tat aat aca aga cac aga gat ggt tat cta 1261Glu Leu Thr Ser Gly Tyr Tyr Asn Thr Arg His Arg Asp Gly Tyr Leu385 390 395cct ata gca cgt atg tta gcg aaa cat ggt gct gta ctt aac ttt aca 1309Pro Ile Ala Arg Met Leu Ala Lys His Gly Ala Val Leu Asn Phe Thr400 405 410 415
tgt atg gaa atg agg gat ggt gaa cag ccc cag agt gca aac tgt tca1357Cys Met Glu Met Arg Asp Gly Glu Gln Pro Gln Ser Ala Asn Cys Ser420 425 430cca gaa ggc tta gtt cga caa gtt aaa act gca gct aga act gct gaa1405Pro Glu Gly Leu Val Arg Gln Val Lys Thr Ala Ala Arg Thr Ala Glu435 440 445gta gaa ctt gct gga gaa aat gct cta gaa agg tat gat gga gga gca1453Val Glu Leu Ala Gly Glu Asn Ala Leu Glu Arg Tyr Asp Gly Gly Ala450 455 460ttt tct caa gtt ttg gca aca agc atg tca gat tct gga aat gga ttg1501Phe Ser Gln Val Leu Ala Thr Ser Met Ser Asp Ser Gly Asn Gly Leu465 470 475agt gca ttt aca ttc ttg cga atg aac aaa cgg ttg ttt gag cca gaa1549Ser Ala Phe Thr Phe Leu Arg Met Asn Lys Arg Leu Phe Glu Pro Glu480 485 490 495aat tgg cgg aat cta gtg caa ttt gtg aag agc atg tct gaa gga ggt1597Asn Trp Arg Asn Leu Val Gln Phe Val Lys Ser Met Ser Glu Gly Gly500 505 510cga aat gct agc ctt cca gag tgt gac tca agc agg aca gac ctc tat1645Arg Asn Ala Ser Leu Pro Glu Cys Asp Ser Ser Arg Thr Asp Leu Tyr515 520 525gta aga ttt atc aaa gag agt cat tct aag aaa gct aca gag gtt gca1693Val Arg Phe Ile Lys Glu Ser His Ser Lys Lys Ala Thr Glu Val Ala530 535 540gta gtg taaagatacg gaactgtata catgtaatat agctatccca ttgtaggtta 1749Val Val545gcaaagaaaa gtggcacata gagtactaaa gtgtcatact catagcacct agaagagtcc 1809acaagaattt gagcctgtgt ctgaaattaa actatagaag acaagaaaaa gaagctaagt 1869acgccaatct ttgccaccct ggttcagagg ttgtgaagct ctgggtcatt gggacagtga 1929gaacaatgag acagtatcat acaaagattt ggataagcat attcttttca ttgtacaaaa 1989attttaaaaa aaatctgcct tccacattta ttattgaaga ataaaggagc taataatatt 2049gcttcctaca gaggcatttt cctgttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaactc gag 2102<210> 8<211> 545<212> PRT<213> 馬鈴薯<400> 8Met Thr Leu Thr Leu Gln Ser Ser Ala Ser Phe Ile Asn Phe Lys Glu1 5 10 15Thr Lys Gly Val Lys Ala Pro Asp Glu Phe Leu Gly Met Val Ser Phe
20 25 30Ala Gln Ala Lys Pro Ser Cys Arg Leu Val Ala Lys Ser Ser Met Gln35 40 45Glu Ala Gln Leu Ser His Glu Arg Ile Met Glu Val Lys Lys Ile Glu50 55 60Lys Arg Glu Lys Leu His Glu Leu Pro Ala Asn His Ser Asn Arg Ser65 70 75 80Thr Arg Val Pro Val Phe Val Met Leu Pro Leu Asp Thr Met Thr Met85 90 95Gly Gly Asn Leu Asn Arg Pro Arg Ala Met Asn Ala Ser Leu Met Ala100 105 110Leu Lys Ser Ser Gly Ala Glu Gly Val Met Val Asp Ala Trp Trp Gly115 120 125Leu Val Glu Lys Asp Gly Pro Leu Lys Tyr Asn Trp Glu Gly Tyr Ala130 135 140Glu Leu Val Lys Met Cys Gln Glu His Gly Leu Lys Leu Gln Val Val145 150 155 160Met Ser Phe His Gln Cys Gly Gly Asn Val Gly Asp Ser Cys Ser Ile165 170 175Pro Leu Pro Pro Trp Val Leu Glu Glu Ile Ser Lys Asn Pro Asp Leu180 185 190Val Tyr Thr Asp Arg Ser Gly Arg Arg Asn Pro Glu Tyr Leu Ser Leu195 200 205Gly Cys Asp Met Leu Pro Val Leu Lys Gly Arg Thr Pro Ile Gln Val210 215 220Tyr Thr Asp Tyr Met Arg Ser Phe Arg Glu Arg Phe Asn Glu Tyr Leu225 230 235 240Gly Asn Val Ile Val Glu Ile Gln Val Gly Met Gly Pro Cys Gly Glu245 250 255Leu Arg Tyr Pro Ala Tyr Pro Glu Ser Asn Gly Thr Trp Arg Phe Pro260 265 270Gly Ile Gly Glu Phe Gln Cys Tyr Asp Lys Tyr Met Gly Ala Ser Leu275 280 285Ala Ala Val Ala Lys Ala Ala Gly Lys Asp Asp Trp Gly Gln Gly Gly290 295 300Pro His Asp Ser Gly Lys Tyr Asn Gln Phe Pro Glu Asp Thr Gly Phe305 310 315 320Phe Gln Arg Asp Gly Thr Trp Asn Ser Glu Tyr Gly Gln Phe Phe Leu325 330 335Glu Trp Tyr Ser Gly Lys Leu Leu Glu His Gly Asp Arg Ile Leu Ala
340 345 350Ala Gly Glu Ser Ile Tyr Gln Gly Thr Gly Ala Lys Leu Ser Gly Lys355 360 365Val Ala Gly Ile His Trp His Tyr Asn Thr Arg Ser His Ala Ala Glu370 375 380Leu Thr Ser Gly Tyr Tyr Asn Thr Arg His Arg Asp Gly Tyr Leu Pro385 390 395 400Ile Ala Arg Met Leu Ala Lys His Gly Ala Val Leu Asn Phe Thr Cys405 410 415Met Glu Met Arg Asp Gly Glu Gln Pro Gln Ser Ala Asn Cys Ser Pro420 425 430Glu Gly Leu Val Arg Gln Val Lys Thr Ala Ala Arg Thr Ala Glu Val435 440 445Glu Leu Ala Gly Glu Asn Ala Leu Glu Arg Tyr Asp Gly Gly Ala Phe450 455 460Ser Gln Val Leu Ala Thr Ser Met Ser Asp Ser Gly Asn Gly Leu Ser465 470 475 480Ala Phe Thr Phe Leu Arg Met Asn Lys Arg Leu Phe Glu Pro Glu Asn485 490 495Trp Arg Asn Leu Val Gln Phe Val Lys Ser Met Ser Glu Gly Gly Arg500 505 510Asn Ala Ser Leu Pro Glu Cys Asp Ser Ser Arg Thr Asp Leu Tyr Val515 520 525Arg Phe Ile Lys Glu Ser His Ser Lys Lys Ala Thr Glu Val Ala Val530 535 540Val54權利要求
1.編碼參與淀粉降解的蛋白質的核酸分子，該核酸分子選自(a)編碼至少蛋白質的成熟形式的核酸分子，該蛋白質包含在SEQ ID NO2、4、6或8中所示的氨基酸序列；(b)包含在SEQ ID NO1、3、5或7中所示核苷酸序列的核酸分子；(c)編碼下述蛋白質的核酸分子，該蛋白質的氨基酸序列與在SEQ ID NO2、4、6或8中所示的氨基酸序列具有至少40％的同源性；(d)互補鏈與如在(a)或(b)中所限定的核酸分子雜交的核酸分子；(e)包含編碼蛋白質的生物活性片段的核苷酸序列的核酸分子，該蛋白質由如在(a)、(b)、(c)或(d)中任何一項所限定的核酸分子編碼；及(f)其核苷酸序列由于遺傳密碼的簡并性而從如在(b)、(c)、(d)或(e)中任何一項所限定的核酸分子的序列衍生而來的核酸分子。
2.與權利要求1的核酸分子特異性雜交的寡核苷酸或多核苷酸。
3.含有根據權利要求1的核酸分子的載體。
4.根據權利要求3的載體，其中的核酸分子以有義方向與調節元件連接，從而確保可翻譯的RNA在原核或真核細胞中的轉錄和翻譯。
5.用權利要求1的核酸分子或權利要求3或4的載體轉化的宿主細胞或從該細胞傳代下來的宿主細胞。
6.根據權利要求5的宿主細胞，其為微生物細胞。
7.根據權利要求5的宿主細胞，其為大腸桿菌細胞。
8.制備參與淀粉降解的蛋白質或其生物活性片段的方法，其中權利要求5～7中任何一項的宿主細胞在允許蛋白質合成的條件下培養，且其中蛋白質從培養的細胞和/或培養基中分離。
9.由權利要求1的核酸分子編碼的或根據權利要求8的方法制備的蛋白質或其生物活性片段。
10.用權利要求1的核酸分子或權利要求3或4的載體轉化的轉基因植物細胞或從該細胞傳代下來的轉基因植物細胞，其中編碼參與淀粉降解的蛋白質的核酸分子處于調節元件控制之下，從而允許可翻譯的mRNA在植物細胞中的轉錄。
11.含有權利要求10的植物細胞的植物。
12.根據權利要求11的植物，其為有用的植物。
13.根據權利要求11或12的植物，其為淀粉貯藏植物。
14.權利要求13的植物，其為馬鈴薯植物。
15.根據權利要求11～14中任何一項的植物的繁殖材料，其含有權利要求10的植物細胞。
16.編碼與權利要求1的DNA分子的轉錄物互補的反義-RNA的DNA分子。
17.編碼具有核酶活性的RNA的DNA分子，該核酶活性特異性切割權利要求1的DNA分子的轉錄物。
18.編碼具有共抑制作用的RNA的DNA分子。
19.編碼RNA的DNA分子，該RNA在植物細胞中表達時由于RNA干涉(RNAi)而導致權利要求1的核酸分子的表達減少。
20.含有權利要求16～19中任何一項的DNA分子的載體。
21.權利要求20的載體，其中的DNA分子與調節性DNA元件聯合，從而確保在植物細胞中的轉錄。
22.含有權利要求16～19中任何一項的DNA分子或權利要求20或21的載體的宿主細胞
23.轉基因植物細胞，其中外源核酸分子的存在或表達導致權利要求9的蛋白質的減少的內源活性。
24.權利要求23的轉基因植物細胞，其中該減少的內源活性歸因于編碼權利要求9的蛋白質的內源基因的表達被抑制。
25.權利要求24的轉基因植物細胞，其中外源核酸分子選自(a)編碼可導致編碼權利要求9的蛋白質的內源基因表達減少的反義-RNA或RNAi構建體的DNA分子；(b)可經由共抑制作用而導致編碼權利要求9的蛋白質的內源基因表達減少的DNA分子；(c)編碼核酶的DNA分子，該核酶可特異性切割編碼權利要求9的蛋白質的內源基因的轉錄物；及(d)經由體內誘變被引入的核酸分子，該誘變導致在編碼權利要求9的蛋白質的內源基因中突變或插入異源序列，從而導致權利要求9的蛋白質表達的減少或導致無活性蛋白質的合成。
26.含有權利要求23～25中任何一項的植物細胞的轉基因植物。
27.通過轉錄權利要求16～19中任何一項的DNA分子可獲得的RNA分子。
28.生產顯示淀粉降解減少的轉基因植物細胞的方法，該方法特征在于細胞中以內源形式合成的權利要求9的蛋白質的量在細胞中減少。
29.權利要求28的方法，其特征在于細胞中權利要求9的蛋白質的量的減少由反義作用所導致。
30.權利要求28的方法，其特征在于細胞中權利要求9的蛋白質的量的減少由核酶作用所導致。
31.權利要求28的方法，其特征在于細胞中權利要求9的蛋白質的量的減少由共抑制作用所導致。
32.權利要求28的方法，其特征在于細胞中權利要求9的蛋白質的量的減少由編碼該蛋白質的內源基因的突變所導致，該突變經由體內誘變引入。
33.權利要求28的方法，其特征在于細胞中權利要求9的蛋白質的量的減少由RNA干涉(RNAi)作用所導致。
34.通過權利要求28～33中任何一項的方法可獲得的植物細胞。
35.含有權利要求34的植物細胞的轉基因植物。
36.含有權利要求23～25中任何一項或權利要求34的植物細胞的權利要求35的植物的繁殖材料。
37.包含權利要求9的蛋白質的洗滌劑或沖洗劑。
全文摘要
本發明提供編碼淀粉降解酶的核酸分子。此外，提供載體和用此處描述的核酸分子轉化的宿主細胞和植物細胞及含有這些細胞的植物。此外，描述了制備顯示增加的或減少的淀粉降解的轉基因植物的方法。
文檔編號C12N5/10GK1610739SQ02808843
公開日2005年4月27日 申請日期2002年4月25日 優先權日2001年4月25日
發明者A·施迪格, J·科斯曼, A·弗洛里奇 申請人:馬普科技促進協會