人g蛋白偶聯受體的內源性和非內源性形式的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：407712閱讀：374來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：人g蛋白偶聯受體的內源性和非內源性形式的制作方法
            
技術領域：
            本發明涉及跨膜受體，在某些實施方案中，涉及G蛋白偶聯受體且，在某些優選實施方案中，涉及被改變從而確立或提高受體組成型活性的內源性GPCR。在某些實施方案中，組成型活化的GPCR可用于直接鑒定作為受體激動劑或反向激動劑的侯選化合物，所述受體激動劑或反向激動劑適于用作治療劑。
            
背景技術：
            雖然人類中存在很多種類的受體，但最豐富而且與治療最相關的是G蛋白偶聯受體(GPCR)。據估計，人類基因組內有大約30,000-40,000個基因，而這些基因中，大約有2％編碼GPCR。已經鑒定其內源性配體的受體，包括GPCR被稱為“已知”受體，而尚未鑒定其內源性配體的受體被稱作“孤獨”受體。
            
GPCR代表了藥物產品研發的一個重要領域全部處方藥物的大約60％是從100個已知GPCR的大約20個中研發出來的。例如，1999年，在主要的100個商標名處方藥物中，下列藥物與GPCR相互作用(所治療的疾病和/或病癥在括號中說明)Claritin(過敏)   Prozac(抑郁)   Vasotec(高血壓)Paxil(抑郁)  Zoloft(抑郁)   Zyprexa(精神病)Cozaar(高血壓)   Imitrex(偏頭痛)Zantac(反流)Propulsid(反流疾病)  Risperdal(精神分裂癥)  Serevent(哮喘)Pepcid(反流) Gaster(潰瘍)   Atrovent(支氣管痙攣)Effexor(抑郁)Depakote(癲癇) Cardura(前列腺肥大)Allegra(過敏)Lupron(前列腺癌)   Zoladex(前列腺癌)Diprivan(麻醉)   BuSpar(焦慮)   Ventolin(支氣管痙攣)Hytrin(高血壓)   Wellbutrin(抑郁)   Zyrtec(鼻炎)Palvix(MI/中風)  Toprol-XL(高血壓)  Tenormin(心絞痛)Xalatan(青光眼)  Singulair(哮喘)Diovan(高血壓)Harnal(前列腺增生)(Med Ad News 1999的數據)。
            
GPCR共有一個共同的結構基元，它們有7個由22-24個疏水氨基酸組成的序列，形成7個α螺旋，每個螺旋都跨膜(每個跨膜區是用數字表示的，即，跨膜-1(TM-1)，跨膜-2(TM-2)，等)。跨膜螺旋通過細胞膜外部，或“胞外”側的跨膜-2和跨膜-3，跨膜-4和跨膜-5，及跨膜-6和跨膜-7之間的氨基酸鏈連接(這些分別被稱作“胞外”區1，2和3(EC-1，EC-2和EC-3))。跨膜螺旋也可通過細胞膜內部，或“胞內”側的跨膜-1和跨膜-2，跨膜-3和跨膜-4，及跨膜-5和跨膜-6之間的氨基酸鏈連接(這些分別被稱作“胞內”區1，2和3(IC-1，IC-2和IC-3))。受體的“羧基”(“C”)末端位于細胞內的胞內空間，受體的“氨基”(“N”)末端位于細胞外的胞外空間。
            
通常，當內源性配體與受體結合(有時也稱作受體的“活化”)時，胞內區的構象發生改變，使胞內區和胞內“G-蛋白”之間偶聯。據報道，GPCR對G蛋白而言是“混雜的”，即，GPCR可與不止一個G蛋白相互作用。見，Kenakin，T.，43 Life Sciences 1095(1988)。雖然還存在其它G蛋白，但目前已經鑒定的G蛋白是Gq，Gs，Gi，Gz和Go。配體活化的CPCR與G-蛋白的偶聯可引發信號級聯放大過程(也稱作“信號轉導”)。在正常條件下，信號轉導最終導致細胞活化或細胞抑制。雖然不希望受到理論的束縛，但據推測IC-3環及受體的羧基末端都與G蛋白相互作用。
            
在生理條件下，GPCR以兩個不同構象“非活性”狀態和“活性”狀態之間平衡的形式存在于細胞膜中。非活性狀態的受體不能與胞內信號轉導途徑連接，從而引發產生生物反應的信號轉導。受體構象到活性狀態的改變可(經由G蛋白)與轉導途徑連接，并產生生物反應。
            
受體可通過配體或化合物，如藥物而被穩定在活性狀態。近來發現，除了配體或藥物之外，還可提供其它促進并使受體穩定在活性狀態構象的方法，包括但不限制于對受體的氨基酸序列進行修飾。這些方法通過模擬配體與受體的結合作用而有效地將受體穩定在活性狀態。通過這種配體非依賴性方式進行的穩定被稱作“組成型受體活化”。
            
發明概述此處公開的是人GPCR的內源性和非內源性形式及其用途。
            
本發明某些實施方案涉及由SEQ ID NO.2的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體，由SEQ ID NO63的氨基酸序列編碼的它們的非內源性組成型活化形式，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及含有載體和SEQ ID NO.62的cDNA的質粒，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及由SEQ ID NO.4的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體，由SEQ ID NO65的氨基酸序列編碼的它們的非內源性組成型活化形式，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及含有載體和SEQ ID NO.64的cDNA的質粒，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及由SEQ ID NO.6的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體，它們的非內源性組成型活化形式，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及含有載體和SEQ ID NO.5的cDNA的質粒，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及由SEQ ID NO.8的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體，由SEQ ID NO67，SEQ ID NO.69，SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.73的氨基酸序列編碼的它們的非內源性組成型活化形式，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及含有載體和SEQ ID NO.66，SEQ IDNO.68，SEQ ID NO.70和SEQ ID NO.72的cDNA的質粒，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及由SEQ ID NO.10的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體，由SEQ ID NO75和SEQ ID NO.77的氨基酸序列編碼的它們的非內源性組成型活化形式，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及含有載體和SEQ ID NO.74和SEQ IDNO.76的cDNA的質粒，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及由SEQ ID NO.12的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體，由SEQ ID NO79和SEQ ID NO.81的氨基酸序列編碼的它們的非內源性組成型活化形式，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及含有載體和SEQ ID NO.78和SEQ IDNO.80的cDNA的質粒，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及由SEQ ID NO.14的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體，由SEQ ID NO83的氨基酸序列編碼的它們的非內源性組成型活化形式，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及含有載體和SEQ ID NO.82的cDNA的質粒，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及由SEQ ID NO.16的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體，由SEQ ID NO85的氨基酸序列編碼的它們的非內源性組成型活化形式，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及含有載體和SEQ ID NO.84的cDNA的質粒，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及由SEQ ID NO.18的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體，由SEQ ID NO87的氨基酸序列編碼的它們的非內源性組成型活化形式，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及含有載體和SEQ ID NO.86的cDNA的質粒，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及含有載體和SEQ ID NO.84的cDNA的質粒，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及由SEQ ID NO.98的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體，它們的非內源性組成型活化形式，及含有它們的宿主細胞。
            
本發明某些實施方案涉及含有載體和SEQ ID NO.97的cDNA的質粒，及含有它們的宿主細胞。
            
附圖簡述
            

            
圖1是基于細胞的第二信使環AMP測定結果的圖示，其中提供了內源性組成型活性的FPRL-2(“FPRL-2wt”)，與Gs/Gi融合蛋白構建體融合的FPRL-2的非內源性組成型活化形式(“FPRL-2(L240K)”)和對照組(“Gs/Gi”)的組成型信號傳遞的比較結果。
            
圖2提供與對照組(“CMV”)相比，內源性STRL33與非內源性組成型活化的STRL33(“STRL33(L230K)”的比較分析圖示結果，它們是在293T細胞中，利用8XCRE-Luc報道分子測定法得到的。
            
圖3提供與對照組(“CMV”)相比，內源性靶受體GPR45(“GPR45wt”)與非內源性TSHR(A632I)(“信號增強子”)共轉染的比較分析圖示結果，它們是在293細胞中，利用基于細胞的腺苷酸環化酶測定法得到的。該測定法包括TSH，即TSHR內源性配體的加入。
            
圖4提供內源性靶受體mGluR7(“mGluR7wt”)和非內源性TSHR(A623I)(“信號增強子”)的共轉染與靶受體mGluR7的非內源性組成型活化形式(“W590S”，“R659H”，“T771C”和“I790K”)和非內源性TSHR(A623I)共轉染的比較分析圖示結果，它們是在293細胞中，利用基于細胞的腺苷酸環化酶測定法得到的。該測定法包括TSH，即TSHR內源性配體的加入。
            
圖5提供內源性靶受體mGluR7(“mGluR7wt”)和非內源性TSHR(A623I)(“信號增強子”)的共轉染與靶受體mGluR7的非內源性組成型活化形式(“W590S”，“R659H”，“T771C”和“I790K”)和非內源性TSHR(A623I)共轉染的比較分析圖示結果，它們是在RGT細胞中，利用基于細胞的腺苷酸環化酶測定法得到的。該測定法包括TSH，即TSHR內源性配體的加入。
            
圖6提供在有和沒有谷氨酸鹽存在的情況下，與“Gq(缺失)”和“Gq(缺失)/Gi”相比，與Gq蛋白非內源性形式，即“Gq(缺失)”和“Gq(缺失)/Gi”共轉染的非內源性mGluR7，“T771C”的第二信使IP3產生的圖示。
            
圖7是SRE報道分子測定法中，內源性非-組成型活性的GPR37(“wt”)與GPR37的非內源性組成型活化形式(“C543Y”和“L352R”)的比較分析，其中對照組是表達載體(“CMV”)。
            
圖8是Gs/Gi融合構建體和內源性靶受體GPR37(“GPR37wt”)的共-轉染與Gs/Gi融合構建體和靶受體GPR37的非內源性組成型活化形式(“C543Y”和“L352R”)共轉染的比較分析，其中利用的是全細胞第二信使cAMP測定法。
            
圖9是在用毛喉素處理過的大鼠施旺氏細胞中表達的GPR37的RNA分析。細胞分化維持在20uM毛喉素。
            
圖10是在壓碎的大鼠坐骨神經中表達的GPR37的RNA分析。GPR37在壓碎后七(7)天被高度上調節。
            
圖11是IP3測定法中，內源性非組成型活性的HF1948(“wt”)與HF1948的非內源性組成型活化形式(“I281F”)的比較分析，其中對照組是表達載體(“pCMV”)。
            
圖12是內源性靶受體HF1948(“HF1948wt”)和非內源性TSHR(A623I)(“信號增強子”)的共轉染與靶受體HF1948的非內源性組成型活化形式(“I281F和“E135N”)和非內源性TSHR-A623I共轉染的比較分析，其中利用了全細胞腺苷酸環化酶測定法。該測定法包括TSH，TSHR內源性配體的加入。
            
圖13是使用多個胰細胞系進行的GPR66 RNA印跡結果的照片復制品。
            
圖14提供內源性GPR35與非內源性組成型活化的GPR35(“GPR35(A216K)”)比較分析的圖形結果，它們是在293A細胞中，利用E2F-Luc報道分子測定法進行的。
            
圖15是使用多個組織(人)的cDNA進行的GPR35 RNA印跡結果的照片復制品。
            
圖16提供內源性ETBR-LP2(“WT”)和非內源性TSHR-A623I(“TSHR-A623I”)(有和沒有TSH)的共轉染與非內源性組成型活化的ETBR-LP2(“N358K”)與突變的TSHR-A623I(有和沒有TSH)共轉染的比較分析，利用的是腺苷酸環化酶測定法。
            
圖17提供內源性ETBR-LP2(“WT”)與非內源性組成型活化的ETBR-LP2(“N358K”)比較分析的圖形結果，利用的是AP1報道分子測定系統。
            
圖18是在毛喉素處理過的大鼠施旺氏細胞中表達的ETBR-LP2的RNA分析。細胞分化維持在20uM毛喉素。
            
圖19是在壓碎的大鼠坐骨神經中表達的ETBR-LP2的RNA分析。ETBR-LP2在壓碎后七(7)天被高度上調節。
            
圖20A和20B提供人ETBR-LP2的推定氨基酸序列(“hETBRLP2p”)與人GPR37的報道氨基酸序列(“hGPR37p”)之間的序列比對報告。
            
詳細描述圍繞受體引出的科學文獻曾使用很多術語來稱呼對受體具有各種作用的配體。為了清楚而且一致，本專利文件將自始至終使用下列定義。當這些定義與這些術語的其它定義相矛盾時，應參照下列定義激動劑是指與受體結合時，可激活胞內反應，或提高GTP與膜結合的物質(例如，配體，候選化合物)。在某些實施方案中，激動劑是與受體結合時，激活胞內反應或提高GTP與膜結合的先前未知的那些物質。
            
此處所用的氨基酸縮寫在表A中列出
            
表A 
            
拮抗劑是指與激動劑在同一位點競爭性結合受體的物質(例如，配體，侯選化合物)，但它不會激活由受體活性形式引發的胞內反應，并可因此抑制由激動劑所致的胞內反應。在沒有激動劑存在的情況下，拮抗劑不會使基礎胞內反應減弱。在某些實施方案中，拮抗劑是與受體結合時，激活胞內反應或提高GTP與膜結合的先前未知的那些物質。
            
侯選化合物是指經篩選技術檢驗的分子(例如，但不限制于，化合物)。優選，短語“侯選化合物”不包括公眾已知的化合物，例如通過間接鑒定方法事先確定的受體反向激動劑，激動劑或拮抗劑(“間接鑒定的化合物”)；更優選，不包括先前已經確定對至少一種哺乳動物有治療效果的間接鑒定的化合物；且，最優選，不包括先前已經確定對人具有治療作用的間接鑒定的化合物。
            
組合物是指含有至少一個組分的物質；“藥物組合物”是組合物的例子。
            
化合物的效力是指化合物抑制或刺激受體功能性的能力，即，與受體結合親和力相反的，激活/抑制信號轉導途徑的能力的測量值。檢測化合物效力的代表性方法在本專利文件的實施例部分中公開。
            
密碼子是指3個一組的核苷酸(或核苷酸等價物)，它通常包括與磷酸基團偶聯的核苷(腺苷(A)，鳥苷(G)，胞苷(C)，尿苷(U)和胸苷(T))，當被翻譯時，編碼氨基酸。
            
組成型活化的受體是指經過組成型受體活化的受體。組成型活化的受體可以是內源性的或非內源性的。
            
組成型受體活化是指利用除了使受體與其配體或化學等價物結合之外的其它方法將受體穩定在活性狀態。
            
接觸是指在體外系統或體內系統中，使至少兩個部分在一起。
            
直接鑒定或直接鑒定的，在涉及短語“侯選化合物”時，是指對侯選化合物進行組成型活化受體，優選組成型活化的孤獨受體，更優選組成型活化的G蛋白偶聯細胞表面孤獨受體的篩選，并評估這個化合物的效力。這個短語在任何情況下，都不能被解釋或理解為包括短語“間接鑒定”或“間接鑒定的”，或被它們包括在內。
            
內源性是指哺乳動物天然產生的物質。例如，但不限制于，相對于術語“受體”而言，內源性是指由哺乳動物(例如，但不限制于，人)或病毒天然產生的。相反，本文中的術語非內源性的是指不是由哺乳動物(例如，但不限制于，人)或病毒天然產生的。例如，但不限制于，其內源性形式的受體不是組成型活性的，但對它進行操作，使它成為組成型活性時，最優選稱其為“非內源性組成型活化的受體”。兩個術語都可用于描述“體內”和“體外”系統。例如，但不限制于，在篩選方法中，內源性或非內源性受體都可用于體外篩選系統中。作為又一個例子，而且不是限制，當對哺乳動物基因組進行操作，使其含有非內源性組成型活化的受體時，可以利用體內系統篩選侯選化合物。
            
G蛋白偶聯受體融合蛋白和GPCR融合蛋白，在此處公開的本發明范圍內，是指非內源性蛋白，它含有內源性組成型活化的GPCR或非內源性組成型活化的GPCR，所述非內源性組成型活化的GPCR與至少一個G蛋白，更優選這種G蛋白的α亞單位(結合GTP的亞單位)融合，所述G蛋白的類型優選與內源性孤獨GPCR天然偶聯的G蛋白相同。例如，但沒有限制，在內源性狀態，如果G蛋白“Gsα”是與GPCR偶聯的優勢G蛋白，那么基于特定GPCR的GPCR融合蛋白則是含有與Gsα融合的GPCR的非內源性蛋白；在某些情況下，如下面所述，非-優勢G蛋白也可與GPCR融合。G蛋白可與組成型活性GPCR的C-末端直接融合，或兩個之間存在間隔區。
            
宿主細胞是指其中能夠插入質粒和/或載體的細胞。對于原核宿主細胞而言，當宿主細胞復制時，質粒通常作為自主分子被復制(通常在復制后，質粒被分離出來，然后引入到真核宿主細胞中)；對于真核宿主細胞而言，質粒被整合到宿主細胞的細胞DNA中，這樣當真核宿主細胞復制時，質粒也復制。在某些實施方案中，宿主細胞是真核的，更優選哺乳動物，最優選選自293，293T和COS-7細胞。
            
間接鑒定或間接鑒定的是指發現藥物的傳統方法，包括鑒定對內源性受體特異的內源性配體，對候選化合物進行受體篩選，確定干擾和/或競爭配體-受體相互反應的那些化合物，并評估化合物影響至少一個與活化受體有關的第二信使途徑的效力。
            
抑制，相對于術語“反應”而言，是指與沒有化合物存在的情況相反，在有化合物存在的情況下，反應降低或被阻礙。
            
反向(inverse)激動劑是指與受體的內源性形式或受體的組成型活化形式結合的物質(例如，配體，候選化合物)，它們可抑制由受體活性形式引發的基礎胞內反應，直到低于標準活性基礎水平，所述標準活性基礎水平是在無激動劑存在的情況下觀察的，或它們可降低GTP與膜的結合。優選與沒有反向激動劑存在情況下的基礎反應相比，在有反向激動劑存在的情況下，基礎胞內反應被抑制至少30％，至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，最優選至少99％。
            
已知受體是指其特異性內源性配體已被鑒定的內源性受體。
            
配體是指對天然存在的受體特異的分子。
            
突變體或突變，相對于內源性受體的核酸和/或氨基酸序列而言，是指對這種內源性序列進行特定的一種或多種改變，從而使內源性非組成型活化的受體顯示受體的組成型活化。對于特定序列的等價物而言，人受體后來的突變形式被認為與人受體的第一次突變等價，條件是(a)人受體后來的突變形式的組成型活化水平與受體第一次突變的水平基本相同，和(b)受體后來的突變形式與受體第一次突變之間的序列(氨基酸和/或核酸)同源性百分比為至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，最優選至少99％。在某些實施方案中，由于此處公開用于實現組成型活化的某些優選盒在GPCR的內源性和非內源性形式之間具有單一氨基酸和/或密碼子的改變，因此優選序列同源性的百分比應至少為98％。
            
非-孤獨受體是指對所鑒定配體特異的，內源性天然存在的分子，其中配體與受體的結合可激活胞內信號傳遞途徑。
            
孤獨受體是指對其特異的配體還未鑒定或未知的內源性受體。
            
藥物組合物是指含有至少一個活性成分的組合物，并因此可以在哺乳動物(例如，但不限制于，人)中研究特定，有效的結果。本領域那些普通技術人員應當能夠理解并正確評價適于確定活性成分是否具有技術人員所需的有效結果的技術。
            
質粒是指載體與cDNA的結合。通常，為了復制和/或使cDNA表達為蛋白，而將質粒引入到宿主細胞中。
            
第二信使是指受體活化產生的胞內反應。第二信使可以包括，例如，肌醇三磷酸(IP3)，二酰甘油(DAG)，環AMP(cAMP)，和環GMP(cGMP)。測量第二信使的反應可用于測定受體活化。此外，測量第二信使的反應還可用于直接鑒定侯選化合物，包括，例如，反向激動劑，激動劑，和拮抗劑。
            
信噪比是指響應活化，擴增，或刺激時產生的信號高于背景噪聲或響應未活化，未擴增，或未刺激時的基礎水平。
            
間隔區是指位于基因，例如目標GPCR最后的密碼子或氨基酸之后，目標G蛋白的起始密碼子或起始區之前的翻譯氨基酸數，其中所述翻譯氨基酸位于目標G蛋白起始區的讀框中。翻譯氨基酸數可根據技術人員的需要特制，通常約為1個氨基酸，優選2個氨基酸，更優選3個氨基酸，更優選4個氨基酸，更優選5個氨基酸，更優選6個氨基酸，更優選7個氨基酸，更優選8個氨基酸，更優選9個氨基酸，更優選10個氨基酸，更優選11個氨基酸，甚至更優選12個氨基酸。
            
刺激，相對于術語“反應”而言，是指與沒有化合物存在的情況相反，在有化合物存在的情況下，反應增加。
            
基本上是指結果在對照組結果的40％之內，優選35％之內，更優選30％之內，更優選25％之內，更優選20％之內，更優選15％之內，更優選10％之內，更優選5％之內，更優選2％之內，最優選1％之內。例如，就受體功能性而言，如果使用此處教導的方法或技術人員已知的相似方法測量的轉導信號在對照組所產生信號的40％之內，那么試驗受體顯示與對照受體基本相似的結果。
            
載體，相對于cDNA而言，是指能將至少一個cDNA插入到宿主細胞中的環狀DNA。
            
下列部分的順序是為了描述效果而排列的，而不能解釋為對下面公開或權利要求的限制。
            
A.引言受體的傳統研究通常是根據先前假定(以歷史為基礎)進行的，即，在發現可影響受體的拮抗劑和其它分子之前，首先必須鑒定內源性配體。即使在事先已經知道拮抗劑的情況下，也應該立即開展尋找內源性配體的研究。甚至在發現組成型活化受體之后，在受體研究中，仍然要堅持這種思維模式。在此之前還沒有認識到，受體的活性狀態對于發現受體的激動劑和反向激動劑才是最有用的。對于由活性過高受體或活性較低受體導致的那些疾病而言，我們希望治療藥物是分別可使受體活性狀態降低，或提高受體活性的化合物，而不希望該藥物是內源性配體的拮抗劑。這是因為，降低或提高活性受體狀態活性的化合物無需與內源性配體在同一位點結合。因此，根據本發明方法的教導，尋找治療化合物的任何研究都應通過針對配體-非依賴性活性狀態篩選化合物開始。
            
B.人GPCR的鑒定人類基因組計劃的實施鑒定了位于人類基因組內的有關核酸序列的大量信息；經過這種努力，即使對任一特定基因組序列是否含有翻譯人類蛋白的可讀框信息不了解或沒有認識，我們也可獲得遺傳序列信息。鑒定人類基因組內核酸序列的很多方法都是本領域那些普通技術人員已知的。
            
受體同源性可用于了解受體在人體內所起的作用。本專利文件對使這些受體突變的技術進行了改進，從而確定這些受體的非內源性組成型活化形式。
            
此處公開的技術還可應用于本領域已知的其它人GPCR，這對于本領域那些技術人員而言是顯而易見的。
            
C.受體的篩選對候選化合物進行此處公開的GPCR的非內源性組成型活化形式的篩選可直接鑒定作用于細胞表面受體的候選化合物，而且無需使用受體的內源性配體。使用常規并且通常可商購的技術可確定此處公開的人GPCR內源性形式在體內表達和/或過量-表達的區域。受體在特定組織中的表達位置可為科學家提供確定受體生理功能作用的能力。使用這些技術還可確定與受體表達和/或過量表達有關的相關疾病/病癥狀況，這種方法在本專利文件中公開。此外，受體在病變器官中的表達可幫助人們確定受體臨床關聯性的大小。
            
此處公開的GPCR的組成型活化是以距離脯氨酸殘基的距離為基礎的，據推測所述脯氨酸殘基位于GPCR的TM6內；該算法技術在共同未決的，而且通常已轉讓的專利文件PCT申請號PCT/US99/23938，即2000年4月20日公開的WO 00/22129，和此處所列的其它專利文件中公開，它們全部引入此處作為參考。該算法技術不是根據傳統的序列“比對”來預測的，而是根據距離上述TM6脯氨酸殘基(或，這種脯氨酸殘基的內源性組成型替代物)的特定距離來預測的。通過使距離該殘基16個氨基酸殘基處的氨基酸(據推測，位于受體的IC3區中)突變為，最優選賴氨酸殘基，可獲得受體的組成型活化。其它氨基酸殘基在此位置的突變也可達到此目的。
            
D.疾病/病癥的鑒定和/或選擇正如下面將要更詳細描述的，非內源性組成型活化的GPCR的反向激動劑和激動劑可通過本發明的方法鑒定。這種反向激動劑和激動劑是用于治療與該受體有關疾病的藥物發現計劃中先導化合物的理想候選者。因為可直接鑒定GPCR的反向激動劑，因此可研究用于治療與GPCR有關的疾病和病癥的藥物組合物。受體在特定組織中的表達位置可為科學家提供確定受體生理功能的能力。例如，篩選病變和正常組織樣品中GPCR的存在，現在不僅是學術研究的需要，而且還是鑒定特定GPCR的內源性配體的需要。組織檢測可在多種健康和病變組織中進行。這種組織檢測為把特定受體與疾病和/或病癥聯系起來提供了可能的第一步。此外，受體在病變器官中的表達可幫助人們確定受體臨床關聯性的大小。根據本發明公開的內容，一旦把受體定位在特定的組織或區域，相信技術人員就能夠推斷GPCR的功能。
            
GPCR的DNA序列可用于制造探針/引物。在某些優選實施方案中，所述DNA序列可用于制造探針，而該探針則用于(a)針對組織-mRNA進行斑點印跡分析，和/或(b)受體在組織樣品中表達的RT-PCR鑒定。組織或病變組織中受體的存在，或與正常組織相比，病變組織中所存在受體水平的提高，可用于把位置與功能聯系起來，并預示受體的生理作用/功能，并建立治療方案，包括但不限制于，治療與該功能/作用有關的疾病。受體還可通過該技術而被定位在器官的區域中。以受體在其中定位的特定組織的已知或假定作用/功能，可推斷受體的推定生理功能。例如但不限制于，在丘腦區域中定位/表達的蛋白與感覺運動過程和覺醒有關(見，Goodman & Gilman’s，The PharmacologicalBasis of Therapeutics，9thEdition，第465頁(1996))。在海馬或施旺氏細胞中表達的蛋白分別與認知和記憶，以及周圍神經的髓鞘形成有關(見，Kandel，E.等，Essentials of Neural Science andBehavior，分別在第657，680和28頁(1995))。在某些實施方案中，探針和/或引物可用于檢測和/或診斷疾病和/或病癥，包括但不限制于，在下面實施例6中鑒定的那些疾病和病癥。生產這種引物和/或探針的方法及使用引物和/或探針檢測疾病和/或病癥的方法為本領域那些技術人員熟知。
            
E.候選化合物的篩選1.一般的GPCR篩選測定技術當G蛋白受體變為組成型活性時，它與G蛋白(例如，Gq，Gs，Gi，Gz，Go)結合，并刺激GTP與G蛋白的結合。然后G蛋白起GTP酶的作用，把GTP水解為GDP，由此受體在正常情況下失活。然而，組成型活化的受體繼續把GDP交換成GTP。GTP的不可水解類似物[35S]GTPγS可用于監測與膜的結合是否提高，該膜表達組成型活化的受體。據報道[35S]GTPγS可用于監測有和沒有配體存在的情況下，G蛋白與膜的偶聯。在本領域那些技術人員熟知而且有效的其它實施例之中，這種監測的其中一個實施例由Traynor和Nahorski于1995年報道。這種測定系統的使用通常是為了初步篩選候選化合物，這是因為本系統通常可用于所有G蛋白偶聯受體，和與受體胞內域相互作用的特定G蛋白無關。
            
2.特定的GPCR篩選測定技術當使用“一般”G蛋白偶聯受體測定法(即，選擇是激動劑或反向激動劑的化合物的測定法)鑒定候選化合物時，優選進行進一步篩選，以證實化合物已經在受體位點相互作用。例如，由“一般”測定法鑒定的化合物可能不與受體結合，但可僅從胞內域與G蛋白“解偶聯”。
            
a.Gs，Gz和GiGs刺激腺苷酸環化酶。另一方面，Gi(和Gz以及Go)則抑制腺苷酸環化酶。腺苷酸環化酶可催化ATP向cAMP轉化；因此，與Gs蛋白偶聯的組成型活化GPCR與細胞cAMP水平的增加有關。另一方面，與Gi(或Gz，Go)蛋白偶聯的組成型活化GPCR與細胞cAMP水平的降低有關。通常，見，“Indirect Mechanisms of SynapticTransmission”，Chpt.8，From Neuron To Brain(3rdEd.)Nichols，J.G.等編輯，Sinauer Associates，Inc.(1992)。因此，檢測cAMP的測定法也可用于確定候選化合物是否是受體的反向激動劑(即，這種化合物是否可降低cAMP的水平)。可利用本領域已知的各種方法測量cAMP；最優選的方法是在基于ELISA的形式中使用抗-cAMP抗體。可利用的其它類型的測定法是全細胞第二信使報道分子系統測定法。基因上的啟動子可驅動特定基因編碼的蛋白的表達。環AMP通過促進cAMP-反應性DNA結合蛋白或轉錄因子(CREB)的結合而驅動基因表達，其中所述轉錄因子(CREB)在特定位點(cAMP反應元件)與啟動子結合并驅動基因的表達。構建報道分子系統，使其具有啟動子，而該啟動子在報道基因，例如β-半乳糖苷酶或熒光素酶之前含有多個cAMP反應元件。因此，組成型活化的Gs-連接受體可引起cAMP累積，然后激活基因并導致報道基因蛋白的表達。報道蛋白，如β-半乳糖苷酶或熒光素酶可使用標準生化測定法檢測(Chen等，1995)。
            
b.Go和GqGq和Go與磷脂酶C的活化有關，它們依次水解磷脂PIP2，釋放兩個胞內信使二酰甘油(DAG)和肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)。IP3的逐漸累積與Gq和Go-相關受體的活化有關。通常見，“IndirectMechanisms of Synaptic Transmission”，Chpt.8，From Neuron ToBrain(3rdEd.)Nichols，J.G.等編輯，Sinauer Associates，Inc.(1992)。檢測IP3累積的測定法可用于確定候選化合物是否是Gq或Go相關受體的反向激動劑(即，這種化合物是否可降低IP3的水平)。Gq相關受體還可使用AP1報道分子測定法檢測，其中Gq依賴性磷脂酶C可引起含AP1元件的基因的活化；因此，活化的Gq相關受體可使這種基因的表達增加，因此，其反向激動劑可證明這種表達的降低，激動劑則證明這種表達的增加。進行這種檢測的測定法在商業上是可行的。
            
3.GPCR融合蛋白內源性組成型活化的GPCR或非內源性組成型活化的GPCR用于篩選侯選化合物，直接鑒定反向激動劑、激動劑的用途為篩選提出了一個有趣的問題，即，在沒有內源性配體與之結合的情況下，受體也是有活性的。因此，為了區分有侯選化合物存在情況下的非內源性受體和沒有該化合物存在情況下的非內源性受體，這種區分的目的是為了解這種化合物是否是反向激動劑或激動劑或對這種受體根本沒有影響，優選所用的方法可提高這種區分。優選方法使用GPCR融合蛋白。
            
通常，一旦使用上述(及其它)測定技術確定了非內源性GPCR是組成型活化的，就可確定與內源性GPCR偶聯的優勢G蛋白。G蛋白與GPCR的偶聯提供了可評估的信號傳遞途徑。在某些實施方案中，優選篩選是使用哺乳動物表達系統進行的，希望這個系統中有內源性G蛋白。因此，在這個系統中，非內源性組成型活化的GPCR將持續發出信號。在某些實施方案中，優選加強信號，這樣在有受體反向激動劑存在的情況下，可更容易區分與反向激動劑接觸的受體，特別是在篩選時。
            
GPCR融合蛋白可提高與非內源性GPCR偶聯的G蛋白的效力。GPCR融合蛋白優選用于篩選內源性組成型活性的GPCR或非內源性組成型活化的GPCR，這是因為這種方法可增加在這種篩選技術中使用的信號。促進顯著的“信噪比”非常重要；這種顯著的信噪比優選用于篩選此處公開的侯選化合物。
            
用于GPCR融合蛋白表達的構建體的構建是本領域那些技術人員已知的。市售的表達載體和系統提供了各種方法，可滿足研究人員的特殊需要。構建這種GPCR融合蛋白構建體的重要標準包括但不限制于，內源性GPCR序列和G蛋白序列都符合讀框(優選，內源性GPCR的序列位于G蛋白序列的上游)，而且GPCR的“終止”密碼子被缺失或替換，這樣在GPCR表達時，G蛋白也被表達。其它實施方案包括其中的內源性GPCR序列和G蛋白序列不符合讀框和/或“終止”密碼子未被缺失或替換的構建體。GPCR可與G蛋白直接連接，或兩者之間存在間隔殘基(雖然這個數字可由本領域普通技術人員很容易地確定，但優選不超過約12個)。為方便起見，優選使用間隔區。優選，在構建GPCR融合蛋白構建體之前，鑒定與非內源性GPCR偶聯的G蛋白。因為只有少數G蛋白已鑒定，因此優選含有G蛋白序列(即，通用的G蛋白構建體(見實施例))的構建體中可插入內源性GPCR序列；這樣就可有效地，大規模篩選具有不同序列的各種不同的內源性GPCR。
            
如上所述，預期與Gi，Gz和Go偶聯的組成型活化的GPCR可抑制cAMP的形成，這就使得以這些類型GPCR為基礎的測定法具有挑戰性(即，cAMP信號在活化后降低，從而直接鑒定例如反向激動劑(它可進一步降低該信號))。正如此處所公開的，我們已經確定，對于這些類型的受體而言，可生產不是以GPCR內源性G蛋白為基礎的GPCR融合蛋白，努力建立可行的，以環化酶為基礎的測定法。因此，例如，內源性Gi偶聯受體可與Gs蛋白融合-這種融合構建體在表達時，可“驅動”或“推動”內源性GPCR與例如Gs，而不是“天然”Gi蛋白偶聯，這樣就可建立以環化酶為基礎的測定法。因此，對于Gi，Gz和Go偶聯受體而言，在某些實施方案中，優選當使用GPCR融合蛋白，而且測定法是以腺苷酸環化酶活性的檢測為基礎時，使用Gs(或刺激腺苷酸環化酶形成的等同G蛋白)建立融合構建體。 
            
利用Gq蛋白與Gs，Gi，Gz或Go蛋白融合的G蛋白融合構建體同樣有效。在某些實施方案中，優選的融合構建體可使用Gq蛋白獲得，其中G-蛋白α-亞單位(“Gαq”)的前六(6)個氨基酸被缺失，Gαq C-末端的后五(5)個氨基酸被目標G蛋白Gα的相應氨基酸替換。例如，融合構建體可以是Gq(6個氨基酸缺失)與Gi蛋白的融合，得到“Gq/Gi融合構建體”。該融合構建體可推動內源性Gi偶聯受體與其非內源性G蛋白Gq偶聯，這樣就可測量第二信使，例如，肌醇三磷酸或二酰甘油而不是cAMP的產生。
            
4.靶Gi偶聯的GPCR與信號增強子Gs偶聯的GPCR的共轉染(基于cAMP的測定法)已知Gi偶聯受體可抑制腺苷酸環化酶，并因此降低cAMP產生的水平，這就不容易評估cAMP的水平。作為活化后主要偶聯Gi的受體組成型活化的指示，測量所產生cAMP降低的有效技術可通過使信號增強子，例如，活化后主要與Gs偶聯的非內源性組成型活化受體(例如，下面公開的TSHR-A623I)與Gi連接的GPCR共轉染而實現。顯然，Gs偶聯受體的組成型活化可根據所產生cAMP的增加測定。Gi偶聯受體的組成型活化可導致所產生cAMP的降低。因此，共轉染方法意在有效利用這些“相反”的作用。例如，非內源性組成型活化的Gs偶聯受體(“信號增強子”)與內源性Gi偶聯受體(“靶受體”)的共轉染提供了基礎cAMP信號(即，雖然Gi偶聯受體可降低cAMP水平，但這種“降低”是相對于由組成型活化的Gs偶聯信號增強子建立的cAMP水平大量增加而言的)。然后，通過使信號增強子與靶受體的組成型活化形式共轉染，而預期cAMP會進一步降低(相對于基礎水平)，這是因為Gi靶的功能活性增加了(即降低cAMP)。
            
然后，使用基于cAMP的測定法篩選侯選化合物，相對于使用內源性受體/G-蛋白融合，發生了兩處‘改變’首先，相對于Gi偶聯的靶受體而言，會產生“相反的”作用，即，Gi偶聯的靶受體的反向激動劑使所測cAMP信號增加，而Gi偶聯的靶受體的激動劑則使該信號降低；第二，很明顯，使用這種方法直接鑒定的侯選化合物應單獨評估，以確保這些候選化合物不會針對信號增強受體(這可在對共轉染受體進行篩選之前或之后完成)。
            
F.藥物化學通常，但不總是如此，侯選化合物的直接鑒定是與通過組合化學技術產生的化合物聯合進行的，由此，隨機制備上千種化合物進行這種分析。通常，這種篩選的結果是具有獨特核心結構的化合物；此后，圍繞優選的核心結構對這些化合物進行其它化學修飾，從而進一步提高其藥物性質。這種技術對于本領域那些技術人員而言是已知的，無需在本專利文件中詳細描述。
            
G.藥物組合物為進行進一步的研究，可使用本領域那些技術人員熟知的技術，把所選擇的侯選化合物配制成藥物組合物。適宜的藥學上可接受的載體是本領域可得到的那些；例如，見Remington’s PharmaceuticalSciences，16thEdition，1980，Mack Publishing Co.，(Osol等編輯)。
            
H.其它用途雖然此處公開的GPCR非內源性形式的優選用途是直接鑒定作為反向激動劑或激動劑(優選用作藥劑)的侯選化合物，但GPCR的這些形式還有其它用途。例如，摻入GPCR的體外和體內系統可用于進一步說明并了解這些受體在正常人和病人中所起的作用，并了解把它用于理解信號級聯放大時，組成型活化的作用。在某些實施方案中，內源性受體優選是“孤獨受體”，即還沒有鑒定出該受體的內源性配體。因此在某些實施方案中，在鑒定內源性配體之前，修飾過的非內源性GPCR可用于了解內源性受體在人體中所起的作用。這種受體還可用于進一步說明已知受體及它們轉導信號的途徑。在本發明文件的基礎上，所公開受體的其它用途對于本領域那些技術人員而言是顯而易見的。
            
實施例下列提出的實施例是為了說明，而不是對本發明的限制。當此處公開了特定的核酸和氨基酸序列時，本領域那些普通技術人員可對這些序列進行較小的修飾，同時獲得與下面所報道的相同或基本相似的結果。應用或了解從一個序列到另一個序列(例如，從大鼠受體到人受體，或從人受體A到人受體B)的序列盒的傳統方法通常是以序列比對技術為基礎進行預測，由此通過把序列進行對比而確定共同區域。此處公開的突變方法不依賴于這種方法，而是以算法和距離人GPCR的TM6區中保守脯氨酸殘基的位置遠近為基礎的。一旦這種方法可靠，本領域那些技術人員就可對其進行較小的修飾，從而獲得與此處公開(即，組成型活化)的基本相同的結果。這種修飾方法被認為落在本公開的范圍之內。
            
實施例11.內源性人GPCR下列cDNA受體是利用這部分描述的技術克隆的，見下文。表B列出了本專利申請公開的受體，內源性GPCR的可讀框，核酸及氨基酸序列(表B)。
            
表B 
            
2.全長克隆方案a.FPRL-2(Seq.Id.Nos.1&2)FPRL-2是1992年，由Bao，L.等，13(2)Genomics 437-40(1992)克隆并測序的。據報道，FPRL-2位于染色體19上，它與N-甲酰基肽受體樣-1(FPR-1)的序列相似，它們二者與N-甲酰基肽受體(FPR)共有顯著的相似性。FPR的內源性配體是甲酰基肽，然而，FPR的兩個同系物，FPRL-1和FPRL-2，不與同一配體結合，但很可能是趨化受體。13(2)Genomics 437-40(1992)。據報道，趨化受體參與炎癥。FPRL-2是具有編碼353氨基酸蛋白的，1062bp可讀框的GPCR。
            
PCR是以基因組cDNA作為模板，使用rTth聚合酶(Perkin Elmer)和制造商提供的緩沖液系統，0.25μM的每種引物，和0.2mM的4種核苷酸進行的。循環條件是94℃1分鐘，64℃1分20秒和72℃2分鐘循環30次。5’PCR含具有下列序列的EcoRI位點5’-AAAGATTCAGGTGTGGGAAGATGGAAACC-3’(SEQ ID NO.19)而3’引物含具有下列序列的ApaI位點5’-AAAGGATCCCCGACCTCACATTGCTTGTA-3’(SEQ ID NO.20)PCR片段是用EcoRI和ApaI消化的，并被克隆到CMV表達載體的EcoRI-ApaI位點中。此后，測定并證實人FPRL-2的核酸(SEQ IDNO.1)及氨基酸(SEQ ID NO.2)序列。
            
b.STLR33(Seq.Id.Nos.3&4)PCR是以基因組cDNA作為模板，使用rTth聚合酶(Perkin Elmer)和制造商提供的緩沖液系統，0.25μM的每種引物，和0.2mM的4種核苷酸進行的。循環條件是94℃1分鐘，62℃1分20秒和72℃2分鐘循環30次。5’PCR含具有下列序列的EcoRI位點5’-CAGGAATTCATCAGAACAGACACCATGGCA-3’(SEQ ID NO.21)而3’引物含具有下列序列的BamHI位點5’-GCAGGATCCAGAGCAGTTTTTTCGAAACCCT-3’(SEQ ID NO.22)PCR片段是用EcoRI和BamHI消化的，并被克隆到CMV表達載體的EcoRI-BamHI位點中。此后，測定并證實人STRL33的核酸(SEQ IDNO.3)及氨基酸(SEQ ID NO.4)序列。
            
c.GPR45(Seq.Id.Nos.5&6)PCR是以基因組cDNA作為模板，使用rTth聚合酶(Perkin Elmer)和制造商提供的緩沖液系統，0.25μM的每種引物，和0.2mM的4種核苷酸進行的。循環條件如下96℃2分鐘，96℃30秒，55℃20秒，72℃1分20秒，和72℃5分鐘，其中第2-4輪重復35次。5’PCR含具有下列序列的HindIII位點5’-TCCAAGCTTCAAGGGTCTCTCCACGATGGCCTG-3’(SEQ ID NO.23)而3’引物含具有下列序列的EcoRI位點5’-TGCGAATTCTCTGTGGCCCCCTGACCCCCTAAA-3’(SEQ ID NO.24)PCR片段是用HindIII和EcoRI消化的，并被克隆到CMV表達載體的HindIII-EcoRI位點中。此后測定并證實人GPR45的核酸(SEQ IDNO.5)及氨基酸(SEQ ID NO.6)序列。
            
然后，通過使用pfu PCR再次亞克隆到V5-His載體中而用V5標記cDNA，所用的兩個引物具有下列序列5’-GGTAAGCTTACCATGGCCTGCAACAGCACGTCCCTT-3’(SEQ ID NO.25)和5’-GACGAATTCAACCGCAGACTGGTTTTCATTGCA-3’(SEQ ID NO.26)。
            
循環條件為94℃1分鐘，60℃2分鐘和72℃2分鐘循環30次。
            
d.mGluR7(Seq.Id.Nos.7&8)
            
谷氨酸是一種興奮性神經遞質，它在哺乳動物的腦中大量存在。見，Dingledine，R.等，130(4S Suppl)Nutr.1039S(2000)。谷氨酸受體有兩類，離子化的(配體-門控離子通道)和代謝向性的(metabotropic(GPCR))。代謝向性的谷氨酸受體是GPCR的異源家族，與若干第二信使途徑有關，可調節神經元的興奮性和突觸傳導。(見，Philips，T.等，57(1)Brain Res Mol Brain Res 132(1998))。據報道，7型代謝向性的谷氨酸鹽受體(mGluR7)在腦中表達，在海馬，大腦皮質和小腦中的表達水平最高。見，Makoff，A.等，40(1)Brain Res Mol Brain Res 165(1996)。根據受體在腦中定位的區域，可推斷受體的推定功能作用。例如，盡管不希望受任何特定理論的束縛，推測mGluR7可在抑郁，焦慮，肥胖，阿爾茨海默氏病，疼痛和中風中發揮作用。
            
mGluR7的cDNA是由Elizabeth Hoffman，Ph.D.慷慨提供的。mGluR7所用的載體是pRcCMV(mGluR7的編碼區被亞克隆到pCMV載體的EcoRI-ClaI位點)。見，mGluR7的核酸序列SEQ ID NO.7和推斷的氨基酸序列SEQ ID NO.8。
            
e.GPR37(Seq.Id.Nos.9&10)本發明還涉及人的GPR37。GPR37是1997年，由Marazziti，D.等，45(1)Genomics 68-77(1997)克隆并測序的。GPR37是具有編碼613氨基酸蛋白的，1839bp可讀框的孤獨GPCR。據報道，GPR37與B型-內皮素樣受體同源，并在人的腦組織，特別是胼胝體，髓質，殼核，和尾狀核中表達。
            
PCR是以腦cDNA作為模板，使用rTth聚合酶(Perkin Elmer)和制造商提供的緩沖液系統，0.25μM的每種引物，和0.2mM的4種核苷酸進行的。循環條件是94℃1分鐘，62℃1分鐘和72℃2分鐘循環30次。5’PCR含具有下列序列的HindIII位點5’-GCAAGCTTGTGCCCTCACCAAGCCATGCGAGCC-3’(SEQ ID NO.27)而3’引物含具有下列序列的EcoRI位點5’-CGGAATTCAGCAATGAGTTCCGACAGAAGC-3’(SEQ ID NO.28)1.9kb的PCR片段是用HindIII和EcoRI消化的，并被克隆到CMVp表達載體的HindIII-EcoRI位點中。此后，測定并證實人GPR37的核酸(SEQ ID NO.9)及氨基酸(SEQ ID NO.10)序列。
            
f.HF1948(Seq.Id.Nos.11&12)HF1948的cDNA是由Elizabeth Hoffman，Ph.D.慷慨提供的。HF1948所用的載體是pRcCMV(HF1948的編碼區被亞克隆到pCMV載體的HindIII-BamHI位點)。見，HF1948的核酸序列SEQ ID NO.11和推斷的氨基酸序列SEQ ID NO.12。
            
g.GPR66(Seq.Id.Nos.13&14)人GPR66的cDNA(GenBank登記號AF044600和AF044601)是如下產生并被克隆到pCMV表達載體中的PCR是以基因組DNA為模板進行的，第一輪PCR使用的是TaqPlus Precision聚合酶(Stratagene)，第二輪PCR使用的是pfu聚合酶(Stratagene)，還使用了由制造商提供的緩沖液系統，0.25μM的每種引物，0.2mM(TaqPlus Precision)或0.5mM(pfu)的4種核苷酸。當使用pfu時，緩沖液中含有10％DMSO。循環條件為94℃1分鐘，65℃1分鐘和72℃時(a)第一輪PCR1分鐘；(b)第二輪PCR2分鐘，循環30次。因為編碼區中存在內含子，因此，分別使用兩組引物生產重疊的5’和3’片段。5’片段的PCR引物是5’-ACCATGGCTTGCAATGGCAGTGCGGCCAGGGGGCACT-3’(外部有義)(SEQ ID NO.29)和5’-CGACCAGGACAAACAGCATCTTGGTCACTTGTCTCCGGC-3’(內部反義)(SEQ ID NO.30)3’片段的PCR引物是5’-GACCAAGATGCTGTTTGTCCTGGTCGTGGTGTTTGGCAT-3’(內部有義)(SEQ ID NO.31)和5’-CGGAATTCAGGATGGATCGGTCTCTTGCTGCGCCT-3’(具有EcoRI位點的外部反義)(SEQ ID NO.32)5’和3’片段是通過用第一輪PCR產物作為模板，并使用激酶化的外部有義引物和外部反義引物進行第二輪PCR而連接在一起的。1.2kb的PCR片段是用EcoRI消化的，并被克隆到pCMV表達載體的平端-EcoRI位點。此后，測定并證實人GPR66的核酸(SEQ ID NO.13)及氨基酸(SEQ ID NO.14)序列。
            
h.GPR35(Seq.Id.Nos.15&16)GPR35是具有309個氨基酸的序列，GPR35的內源性配體未知(O’Dowd B.等，47(2)Genomics 310(1998))。經測定，GPR35與特異性轉錄因子，如E2F相互作用，其對于引發DNA復制及最終細胞增殖而言是必需的。在細胞內，E2F與腫瘤抑制基因偶聯，如成視網膜細胞瘤。在該轉錄因子構建體磷酸化后，E2F從Rb基因釋放出來，然后進入細胞核。在核內，E2F與基因，如DNA聚合酶結合，引發DNA復制，導致細胞增殖。
            
PCR是以基因組DNA作為模板，使用rTth聚合酶(Perkin Elmer)和制造商提供的緩沖液系統，0.25μM的每種引物，和0.2mM的4種核苷酸進行的。循環條件是94℃1分鐘，62℃1分鐘和72℃1分20秒，循環30次。5’PCR引物是用下列序列激酶化的5’-GCGAATTCCGGCTCCCTGTGCTGCCCCAGG-3’(SEQ ID NO.33)而3’引物含具有下列序列的BamHI位點5’-GCGGATCCCGGAGCCCCCGAGACCTGGCCC-3’(SEQ ID NO.34)1kb的PCR片段是用BamHI消化的，并被克隆到CMVp表達載體的EcoRV-BamHI位點中。進行測序的全部6個克隆都含有潛在的多態性，包括氨基酸294從Arg到Ser的改變。此后，測定并證實人GPR35的核酸(SEQ ID NO.15)及氨基酸(SEQ ID NO.16)序列。
            
i.ETBR-LP2(Seq.Id.Nos.17&18)ETBR-LP2是1998年，由Valdenaire O.等，424(3)FEBS Lett.193(1998)克隆并測序的，推斷的核酸及氨基酸序列見Valdenaire的圖1。ETBR-LP2具有編碼613氨基酸蛋白的，1839bp的可讀框。據報道，ETBR-LP2與B型內皮素受體(ETBR-LP)同源。此外，ETBR-LP2與人GPR37的氨基酸序列大約47％同源。據報道，ETBR-LP2在人中樞神經系統中表達(例如，大腦皮質，內囊纖維和伯格曼神經膠質(424FEBS Lett at 196))。
            
PCR是以腦cDNA作為模板，使用rTth聚合酶(Perkin Elmer)和制造商提供的緩沖液系統，0.25μM的每種引物，和0.2mM的4種核苷酸進行的。循環條件是94℃1分鐘，65℃1分鐘和72℃1.5分鐘，循環30次。5’PCR含具有下列序列的EcoRI位點5’-CTGGAATTCTCCTGCTCATCCAGCCATGCGG-3’(SEQ ID NO.35)而3’引物含具有下列序列的BamHI位點5’-CCTGGATCCCCACCCCTACTGGGGCCTCAG-3’(SEQ ID NO.36)
            
所得1.5kb的PCR片段是用EcoRI和BamHI消化的，并被克隆到pCMV表達載體的EcoRI-BamHI位點中。此后，測定并證實人ETBR-LP2的核酸(SEQ ID NO.17)及氨基酸(SEQ ID NO.18)序列。
            
j.GPR26(Seq.Id.Nos.97&98)EST克隆HIBB055，一個3,400bp的PCR片段，用于篩選人基因組λ-II文庫(Stratagene目錄的特定順序)。篩選條件如下55℃時，濾器在甲酰胺雜交溶液中雜交過夜。洗滌條件是65℃用2XSSC/1％SDS洗滌兩次，65℃用.2X SSC/.1％SDS洗滌兩次，每次20分鐘。把濾器放置在薄膜上，-80℃曝光過夜，第二天顯影。通過在相同條件下，從原始填料第二輪篩選噬菌體而進一步表征陽性噬斑。
            
然后用250bp的探針探測人胎兒腦cDNA庫Uni-ZAP XP載體(目錄#937227，Stratagene)，所述探針是從來源于基因組庫篩選的新序列產生的。250bp的探針是利用Taqplus Precision PCR系統(Stratagene #600210)和制造商提供的緩沖液系統，通過PCR產生的。循環參數如下95℃45秒，55℃40秒和72℃1分鐘，循環30次，最后延伸10分鐘。所用引物如下5’-CGAGAAGGTGCTCAAGGTGGC-3’(SEQ ID NO.99)和5’-GAGAAGAGCTCCACTAGCCTGGTGATCACA-3’(SEQ ID NO.100)。
            
人胎兒腦cDNA文庫是在與基因組文庫相同的條件下，使用相同的250bp PCR片段探測的，只是雜交溫度為42℃。陽性原始填料是在相同條件下，在55℃的雜交溫度時，通過第二輪篩選進一步表征的。陽性噬斑是利用Sanger方法，通過序列進行分析的，起始密碼子是從其中一個陽性克隆得到的。
            
然后使用PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene#600250)通過PCR生產人GPR26的全長克隆，參數如下95℃45秒，62℃1分鐘和72℃1.2分鐘，循環40次，最后延伸10分鐘。所用模板為人胎兒腦cDNA(Clonetech#7402-1)，引物如下5’-GAATTCATGAACTCGTGGGACGCGGGCCTGGCGGGC-3’(SEQ ID NO.101)和5’-CTCGAGTCACTCAGACACCGGCAGAATGTTCT-3’(SEQ ID NO.102)。
            
所產生的片段具有一個5’EcoR1接頭和一個3’Xho1接頭。PCR產物是用已知的連接酶消化的，并使用快速連接試劑盒(Roche#1635379)被亞克隆到表達載體pcDNA3.1(+)(Invitrogen#V790-20)的EcoR1/XhoI位點。此后，確定并證實人GPR26的核酸(SEQ IDNO.97)及氨基酸(SEQ ID NO.98)序列。
            
實施例2非內源性組成型活化的GPCR的制備本領域那些技術人員有能力選擇核酸序列的突變技術。下面提出的是用于生產上面公開的人GPCR若干非內源性形式的方法。下面公開的突變是以算法為基礎的，保守脯氨酸(或其內源性的保守置換)殘基(位于GPCR的TM6區中，接近TM6/IC3界面)的第16個氨基酸(位于GPCR的IC3區)發生突變，優選突變成丙氨酸，組氨酸，精氨酸或賴氨酸殘基，最優選突變成賴氨酸殘基。
            
1.定點誘變非內源性人GPCR的制備是根據制造商的指導，使用TransformerSite-DirectedTM誘變試劑盒(Clontech)或QuickChangeTMSite-DirectedTM誘變試劑盒(Stratagene，根據制造商的指導)在人GPCR上進行的。使用指定的序列引物(表C)，按照上述方法使下列GPCR突變。為簡便起見，還以標準形式標注了插入到人GPCR中的密碼子突變(表C)
            
表C 
            
1.生產非內源性人GPCR的可選擇方法非內源性組成型活化的人GPR35受體的制備是通過建造A216K突變完成的。誘變是按照制造商的指導，使用Transformer Site-DirectedTM誘變試劑盒(Clontech)進行的。(見，核酸序列SEQ IDNO.84，氨基酸序列SEQ ID NO.85)。所用的兩個誘變引物是賴氨酸誘變寡核苷酸，和選擇標記寡核苷酸，它們具下列序列5’-GCCACCCGCAAGGCTAAACGCATGGTCTGG-3’(SEQ ID NO.60，有義)5’-CTCCTTCGGTCCTCCTATCGTTGTCAGAAGT-3’(SEQ ID NO.61，反義)對于第一輪PCR而言，SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.61用于生產5,700bp的片段，而SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.60用于生產3,350bp的片段。PCR是以內源性GPR35的GDNA作為模板，使用pfu聚合酶(Stratagene)和制造商提供的，補充了10％DMSO的緩沖液系統，0.25μM的每種引物，和0.5mM的4種核苷酸進行的。循環條件是94℃30秒，65℃1分鐘和72℃2分20秒，循環25次。然后使用第一輪PCR的5’和3’PCR片段作為共同的模板進行第二輪PCR，其中所用引物是寡核苷酸1和2，聚合酶是上述pfu，只是退火溫度為55℃，延伸時間為2分鐘。然后按照內源性cDNA所述，消化所得PCR片段，并把它亞克隆到pCMV中。
            
然后對非內源性人GPCR進行測序，衍生和證實的核酸及氨基酸序列在本專利文件的附件“序列表”中列出，在下面的表D中概括
            
表D 
            
實施例3受體表達雖然本領域很多細胞都可表達蛋白，但優選使用哺乳動物細胞。據推測，主要原因在于可行性，即，表達GPCR的酵母細胞的使用可能會引入非-哺乳動物細胞，其可能(事實上，對于酵母而言，確實)不包括受體-偶聯，遺傳-機理和分泌途徑，而這些經過發展已經用于哺乳動物系統-因此，在非-哺乳動物細胞中獲得的結果，雖然可能有用，但不如使用哺乳動物細胞獲得的那些結果好。雖然可根據技術人員的特殊需要預測所用的特定哺乳動物細胞，但在哺乳動物細胞中，COS-7，293和293T細胞是特別優選的。
            
a.293細胞的瞬時轉染第一天，以6×106個細胞/10cm培養皿的密度接種293細胞。第二天，準備兩支反應試管(每個平板一支試管)試管A是通過把4μg DNA(例如，pCMV載體；具有受體cDNA的pCMV載體等)混合在0.5ml沒有血清的DMEM(Gibco BRL)中制備的；試管B是通過把24μl脂轉染胺(Gibco BRL)混合在0.5ml沒有血清的DMEM中制備的。然后把試管A和B翻轉(幾次)混合，室溫孵育30-45分鐘。該混合物被稱作“轉染混合物”。用1XPBS洗滌鋪板的293細胞，然后加入5ml沒有血清的DMEM。把1ml轉染混合物加入到細胞中，37℃/5％CO2孵育4小時。通過抽吸除去轉染混合物，加入10ml DMEM/10％胎牛血清。37℃/5％CO2孵育細胞。孵育48小時后，采集細胞，并進行分析。
            
b.穩定的293細胞系把大約12×106個293細胞鋪板到15cm的組織培養平板上，使它們在含有10％胎牛血清和1％丙酮酸鈉，L-谷氨酰胺和抗生素的DME高濃度葡萄糖培養基中生長。293細胞在鋪板24小時后(大約-80％匯合)，使用12μg DNA轉染細胞。所述12μg DNA與60μl脂轉染胺和2mL沒有血清的DME高濃度葡萄糖培養基混合。把培養基從平板中吸出，用沒有血清的培養基洗滌細胞一次。然后把DNA，脂轉染胺，和培養基混合物連同10mL沒有血清的培養基一起加到平板中。37℃孵育4-5小時后，吸出培養基，加入25ml含血清的培養基。轉染24小時后，再次吸出培養基，加入含血清的新鮮培養基。轉染48小時后，吸出培養基，加入含血清的培養基，其中還含有終濃度為500μg/mL的遺傳霉素(G418藥物)。然后選擇含有G418抗性基因的陽性轉染細胞。進行選擇時每4-5天更換培養基。在選擇過程中，細胞生長產生穩定的集合體，或分裂進行穩定的克隆選擇。
            
c.RGT細胞(用于mGluR7)RGT細胞是從腺病毒轉化的敘利亞倉鼠細胞系(AV12-664)得到的，其中穩定轉染了谷氨酸鹽-天門冬氨酸鹽轉運蛋白。
            
第一天，以5×106個細胞/10cm培養皿的密度接種RGT細胞。第二天，向試管中加入91μl沒有血清的培養基，接著加入9μl Fugene 6(Roche)。向相同的混合物中加入3μgDNA(0.5μg/μl)。輕輕混合該混合物，室溫孵育15分鐘，然后，把該混合物逐滴加入DMEM/10％FBS中生長的細胞，37℃/5％CO2孵育48小時。孵育48小時后，采集細胞并進行分析。
            
實施例4用于測定非內源性GPCR的組成型活性的測定法有很多方法都可用來評估非內源性人GPCR的組成型活性。下面是舉例說明；本領域那些普通技術人員有能力確定對技術人員的需要最有益的那些技術。
            
1.膜結合測定法[35S]GTPγS測定法當G蛋白偶聯受體處于活性狀態時，作為配體結合或組成型活化的結果，受體與G蛋白偶聯，并刺激GDP的釋放及隨后GPT與G蛋白的結合。G蛋白-受體復合體的α亞單位可起GTP酶的作用，并緩慢把GTP水解為GDP，受體通常在該點失活。組成型活化的受體繼續把GDP交換成GTP。不可水解的GTP類似物[35S]GTPγS可用于證實[35S]GTPγS與表達組成型活化受體的膜的結合提高。使用[35S]GTPγS結合測量組成型活化的優點包括但不限制于(a)可通用于所有G蛋白偶聯受體；(b)它接近膜表面，不太可能選出影響胞內級聯的分子。
            
該測定法利用了G蛋白偶聯受體刺激[35S]GTPγS與表達相關受體的膜結合的能力。因此，該測定法可用于直接鑒定的方法中，篩選組成型活化的G蛋白偶聯受體的候選化合物。該測定法比較普遍，可用于所有G蛋白偶聯受體的藥物發現。GTPγS測定法是在20mM HEPES和1-約20mM MgCl2(雖然優選20mM，但為使結果最佳，可對該量進行調整)pH7.4，具有約0.3-1.2nM[35S]GTPγS的結合緩沖液(雖然優選1.2，但為使結果最佳，可對該量進行調整)，12.5-75μg膜蛋白(例如，表達Gs融合蛋白的293細胞；為使結果最佳，可對該量進行調整)和10μM GDP(為使結果最佳，可對該量進行調整)中孵育1小時。然后加入小麥胚凝集素珠(25μl；Amersham)，室溫再孵育該混合物30分鐘。然后室溫時，以1500xg將試管離心5分鐘，在閃爍計數器中計數。
            
2.基于細胞的cAMP測定法可以改進為基于細胞的測定法設計的Flash PlateTM腺苷酸環化酶試劑盒(New England Nuclear，Cat.No.SMP004A)，從而用于粗質膜。閃爍平板的孔可含有閃爍涂層，其中還含有識別cAMP的特異性抗體。孔中產生的cAMP可通過與放射性cAMP示蹤劑競爭結合cAMP抗體而量化。下列是測量表達受體的全細胞中cAMP水平的改變而進行的簡要方案。
            
在瞬時轉染后大約2 4小時采集轉染的細胞。小心吸出培養基并棄去。向每個細胞培養皿中輕輕加入10ml PBS，然后小心吸出。向各平板中加入1ml Sigma細胞解離緩沖液和3ml PBS。把細胞從平板中吸出，將細胞混懸液收集到50ml錐形離心管中。室溫1,100rpm把細胞離心5分鐘。把細胞沉淀物小心重懸浮在適當體積的PBS中(大約3ml/平板)。然后用血細胞計數器給細胞計數，加入額外的PBS至得到適宜的細胞數(至大約50μl/孔的終體積)。
            
cAMP標準和檢測緩沖液(11ml檢測緩沖液含1μCi示蹤劑[125IcAMP(50μl)])是根據制造商的指導制備并維持的。用于篩選的測定緩沖液是新鮮制備的，并含有50μl刺激緩沖液，3μl試驗化合物(12μM終測定濃度)和50μl細胞，測定緩沖液在冰上貯存備用。該測定法是通過向適當的孔中加入50μl cAMP標準，接著向孔H-11和H-12中加入50μl PBSA而開始的。向所有孔中加入50μl刺激緩沖液。使用能夠分散3μl化合物溶液的針狀工具將DMSO(或選擇的候選化合物)加入到適當的孔中，試驗化合物的終測定濃度為12μM，總測定體積為100μl。然后把細胞加入到孔中，室溫孵育60分鐘。向孔中加入100μl含示蹤劑cAMP的檢測混合物。將平板再孵育2小時，接著在WallacMicroBetaTM閃爍計數器中計數。然后根據各測定平板的標準cAMP曲線推斷cAMP/孔的值。
            
3.Gi偶聯的FPRL-2與Gs/Gi融合蛋白構建體的共轉染含FPRL-2和Gs/Gi融合蛋白構建體的轉染混合物(實施例3A)是通過抽吸除去的，然后加入10ml DMEM/10％胎牛血清。37℃/5％CO2孵育該細胞。孵育48小時后，采集細胞并進行分析。然后按照上面實施例4(2)的方案進行基于細胞的cAMP檢測。
            
由于認為內源性FPRL-2主要與活性狀態的Gi蛋白偶聯，因此所產生cAMP的降低預示所公開FPRL-2的非內源性形式是組成型活性的。因此，通過增加cAMP信號而影響FPRL-2受體的候選化合物是反向激動劑，而FPRL-2激動劑可降低cAMP信號。見，圖1。
            
圖1顯示與Gs/Gi相比，FPRL-2的活性增加了大約4倍。當把FPRL-2的內源性形式與非內源性形式進行比較時，與對照組Gs/Gi相比，非內源性FPRL-2(“FPRL-2(“FPRL-2(L240K)”))的受體活性增加了約3倍。因此，該數據表明，FPRL-2的內源性和非內源性形式是組成型活性的。
            
參考圖9。在圖9中，與GPR37(“GPR37wt”)的內源性形式相比，非內源性GPR37(L352R)產生的cAMP增加了約354％，而與GPR37wt相比，GPR37(C543Y)產生的cAMP增加了約189％。該數據表明，GPR37的非內源性L352R和C543Y形式都是組成型活化的。
            
4.Gi偶聯靶GPCR的基于細胞的cAMPTSHR是一種Gs偶聯的GPCR，活化后可引起cAMP累積。TSHR是通過使氨基酸殘基623突變(即，丙氨酸殘基變為異亮氨酸殘基)而被組成型活化的。預期Gi偶聯受體可抑制腺苷酸環化酶，并因此降低cAMP的產生水平，這就難以評估cAMP的水平。作為Gi偶聯受體組成型活化的指示，測量cAMP產生降低的有效技術可通過使“信號增強子”，例如最優選非內源性組成型活化的TSHR(TSHR-A623I)(或內源性組成型活性的Gs偶聯受體)與Gi連接的靶GPCR共轉染，建立cAMP的基礎水平而實現。在生產Gi偶聯受體的非內源性形式后，使靶GPCR的非內源性形式與信號增強子共轉染，該物質可用于進行篩選。當使用cAMP測定法時，該方法可用于有效產生信號；該方法優選針對Gi偶聯受體直接鑒定候選化合物。應當指出，對于Gi偶聯的GPCR而言，當使用此方法時，靶GPCR的反向激動劑增加cAMP信號，激動劑則降低cAMP信號。
            
細胞是按照上面實施例3A轉染的。在瞬時轉染約24小時后，采集轉染的細胞。然后按照上面實施例4(2)中的方案進行基于細胞的cAMP檢測。
            
優選，而且正如先前指出的，為確保小分子候選化合物針對Gi偶聯的靶受體，而不是例如TSHR(A623I)，優選在沒有靶受體存在的情況下，針對信號增強子直接篩選鑒定候選化合物。
            
參考圖3。圖3是293細胞中，內源性GPR45(“GPR45wt”)與對照組(“CMV”)的比較分析。內源性靶受體GPR45與信號增強子TSHR(A623I)共轉染。與對照組(CMV)相比，在沒有TSH，TSH受體的內源性配體存在的情況下，TSHR(A623I)與內源性GPR45的共轉染顯示cAMP的產生降低了大約96％。與對照組(CMV)相比，在有TSH存在的情況下，內源性GPR45(“GPR45wt”)顯示cAMP的產生降低了約73％。該數據表明，GPR45是內源性組成型活性的，并通過Gi蛋白偶聯。
            
參考圖4和表E。表E是圖4的概括，它是在293細胞中，內源性mGluR7(“mGluR7wt”)與若干mGluR7的非內源性形式(“W590S”，“R659H”，“T711C”和“I790K”)及對照組(“pCMV”)的比較分析。表E概括了在沒有內源性配體(即，TSH)存在的情況下，載體cAMP的產生，所述載體含有信號增強子受體(即，TSHR(A623I))和靶受體(mGluR7)；在有TSH存在的情況下，信號增強子與靶受體共轉染產生的cAMP降低的百分比(％)；在有TSH存在的情況下，與TSHR(A623I)共轉染的mGluR7的內源性形式和非內源性形式之間cAMP的產生。該數據顯示，與內源性mGluR7相比，mGluR7的非內源性形式(“W590S”，“R659H”，“T771C”和“I790K”)可降低cAMP的產生，并因此通過上面公開的方法被組成型活化。
            
表E 
            
在RGT細胞中轉染的mGluR 7形式支持了上述數據。參考圖5。在圖5中，與mGluR7受體的內源性形式相比，W590S顯示cAMP的產生降低了約52％，R659H顯示降低了約43％；T771C顯示降低了約5％；I790K顯示cAMP的產生降低了約28％。
            
因為mGluR7主要與活性狀態的Gi偶聯，因此cAMP產生的降低預示所公開的mGluR7的非內源性形式是組成型活性的。因此，通過增加cAMP信號而影響mGluR7受體的候選化合物是反向激動劑，而mGluR7激動劑則降低cAMP信號。以圖5和6的數據為基礎，當在293和RGT細胞中使用cAMP測定法，并用于TSHR組成型活化的共轉染方法中時，“W590S”，“R659H”，“T711C”和“I790K”是優選的mGluR7非內源性形式，最優選“W590S”。
            
參考圖12。在圖12中，與HF1948(“wt”)的內源性形式相比，HF1948的非內源性形式(“I281F”和“E135N”)分別顯示cAMP的產生降低了約18％和39％。該數據表明，HF1948的非內源性I281F和E135N形式都是組成型活化的。cAMP的這種降低進一步表明這些形式是Gi-偶聯的。除了是Gi-偶聯的之外，圖11還表明，HF1948的內源性I281F形式還可與GqG蛋白偶聯(見，下面的實施例4(5)(f))。
            
參考圖16。圖16顯示，與內源性ETBR-LP2(“WT”)(102.59pmolcAMP/孔)和TSHR-A623I的共轉染相比，非內源性組成型活化的ETBR-LP2(“N358K”)(65.96pmol cAMP/孔)與TSHR-A623I(“TSHR-A623I”)(在有TSH存在的情況下)共轉染時，細胞產生的cAMP降低了約36％。當相對于pCMV與TSHR-A623I(290.75pmolcAMP/孔)的共轉染，把ETBR-LP2(“N358K”)與TSHR-A623I的共轉染和ETBR-LP2(“WT”)與TSHR-A623I的共轉染進行比較時，它們cAMP的產生分別降低了約77％和65％。優選，該方法用于篩選增加信號的反向激動劑，而激動劑應降低信號。為了證實小分子結合ETBR-LP2，而不結合TSHR-A623I構建體，優選在沒有ETBR-LP2存在的情況下，針對該構建體篩選小分子。
            
5.基于受體的測定法a.Cre-Luc報道分子測定法(Gs-相關受體)把293和293T細胞以2×104個細胞/孔的密度鋪于96孔平板上，第二天按照制造商的指導，使用脂轉染胺試劑(BRL)轉染。如下制備DNA/脂類混合物用于6-孔轉染把100μl DMEM中的260ng質粒DNA與100μl DMEM中的2μl脂類(260ng質粒DNA由200ng 8xCRE-Luc受體質粒，50ng pCMV，其中含內源性受體或非內源性受體或只含pCMV，和10ng GPRS表達質粒(GPRS在pcDNA3中(Invitrogen)))輕輕混合。8XCRE-Luc受體質粒是如下制備的載體SRIF-β-gal是通過在pβgal-Basic載體(Clontech)中的BglV-HindIII位點克隆大鼠促生長素抑制素啟動子(-71/+51)得到的。cAMP反應元件的八(8)個拷貝是通過PCR從腺病毒模板AdpCF126CCRE8(見，7 HumanGene Therapy 1883(1996))獲得的，并被克隆到SRIF-β-gal載體的Kpn-BalV位點，產生8xCRE-β-gal報道分子載體。8xCRE-Luc報道分子質粒是通過用pGL3-basic載體(Promega)中HindIII-BamHI位點的熒光素酶基因替換8xCRE-β-gal報道分子載體中的β-半乳糖苷酶基因而產生的。室溫孵育30分鐘后，用400μl DMEM稀釋DNA/脂類混合物，并向各孔中加入100μl稀釋的混合物。在細胞培養孵育箱中孵育4小時后，向各孔中加入100μl含有10％FCS的DMEM。第二天，用含10％FCS的DMEM以200μl/孔更換轉染的細胞。8小時后，用PBS洗滌一次之后，把孔更換為100μl/孔沒有酚紅的DMEM。第二天，按照制造商的指導使用LucLiteTM報道基因測定試劑盒(Packard)測量熒光素酶的活性，并在1450 MicroBetaTM閃爍發光計數器(Wallac)上讀數。
            
參考圖2。圖2顯示在12.5ng STRL33報道分子的情況下，與對照組(CMV)相比，STRL33的活性降低了約50％。在12.5ng蛋白的情況下，把STRL33的內源性形式和非內源性形式進行比較，非內源性STRL33(“STRL33(L230K)”)顯示報道分子的活性降低了約30％，在25ng蛋白的情況下，降低了約40％。該數據表明，STRL33報道分子的非內源性形式是組成型活性的，而且可與G蛋白Gi偶聯。
            
b.AP1報道分子測定法(Gq相關受體)檢測Gq刺激的方法取決于Gq-依賴性磷脂酶C的已知性質，它可引起啟動子中含AP1元件的基因活化。按照上述CREB報道分子測定法所述的方案，使用PathdetectTMAP-1順式-報道系統(Stratagene，目錄#219073)，只是磷酸鈣沉淀的組分為410ng pAP1-Luc，80ng pCMV-報道分子表達質粒，和20ng CMV-SEAP。
            
參考圖17。圖17顯示與內源性ETBR-LP2(862個相對光單位)相比，人ETBR-LP2的非內源性組成型活化形式(“N358K”)(2203個相對光單位)的活性增加了61.1％。該數據表明，ETBR-LP2受體的非內源性形式是組成型活性的，而且可與G蛋白Gi偶聯。
            
c.SRF-Luc報道分子測定法(Gq相關受體)檢測Gq刺激的方法取決于Gq-依賴性磷脂酶C的已知性質，它可引起啟動子中含血清反應因子的基因活化。PathdetectTMSRF-Luc-報道系統(Stratagene)可用于測定COS7細胞中的Gq偶聯活性。細胞是按照制造商的指導，使用哺乳動物轉染TM試劑盒(Stratagene，Catalogue #200285)，和系統的質粒成分及編碼內源性或非內源性GPCR的表達質粒轉染的。簡單地說，按照制造商的指導，把410ngSRF-Luc，80ng pCMV-受體表達質粒和20ng CMV-SEAP(分泌型堿性磷酸酶表達質粒；堿性磷酸酶活性是在轉染細胞的培養基中測量的，從而控制樣品之間轉染效率的變化)結合在磷酸鈣沉淀中。沉淀的一半平均分布在96孔平板的3個孔中，細胞在沒有血清的培養基中保持24小時。最后5小時，用1μM血管緊張素培養細胞。然后溶解細胞，按照制造商的指導，使用LucliteTM試劑盒(Packard，Cat.#6016911)和“Trilux 1450 Microbeta”液體閃爍發光計數器(Wallac)測定熒光素酶的活性。該數據可使用GraphPad PrismTM2.0a(GraphPadSoftware Inc.)分析。
            
d.SRE報道分子測定法在293細胞中利用SRE-Luc報道基因(Mer cury熒光素酶系統3的組分，Clontech Catalogue #K2053-1)。細胞是按照制造商的指導，使用脂轉染胺試劑(Gibco/BRL，Catalogue #18324-012)，和系統的質粒成分及編碼內源性或非內源性受體的表達質粒轉染的。簡單地說，按照制造商的指導，把420ng SRE-Luc，50ng CMV(含GPR37受體)和30ng CMV-SEAP(分泌型堿性磷酸酶表達質粒；堿性磷酸酶的活性是在轉染細胞的培養基中測量的，從而控制樣品之間轉染效率的變異)結合在陽離子脂類-DNA沉淀中。用Optimem(Vendor)補充至最終體積為25μl。它被稱作“模板混合物”。把模板混合物與脂轉染胺混合在聚苯乙烯試管中，孵育30分鐘。在孵育過程中，用100μlOptimem洗滌細胞。孵育后，把200μl 0ptimem加入到混合物中，40μl-50μl/孔。細胞在混合物中過夜。第二天早上，以130μl/孔加入DMEM/沒有酚紅/1％FBNS，用新鮮培養基更換培養基。然后按照制造商的指導，使用LucliteTM試劑盒(Packard，Cat.#6016911)和“Trilux1450 Microbeta”液體閃爍發光計數器(Wallac)測定細胞的熒光素酶活性。使用GraphPad PrismTM2.0a(GraphPad Software Inc.)分析數據。
            
參考圖7。在圖7中，當比較GPR37的非內源性形式(“C543Y”)和內源性形式(“wt”)時，C543Y突變較之wt形式顯示cAMP的產生增加了約316％，而非內源性形式“L352R”較之wt形式顯示cAMP的產生增加了約178％。該數據表明，GPR37的非內源性形式C543Y和L352R都是組成型活化的。
            
e.E2F-Luc報道分子測定法在293A細胞中使用pE2F-Luc報道分子(Mercury熒光素酶系統3的組分，Clontech Catalogue #K2053-1)。細胞是按照制造商的指導，使用脂轉染胺試劑(Gibco/BRL，Catalogue #18324-012)，和系統的質粒成分及編碼內源性或非內源性受體的表達質粒轉染的。簡單地說，按照制造商的指導，把400ng pE2F-Luc，80ng CMV(含GPR35受體)和20ng CMV-SEAP(分泌型堿性磷酸酶表達質粒；堿性磷酸酶的活性是在轉染細胞的培養基中測量的，從而控制樣品之間轉染效率的變化)結合在陽離子脂類-DNA沉淀中。沉淀的一半平均分布在96-孔平板的3個孔中，細胞保持過夜，第二天用新鮮培養基替換。開始轉染后四十八(48)小時，處理細胞，并按照制造商的指導，使用LucliteTM試劑盒(Packard，Cat.#6016911)和“Trilux 1450Microbeta”液體閃爍發光計數器(Wallac)測定熒光素酶的活性。使用GraphPad PrismTM2.0a(GraphPad Software Inc.)分析數據。
            
參考圖14。圖14顯示，與內源性GPR35(24.97個相對光單位)相比，人GPR35的非內源性組成型活性形式(A216K)(607.13個相對光單位)的活性增加了約100％。該數據表明，GPR35(A216K)與轉錄因子E2F相互作用，驅動熒光素酶蛋白的表達。與E2F的這種相互作用，連同GPR35在結腸癌細胞中的表達進一步表明，GPR35可在癌細胞增殖中起作用。因此，以這些數據為基礎，影響GPR35受體的優選侯選化合物是反向激動劑。該數據表明，GPR35的反向激動劑可用于治療癌癥，特別是結腸癌。
            
f.胞內IP3累積測定法(Gq相關受體)第1天，通常以1×105個細胞/孔(雖然可優化該數字)的密度在2 4孔平板上鋪板含受體(內源性和/或非內源性)的細胞。第2天，首先通過在50μl沒有血清的DMEM/孔中混合0.25μg DNA和2μl脂轉染胺而把細胞轉染。將溶液輕輕混合，室溫孵育15-30分鐘。細胞用0.5ml PBS洗滌，然后把400μl沒有血清的培養基與轉染培養基混合，加入到細胞中。細胞在37℃/5％CO2孵育3-4小時，除去轉染培養基，用1ml/孔的常規生長培養基替換。第3天，用3H-肌醇標記細胞。簡單地說，除去培養基，用0.5ml PBS洗滌細胞。然后向每孔加入0.5ml沒有肌醇/沒有血清的培養基(GIBCO-BRL)和0.25μCi的3H-肌醇，37℃/5％CO2孵育細胞16-18小時過夜。第4天，用0.5ml PBS洗滌細胞，加入0.45ml測定培養基，其中含有沒有肌醇/沒有血清的培養基，10μM帕吉林，10mM氯化鋰，或0.4ml測定咯養基。然后在37℃孵育細胞30分鐘。用0.5ml PBS洗滌細胞，向每孔加入200μl新鮮/冰冷的終止溶液(1M KOH；18mM硼酸鈉；3.8mM EDTA)。該溶液在冰上放置5-10分鐘(或直到細胞溶解)，然后用200μl新鮮/冰冷的中和溶液(7.5％HCl)中和。把溶解產物轉移到1.5ml Eppendorf試管中，每支試管中加入1ml氯仿/甲醇(1∶2)。溶液渦旋15秒，把上層相上樣到Biorad AG1-X8TM離子交換樹脂(100-200目)上。首先，以1∶1.25W/V的水洗樹脂，并把0.9ml上層相上樣到柱上。然后用10ml5mM的肌醇和10ml 5m硼酸鈉/60mM甲酸鈉洗柱子。把肌醇三磷酸洗脫到閃爍小瓶中，其中含有10ml閃爍雞尾酒和2ml 0.1M甲酸/1M甲酸銨。通過用10ml 0.1M甲酸/3M甲酸銨洗滌，并用dd H2O沖洗兩次而使柱子再生，貯存在4℃的水中。
            
參考圖6。在圖6中，用含有6個氨基酸缺失的Gq蛋白“Gq(缺失)”；與Gi蛋白融合的Gq蛋白“Gq(缺失)/Gi”，和非內源性mGluR7，T771C加之Gq(缺失)“T771C+Gq(缺失)”及T771C與Gq(缺失)/Gi“T771C+Gq(缺失)/Gi”轉染293細胞。在有和沒有谷氨酸存在的情況下測量肌醇三磷酸。在有谷氨酸鹽存在的情況下，與Gq(缺失)/Gi相比，mGluR7的非內源性形式與Gq(缺失)/Gi的共轉染顯示大約增加了1850倍；在有谷氨酸鹽存在的情況下，與T771C+Gq(缺失)/Gi相比，增加了大約860倍。這些數據表明，mGluR7，一種Gi偶聯受體，可通過Gq蛋白活化。因此，Gq(缺失)/Gi融合構建體可與GPCR共轉染，用作篩選侯選化合物的工具。
            
參考圖11。在圖11中，當比較HF1948的非內源性形式(“I281F”)與內源性形式(“wt”)時，I281F突變較之wt形式使IP3累積增加了大約361％。該數據表明，HF1948的非內源性I281F形式是組成型活化且Gq-偶聯的。
            
實施例5融合蛋白的制備a.GPCRGs融合構建體組成型活化的GPCR-G蛋白融合構建體的設計如下進行對大鼠G蛋白Gsα(較長形式；Itoh，H.等，83 PNAS 3776(1986))5’和3’末端進行工程化，使其含有HindIII(5’-AAGCTT-3’)序列。在確認了正確的序列之后(含有側翼HindIII序列)，利用該載體的HindIII限制性位點通過亞克隆把整個序列插入到pcDNA3.1(-)(Invitrogen，cat.no.V795-20)中。Gsα序列的正確方向在亞克隆到pcDNA3.1(-)中后確定。然后證實在HindIII序列上含有大鼠Gsα基因的修飾pcDNA3.1(-)；該載體可被用作“通用的”Gsα蛋白載體。pcDNA3.1(-)載體在HindIII位點的上游含有各種熟知的限制性位點，因此可有利地在Gs蛋白上游插入內源性組成型活性的GPCR編碼序列。同樣的方法還可用于生產其它“通用的”G蛋白載體，當然，也可使用技術人員已知的其它市售或專有載體。在某些實施方案中，重要的標準在于GPCR序列位于G蛋白的上游，而且與G蛋白的序列符合讀框。
            
G蛋白和GPCR之間限制性位點中的間隔區是任選的。有義和反義引物分別含有XbaI和EcoRV限制性位點，這樣在G蛋白和GPCR之間就會存在間隔區(屬于限制性位點)。
            
然后，利用PCR使各受體序列在上述Gsα通用載體內融合，方法如下把100ng GPCR的cDNA加入到單獨的試管中，每個試管中含有2μl引物(有義和反義)，3μl 10mM的dNTPs，10μl10XTaqPlusTMPrecision緩沖液，1μl TaqPlusTMPrecision聚合酶(Stratagene#600211)，和80μl水。GPCR的反應溫度和循環次數如下94℃1分鐘；94℃30秒；62℃20秒；72℃1分40秒；和72℃5分鐘，第2-4個循環步驟重復35次。使PCR產物經過1％瓊脂糖凝膠，然后純化。純化產物用XbaI和EcoRV消化，所需插入片段純化后，與Gs通用載體的各限制性位點連接。轉化后分離陽性克隆，并通過限制性酶消化來測定；使用293細胞表達是按照上述方法完成的。對GPCR-Gs融合蛋白的每個陽性克隆進行測序，以證實正確性。
            
b.Gq(6個氨基酸缺失)/Gi融合構建體Gq(缺失)/Gi融合構建體的設計是如下進行的Gαq-亞單位具有TLESIM(SEQ ID NO.88)序列的N-末端六(6)個氨基酸(氨基酸2-7)被缺失，具有EYNLV(SEQ ID NO.89)序列的C-末端五(5)個氨基酸被具有序列DCGLF(SEQ ID NO.90)的Gαi蛋白的相應氨基酸替換。該融合構建體是使用下列引物通過PCR獲得的5’-gatcAAGCTTCCATGGCGTGCTGCCTGAGCGAGG-3’(SEQ ID NO.91)和5’gatcGGATCCTTAGAACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTCAGCTGCAGGATGGTG-3’(SEQ ID NO.92)，其中以含有小鼠Gαq-野生型的質粒63313作為模板，小鼠Gαq-野生型具有血細胞凝集素標記。小寫的核苷酸作為間隔區。
            
使用TaqPlus Precision DNA聚合酶(Stratagene)擴增，循環條件如下95℃2分鐘；95℃20秒；56℃20秒；72℃2分鐘；和72℃7分鐘，第2-4步重復35次。把PCR產物克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，使用ABI Big染料終止子試劑盒(P.E.Biosystems)進行測序。通過2步克隆，把含有融合構建體序列的TOPO克隆的插入片段插入到表達載體pcDNA3.1(+)的HindIII/BamHI位點中。
            
c.Gs/Gi融合蛋白構建體Gs/Gi融合蛋白構建體的設計如下進行Gαs-亞單位具有序列5’-QYELL-3’(SEQ ID NO.93)的C-末端五(5)個氨基酸被缺失，并用Gαi蛋白具有序列5’-DCGLF-3’(SEQ ID NO.94)的相應氨基酸替換。該蛋白融合構建體是使用5’和3’寡核苷酸，通過PCR獲得的。
            
使用TaqPlusPrecision DNA聚合酶(Stratagene)進行擴增，循環條件如下98℃2分鐘；98℃30秒；60℃30秒；72℃2分鐘；和72℃5分鐘，第2-4步重復25次。把PCR產物克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，使用ABI Big染料終止子試劑盒(P.E.Biosystems)進行測序。把含有蛋白融合構建體序列的TOPO克隆的插入片段插入到表達載體pcDNA3.1(+)的限制性位點中。然后測定Gs/Gi蛋白融合構建體的核酸序列。見核酸序列SEQ ID NO.95和氨基酸序列SEQ ID NO.96。
            
實施例6施旺氏細胞的制備把2L新生大鼠幼畜(Sprague Dawley)(產后第2天-產后第3天)放在冰上致死。移走幼鼠，切掉頭部，使血液排出。把它腹部向下放在解剖臺上，用70％乙醇清洗消毒。使用解剖刀除去大腿區域的皮膚，直到露出坐骨神經(或直到看見從脊髓到膝部延伸的細白“線”)。把神經放在DMEM培養基中，然后吸出，接著用DMEM培養基補充至2.4ml體積，加入300μL 10X膠原酶(0.3％，Sigma Cat.#C-9891)和300μL 10X胰蛋白酶(0.25％，GIBCO Cat.#25095-019)進行解離。然后37℃孵育神經15分鐘，1,000rpm離心5分鐘，除去培養基(重復2次)。加入1mL DMEM-HEPES和1mL DMEM/10％FBS，然后轉移到50mL錐形試管中。用下列規格的針頭剪切試管內含物18G一次，21G兩次，23G兩次。把內含物放在Falcon細胞滲濾器上，低速(大約1200rpm)旋轉。用DEME/10％FBS補充至總體積為10mL，鋪板于聚-L-賴氨酸處理過的10cm平板(Sigma，Cat.#P-1274)上。在37℃，7％CO2的濕潤孵育箱中孵育過夜。加入含有100X ARA C(10mM，Sigma，Cat.#C-1768)的新鮮培養基，再培養48小時。然后用PBS洗滌細胞(3次)，除去ARA C，加入DMEM/10％FBS，100％乙醇中不同濃度(2μM，5μM，10μM，20μM和50μM)的毛喉素(Calbiochem，Cat#344270)，PBS和0.1％BSA中的80μg垂體提取物(Sigma，#P-1167)，然后細胞在37℃，7％CO2的加濕器中生長30小時。采集細胞，分離RNA并進行分析。
            
抗體選擇是如下進行的首先用1X PBS洗滌聚-L-賴氨酸處理過的平板(3次)，用1mL 0.5％胰蛋白酶-EDTA進行胰蛋白酶消化約1分鐘，然后用9mL DMEM-HEPES緩沖液和10％FBS中和。1200rpm離心細胞5分鐘，重懸浮在3mL DMEM-HEPES中，洗出胰蛋白酶，1200rpm旋轉5分鐘。然后把細胞重懸浮在600μL DMEM-HEPES中，旋轉之后剩下的一些培養基具有單一的細胞。加入1∶1000稀釋的Thyl.1抗體(單克隆抗體，Sigma，Cat.#P-1274)。
            
37℃孵育細胞20分鐘，每2分鐘輕輕搖動試管一次。使用它之前，融解20μL豚鼠補體(GIBCO，Cat.#19195-015)，然后通過把補體加入到含有抗體的細胞中至終體積1mL。在37℃水浴孵育細胞約20-30分鐘，加入10mL DMEM-HEPES，1200rpm時旋轉5分鐘。把細胞重懸浮在5mL DMEM/10％FBS中，并加入到聚-L-賴氨酸處理過的平板中，該平板含有垂體提取物和毛喉素。使細胞恢復24-48小時，重復該免疫選擇過程2次。
            
實施例7壓碎的大鼠坐骨神經的制備使麻醉(iso-florene)成年(10-13周)Sprague-Dawley大鼠的坐骨神經暴露于坐骨神經切口。用平頭鑷子用力壓坐骨神經切口處的坐骨神經2次，每次10秒，使神經壓碎；該技術可導致軸突退化，但也可使軸突再生。在神經損傷后的不同時間，通過CO2吸入使動物死亡，除去遠側的神經殘株，修剪最近處的2-3mm。對于壓碎的神經來說，收集整個遠側神經。把神經立即冷凍在液氮中-80℃貯藏。未受損的坐骨神經是從不同年齡的動物獲得的，P0(壓碎后)-P13。
            
實施例8公開的人GPCR的組織分布1.RT-PCRRT-PCR可用于證實表達并測定若干新的人GPCR的組織分布。所用的寡核苷酸是GPCR-特異性的，并以人多個組織的cDNA(MTC，Clontech)作為模板。按照制造商的指導，在40μl反應物中，使用Taq DNA聚合酶(Stratagene)進行擴增。把20μl反應物上樣到1.5％瓊脂糖凝膠上，分析RT-PCR產物。
            
2.斑點印跡使用市售人-組織斑點-印跡形式的內源性GPCR探測，以確定受體定位的區域。實施例1的PCR片段用作探針放射性標記的探針是按照制造商的指導，使用該片段和Prime-It IITM隨機引物標記試劑盒(Stratagene，#300385)生產的。使人RNA Master BlotTM(Clontech，#7770-1)與GPCR放射性標記的探針雜交，并按照制造商的指導，在嚴格條件下洗滌。-80℃時，使印跡在Kodak BioMax放射自顯影膠片上曝光過夜。下面的表F列出了受體和在其中表達的組織。與受體有關的代表性疾病/病癥在實施例6中討論。
            
表F 
            
3.RNA印跡a.GPR37按照制造商的指導，利用RNAzol B試劑(TelTest Inc.，Cat.#CS-104)收集實施例6的RNA。在1％瓊脂糖/甲醛凝膠中進行電泳后，使用10X SSC通過毛細管作用把RNA轉移到尼龍膜(SachleicherSchull)上。按照制造商的指導，使用與GPR37的3’末端準確對應的DNA片段和High Prime標記試劑盒(Roche MolecularBiochemical)合成32P-標記的GPR37 DNA探針。使用補充了100μg/ml鮭魚精子DNA的ExpressHyb溶液(Clontech，Cat.#8015-2)如下進行雜交。首先在65℃時，用ExpressHyb溶液孵育含有分離RNA樣品的薄膜過夜。32P-標記的GPR37 DNA探針通過沸騰2分鐘而變性，把它在冰上放置5分鐘，然后轉移到浸潤薄膜的ExpressHyb溶液中。65℃過夜孵育后，除去雜交溶液中的薄膜，65℃時在2XSSC/1％SDS中洗滌4次，每次15分鐘，接著于255℃時，在0.2XSSC/1％SDS中洗滌2次，每次15分鐘。輕輕振搖除去印跡的多余水分，然后把印跡包在塑料紙中，-80℃時，在膠片上曝光過夜。
            
參考圖9。圖9顯示GPR37在施旺氏細胞中表達，這樣髓鞘形成可在20μM毛喉素維持。
            
圖10顯示GPR37在壓碎的大鼠坐骨神經中被上調，特別是在神經壓碎后七(7)天。這樣的數據與圖9提出的數據相一致，即，GPR37通過刺激施旺氏細胞中髓鞘形成的過程而對神經再生起作用。
            
GPR37在人中樞神經系統，特別是腦中表達。已經進一步確定了GPR37在施旺氏細胞中表達。當軸突(或神經)受損時，施旺氏細胞通過在軸突周圍形成髓鞘而使神經再生，其提供髓鞘形式的“隔層”。髓鞘形成的過程很重要，這是因為作用可能性快速運行，由此保存代謝能量。施旺氏細胞及其前體對于影響構成周圍神經的其它細胞的存活和分化起了重要的作用。此外，已經確定GPR37在壓碎的大鼠坐骨神經中表達。這樣的數據支持了GPR37在神經細胞再生中起作用的證據。以受體定位的特異性組織的已知功能為基礎，可推斷受體的推定功能。因此，在髓鞘形成過多(例如，腫瘤發生)的情況下，優選GPR37的反向激動劑，而當發生髓鞘形成過少(例如，變性疾病，如糖尿病)時，激動劑是優選的。
            
b.GPR66按照制造商的指導，使用TRIzol試劑(Gibco/BRL，Cat#15596-018)分離若干胰細胞系(例如，HIT，ARIP，Tu6，RINαTC，STC，NIT，和EcR-CHO)的總RNA。在1％瓊脂糖/甲醛凝膠中進行電泳后，使用標準方案把RNA轉移到尼龍薄膜上。按照制造商的指導，使用與整個編碼序列準確對應的DNA片段和Prime It II隨機引物標記試劑盒(Stratagene，Cat.#300385)合成32P-標記的GPR66探針。雜交是使用補充了100μg/ml鮭魚精子DNA的ExpressHyb溶液(Clontech，Cat.#8015-2)進行的。首先在65℃時，用ExpressHyb溶液孵育含有分離RNA樣品的薄膜1小時。32P-標記的GPR66 DNA探針通過沸騰2分鐘而變性，把它在冰上放置5分鐘，然后轉移到浸潤薄膜的ExpressHyb溶液中。65℃過夜孵育后，除去雜交溶液中的薄膜，65℃時，在2XSSC/1％SDS中洗滌4次，每次15分鐘，然后55℃時，在0.1XSSC/0.5％SDS中洗滌2次，每次15分鐘。輕輕振搖除去印跡中的多余水分，然后把印跡包在塑料紙中，-80℃時，在膠片上曝光過夜。
            
參考圖13。RNA印跡的結果(見，圖13)連同斑點-印跡的數據顯示，GPR66在胰腺中表達，表明GPR66在所有胰島細胞系和ARIP細胞，即一種胰導管細胞系中大量表達。不希望受任何理論的束縛，GPR66在胰細胞系中的表達表明GPR66可在胰島新生中起作用。
            
c.GPR35按照制造商的指導，利用TRIzol試劑(Gibco/BRL，Cat#15596-018)分離若干癌細胞系(例如，RIN-5AH，HEP-G2，A549，HELA，MOLT-4，HL-60和SW480細胞，全部是市售的)的總RNA。在1％瓊脂糖/甲醛凝膠中進行電泳后，使用標準方案把RNA轉移到尼龍薄膜上。按照制造商的指導，使用與整個編碼序列準確對應的DNA片段和Prime It II隨機引物標記試劑盒(Stratagene，Cat.#300385)合成32P-標記的GPR35探針。雜交是使用補充了100μg/ml鮭魚精子DNA的ExpressHyb溶液(Clontech，Cat.#8015-2)進行的。首先在65℃時，用ExpressHyb溶液孵育含有分離RNA樣品的薄膜1小時。32P-標記的GPR35 DNA探針通過沸騰2分鐘而變性，把它在冰上放置5分鐘，然后轉移到浸潤薄膜的ExpressHyb溶液中。65℃過夜孵育后，除去雜交溶液中的薄膜，65℃時，在2XSSC/1％SDS中洗滌4次，每次15分鐘，然后于55℃時，在0.1XSSC/0.5％SDS中洗滌2次，每次15分鐘。輕輕振搖除去印跡中的多余水分，然后把印跡包在塑料紙中，-80℃時，在膠片上曝光過夜。
            
參考圖15。RNA印跡的結果(見，圖15)顯示，GPR35在結直腸癌細胞系SW480中大量表達。這樣的數據表明，GPR35可在結直腸癌發生中起作用。通過下面所討論方法鑒定的侯選化合物最優選反向激動劑。預期GPR35的反向激動劑可減少DNA復制，從而抑制癌細胞的細胞增殖。GPR35在大腸和小腸中表達。確定GPR35在結直腸癌細胞系(例如，HELA，MOLT-4和SW480)中表達后，檢查了若干癌細胞系。該數據表明，GPR35可在結腸癌發生中起作用。結腸癌是結腸或直腸的惡性腫瘤。大腸癌是在男性和女性中發現的第二普遍的癌癥形式。
            
d.ETBR-LP2按照制造商的指導，利用RNAzol B試劑(TelTest Inc.，Cat.#CS-104)采集實施例6的RNA。在1％瓊脂糖/甲醛凝膠中進行電泳后，使用10X SSC通過毛細管作用把RNA轉移到尼龍薄膜上(Sachleicher Schull)。按照制造商的指導，使用與ETBR-LP2的3’末端準確對應的DNA片段和High Prime標記試劑盒(Roche MolecularBiochemical)合成32P-標記的ETBR-LP2 DNA探針。雜交是使用補充了100μg/ml鮭魚精子DNA的ExpressHyb溶液(Clontech，Cat.#8015-2)如下進行的。首先在65℃時，用Express Hyb溶液孵育含有分離RNA樣品的薄膜過夜。32P-標記的ETBR-LP2 DNA探針通過沸騰2分鐘而變性，把它在冰上放置5分鐘，然后轉移到浸潤薄膜的ExpressHyb溶液中。65℃過夜孵育后，除去雜交溶液中的薄膜，65℃時，在2XSSC/1％SDS中洗滌4次，每次15分鐘，然后于55℃時，在0.2XSSC/0.1％SDS中洗滌2次，每次15分鐘。輕輕振搖除去印跡中的多余水分，然后把印跡包在塑料紙中，-80℃時，在膠片上曝光過夜。
            
參考圖18。圖18顯示ETBR-LP2在施旺氏細胞中表達，這樣髓鞘形成就可在20μM毛喉素時維持。
            
參考圖19。圖19顯示ETBR-LP2在壓碎的大鼠坐骨神經中被上調節，特別是在把神經壓碎后七(7)天。這樣的數據與圖18提出的數據相一致，即，ETBR-LP2通過刺激施旺氏細胞中髓鞘形成的過程而在神經再生中起作用。
            
以這些數據為基礎，ETBR-LP2在施旺氏細胞中表達。當軸突(或神經)受損時，施旺氏細胞通過在軸突周圍形成髓鞘而使神經再生，其提供髓鞘形式的“隔層”。髓鞘形成過程很重要，這是因為作用的可能性快速運行，由此保存代謝能量。施旺氏細胞及其前體對于影響構成周圍神經的其它細胞的存活和分化起著重要的作用。此外，已經確定ETBR-LP2在壓碎的大鼠坐骨神經中表達。這樣的數據支持了ETBR-LP2可在神經細胞再生中起作用的證據。以受體定位的特異性組織的已知功能為基礎，可推斷受體的推定功能。因此，在髓鞘形成過多(例如，腫瘤發生)的情況下，優選ETBR-LP2的反向激動劑，而當發生髓鞘形成過少(例如，變性疾病，如糖尿病)時，激動劑是優選的。
            
與位于這些組織或區域中的受體有關的疾病和病癥包括，但不限制于，心臟疾病和病癥(例如，血栓形成，心肌梗塞，動脈粥樣硬化，心肌病)；腎疾病/病癥(例如，腎衰竭，腎小管酸中毒，腎性糖尿，腎原性尿崩癥，胱氨酸尿，多囊腎)；嗜曙紅細胞增多；白細胞增多；白細胞減少；卵巢癌；性機能障礙；多囊卵巢綜合征；胰腺炎和胰腺癌；應激性腸綜合征；結腸癌；克羅恩氏病；潰瘍性結膜炎；憩室炎；慢性梗阻性肺疾病(COPD)；囊纖維化；肺炎；肺動脈高血壓；肺結核和肺癌；帕金森氏病；運動疾病和運動失調；認知和記憶疾病；進食疾病(例如，厭食，食欲過盛等)；肥胖；癌；胸腺瘤；重癥肌無力；循環疾病；前列腺癌；前列腺炎；腎疾病/病癥(例如，腎衰竭，腎小管酸中毒，腎性糖尿，腎原性尿崩癥，胱氨酸尿，多囊腎)；感覺運動過程和覺醒疾病；強迫觀念與行為疾病；睪丸癌；陰莖異常勃起；前列腺炎；疝氣；內分泌疾病；性機能障礙；過敏；抑郁；精神病；偏頭痛；反流；精神分裂癥；潰瘍；支氣管痙攣；癲癇；前列腺肥大；焦慮；鼻炎；絞痛和青光眼。因此，本發明方法還可用于診斷和/或治療這些及其它疾病和病癥。
            
實施例7方案直接鑒定反向激動劑和激動劑A.[35S]GTPγS測定法雖然內源性組成型活性的GPCR已經用于直接鑒定侯選化合物，例如，反向激動劑，但由于還不完全了解的原因，測定內的差異加劇。在某些實施方案中，上面公開的GPCR融合蛋白還可與非內源性組成型活化的GPCR一起使用。當使用這種蛋白時，測定內的差異似乎基本上穩定，由此獲得有效的信噪比。這更有利于鑒定侯選化合物。因此，在某些優選實施方案中，優選使用GPCR融合蛋白直接鑒定，而且在使用它時，利用下列測定方案。
            
1.膜的制備含有目標組成型活性的孤獨GPCR融合蛋白，并用于直接鑒定作為反向激動劑或激動劑的侯選化合物薄膜是如下制備的a.材料“膜刮取緩沖液”由20mM HEPES和10mM EDTA組成，pH7.4；“膜洗滌緩沖液”由20mM HEPES和0.1mM EDTA組成，pH7.4；“結合緩沖液”由20mM HEPES，100mM NaCl，和10mM MgCl2組成，pH7.4。
            
b.過程整個過程中，所有材料都在冰上保存。首先，從匯合的細胞單層中吸出培養基，接著用10ml冷的PBS洗滌，然后吸出。此后，加入5ml膜刮取緩沖液提取細胞；然后把細胞提取物轉移到50ml離心管中(4℃時，20,000rpm離心17分鐘)。之后吸出上清液，把沉淀重懸浮在30ml膜洗滌緩沖液中，接著在4℃時，20,000rpm離心17分鐘。然后吸出上清液，把沉淀重懸浮在結合緩沖液中。使用Brinkman PolytronTM均化器均化重懸浮的沉淀(15-20秒脈沖，直到物質處于混懸液的狀態)。此處稱之為“膜蛋白”。
            
2.布來得福特蛋白測定法均化后，使用布來得福特蛋白測定法測定膜的蛋白濃度(蛋白稀釋到約1.5mg/ml，等分，冷凍(-80℃)備用；冷凍狀態下，所用方案如下在測定當天，室溫融化冷凍的膜蛋白，接著旋轉，然后用Polytron以約12×1,000rpm均化大約5-10秒；應當指出的是，對于多次制備而言，在不同制劑均化之間，應徹底清洗均化器)。
            
a.材料按照制造商(Biorad，cat.no.500-0006)的指導，使用結合緩沖液(如上所述)；布來得福特染料試劑；布來得福特蛋白標準品。
            
b.過程準備兩個試管，一個含有該膜，另一個作為“空白”對照。每個都含有800μl結合緩沖液。之后，向每個試管中加入10μl布來得福特蛋白標準品(1mg/ml)，然后在其中一個試管(不是空白試管)中加入10μl膜蛋白。之后，向每個試管中加入200μl布來得福特染料試劑，然后渦旋。5分鐘后，把試管再次渦旋，把其中的物質轉移到比色杯中。然后使用CECIL 3041分光光度計，在595波長閱讀比色杯。
            
3.直接鑒定法a.材料GDP緩沖液由37.5ml結合緩沖液和2mg GDP(Sigma，cat.no.G-7127)組成，接著用結合緩沖液進行一系列稀釋，得到0.2μM GDP(每孔中GDP的終濃度為0.1μM GDP)；每孔含有一個侯選化合物，終體積為200μl，其中包括100μl GDP緩沖液(終濃度，0.1μM GDP)，50μl溶于結合緩沖液中的膜蛋白，和50μl溶于結合緩沖液中的[35S]GTPγS(0.6nM)(2.5μl[35S]GTPγS/10ml結合緩沖液)。
            
b.過程優選使用96-孔平板篩選侯選化合物(可在-80℃冷凍)。把膜蛋白(或具有表達載體，表達載體中沒有GPCR融合蛋白的膜，作為對照)簡單均化至混懸狀態。然后使用上述布來得福特測定法測定蛋白濃度。用結合緩沖液把膜蛋白(和對照組)稀釋到0.25mg/ml(終測定濃度，12.5μg/孔)。之后，向Wallac ScintistripTM(Wallac)的每個孔中加入100μl GDP緩沖液。使用5μl針狀-工具把5μl侯選化合物轉移到這樣的孔中(即，5μl在200μl總測定體積中的比例為1∶40，這樣侯選化合物的終篩選濃度為10μM)。再有，為防止污染，在每次轉移步驟之后，把針狀工具在貯器中清洗3次，該貯器中含有水(1X)，乙醇(1X)和水(2X)-過量的液體在每次清洗后從工具中甩掉，用紙和Kim擦干燥工具。之后，把50μl膜蛋白加入到各孔中(還可使用含有薄膜的對照孔，薄膜中沒有GPCR融合蛋白)，室溫預孵育5-10分鐘。之后，把50μl溶于結合緩沖液中的[35S]GTPγS(0.6nM)加入到各孔中，室溫振蕩孵育60分鐘(在這個實施例中，用箔覆蓋平板)。22℃時，通過4000RPM旋轉平板15分鐘而終止測定。然后用8道支管吸凈平板，并用平板的蓋密封。然后用設置在“Prot.#37”檔的Wallac 1450閱讀平板(按照制造商的指導)。
            
B.環AMP測定法直接鑒定侯選化合物的另一個測定法是利用基于環化酶的測定法完成的。除了直接鑒定之外，該測定法還可作為獨立的方法證實上述[35S]GTPγS方法的結果。
            
優選按照下列方案，使用改進的Flash PlateTM腺苷酸環化酶試劑盒(New England Nuclear；Cat.No.SMP004A)直接鑒定作為GPCR反向激動劑和激動劑的侯選化合物。
            
轉染后大約3天采集轉染的細胞。通過在含有20mM HEPES，pH7.4和10mM MgCl2的緩沖液中均化懸浮的細胞而制備膜。均化是使用Brinkman PolytronTM在冰上進行大約10秒。4℃時，以49,000Xg離心所得的勻漿15分鐘。然后把所得沉淀重懸浮在含20mM HEPES，pH7.4和0.1mM EDTA的緩沖液中，均化10秒，然后4℃時，49,000Xg離心15分鐘。把得到的沉淀在-80℃貯藏備用。在進行直接鑒定篩選的當天，室溫緩慢融化膜沉淀，在含有20mM HEPES，pH7.4和10mM MgCl2的緩沖液中重懸浮，產生終濃度0.60mg/ml的蛋白(把重懸浮的膜放在冰上備用)。
            
按照制造商的指導，制備并維持cAMP標準品和檢測緩沖液(11ml檢測緩沖液中含有2μCi示蹤劑[125I cAMP(100μl)]))。新鮮制備用于篩選的測定緩沖液，它含有20mM HEPES，pH7.4，10mM MgCl2，20mM磷酸肌酸(Sigma)，0.1單位/ml肌酸磷酸激酶(Sigma)，5 0μM GTP(Sigma)，和0.2mM ATP(Sigma)；測定緩沖液在冰上貯存備用。
            
優選把上述鑒定的侯選化合物(如果處于冷凍狀態，在室溫融化)，以及40μl膜蛋白(30μg/孔)和50μl測定緩沖液加入到96孔平板孔中(3μl/孔；12μM終測定濃度)。室溫時，輕輕振蕩孵育該混合物30分鐘。
            
孵育后，向每孔中加入100μl檢測緩沖液，培養2-24小時。然后(按照制造商的指導)使用“Prot.#31”檔在Wallac MicroBetaTM中對平板計數。
            
C.黑素細胞篩選測定法鑒定GPCR侯選激動劑或反向激動劑的方法可通過引入色素細胞系的試驗細胞進行，其中色素細胞系能夠反應于特定刺激而分散并聚集色素，并表達編碼GPCR的外源性克隆。刺激物，例如，光，可設置色素分布的最初狀態，其中色素在試驗細胞內聚集，如果激活GPCR，可誘導色素分散。然而，用刺激物刺激細胞從而設置色素分散的色素分布的最初狀態時，如果激活GPCR，可誘導色素聚集。然后使試驗細胞與化合物接觸，并確定細胞中的色素分布是否從色素分布的最初狀態發生了改變。由于侯選化合物與GPCR偶聯，因此在陪替氏培養皿中，色素細胞分散處顯得比較暗，色素細胞聚集處則顯得比較亮。
            
材料和方法在美國專利號5,462,856和美國專利號6,051,386中公開，它們全部引入此處作為參考。
            
雖然對于本領域那些技術人員而言，可以使用各種表達載體，但對于內源性和非內源性人GPCR而言，在某些實施方案中，優選使用pCMV載體。按照用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，該載體于1998年10月13日在美國典型培養物保藏中心(ATCC)(10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209 USA)保藏。DNA由ATCC試驗，并確定是存活的。ATCC給出了下列保藏號pCMVATCC#203351。
            
除非另有說明，本專利文件中引證的參考文獻，包括尚未批準的有關專利申請全部引入此處作為參考。技術人員權限內的，對所公開發明進行的改進和擴展也包括在上述公開和權利要求的范圍之內。
            
序列表<110>阿倫納藥品公司<120>人G蛋白偶聯受體的內源性和非內源性形式<130>AREN-0321<160>102<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1062<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1atggaaacca acttctccat tcctctgaat gaaactgagg aggtgctccc tgagcctgct60ggccacaccg ttctgtggat cttctcattg ctagtccacg gagtcacctt tgtcttcggg120gtcctgggca atgggcttgt gatctgggtg gctggattcc ggatgacacg cacagtcaac180accatctgtt acctgaacct ggccctagct gacttctctt tcagtgccat cctaccattc240cgaatggtct cagtcgccat gagagaaaaa tggccttttg gctcattcct atgtaagtta300gttcatgtta tgatagacat caacctgttt gtcagtgtct acctgatcac catcattgct360ctggaccgct gtatttgtgt cctgcatcca gcctgggccc agaaccatcg caccatgagt420ctggccaaga gggtgatgac gggactctgg attttcacca tagtccttac cttaccaaat480ttcatcttct ggactacaat aagtactacg aatggggaca catactgtat tttcaacttt540gcattctggg gtgacactgc tgtagagagg ttgaacgtgt tcattaccat ggccaaggtc600tttctgatcc tccacttcat tattggcttc agcgtgccta tgtccatcat cacagtctgc660tatgggatca tcgctgccaa aattcacaga aaccacatga ttaaatccag ccgtccctta720cgtgtcttcg ctgctgtggt ggcttctttc ttcatctgtt ggttccctta tgaactaatt780ggcattctaa tggcagtctg gctcaaagag atgttgttaa atggcaaata caaaatcatt840cttgtcctga ttaacccaac aagctccttg gcctttttta acagctgcct caacccaatt900
            
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130 135 140Val Met Thr Gly Leu Trp Ile Phe Thr Ile Val Leu Thr Leu Pro Asn145 150 155 160Phe Ile Phe Trp Thr Thr Ile Ser Thr Thr Asn Gly Asp Thr Tyr Cys165 170 175Ile Phe Asn Phe Ala Phe Trp Gly Asp Thr Ala Val Glu Arg Leu Asn180 185 190Val Phe Ile Thr Met Ala Lys Val Phe Leu Ile Leu His Phe Ile Ile195 200 205Gly Phe Ser Val Pro Met Ser Ile Ile Thr Val Cys Tyr Gly Ile Ile210 215 220Ala Ala Lys Ile His Arg Asn His Met Ile Lys Ser Ser Arg Pro Leu225 230 235 240Arg Val Phe Ala Ala Val Val Ala Ser Phe Phe Ile Cys Trp Phe Pro245 250 255Tyr Glu Leu Ile Gly Ile Leu Met Ala Val Trp Leu Lys Glu Met Leu260 265 270Leu Asn Gly Lys Tyr Lys Ile Ile Leu Val Leu Ile Asn Pro Thr Ser275 280 285Ser Leu Ala Phe Phe Asn Ser Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Val Phe290 295 300Met Gly Arg Asn Phe Gln Glu Arg Leu Ile Arg Ser Leu Pro Thr Ser305 310 315 320Leu Glu Arg Ala Leu Thr Glu Val Pro Asp Ser Ala Gln Thr Ser Asn
            
325 330 335Thr Asp Thr Thr Ser Ala Ser Pro Pro Glu Glu Thr Glu Leu Gln Ala340 345 350Met<210>3<211>1029<212>DNA<213>人<400>3atggcagagc atgattacca tgaagactat gggttcagca gtttcaatga cagcagccag60gaggagcatc aagccttcct gcagttcagc aaggtctttc tgccctgcat gtacctggtg120gtgtttgtct gtggtctggt ggggaactct ctggtgctgg tcatatccat cttctaccat180aagttgcaga gcctgacgga tgtgttcctg gtgaacctac ccctggctga cctggtgttt240gtctgcactc tgcccttctg ggcctatgca ggcatccatg aatgggtgtt tggccaggtc300atgtgcaaaa gcctactggg catctacact attaacttct acacgtccat gctcatcctc360acctgcatca ctgtggatcg tttcattgta gtggttaagg ccaccaaggc ctacaaccag420caagccaaga ggatgacctg gggcaaggtc accagcttgc tcatctgggt gatatccctg480ctggtttcct tgccccaaat tatctatggc aatgtcttta atctcgacaa gctcatatgt540ggttaccatg acgaggcaat ttccactgtg gttcttgcca cccagatgac actggggttc600ttcttgccac tgctcaccat gattgtctgc tattcagtca taatcaaaac actgcttcat660gctggaggct tccagaagca cagatctcta aagatcatct tcctggtgat ggctgtgttc720ctgctgaccc agatgccctt caacctcatg aagttcatcc gcagcacaca ctgggaatac780tatgccatga ccagctttca ctacaccatc atggtgacag aggccatcgc atacctgagg840gcctgcctta accctgtgct ctatgccttt gtcagcctga agtttcgaaa gaacttctgg900aaacttgtga aggacattgg ttgcctccct taccttgggg tctcacatca atggaaatct960
            
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<223>新序列<400>12Met Ser Pro Glu Cys Ala Arg Ala Ala Gly Asp Ala Pro Leu Arg Ser1   5   10  15Leu Glu Gln Ala Asn Arg Thr Arg Phe Pro Phe Phe Ser Asp Val Lys20  25  30Gly Asp His Arg Leu Val Leu Ala Ala Val Glu Thr Thr Val Leu Val35  40  45Leu Ile Phe Ala Val Ser Leu Leu Gly Asn Val Cys Ala Leu Val Leu50  55  60Val Ala Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ala Thr Ala Cys Leu Val Leu Asn65  70  75  80Leu Phe Cys Ala Asp Leu Leu Phe Ile Ser Ala Ile Pro Leu Val Leu85  90  95Ala Val Arg Trp Thr Glu Ala Trp Leu Leu Gly Pro Val Ala Cys His100 105 110Leu Leu Phe Tyr Val Met Thr Leu Ser Gly Ser Val Thr Ile Leu Thr115 120 125Leu Ala Ala Val Ser Leu Glu Arg Met Val Cys Ile Val His Leu Gln130 135 140Arg Gly Val Arg Gly Pro Gly Arg Arg Ala Arg Ala Val Leu Leu Ala145 150 155 160
            
Leu Ile Trp Gly Tyr Ser Ala Val Ala Ala Leu Pro Leu Cys Val Phe165 170 175Phe Arg Val Val Pro Gln Arg Leu Pro Gly Ala Asp Gln Glu Ile Ser180 185 190Ile Cys Thr Leu Ile Trp Pro Thr Ile Pro Gly Glu Ile Ser Trp Asp195 200 205Val Ser Phe Val Thr Leu Asn Phe Leu Val Pro Gly Leu Val Ile Val210 215 220Ile Ser Tyr Ser Lys Ile Leu Gln Ile Thr Lys Ala Ser Arg Lys Arg225 230 235 240Leu Thr Val Ser Leu Ala Tyr Ser Glu Ser His Gln Ile Arg Val Ser245 250 255Gln Gln Asp Phe Arg Leu Phe Arg Thr Leu Phe Leu Leu Mer Val Ser260 265 270Phe Phe Ile Met Trp Ser Pro Ile Ile Ile Thr Ile Leu Leu Ile Leu275 280 285Ile Gln Asn Phe Lys Gln Asp Leu Val Ile Trp Pro Ser Leu Phe Phe290 295 300Trp Val Val Ala Phe Thr Phe Ala Asn Ser Ala Leu Asn Pro Ile Leu305 310 315 320Tyr Asn Met Thr Leu Cys Arg Asn Glu Trp Lys Lys Ile Phe Cys Cys325 330 335Phe Trp Phe Pro Glu Lys Gly Ala Ile Leu Thr Asp Thr Ser Val Lys340 345 350
            
Arg Asn Asp Leu Ser Ile Ile Ser Gly355 360<210>13<211>1212<212>DNA<213>人<400>13atggcttgca atggcagtgc ggccaggggg cactttgacc ctgaggactt gaacctgact60gacgaggcac tgagactcaa gtacctgggg ccccagcaga cagagctgtt catgcccatc120tgtgccacat acctgctgat cttcgtggtg ggcgctgtgg gcaatgggct gacctgtctg180gtcatcctgc gccacaaggc catgcgcacg cctaccaact actacctctt cagcctggcc240gtgtcggacc tgctggtgct gctggtgggc ctgcccctgg agctctatga gatgtggcac300aactacccct tcctgctggg cgttggtggc tgctatttcc gcacgctact gtttgagatg360gtctgcctgg cctcagtgct caacgtcact gccctgagcg tggaacgcta tgtggccgtg420gtgcacccac tccaggccag gtccatggtg acgcgggccc atgtgcgccg agtgcttggg480gccgtctggg gtcttgccat gctctgctcc ctgcccaaca ccagcctgca cggcatccgg540cagctgcacg tgccctgccg gggcccagtg ccagactcag ctgtttgcat gctggtccgc600ccacgggccc tctacaacat ggtagtgcag accaccgcgc tgctcttctt ctgcctgccc660atggccatca tgagcgtgct ctacctgctc attgggctgc gactgcggcg ggagaggctg720ctgctcatgc aggaggccaa gggcaggggc tctgcagcag ccaggtccag atacacctgc780aggctccagc agcacgatcg gggccggaga caagtgacca agatgctgtt tgtcctggtc840gtggtgtttg gcatctgctg ggccccgttc cacgccgacc gcgtcatgtg gagcgtcgtg900tcacagtgga cagatggcct gcacctggcc ttccagcacg tgcacgtcat ctccggcatc960ttcttctacc tgggctcggc ggccaacccc gtgctctata gcctcatgtc cagccgcttc1020cgagagacct tccaggaggc cctgtgcctc ggggcctgct gccatcgcct cagaccccgc1080
            
cacagctccc acagcctcag caggatgacc acaggcagca ccctgtgtga tgtgggctcc1140ctgggcagct gggtccaccc cctggctggg aacgatggcc cagaggcgca gcaagagacc1200gatccatcct ga1212<210>14<211>403<212>PRT<213>人<400>14Met Ala Cys Asn Gly Ser Ala Ala Arg Gly His Phe Asp Pro Glu Asp1   5   10  15Leu Asn Leu Thr Asp Glu Ala Leu Arg Leu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln20  25  30Gln Thr Glu Leu Phe Met Pro Ile Cys Ala Thr Tyr Leu Leu Ile Phe35  40  45Val Val Gly Ala Val Gly Asn Gly Leu Thr Cys Leu Val Ile Leu Arg50  55  60His Lys Ala Met Arg Thr Pro Thr Asn Tyr Tyr Leu Phe Ser Leu Ala65  70  75  80Val Ser Asp Leu Leu Val Leu Leu Val Gly Leu Pro Leu Glu Leu Tyr85  90  95Glu Met Trp His As nTyr Pro Phe Leu Leu Gly Val Gly Gly Cys Tyr100 105 110Phe Arg Thr Leu Leu Phe Glu Met Val Cys Leu Ala Ser Val Leu Asn115 120 125Val Thr Ala Leu Ser Val Glu Arg Tyr Val Ala Val Val His Pro Leu130 135 140
            
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Ser Ser Arg Phe Arg Glu Thr Phe Gln Glu Ala Leu Cys Leu Gly Ala340 345 350Cys Cys His Arg Leu Arg Pro Arg His Ser Ser His Ser Leu Ser Arg355 360 365Met Thr Thr Gly Ser Thr Leu Cys Asp Val Gly Ser Leu Gly Ser Trp370 375 380Val His Pro Leu Ala Gly Asn Asp Gly Pro Glu Ala Gln Gln Glu Thr385 390 395 400Asp Pro Ser<210>15<211>930<212>DNA<213>人<400>15atgaatggca cctacaacac ctgtggctcc agcgacctca cctggccccc agcgatcaag60ctgggcttct acgcctactt gggcgtcctg ctggtgctag gcctgctgct caacagcctg120gcgctctggg tgttctgctg ccgcatgcag cagtggacgg agacccgcat ctacatgacc180aacctggcgg tggccgacct ctgcctgctg tgcaccttgc ccttcgtgct gcactccctg240cgagacacct cagacacgcc gctgtgccag ctctcccagg gcatctacct gaccaacagg300tacatgagca tcagcctggt cacggccatc gccgtggacc gctatgtggc cgtgcggcac360ccgctgcgtg cccgcgggct gcggtccccc aggcaggctg cggccgtgtg cgcggtcctc420tgggtgctgg tcatcggctc cctggtggct cgctggctcc tggggattca ggagggcggc480ttctgcttca ggagcacccg gcacaatttc aactccatgc ggttcccgct gctgggattc540tacctgcccc tggccgtggt ggtcttctgc tccctgaagg tggtgactgc cctggcccag600
            
aggccaccca ccgacgtggg gcaggcagag gccacccgca aggctgcccg catggtctgg660gccaacctcc tggtgttcgt ggtctgcttc ctgcccctgc acgtggggct gacagtgcgc720ctcgcagtgg gctggaacgc ctgtgccctc ctggagacga tccgtcgcgc cctgtacata780accagcaagc tctcagatgc caactgctgc ctggacgcca tctgctacta ctacatggcc840aaggagttcc aggaggcgtc tgcactggcc gtggctcccc gtgctaaggc ccacaaaagc900caggactctc tgtgcgtgac cctcgcctaa 930<210>16<211>309<212>PRT<213>人<400>16Met Asn Gly Thr Tyr Asn Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Thr Trp Pro1   5   10  15Pro Ala Ile Lys Leu Gly Phe Tyr Ala Tyr Leu Gly Val Leu Leu Val20  25  30Leu Gly Leu Leu Leu Asn Ser Leu Ala Leu Trp Val Phe Cys Cys Arg35  40  45Met Gln Gln Trp Thr Glu Thr Arg Ile Tyr Met Thr Asn Leu Ala Val50  55  60Ala Asp Leu Cys Leu Leu Cys Thr Leu Pro Phe Val Leu His Ser Leu65  70  75  80Arg Asp Thr Ser Asp Thr Pro Leu Cys Gln Leu Ser Gln Gly Ile Tyr85  90  95Leu Thr Asn Arg Tyr Met Ser Ile Ser Leu Val Thr Ala Ile Ala Val100 105 110
            
Asp Arg Tyr Val Ala Val Arg His Pro Leu Arg Ala Arg Gly Leu Arg115 120 125Ser Pro Arg Gln Ala Ala Ala Val Cys Ala Val Leu Trp Val Leu Val130 135 140Ile Gly Ser Leu Val Ala Arg Trp Leu Leu Gly Ile Gln Glu Gly Gly145 150 155 160Phe Cys Phe Arg Ser Thr Arg His Asn Phe Asn Ser Met Arg Phe Pro165 170 175Leu Leu Gly Phe Tyr Leu Pro Leu Ala Val Val Val Phe Cys Ser Leu180 185 190Lys Val Val Thr Ala Leu Ala Gln Arg Pro Pro Thr Asp Val Gly Gln195 200 205Ala Glu Ala Thr Arg Lys Ala Ala Arg Met Val Trp Ala Asn Leu Leu210 215 220Val Phe Val Val Cys Phe Leu Pro Leu His Val Gly Leu Thr Val Arg225 230 235 240Leu Ala Val Gly Trp Asn Ala Cys Ala Leu Leu Glu Thr Ile Arg Arg245 250 255Ala Leu Tyr Ile Thr Ser Lys Leu Ser Asp Ala Asn Cys Cys Leu Asp260 265 270Ala Ile Cys Tyr Tyr Tyr Met Ala Lys Glu Phe Gln Glu Ala Ser Ala275 280 285Leu Ala Val Ala Pro Arg Ala Lys Ala His Lys Ser Gln Asp Ser Leu290 295 300
            
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gtggtggcct acctctccac cgagctgacc cgccagaccc tggacctcct gggcctcatc1200aaccagttct ccaccttctt caagggcgcc atcaccccag tgctgctcct ttgcatctgc1260aggccgctgg gccaggcctt cctggactgc tgctgctgct gctgctgtga ggagtgcggc1320ggggcttcgg aggcctctgc tgccaatggg tcggacaaca agctcaagac cgaggtgtcc1380tcttccatct acttccacaa gcccagggag tcacccccac tcctgcccct gggcacacct1440tgctga   1446<210>18<211>481<212>PRT<213>人<400>18Met Arg Trp Leu Trp Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala ValIle Leu Ala1   5   10 15Val Gly Leu Ser Arg Val Ser Gly Gly Ala Pro Leu His Leu Gly Arg20  25  30His Arg Ala Glu Thr Gln Glu Gln Gln Ser Arg Ser Lys Arg Gly Thr35  40  45Glu Asp Glu Glu Ala Lys Gly Val Gln Gln Tyr Val Pro Glu Glu Trp50  55  60Ala Glu Tyr Pro Arg Pro Ile His Pro Ala Gly Leu Gln Pro Thr Lys65  70  75  80Pro Leu Val Ala Thr Ser Pro Asn Pro Asp Lys Asp Gly Gly Thr Pro85  90  95Asp Ser Gly Gln Glu Leu Arg Gly Asn Leu Thr Gly Ala Pro Gly Gln100 105 110
            
Arg Leu Gln Ile Gln Asn Pro Leu Tyr Pro Val Thr Glu Ser Ser Tyr115 120 125Ser Ala Tyr Ala Ile Met Leu Leu Ala Leu Val Val Phe Ala Val Gly130 135 140Ile Val Gly Asn Leu Ser Val Met Cys Ile Val Trp His Ser Tyr Tyr145 150 155 160Leu Lys Ser Ala Trp Asn Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ala Leu Trp Asp165 170 175Phe Leu Val Leu Phe Phe Cys Leu Pro Ile Val Ile Phe Asn Glu Ile180 185 190Thr Lys Gln Arg Leu Leu Gly Asp Val Ser Cys Arg Ala Val Pro Phe195 200 205Met Glu Val Ser Ser Leu Gly Val Thr Thr Phe Ser Leu Cys Ala Leu210 215 220Gly Ile Asp Arg Phe His Val Ala Thr Ser Thr Leu Pro Lys Val Arg225 230 235 240Pro Ile Glu Arg Cys Gln Ser Ile Leu Ala Lys Leu Ala Val Ile Trp245 250 255Val Gly Ser Met Thr Leu Ala Val Pro Glu Leu Leu Leu Trp Gln Leu260 265 270Ala Gln Glu Pro Ala Pro Thr Met Gly Thr Leu Asp Ser Cys Ile Met275 280 285Lys Pro Ser Ala Ser Leu Pro Glu Ser Leu Tyr Ser Leu Val Met Thr290 295 300
            
Tyr Gln Asn Ala Arg Met Trp Trp Tyr Phe Gly Cys Tyr Phe Cys Leu305 310 315 320Pro Ile Leu Phe Thr Val Thr Cys Gln Leu Val Thr Trp Arg Val Arg325 330 335Gly Pro Pro Gly Arg Lys Ser Glu Cys Arg Ala Ser Lys His Glu Gln340 345 350Cys Glu Ser Gln Leu Asn Ser Thr Val Val Gly Leu Thr Val Val Tyr355 360 365Ala Phe Cys Thr Leu Pro Glu Asn Val Cys Asn Ile Val Val Ala Tyr370 375 380Leu Ser Thr Glu Leu Thr Arg Gln Thr Leu Asp Leu Leu Gly Leu Ile385 390 395 400Asn Gln Phe Ser Thr Phe Phe Lys Gly Ala Ile Thr Pro Val Leu Leu405 410 415Leu Cys Ile Cys Arg Pro Leu Gly Gln Ala Phe Leu Asp Cys Cys Cys420 425 430Cys Cys Cys Cys Glu Glu Cys Gly Gly Ala Ser Glu Ala Ser Ala Ala435 440 445Asn Gly Ser Asp Asn Lys Leu Lys Thr Glu Val Ser Ser Ser Ile Tyr450 455 460Phe His Lys Pro Arg Glu Ser Pro Pro Leu Leu Pro Leu Gly Thr Pro465 470 475 480Cys
            
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<223>新序列<400>29accatggctt gcaatggcag tgcggccagg gggcact   37<210>30<211>39<212>DNA<213>未知<220>
            
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<223>新序列<400>31gaccaagatg ctgtttgtcc tggtcgtggt gtttggcat  39<210>32<211>35<212>DNA<213>未知<220>
            
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<223>新序列<400>48ctatgcacag agcacatcgg gtgaaaggtg gtgac 35<210>49<211>36<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>49ccttttgttc tttaagtcct atgtcacccc agtcct36<210>50<211>36<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>50aggactgggg tgacatagga cttaaagaac aaaagg36
            
<210>51<211>31<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>51atgtggagcc ccatcttcat caccatcctc c  31<210>52<211>31<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>52ggaggatggt gatgaagatg gggctccaca t  31<210>53<211>33<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>53gccgcggtca gcctgaatcg catggtgtgc atc33<210>54<211>33<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>54gatgcacacc atgcgattca ggctgaccgc ggc33
            
<210>55<211>29<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>55ggccggagac aagtgaaaag atgctgttt29<210>56<211>30<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>56aaacagcatc tttttcactt gtctccggcc   30<210>57<211>27<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>57gagagccagc tcaagagcac cgtggtg  27<210>58<211>31<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>58ctccttcggt cctcctatcg ttgtcagaag t 31
            
<210>59<211>31<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>59agtggcactc cccctcggct gtgattcctg t 31<210>60<211>30<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>60gccacccgca aggctaaacg catggtctgg   30<210>61<211>31<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>61ctccttcggt cctcctatcg ttgtcagaag t 31<210>62<211>1062<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>62atggaaacca acttctccat tcctctgaat gaaactgagg aggtgctccc tgagcctgct60ggccacaccg ttctgtggat cttctcattg ctagtccacg gagtcacctt tgtcttcggg120
            
gtcctgggca atgggcttgt gatctgggtg gctggattcc ggatgacacg cacagtcaac180accatctgtt acctgaacct ggccctagct gacttctctt tcagtgccat cctaccattc240cgaatggtct cagtcgccat gagagaaaaa tggccttttg gctcattcct atgtaagtta300gttcatgtta tgatagacat caacctgttt gtcagtgtct acctgatcac catcattgct360ctggaccgct gtatttgtgt cctgcatcca gcctgggccc agaaccatcg caccatgagt420ctggccaaga gggtgatgac gggactctgg attttcacca tagtccttac cttaccaaat480ttcatcttct ggactacaat aagtactacg aatggggaca catactgtat tttcaacttt540gcattctggg gtgacactgc tgtagagagg ttgaacgtgt tcattaccat ggccaaggtc600tttctgatcc tccacttcat tattggcttc agcgtgccta tgtccatcat cacagtctgc660tatgggatca tcgctgccaa aattcacaga aaccacatga ttaaatccag ccgtcccaaa720cgtgtcttcg ctgctgtggt ggcttctttc ttcatctgtt ggttccctta tgaactaatt780ggcattctaa tggcagtctg gctcaaagag atgttgttaa atggcaaata caaaatcatt840cttgtcctga ttaacccaac aagctccttg gcctttttta acagctgcct caacccaatt900ctctacgtct ttatgggtcg taacttccaa gaaagactga ttcgctcttt gcccactagt960ttggagaggg ccctgactga ggtccctgac tcagcccaga ccagcaacac agacaccact1020tctgcttcac ctcctgagga gacggagtta caagcaatgt ga   1062<210>63<211>353<212>PRT<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>63Met Glu Thr Asn Phe Ser Ile Pro Leu Asn Glu Thr Glu Glu Val Leu1   5   10  15
            
Pro Glu Pro Ala Gly His Thr Val Leu Trp Ile Phe Ser Leu Leu Val20  25  30His Gly Val Thr Phe Val Phe Gly Val Leu Gly Asn Gly Leu Val Ile35  40  45Trp Val Ala Gly Phe Arg Met Thr Arg Thr Val Asn Thr Ile Cys Tyr50  55  60Leu Asn Leu Ala Leu Ala Asp Phe Ser Phe Ser Ala Ile Leu Pro Phe65  70  75  80Arg Met Val Ser Val Ala Met Arg Glu Lys Trp Pro Phe Gly Ser Phe85  90  95Leu Cys Lys Leu Val His Val Met Ile Asp Ile Asn Leu Phe Val Ser100 105 110Val Tyr Leu Ile Thr Ile Ile Ala Leu Asp Arg Cys Ile Cys Val Leu115 120 125His Pro Ala Trp Ala Gln Asn His Arg Thr Met Ser Leu Ala Lys Arg130 135 140Val Met Thr Gly Leu Trp Ile Phe Thr Ile Val Leu Thr Leu Pro Asn145 150 155 160Phe Ile Phe Trp Thr Thr Ile Ser Thr Thr Asn Gly Asp Thr Tyr Cys165 170 175Ile Phe Asn Phe Ala Phe Trp Gly Asp Thr Ala Val Glu Arg Leu Asn180 185 190Val Phe Ile Thr Met Ala Lys Val Phe Leu Ile Leu His Phe Ile Ile195 200 205
            
Gly Phe Ser Val Pro Met Ser Ile Ile Thr Val Cys Tyr Gly Ile Ile210 215 220Ala Ala Lys Ile His Arg Asn His Met Ile Lys Ser Ser Arg Pro Lys225 230 235 240Arg Val Phe Ala Ala Val Val Ala Ser Phe Phe Ile Cys Trp Phe Pro245 250 255Tyr Glu Leu Ile Gly Ile Leu Met Ala Val Trp Leu Lys Glu Met Leu260 265 270Leu Asn Gly Lys Tyr Lys Ile Ile Leu Val Leu Ile Asn Pro Thr Ser275 280 285Ser Leu Ala Phe Phe Asn Ser Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Val Phe290 295 300Met Gly Arg Asn Phe Gln Glu Arg Leu Ile Arg Ser Leu Pro Thr Ser305 310 315 320Leu Glu Arg Ala Leu Thr Glu Val Pro Asp Ser Ala Gln Thr Ser Asn325 330 335Thr Asp Thr Thr Ser Ala Ser Pro Pro Glu Glu Thr Glu Leu Gln Ala340 345 350Met<210>64<211>1029<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列
            
<400>64atggcagagc atgattacca tgaagactat gggttcagca gtttcaatga cagcagccag60gaggagcatc aagccttcct gcagttcagc aaggtctttc tgccctgcat gtacctggtg120gtgtttgtct gtggtctggt ggggaactct ctggtgctgg tcatatccat cttctaccat180aagttgcaga gcctgacgga tgtgttcctg gtgaacctac ccctggctga cctggtgttt240gtctgcactc tgcccttctg ggcctatgca ggcatccatg aatgggtgtt tggccaggtc300atgtgcaaaa gcctactggg catctacact attaacttct acacgtccat gctcatcctc360acctgcatca ctgtggatcg tttcattgta gtggttaagg ccaccaaggc ctacaaccag420caagccaaga ggatgacctg gggcaaggtc accagcttgc tcatctgggt gatatccctg480ctggtttcct tgccccaaat tatctatggc aatgtcttta atctcgacaa gctcatatgt540ggttaccatg acgaggcaat ttccactgtg gttcttgcca cccagatgac actggggttc600ttcttgccac tgctcaccat gattgtctgc tattcagtca taatcaaaac actgcttcat660gctggaggct tccagaagca cagatcaaaa aagatcatct tcctggtgat ggctgtgttc720ctgctgaccc agatgccctt caacctcatg aagttcatcc gcagcacaca ctgggaatac780tatgccatga ccagctttca ctacaccatc atggtgacag aggccatcgc atacctgagg840gcctgcctta accctgtgct ctatgccttt gtcagcctga agtttcgaaa gaacttctgg900aaacttgtga aggacattgg ttgcctccct taccttgggg tctcacatca atggaaatct960tctgaggaca attccaagac tttttctgcc tcccacaatg tggaggccac cagcatgttc1020cagttatag1029<210>65<211>342<212>PRT<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>65
            
Met Ala Glu His Asp Tyr His Glu Asp Tyr Gly Phe Ser Ser Phe Asn1   5   10  15Asp Ser Ser Gln Glu Glu His Gln Ala Phe Leu Gln Phe Ser Lys Val20  25  30Phe Leu Pro Cys Met Tyr Leu Val Val Phe Val Cys Gly Leu Val Gly35  40  45Asn Ser Leu Val Leu Val Ile Ser Ile Phe Tyr His Lys Leu Gln Ser50  55  60Leu Thr Asp Val Phe Leu Val Asn Leu Pro Leu Ala Asp Leu Val Phe65  70  75  80Val Cys Thr Leu Pro Phe Trp Ala Tyr Ala Gly Ile His Glu Trp Val85  90  95Phe Gly Gln Val Met Cys Lys Ser Leu Leu Gly Ile Tyr Thr Ile Asn100 105 110Phe Tyr Thr Ser Met Leu Ile Leu Thr Cys Ile Thr Val Asp Arg Phe115 120 125Ile Val Val Val Lys Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Gln Gln Ala Lys Arg130 135 140Met Thr Trp Gly Lys Val Thr Ser Leu Leu Ile Trp Val Ile Ser Leu145 150 155 160Leu Val Ser Leu Pro Gln Ile Ile Tyr Gly Asn Val Phe Asn Leu Asp165 170 175Lys Leu Ile Cys Gly Tyr His Asp Glu Ala Ile Ser Thr Val Val Leu180 185 190
            
Ala Thr Gln Met Thr Leu Gly Phe Phe Leu Pro Leu Leu Thr Met Ile195 200 205Val Cys Tyr Ser Val Ile Ile Lys Thr Leu Leu His Ala Gly Gly Phe210 215 220Gln Lys His Arg Ser Lys Lys Ile Ile Phe Leu Val Met Ala Val Phe225 230 235 240Leu Leu Thr Gln Met Pro Phe Asn Leu Met Lys Phe Ile Arg Ser Thr245 250 255His Trp Glu Tyr Tyr Ala Met Thr Ser Phe His Tyr Thr Ile Met Val260 265 270Thr Glu Ala Ile Ala Tyr Leu Arg Ala Cys Leu Asn Pro Val Leu Tyr275 280 285Ala Phe Val Ser Leu Lys Phe Arg Lys Asn Phe Trp Lys Leu Val Lys290 295 300Asp Ile Gly Cys Leu Pro Tyr Leu Gly Val Ser His Gln Trp Lys Ser205 310 315 320Ser Glu Asp Asn Ser Lys Thr Phe Ser Ala Ser His Asn Val Glu Ala325 330 335Thr Ser Met Phe Gln Leu340<210>66<211>2748<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列
            
<400>66atggtccagc tgaggaagct gctccgcgtc ctgactttga tgaagttccc ctgctgcgtg60ctggaggtgc tcctgtgcgc gctggcggcg gcggcgcgcg gccaggagat gtacgccccg120cactcaatcc ggatcgaggg ggacgtcacc ctcggggggc tgttccccgt gcacgccaag180ggtcccagcg gagtgccctg cggcgacatc aagagggaaa acgggatcca caggctggaa240gcgatgctct acgccctgga ccagatcaac agtgatccca acctactgcc caacgtgacg300ctgggcgcgc ggatcctgga cacttgttcc agggacactt acgcgctcga acagtcgctt360actttcgtcc aggcgctcat ccagaaggac acctccgacg tgcgctgcac caacggcgaa420ccgccggttt tcgtcaagcc ggagaaagta gttggagtga ttggggcttc ggggagttcg480gtctccatca tggtagccaa catcctgagg ctcttccaga tcccccagat tagttatgca540tcaacggcac ccgagctaag tgatgaccgg cgctatgact tcttctctcg cgtggtgcca600cccgattcct tccaagccca ggccatggta gacattgtaa aggccctagg ctggaattat660gtgtctaccc tcgcatcgga aggaagttat ggagagaaag gtgtggagtc cttcacgcag720atttccaaag aggcaggtgg actctgcatt gcccagtccg tgagaatccc ccaggaacgc780aaagacagga ccattgactt tgatagaatt atcaaacagc tcctggacac ccccaactcc840agggccgtcg tgatttttgc caacgatgag gatataaagc agatccttgc agcagccaaa900agagctgacc aagttggcca ttttctttgg gtgggatcag acagctgggg atccaaaata960aacccactgc accagcatga agatatcgca gaaggggcca tcaccattca gcccaagcga1020gccacggtgg aagggtttga tgcctacttt acgtcccgta cacttgaaaa caacagaaga1080aatgtatggt ttgccgaata ctgggaggaa aacttcaact gcaagttgac gattagtggg1140tcaaaaaaag aagacacaga tcgcaaatgc acaggacagg agagaattgg aaaagattcc1200aactatgagc aggagggtaa agtccagttc gtgattgacg cagtctatgc tatggctcac1260gcccttcacc acatgaacaa ggatctctgt gctgactacc ggggtgtctg cccagagatg1320gagcaagctg gaggcaagaa gttgctgaag tatatacgca atgttaattt caatggtagt1380gctggcactc cagtgatgtt taacaagaac ggggatgcac ctgggcgtta tgacatcttt1440
            
cagtaccaga ccacaaacac cagcaacccg ggttaccgtc tgatcgggca gtggacagac1500gaacttcagc tcaatataga agacatgcag tggggtaaag gagtccgaga gatacccgcc1560tcagtgtgca cactaccatg taagccagga cagagaaaga agacacagaa aggaactcct1620tgctgttgga cctgtgagcc ttgcgatggt taccagtacc agtttgatga gatgacatgc1680cagcattgcc cctatgacca gaggcccaat gaaaatcgaa ccggatgcca ggatattccc1740atcatcaaac tggagtggca ctccccctcg gctgtgattc ctgtcttcct ggcaatgttg1800gggatcattg ccaccatctt tgtcatggcc actttcatcc gctacaatga cacgcccatt1860gtccgggcat ctgggcggga actcagctat gttcttttga cgggcatctt tctttgctac1920atcatcactt tcctgatgat tgccaaacca gatgtggcag tgtgttcttt ccggcgagtt1980ttcttgggct tgggtatgtg catcagttat gcagccctct tgacgaaaac aaatcggatt2040tatcgcatat ttgagcaggg caagaaatca gtaacagctc ccagactcat aagcccaaca2100tcacaactgg caatcacttc cagtttaata tcagttcagc ttctaggggt gttcatttgg2160tttggtgttg atccacccaa catcatcata gactacgatg aacacaagac aatgaaccct2220gagcaagcca gaggggttct caagtgtgac attacagatc tccaaatcat ttgctccttg2280ggatatagca ttcttctcat ggtcacatgt actgtgtatg ccatcaagac tcggggtgta2340cccgagaatt ttaacgaagc caagcccatt ggattcacta tgtacacgac atgtatagta2400tggcttgcct tcattccaat tttttttggc accgctcaat cagcggaaaa gctctacata2460caaactacca cgcttacaat ctccatgaac ctaagtgcat cagtggcgct ggggatgcta2520tacatgccga aagtgtacat catcattttc caccctgaac tcaatgtcca gaaacggaag2580cgaagcttca aggcggtagt cacagcagcc accatgtcat cgaggctgtc acacaaaccc2640agtgacagac ccaacggtga ggcaaagacc gagctctgtg aaaacgtaga cccaaacagc2700cctgctgcaa aaaagaagta tgtcagttat aataacctgg ttatctaa 2748<210>67<211>915
            
<212>PRT<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>67Met Val Gln Leu Arg Lys Leu Leu Arg Val Leu Thr Leu Met Lys Phe1   5   10  15Pro Cys Cys Val Leu Glu Val Leu Leu Cys Ala Leu Ala Ala Ala Ala20  25  30Arg Gly Gln Glu Met Tyr Ala Pro His Ser Ile Arg Ile Glu Gly Asp35  40  45Val Thr Leu Gly Gly Leu Phe Pro Val His Ala Lys Gly Pro Ser Gly50  55  60Val Pro Cys Gly Asp Ile Lys Arg Glu Asn Gly Ile His Arg Leu Glu65  70  75  80Ala Met Leu Tyr Ala Leu Asp Gln Ile Asn Ser Asp Pro Asn Leu Leu85  90  95Pro Asn Val Thr Leu Gly Ala Arg Ile Leu Asp Thr Cys Ser Arg Asp100 105 110Thr Tyr Ala Leu Glu Gln Ser Leu Thr Phe Val Gln Ala Leu Ile Gln115 120 125Lys Asp Thr Ser Asp Val Arg Cys Thr Asn Gly Glu Pro Pro Val Phe130 135 140Val Lys Pro Glu Lys Val Val Gly Val Ile Gly Ala Ser Gly Ser Ser145 150 155 160
            
Val Ser Ile Met Val Ala Asn Ile Leu Arg Leu Phe Gln Ile Pro Gln165 170 175Ile Ser Tyr Ala Ser Thr Ala Pro Glu Leu Ser Asp Asp Arg Arg Tyr180 185 190Asp Phe Phe Ser Arg Val Val Pro Pro Asp Ser Phe Gln Ala Gln Ala195 200 205Met Val Asp Ile Val Lys Ala Leu Gly Trp Asn Tyr Val Ser Thr Leu210 215 220Ala Ser Glu Gly Ser Tyr Gly Glu Lys Gly Val Glu Ser Phe Thr Gln225 230 235 240Ile Ser Lys Glu Ala Gly Gly Leu Cys Ile Ala Gln Ser Val Arg Ile245 250 255Pro Gln Glu Arg Lys Asp Arg Thr Ile Asp Phe Asp Arg Ile Ile Lys260 265 270Gln Leu Leu Asp Thr Pro Asn Ser Arg Ala Val Val Ile Phe Ala Asn275 280  285Asp Glu Asp Ile Lys Gln Ile Leu Ala Ala Ala Lys Arg Ala Asp Gln290 295 300Val Gly His Phe Leu Trp Val Gly Ser Asp Ser Trp Gly Ser Lys Ile305 310 315 320Asn Pro Leu His Gln His Glu Asp Ile Ala Glu Gly Ala Ile Thr Ile325 330 335Gln Pro Lys Arg Ala Thr Val Glu Gly Phe Asp Ala Tyr Phe Thr Ser340 345 350
            
Arg Thr Leu Glu Asn Asn Arg Arg Asn Val Trp Phe Ala Glu Tyr Trp355 360 365Glu Glu Asn Phe Asn Cys Lys Leu Thr Ile Ser Gly Ser Lys Lys Glu370 375 380Asp Thr Asp Arg Lys Cys Thr Gly Gln Glu Arg Ile Gly Lys Asp Ser385 390 395 400Asn Tyr Glu Gln Glu Gly Lys Val Gln Phe Val Ile Asp Ala Val Tyr405 410 415Ala Met Ala His Ala Leu His His Met Asn Lys Asp Leu Cys Ala Asp420 425 430Tyr Arg Gly Val Cys Pro Glu Met Glu Gln Ala Gly Gly Lys Lys Leu435 440 445Leu Lys Tyr Ile Arg Asn Val Asn Phe Asn Gly Ser Ala Gly Thr Pro450 455 460Val Met Phe Asn Lys Asn Gly Asp Ala Pro Gly Arg Tyr Asp Ile Phe465 470 475 480Gln Tyr Gln Thr Thr Asn Thr Ser Asn Pro Gly Tyr Arg Leu Ile Gly485 490 495Gln Trp Thr Asp Glu Leu Gln Leu Asn Ile Glu Asp Met Gln Trp Gly500 505 510Lys Gly Val Arg Glu Ile Pro Ala Ser Val Cys Thr Leu Pro Cys Lys515 520 525Pro Gly Gln Arg Lys Lys Thr Gln Lys Gly Thr Pro Cys Cys Trp Thr530 535 540
            
Cys Glu Pro Cys Asp Gly Tyr Gln Tyr Gln Phe Asp Glu Met Thr Cys545 550 555 560Gln His Cys Pro Tyr Asp Gln Arg Pro Asn Glu Asn Arg Thr Gly Cys565 570 575Gln Asp Ile Pro Ile Ile Lys Leu Glu Trp His Ser Pro Ser Ala Val580 585 590Ile Pro Val Phe Leu Ala Met Leu Gly Ile Ile Ala Thr Ile Phe Val595 600 605Met Ala Thr Phe Ile Arg Tyr Asn Asp Thr Pro Ile Val Arg Ala Ser610 615 620Gly Arg Glu Leu Ser Tyr Val Leu Leu Thr Gly Ile Phe Leu Cys Tyr625 630 635 640Ile Ile Thr Phe Leu Met Ile Ala Lys Pro Asp Val Ala Val Cys Ser645 650 655Phe Arg Arg Val Phe Leu Gly Leu Gly Met Cys Ile Ser Tyr Ala Ala660 665 670Leu Leu Thr Lys Thr Asn Arg Ile Tyr Arg Ile Phe Glu Gln Gly Lys675 680 685Lys Ser Val Thr Ala Pro Arg Leu Ile Ser Pro Thr Ser Gln Leu Ala690 695 700Ile Thr Ser Ser Leu Ile Ser Val Gln Leu Leu Gly Val Phe Ile Trp705 710 715 720Phe Gly Val Asp Pro Pro Asn Ile Ile Ile Asp Tyr Asp Glu His Lys725 730 735
            
Thr Met Asn Pro Glu Gln Ala Arg Gly Val Leu Lys Cys Asp Ile Thr740 745 750Asp Leu Gln Ile Ile Cys Ser Leu Gly Tyr Ser Ile Leu Leu Met Val755 760 765Thr Cys Thr Val Tyr Ala Ile Lys Thr Arg Gly Val Pro Glu Asn Phe770 775 780Asn Glu Ala Lys Pro Ile Gly Phe Thr Met Tyr Thr Thr Cys Ile Val785 790 795 800Trp Leu Ala Phe Ile Pro Ile Phe Phe Gly Thr Ala Gln Ser Ala Glu805 810 815Lys Leu Tyr Ile Gln Thr Thr Thr Leu Thr Ile Ser Met Asn Leu Ser820 825 830Ala Ser Val Ala Leu Gly Met Leu Tyr Met Pro Lys Val Tyr Ile Ile835 840 845Ile Phe His Pro Glu Leu Asn Val Gln Lys Arg Lys Arg Ser Phe Lys850 855 860Ala Val Val Thr Ala Ala Thr Met Ser Ser Arg Leu Ser His Lys Pro865 870 875 880Ser Asp Arg Pro Asn Gly Glu Ala Lys Thr Glu Leu Cys Glu Asn Val885 890 895Asp Pro Asn Ser Pro Ala Ala Lys Lys Lys Tyr Val Ser Tyr Asn Asn900 905 910Leu Val Ile915
            
<210>68<211>2748<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>68atggtccagc tgaggaagct gctccgcgtc ctgactttga tgaagttccc ctgctgcgtg60ctggaggtgc tcctgtgcgc gctggcggcg gcggcgcgcg gccaggagat gtacgccccg120cactcaatcc ggatcgaggg ggacgtcacc ctcggggggc tgttccccgt gcacgccaag180ggtcccagcg gagtgccctg cggcgacatc aagagggaaa acgggatcca caggctggaa240gcgatgctct acgccctgga ccagatcaac agtgatccca acctactgcc caacgtgacg300ctgggcgcgc ggatcctgga cacttgttcc agggacactt acgcgctcga acagtcgctt360actttcgtcc aggcgctcat ccagaaggac acctccgacg tgcgctgcac caacggcgaa420ccgccggttt tcgtcaagcc ggagaaagta gttggagtga ttggggcttc ggggagttcg480gtctccatca tggtagccaa catcctgagg ctcttccaga tcccccagat tagttatgca540tcaacggcac ccgagctaag tgatgaccgg cgctatgact tcttctctcg cgtggtgcca600cccgattcct tccaagccca ggccatggta gacattgtaa aggccctagg ctggaattat660gtgtctaccc tcgcatcgga aggaagttat ggagagaaag gtgtggagtc cttcacgcag720atttccaaag aggcaggtgg actctgcatt gcccagtccg tgagaatccc ccaggaacgc780aaagacagga ccattgactt tgatagaatt atcaaacagc tcctggacac ccccaactcc840agggccgtcg tgatttttgc caacgatgag gatataaagc agatccttgc agcagccaaa900agagctgacc aagttggcca ttttctttgg gtgggatcag acagctgggg atccaaaata960aacccactgc accagcatga agatatcgca gaaggggcca tcaccattca gcccaagcga1020gccacggtgg aagggtttga tgcctacttt acgtcccgta cacttgaaaa caacagaaga1080aatgtatggt ttgccgaata ctgggaggaa aacttcaact gcaagttgac gattagtggg1140tcaaaaaaag aagacacaga tcgcaaatgc acaggacagg agagaattgg aaaagattcc1200
            
aactatgagc aggagggtaa agtccagttc gtgattgacg cagtctatgc tatggctcac1260gcccttcacc acatgaacaa ggatctctgt gctgactacc ggggtgtctg cccagagatg1320gagcaagctg gaggcaagaa gttgctgaag tatatacgca atgttaattt caatggtagt1380gctggcactc cagtgatgtt taacaagaac ggggatgcac ctgggcgtta tgacatcttt1440cagtaccaga ccacaaacac cagcaacccg ggttaccgtc tgatcgggca gtggacagac1500gaacttcagc tcaatataga agacatgcag tggggtaaag gagtccgaga gatacccgcc1560tcagtgtgca cactaccatg taagccagga cagagaaaga agacacagaa aggaactcct1620tgctgttgga cctgtgagcc ttgcgatggt taccagtacc agtttgatga gatgacatgc1680cagcattgcc cctatgacca gaggcccaat gaaaatcgaa ccggatgcca ggatattccc1740atcatcaaac tggagtggca ctccccctgg gctgtgattc ctgtcttcct ggcaatgttg1800gggatcattg ccaccatctt tgtcatggcc actttcatcc gctacaatga cacgcccatt1860gtccgggcat ctgggcggga actcagctat gttcttttga cgggcatctt tctttgctac1920atcatcactt tcctgatgat tgccaaacca gatgtggcag tgtgttcttt ccggcatgtt1980ttcttgggct tgggtatgtg catcagttat gcagccctct tgacgaaaac aaatcggatt2040tatcgcatat ttgagcaggg caagaaatca gtaacagctc ccagactcat aagcccaaca2100tcacaactgg caatcacttc cagtttaata tcagttcagc ttctaggggt gttcatttgg2160tttggtgttg atccacccaa catcatcata gactacgatg aacacaagac aatgaaccct2220gagcaagcca gaggggttct caagtgtgac attacagatc tccaaatcat ttgctccttg2280ggatatagca ttcttctcat ggtcacatgt actgtgtatg ccatcaagac tcggggtgta2340cccgagaatt ttaacgaagc caagcccatt ggattcacta tgtacacgac atgtatagta2400tggcttgcct tcattccaat tttttttggc accgctcaat cagcggaaaa gctctacata2460caaactacca cgcttacaat ctccatgaac ctaagtgcat cagtggcgct ggggatgcta2520tacatgccga aagtgtacat catcattttc caccctgaac tcaatgtcca gaaacggaag2580cgaagcttca aggcggtagt cacagcagcc accatgtcat cgaggctgtc acacaaaccc2640
            
agtgacagac ccaacggtga ggcaaagacc gagctctgtg aaaacgtaga cccaaacagc2700cctgctgcaa aaaagaagta tgtcagttat aataacctgg ttatctaa 2748<210>69<211>915<212>PRT<213>未知<220>
            
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tggcttgcct tcattccaat tttttttggc accgctcaat cagcggaaaa gctctacata2460caaactacca cgcttacaat ctccatgaac ctaagtgcat cagtggcgct ggggatgcta2520tacatgccga aagtgtacat catcattttc caccctgaac tcaatgtcca gaaacggaag2580cgaagcttca aggcggtagt cacagcagcc accatgtcat cgaggctgtc acacaaaccc2640agtgacagac ccaacggtga ggcaaagacc gagctctgtg aaaacgtaga cccaaacagc2700cctgctgcaa aaaagaagta tgtcagttat aataacctgg ttatctaa 2748<210>71<211>915<212>PRT<213>未知<220>
            
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atttccaaag aggcaggtgg actctgcatt gcccagtccg tgagaatccc ccaggaacgc780aaagacagga ccattgactt tgatagaatt atcaaacagc tcctggacac ccccaactcc840agggccgtcg tgatttttgc caacgatgag gatataaagc agatccttgc agcagccaaa900agagctgacc aagttggcca ttttctttgg gtgggatcag acagctgggg atccaaaata960aacccactgc accagcatga agatatcgca gaaggggcca tcaccattca gcccaagcga1020gccacggtgg aagggtttga tgcctacttt acgtcccgta cacttgaaaa caacagaaga1080aatgtatggt ttgccgaata ctgggaggaa aacttcaact gcaagttgac gattagtggg1140tcaaaaaaag aagacacaga tcgcaaatgc acaggacagg agagaattgg aaaagattcc1200aactatgagc aggagggtaa agtccagttc gtgattgacg cagtctatgc tatggctcac1260gcccttcacc acatgaacaa ggatctctgt gctgactacc ggggtgtctg cccagagatg1320gagcaagctg gaggcaagaa gttgctgaag tatatacgca atgttaattt caatggtagt1380gctggcactc cagtgatgtt taacaagaac ggggatgcac ctgggcgtta tgacatcttt1440cagtaccaga ccacaaacac cagcaacccg ggttaccgtc tgatcgggca gtggacagac1500gaacttcagc tcaatataga agacatgcag tggggtaaag gagtccgaga gatacccgcc1560tcagtgtgca cactaccatg taagccagga cagagaaaga agacacagaa aggaactcct1620tgctgttgga cctgtgagcc ttgcgatggt taccagtacc agtttgatga gatgacatgc1680cagcattgcc cctatgacca gaggcccaat gaaaatcgaa ccggatgcca ggatattccc1740atcatcaaac tggagtggca ctccccctgg gctgtgattc ctgtcttcct ggcaatgttg1800gggatcattg ccaccatctt tgtcatggcc actttcatcc gctacaatga cacgcccatt1860gtccgggcat ctgggcggga actcagctat gttcttttga cgggcatctt tctttgctac1920atcatcactt tcctgatgat tgccaaacca gatgtggcag tgtgttcttt ccggcgagtt1980ttcttgggct tgggtatgtg catcagttat gcagccctct tgacgaaaac aaatcggatt2040tatcgcatat ttgagcaggg caagaaatca gtaacagctc ccagactcat aagcccaaca2100tcacaactgg caatcacttc cagtttaata tcagttcagc ttctaggggt gttcatttgg2160
            
tttggtgttg atccacccaa catcatcata gactacgatg aacacaagac aatgaaccct2220gagcaagcca gaggggttct caagtgtgac attacagatc tccaaatcat ttgctccttg2280ggatatagca ttcttctcat ggtcacatgt actgtgtatg ccatcaagac tcggggtgta2340cccgagaatt ttaacgaagc caagcccaag ggattcacta tgtacacgac atgtatagta2400tggcttgcct tcattccaat tttttttggc accgctcaat cagcggaaaa gctctacata2460caaactacca cgcttacaat ctccatgaac ctaagtgcat cagtggcgct ggggatgcta2520tacatgccga aagtgtacat catcattttc caccctgaac tcaatgtcca gaaacggaag2580cgaagcttca aggcggtagt cacagcagcc accatgtcat cgaggctgtc acacaaaccc2640agtgacagac ccaacggtga ggcaaagacc gagctctgtg aaaacgtaga cccaaacagc2700cctgctgcaa aaaagaagta tgtcagttat aataacctgg ttatctaa 2748<210>73<211>915<212>PRT<213>未知<220>
            
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atttccgggc gtagccagga gcagagtgtg aagacagtcc ccggagccag cgatcttttt540tactggccaa ggagagccgg gaaactccag ggttcccacc acaagcccct gtccaagacg600gccaatggac tggcggggca cgaagggtgg acaattgcac tcccgggccg ggcgctggcc660cagaatggat ccttgggtga aggaatccat gagcctgggg gtccccgccg gggaaacagc720acgaaccggc gtgtgagact gaagaacccc ttctacccgc tgacccagga gtcctatgga780gcctacgcgg tcatgtgtct gtccgtggtg atcttcggga ccggcatcat tggcaacctg840gcggtgatgt gcatcgtgtg ccacaactac tacatgcgga gcatctccaa ctccctcttg900gccaacctgg ccttctggga ctttctcatc atcttcttct gccttccgct ggtcatcttc960cacgagctga ccaagaagtg gctgctggag gacttctcct gcaagatcgt gccctatata1020gaggtcgctt ctctgggagt caccaccttc acccgatgtg ctctgtgcat agaccgcttc1080cgtgctgcca ccaacgtaca gatgtactac gaaatgatcg aaaactgttc ctcaacaact1140gccaaacttg ctgttatatg ggtgggagct ctattgttag cacttccaga agttgttctc1200cgccagctga gcaaggagga tttggggttt agtggccgag ctccggcaga aaggtgcatt1260attaagatct ctcctgattt accagacacc atctatgttc tagccctcac ctacgacagt1320gcgagactgt ggtggtattt tggctgttac ttttgtttgc ccacgctttt caccatcacc1380tgctctctag tgactgcgag gaaaatccgc aaagcagaga aagcctgtac ccgagggaat1440aaacggcaga ttcaactaga gagtcagatg aactgtacag tagtggcact gaccatttta1500tatggatttt gcattattcc tgaaaatatc tgcaacattg ttactgccta catggctaca1560ggggtttcac agcagacaat ggacctcctt aatatcatca gccagttcct tttgttcttt1620aagtcctgtg tcaccccagt cctccttttc tgtctctgca aacccttcag tcgggccttc1680atggagtgct gctgctgttg ctgtgaggaa tgcattcaga agtcttcaac ggtgaccagt1740gatgacaatg acaacgagta caccacggaa ctcgaactct cgcctttcag taccatacgc1800cgtgaaatgt ccacttttgc ttctgtcgga actcattgct ga   1842
            
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gccaatggac tggcggggca cgaagggtgg acaattgcac tcccgggccg ggcgctggcc660cagaatggat ccttgggtga aggaatccat gagcctgggg gtccccgccg gggaaacagc720acgaaccggc gtgtgagact gaagaacccc ttctacccgc tgacccagga gtcctatgga780gcctacgcgg tcatgtgtct gtccgtggtg atcttcggga ccggcatcat tggcaacctg840gcggtgatgt gcatcgtgtg ccacaactac tacatgcgga gcatctccaa ctccctcttg900gccaacctgg ccttctggga ctttctcatc atcttcttct gccttccgct ggtcatcttc960cacgagctga ccaagaagtg gctgctggag gacttctcct gcaagatcgt gccctatata1020gaggtcgctt ctctgggagt caccaccttc accttatgtg ctctgtgcat agaccgcttc1080cgtgctgcca ccaacgtaca gatgtactac gaaatgatcg aaaactgttc ctcaacaact1140gccaaacttg ctgttatatg ggtgggagct ctattgttag cacttccaga agttgttctc1200cgccagctga gcaaggagga tttggggttt agtggccgag ctccggcaga aaggtgcatt1260attaagatct ctcctgattt accagacacc atctatgttc tagccctcac ctacgacagt1320gcgagactgt ggtggtattt tggctgttac ttttgtttgc ccacgctttt caccatcacc1380tgctctctag tgactgcgag gaaaatccgc aaagcagaga aagcctgtac ccgagggaat1440aaacggcaga ttcaactaga gagtcagatg aactgtacag tagtggcact gaccatttta1500tatggatttt gcattattcc tgaaaatatc tgcaacattg ttactgccta catggctaca1560ggggtttcac agcagacaat ggacctcctt aatatcatca gccagttcct tttgttcttt1620aagtcctatg tcaccccagt cctccttttc tgtctctgca aacccttcag tcgggccttc1680atggagtgct gctgctgttg ctgtgaggaa tgcattcaga agtcttcaac ggtgaccagt1740gatgacaatg acaacgagta caccacggaa ctcgaactct cgcctttcag taccatacgc1800cgtgaaatgt ccacttttgc ttctgtcgga actcattgct ga   1842<210>77<211>613<212>PRT<213>未知
            
<220>
            
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ctcatctggg gctattcggc ggtcgccgct ctgcctctct gcgtcttctt tcgagtcgtc540ccgcaacggc tccccggcgc cgaccaggaa atttcgattt gcacactgat ttggcccacc600attcctggag agatctcgtg ggatgtctct tttgttactt tgaacttctt ggtgccagga660ctggtcattg tgatcagtta ctccaaaatt ttacagatca caaaggcatc aaggaagagg720ctcacggtaa gcctggccta ctcggagagc caccagatcc gcgtgtccca gcaggacttc780cggctcttcc gcaccctctt cctcctcatg gtctccttct tcatcatgtg gagccccatc840atcatcacca tcctcctcat cctgatccag aacttcaagc aagacctggt catctggccg900tccctcttct tctgggtggt ggccttcaca tttgctaatt cagccctaaa ccccatcctc960tacaacatga cactgtgcag gaatgagtgg aagaaaattt tttgctgctt ctggttccca1020gaaaagggag ccattttaac agacacatct gtcaaaagaa atgacttgtc gattatttct1080ggctaa   1086<210>81<211>361<212>PRT<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>81Met Ser Pro Glu Cys Ala Arg Ala Ala Gly Asp Ala Pro Leu Arg Ser1   5   10  15Leu Glu Gln Ala Asn Arg Thr Arg Phe Pro Phe Phe Ser Asp Val Lys20  25  30Gly Asp His Arg Leu Val Leu Ala Ala Val Glu Thr Thr Val Leu Val35  40  45Leu Ile Phe Ala Val Ser Leu Leu Gly Asn Val Cys Ala Leu Val Leu50  55  60
            
Val Ala Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ala Thr Ala Cys Leu Val Leu Asn65  70  75  80Leu Phe Cys Ala Asp Leu Leu Phe Ile Ser Ala Ile Pro Leu Val Leu85  90  95Ala Val Arg Trp Thr Glu Ala Trp Leu Leu Gly Pro Val Ala Cys His100 105 110Leu Leu Phe Tyr Val Met Thr Leu Ser Gly Ser Val Thr Ile Leu Thr115 120 125Leu Ala Ala Val Ser Leu Asn Arg Met Val Cys Ile Val His Leu Gln130 135 140Arg Gly Val Arg Gly Pro Gly Arg Arg Ala Arg Ala Val Leu Leu Ala145 150 155 160Leu Ile Trp Gly Tyr Ser Ala Val Ala Ala Leu Pro Leu Cys Val Phe165 170 175Phe Arg Val Val Pro Gln Arg Leu Pro Gly Ala Asp Gln Glu Ile Ser180 185 190Ile Cys Thr Leu Ile Trp Pro Thr Ile Pro Gly Glu Ile Ser Trp Asp195 200 205Val Ser Phe Val Thr Leu Asn Phe Leu Val Pro Gly Leu Val Ile Val210 215 220Ile Ser Tyr Ser Lys Ile Leu Gln Ile Thr Lys Ala Ser Arg Lys Arg225 230 235 240Leu Thr Val Ser Leu Ala Tyr Ser Glu Ser His Gln Ile Arg Val Ser245 250 255
            
Gln Gln Asp Phe Arg Leu Phe Arg Thr Leu Phe Leu Leu Met Val Ser260 265 270Phe Phe Ile Met Trp Ser Pro Ile Ile Ile Thr Ile Leu Leu Ile Leu275 280 285Ile Gln Asn Phe Lys Gln Asp Leu Val Ile Trp Pro Ser Leu Phe Phe290 295 300Trp Val Val Ala Phe Thr Phe Ala Asn Ser Ala Leu Asn Pro Ile Leu305 310 315 320Tyr Asn Met Thr Leu Cys Arg Asn Glu Trp Lys Lys Ile Phe Cys Cys325 330 335Phe Trp Phe Pro Glu Lys Gly Ala Ile Leu Thr Asp Thr Ser Val Lys340 345 350Arg Asn Asp Leu Ser Ile Ile Ser Gly355 360<210>82<211>1212<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>82atggcttgca atggcagtgc ggccaggggg cactttgacc ctgaggactt gaacctgact60gacgaggcac tgagactcaa gtacctgggg ccccagcaga cagagctgtt catgcccatc120tgtgccacat acctgctgat cttcgtggtg ggcgctgtgg gcaatgggct gacctgtctg180gtcatcctgc gccacaaggc catgcgcacg cctaccaact actacctctt cagcctggcc240gtgtcggacc tgctggtgct gctggtgggc ctgcccctgg agctctatga gatgtggcac300
            
aactacccct tcctgctggg cgttggtggc tgctatttcc gcacgctact gtttgagatg360gtctgcctgg cctcagtgct caacgtcact gccctgagcg tggaacgcta tgtggccgtg420gtgcacccac tccaggccag gtccatggtg acgcgggccc atgtgcgccg agtgcttggg480gccgtctggg gtcttgccat gctctgctcc ctgcccaaca ccagcctgca cggcatccgg540cagctgcacg tgccctgccg gggcccagtg ccagactcag ctgtttgcat gctggtccgc600ccacgggccc tctacaacat ggtagtgcag accaccgcgc tgctcttctt ctgcctgccc660atggccatca tgagcgtgct ctacctgctc attgggctgc gactgcggcg ggagaggctg720ctgctcatgc aggaggccaa gggcaggggc tctgcagcag ccaggtccag atacacctgc780aggctccagc agcacgatcg gggccggaga caagtgaaaa agatgctgtt tgtcctggtc840gtggtgtttg gcatctgctg ggccccgttc cacgccgacc gcgtcatgtg gagcgtcgtg900tcacagtgga cagatggcct gcacctggcc ttccagcacg tgcacgtcat ctccggcatc960ttcttctacc tgggctcggc ggccaacccc gtgctctata gcctcatgtc cagccgcttc1020cgagagacct tccaggaggc cctgtgcctc ggggcctgct gccatcgcct cagaccccgc1080cacagctccc acagcctcag caggatgacc acaggcagca ccctgtgtga tgtgggctcc1140ctgggcagct gggtccaccc cctggctggg aacgatggcc cagaggcgca gcaagagacc1200gatccatcct ga1212<210>83<211>403<212>PRT<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>83Met Ala Cys Asn Gly Ser Ala Ala Arg Gly His Phe Asp Pro Glu Asp1   5   10  15Leu Asn Leu Thr Asp Glu Ala Leu Arg Leu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln
            
20  25  30Gln Thr Glu Leu Phe Met Pro Ile Cys Ala Thr Tyr Leu Leu Ile Phe35  40  45Val Val Gly Ala Val Gly Asn Gly Leu Thr Cys Leu Val Ile Leu Arg50  55  60His Lys Ala Met Arg Thr Pro Thr Asn Tyr Tyr Leu Phe Ser Leu Ala65  70  75  80Val Ser Asp Leu Leu Val Leu Leu Val Gly Leu Pro Leu Glu Leu Tyr85  90  95Glu Met Trp His Asn Tyr Pro Phe Leu Leu Gly Val Gly Gly Cys Tyr100 105 110Phe Arg Thr Leu Leu Phe Glu Met Val Cys Leu Ala Ser Val Leu Asn115 120 125Val Thr Ala Leu Ser Val Glu Arg Tyr Val Ala Val Val His Pro Leu130 135 140Gln Ala Arg Ser Met Val Thr Arg Ala His Val Arg Arg Val Leu Gly145 150 155 160Ala Val Trp Gly Leu Ala Met Leu Cys Ser Leu Pro Asn Thr Ser Leu165 170 175His Gly Ile Arg Gln Leu His Val Pro Cys Arg Gly Pro Val Pro Asp180 185 190Ser Ala Val Cys Met Leu Val Arg Pro Arg Ala Leu Tyr Asn Met Val195 200 205Val Gln Thr Thr Ala Leu Leu Phe Phe Cys Leu Pro Met Ala Ile Met
            
210 215 220Ser Val Leu Tyr Leu Leu Ile Gly Leu Arg Leu Arg Arg Glu Arg Leu225 230 235 240Leu Leu Met Gln Glu Ala Lys Gly Arg Gly Ser Ala Ala Ala Arg Ser245 250 255Arg Tyr Thr Cys Arg Leu Gln Gln His Asp Arg Gly Arg Arg Gln Val260 265 270Lys Lys Met Leu Phe Val Leu Val Val Val Phe Gly Ile Cys Trp Ala275 280 285Pro Phe His Ala Asp Arg Val Met Trp Ser Val Val Ser Gln Trp Thr290 295 300Asp Gly Leu His Leu Ala Phe Gln His Val His Val Ile Ser Gly Ile305 310 315 320Phe Phe Tyr Leu Gly Ser Ala Ala Asn Pro Val Leu Tyr Ser Leu Met325 330 335Ser Ser Arg Phe Arg Glu Thr Phe Gln Glu Ala Leu Cys Leu Gly Ala340 345 350Cys Cys His Arg Leu Arg Pro Arg His Ser Ser His Ser Leu Ser Arg355 360 365Met Thr Thr Gly Ser Thr Leu Cys Asp Val Gly Ser Leu Gly Ser Trp370 375 380Val His Pro Leu Ala Gly Asn Asp Gly Pro Glu Ala Gln Gln Glu Thr385 390 395 400Asp Pro Ser
            
<210>84<211>930<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>84atgaatggea cctacaacac ctgtggctcc agcgacctca cctggccccc agcgatcaag60ctgggcttet acgcctactt gggcgtcctg ctggtgctag gcctgctgct caacagcctg120gcgctctggg tgttctgctg ccgcatgcag cagtggacgg agacccgcat ctacatgacc180aacctggcgg tggccgacct ctgcctgctg tgcaccttgc ccttcgtgct gcactccctg240cgagacacct cagacacgcc gctgtgccag ctctcccagg gcatctacct gaccaacagg300tacatgagca tcagcctggt cacggccatc gccgtggacc gctatgtggc cgtgcggcac360ccgctgcgtg cccgcgggct gcggtccccc aggcaggctg cggccgtgtg cgcggtcctc420tgggtgctgg tcatcggctc cctggtggct cgctggctcc tggggattca ggagggcggc480ttctgcttca ggagcacccg gcacaatttc aactccatgc ggttcccgct gctgggattc540tacctgcccc tggccgtggt ggtcttctgc tccctgaagg tggtgactgc cctggcccag600aggccaccca ccgacgtggg gcaggcagag gccacccgca aggctaaacg catggtctgg660gccaacctcc tggtgttcgt ggtctgcttc ctgcccctgc acgtggggct gacagtgcgc720ctcgcagtgg gctggaacgc ctgtgccctc ctggagacga tccgtcgcgc cctgtacata780accagcaagc tctcagatgc caactgctgc ctggacgcca tctgctacta ctacatggcc840aaggagttcc aggaggcgtc tgcactggcc gtggctcccc gtgctaaggc ccacaaaagc900caggactctc tgtgcgtgac cctcgcctaa 930<210>85<211>309<212>PRT
            
<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>85Met Asn Gly Thr Tyr Asn Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Thr Trp Pro1   5   10  15Pro Ala Ile Lys Leu Gly Phe Tyr Ala Tyr Leu Gly Val Leu Leu Val20  25  30Leu Gly Leu Leu Leu Asn Ser Leu Ala Leu Trp Val Phe Cys Cys Arg35  40  45Met Gln Gln Trp Thr Glu Thr Arg Ile Tyr Met Thr Asn Leu Ala Val50  55  60Ala Asp Leu Cys Leu Leu Cys Thr Leu Pro Phe Val Leu His Ser Leu65  70  75  80Arg Asp Thr Ser Asp Thr Pro Leu Cys Gln Leu Ser Gln Gly Ile Tyr85  90  95Leu Thr Asn Arg Tyr Met Ser Ile Ser Leu Val Thr Ala Ile Ala Val100 105 110Asp Arg Tyr Val Ala Val Arg His Pro Leu Arg Ala Arg Gly Leu Arg115 120 125Ser Pro Arg Gln Ala Ala Ala Val Cys Ala Val Leu Trp Val Leu Val130 135 140Ile Gly Ser Leu Val Ala Arg Trp Leu Leu Gly Ile Gln Glu Gly Gly145 150 155 160Phe Cys Phe Arg Ser Thr Arg His Asn Phe Asn Ser Met Arg Phe Pro
            
165 170 175Leu Leu Gly Phe Tyr Leu Pro Leu Ala Val Val Val Phe Cys Ser Leu180 185 190Lys Val Val Thr Ala Leu Ala Gln Arg Pro Pro Thr Asp Val Gly Gln195 200 205Ala Glu Ala Thr Arg Lys Ala Lys Arg Met Val Trp Ala Asn Leu Leu210 215 220Val Phe Val Val Cys Phe Leu Pro Leu His Val Gly Leu Thr Val Arg225 230 235 240Leu Ala Val Gly Trp Asn Ala Cys Ala Leu Leu Glu Thr Ile Arg Arg245 250 255Ala Leu Tyr Ile Thr Ser Lys Leu Ser Asp Ala Asn Cys Cys Leu Asp260 265 270Ala Ile Cys Tyr Tyr Tyr Met Ala Lys Glu Phe Gln Glu Ala Ser Ala275 280 285Leu Ala Val Ala Pro Arg Ala Lys Ala His Lys Ser Gln Asp Ser Leu290 295 300Cys Val Thr Leu Ala305<210>86<211>1446<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>86
            
atgcggtggc tgtggcccct ggctgtctct cttgctgtga ttttggctgt ggggctaagc60agggtctctg ggggtgcccc cctgcacctg ggcaggcaca gagccgagac ccaggagcag120cagagccgat ccaagagggg caccgaggat gaggaggcca agggcgtgca gcagtatgtg180cctgaggagt gggcggagta cccccggccc attcaccctg ctggcctgca gccaaccaag240cccttggtgg ccaccagccc taaccccgac aaggatgggg gcaccccaga cagtgggcag300gaactgaggg gcaatctgac aggggcacca gggcagaggc tacagatcca gaaccccctg360tatccggtga ccgagagctc ctacagtgcc tatgccatca tgcttctggc gctggtggtg420tttgcggtgg gcattgtggg caacctgtcg gtcatgtgca tcgtgtggca cagctactac480ctgaagagcg cctggaactc catccttgcc agcctggccc tctgggattt tctggtcctc540tttttctgcc tccctattgt catcttcaac gagatcacca agcagaggct actgggtgac600gtttcttgtc gtgccgtgcc cttcatggag gtctcctctc tgggagtcac gactttcagc660ctctgtgccc tgggcattga ccgcttccac gtggccacca gcaccctgcc caaggtgagg720cccatcgagc ggtgccaatc catcctggcc aagttggctg tcatctgggt gggctccatg780acgctggctg tgcctgagct cctgctgtgg cagctggcac aggagcctgc ccccaccatg840ggcaccctgg actcatgcat catgaaaccc tcagccagcc tgcccgagtc cctgtattca900ctggtgatga cctaccagaa cgcccgcatg tggtggtact ttggctgcta cttctgcctg960cccatcctct tcacagtcac ctgccagctg gtgacatggc gggtgcgagg ccctccaggg1020aggaagtcag agtgcagggc cagcaagcac gagcagtgtg agagccagct caagagcacc1080gtggtgggcc tgaccgtggt ctacgccttc tgcaccctcc cagagaacgt ctgcaacatc1140gtggtggcct acctctccac cgagctgacc cgccagaccc tggacctcct gggcctcatc1200aaccagttct ccaccttctt caagggcgcc atcaccccag tgctgctcct ttgcatctgc1260aggccgctgg gccaggcctt cctggactgc tgctgctgct gctgctgtga ggagtgcggc1320ggggcttcgg aggcctctgc tgccaatggg tcggacaaca agctcaagac cgaggtgtcc1380tcttccatct acttccacaa gcccagggag tcacccccac tcctgcccct gggcacacct1440
            
tgctga 1446<210>87<211>481<212>PRT<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>87Met Arg Trp Leu Trp Pro Leu Ala Val Ser Leu Ala Val Ile Leu Ala1   5   10  15Val Gly Leu Ser Arg Val Ser Gly Gly Ala Pro Leu His Leu Gly Arg20  25  30His Arg Ala Glu Thr Gln Glu Gln Gln Ser Arg Ser Lys Arg Gly Thr35  40  45Glu Asp Glu Glu Ala Lys Gly Val Gln Gln Tyr Val Pro Glu Glu Trp50  55  60Ala Glu Tyr Pro Arg Pro Ile His Pro Ala Gly Leu Gln Pro Thr Lys65  70  75  80Pro Leu Val Ala Thr Ser Pro Asn Pro Asp Lys Asp Gly Gly Thr Pro85  90  95Asp Ser Gly Gln Glu Leu Arg Gly Asn Leu Thr Gly Ala Pro Gly Gln100 105 110Arg Leu Gln Ile Gln Asn Pro Leu Tyr Pro Val Thr Glu Ser Ser Tyr115 120 125Ser Ala Tyr Ala Ile Met Leu Leu Ala Leu Val Val Phe Ala Val Gly130 135 140
            
Ile Val Gly Asn Leu Ser Val Met Cys Ile Val Trp His Ser Tyr Tyr145 150 155 160Leu Lys Ser Ala Trp Asn Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ala Leu Trp Asp165 170 175Phe Leu Val Leu Phe Phe Cys Leu Pro Ile Val Ile Phe Asn Glu Ile180 185 190Thr Lys Gln Arg Leu Leu Gly Asp Val Ser Cys Arg Ala Val Pro Phe195 200 205Met Glu Val Ser Ser Leu Gly Val Thr Thr Phe Ser Leu Cys Ala Leu210 215 220Gly Ile Asp Arg Phe His Val Ala Thr Ser Thr Leu Pro Lys Val Arg225 230 235 240Pro Ile Glu Arg Cys Gln Ser Ile Leu Ala Lys Leu Ala Val Ile Trp245 250 255Val Gly Ser Met Thr Leu Ala Val Pro Glu Leu Leu Leu Trp Gln Leu260 265 270Ala Gln Glu Pro Ala Pro Thr Met Gly Thr Leu Asp Ser Cys Ile Met275 280 285Lys Pro Ser Ala Ser Leu Pro Glu Ser Leu Tyr Ser Leu Val Met Thr290 295 300Tyr Gln Asn Ala Arg Met Trp Trp Tyr Phe Gly Cys Tyr Phe Cys Leu305 310 315 320Pro Ile Leu Phe Thr Val Thr Cys Gln Leu Val Thr Trp Arg Val Arg325 330 335
            
Gly Pro Pro Gly Arg Lys Ser Glu Cys Arg Ala Ser Lys His Glu Gln340 345 350Cys Glu Ser Gln Leu Lys Ser Thr Val Val Gly Leu Thr Val Val Tyr355 360 365Ala Phe Cys Thr Leu Pro Glu Asn Val Cys Asn Ile Val Val Ala Tyr370 375 380Leu Ser Thr Glu Leu Thr Arg Gln Thr Leu Asp Leu Leu Gly Leu Ile385 390 395 400Asn Gln Phe Ser Thr Phe Phe Lys Gly Ala Ile Thr Pro Val Leu Leu405 410 415Leu Cys Ile Cys Arg Pro Leu Gly Gln Ala Phe Leu Asp Cys Cys Cys420 425 430Cys Cys Cys Cys Glu Glu Cys Gly Gly Ala Ser Glu Ala Ser Ala Ala435 440 445Asn Gly Ser Asp Asn Lys Leu Lys Thr Glu Val Ser Ser Ser Ile Tyr450 455 460Phe His Lys Pro Arg Glu Ser Pro Pro Leu Leu Pro Leu Gly Thr Pro465 470 475 480Cys<210>88<211>6<212>PRT<213>未知<220>
            
<223>新序列
            
<400>88Thr Leu Glu Ser Ile Met1   5<210>89<211>5<212>PRT<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>89Glu Tyr Asn Leu Val1   5<210>90<211>5<212>PRT<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>90Asp Cys Gly Leu Phe1   5<210>91<211>34<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>91gatcaagctt ccatggcgtg ctgcctgagc gagg  34<210>92
            
<211>53<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>92gatcggatcc ttagaacagg ccgcagtcct tcaggttcag ctgcaggatg gtg 53<210>93<211>5<212>PRT<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>93Gln Tyr Glu Leu Leu1   5<210>94<211>5<212>PRT<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>94Asp Cys Gly Leu Phe1   5<210>95<211>1185<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>95
            
atgggctgcc tcggcaacag taagaccgag gaccagcgca acgaggagaa ggcgcagcgc60gaggccaaca aaaagatcga gaagcagctg cagaaggaca agcaggtcta ccgggccacg120caccgcctgc tgctgctggg tgctggagag tctggcaaaa gcaccattgt gaagcagatg180aggatcctac atgttaatgg gtttaacgga gagggcggcg aagaggaccc gcaggctgca240aggagcaaca gcgatggtga gaaggccacc aaagtgcagg acatcaaaaa caacctgaag300gaggccattg aaaccattgt ggccgccatg agcaacctgg tgccccccgt ggagctggcc360aaccctgaga accagttcag agtggactac attctgagcg tgatgaacgt gccaaacttt420gacttcccac ctgaattcta tgagcatgcc aaggctctgt gggaggatga gggagttcgt480gcctgctacg agcgctccaa cgagtaccag ctgatcgact gtgcccagta cttcctggac540aagattgatg tgatcaagca ggccgactac gtgccaagtg accaggacct gcttcgctgc600cgcgtcctga cctctggaat ctttgagacc aagttccagg tggacaaagt caacttccac660atgttcgatg tgggcggcca gcgcgatgaa cgccgcaagt ggatccagtg cttcaatgat720gtgactgcca tcatcttcgt ggtggccagc agcagctaca acatggtcat ccgggaggac780aaccagacca accgtctgca ggaggctctg aacctcttca agagcatctg gaacaacaga840tggctgcgta ccatctctgt gatcctcttc ctcaacaagc aagatctgct tgctgagaag900gtcctcgctg ggaaatcgaa gattgaggac tactttccag agttcgctcg ctacaccact960cctgaggatg cgactcccga gcccggagag gacccacgcg tgacccgggc caagtacttc1020atccgggatg agtttctgag aatcagcact gctagtggag atggacgtca ctactgctac1080cctcacttta cctgcgccgt ggacactgag aacatccgcc gtgtcttcaa cgactgccgt1140gacatcatcc agcgcatgca tcttcgcgac tgcgggctgt tttaa1185<210>96<211>393<212>PRT<213>未知<220>
            
<223>新序列
            
<400> 96Met Gly Cys Leu Gly Asn Ser Lys Thr Glu Asp Gln Arg Asn Glu Glu1   5   10  15Lys Ala Gln Arg Glu Ala Asn Lys Lys Ile Glu Lys Gln Leu Gln Lys20  25  30Asp Lys Gln Val Tyr Arg Ala Thr His Arg Leu Leu Leu Leu Gly Ala35  40  45Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr Ile Val Lys Gln Met Arg Ile Leu His50  55  60Val Asn Gly Phe Asn Gly Glu Gly Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Ala65  70  75  80Arg Ser Asn Ser Asp Gly Glu Lys Ala Thr Lys Val Gln Asp Ile Lys85  90  95Asn Asn Leu Lys Glu Ala Ile Glu Thr Ile Val Ala Ala Ser Asn Leu100 105 110Val Pro Pro Val Glu Leu Ala Asn Pro Glu Asn Gln Phe Arg Val Asp115 120 125Tyr Ile Leu Ser Val Met Asn Val Pro Asn Phe Asp Phe Pro Pro Glu130 135 140Phe Tyr Glu His Ala Lys Ala Leu Trp Glu Asp Glu Gly Val Arg Ala145 150 155 160Cys Tyr Glu Arg Ser Asn Glu Tyr Gln Leu Ile Asp Cys Ala Gln Tyr165 170 175Phe Leu Asp Lys Ile Asp Val Ile Lys Gln Ala Asp Tyr Val Pro Ser
            
180 185 190Asp Gln Asp Leu Leu Arg Cys Arg Val Leu Thr Ser Gly Ile Phe Glu195 200 205Thr Lys Phe Gln Val Asp Lys Val Asn Phe His Met Phe Asp Val Gly210 215 220Gly Gln Arg Asp Glu Arg Arg Lys Trp Ile Gln Cys Phe Asn Asp Val225 230 235 240Thr Ala Ile Ile Phe Val Val Ala Ser Ser Ser Tyr Asn Met Val Ile245 250 255Arg Glu Asp Asn Gln Thr Asn Arg Leu Gln Glu Ala Leu Asn Leu Phe260 265 270Lys Ser Ile Trp Asn Asn Arg Trp Leu Arg Thr Ile Ser Val Ile Leu275 280 285Phe Leu Asn Lys Gln Asp Leu Leu Ala Glu Lys Val Leu Ala Gly Lys290 295 300Ser Lys Ile Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Phe Ala Arg Tyr Thr Thr Pro305 310 315 320Glu Asp Ala Thr Pro Glu Pro Gly Glu Asp Pro Arg Val Thr Arg Ala325 330 335Lys Tyr Phe Ile Arg Asp Glu Phe Leu Arg Ile Ser Thr Ala Ser Gly340 345 350Asp Gly Arg His Tyr Cys Tyr Pro His Phe Thr Cys Ala Val Asp Thr355 360 365Glu Asn Ile Arg Arg Val Phe Asn Asp Cys Arg Asp Ile Ile Gln Arg
            
370 375380Met His Leu Arg Asp Cys Gly Leu Phe385 390<210>97<211>1014<212>DNA<213>人<400>97atgaactcgt gggacgcggg cctggcgggg ctactggtgg gcacgatggg cgtctcgctg60ctgtccaacg cgctggtgct gctctgcctg ctgcacagcg cggacatccg ccgccaggcg120ccggcgctct tcaccctgaa cctcacgtgc gggaacctgc tgtgcaccgt ggtcaacatg180ccgctcacgc tggccggcgt cgtggcgcag cggcagccgg cgggcgaccg cctgtgccgc240ctggctgcct tcctcgacac cttcctggct gccaactcca tgctcagcat ggccgcgctc300agcatcgacc gctgggtggc cgtggtcttc ccgctgagct accgggccaa gatgccgcct360ccgagatgcg cgctcatcct ggcctacacg tggctgcacg cgctcacctt cccagccgcc420gcgctcgccc tgtcctggct cggcttccac cagctgtacg cctcgtgcac gctgtgcagc480cggcggccgg acgagcgcct gcgcttcgcc gtattcactg gcgccttcca cgctctcagc540ttcctgctct ccttcgtcgt gctctgctgc acgtacctca aggtgctcaa ggtggcccgc600ttccattgca agcgcatcga cgtgatcacc atgcagacgc tcgtgctgct ggtggacctg660caccccagtg tgcgggaacg ctgtctggag gagcagaagc ggaggcgaca gcgagccacc720aagaagatca gcaccttcat agggaccttc cttgtgtgct tcgcgcccta tgtgatcacc780aggctagtgg agctcttctc cacggtgccc atcggctccc actggggggt gctgtccaag840tgcttggcgt acagcaaggc cgcatccgac ccctttgtgt actccttact gcgacaccag900taccgcaaaa gctgcaagga gattctgaac aggctcctgc acagacgctc catccactcc960tctggcctca caggcgactc tcacagccag aacattctgc cggtgtctga gtga  1014
            
<210>98<211>337<212>PRT<213>人<400>98Met Asn Ser Trp Asp Ala Gly Leu Ala Gly Leu Leu Val Gly Thr Met1   5   10  15Gly Val Ser Leu Leu Ser Asn Ala Leu Val Leu Leu Cys Leu Leu His20  25  30Ser Ala Asp Ile Arg Arg Gln Ala Pro Ala Leu Phe Thr Leu Asn Leu35  40  45Thr Cys Gly Asn Leu Leu Cys Thr Val Val Asn Met Pro Leu Thr Leu50  55  60Ala Gly Val Val Ala Gln Arg Gln Pro Ala Gly Asp Arg Leu Cys Arg65  70  75  80Leu Ala Ala Phe Leu Asp Thr Phe Leu Ala Ala Asn Ser Met Leu Ser85  90  95Met Ala Ala Leu Ser Ile Asp Arg Trp Val Ala Val Val Phe Pro Leu100 105 110Ser Tyr Arg Ala Lys Met Pro Pro Pro Arg Cys Ala Leu Ile Leu Ala115 120 125Tyr Thr Trp Leu His Ala Leu Thr Phe Pro Ala Ala Ala Leu Ala Leu130 135 140Ser Trp Leu Gly Phe His Gln Leu Tyr Ala Ser Cys Thr Leu Cys Ser145 150 155 160Arg Arg Pro Asp Glu Arg Leu Arg Phe Ala Val Phe Thr Gly Ala Phe
            
165 170 175His Ala Leu Ser Phe Leu Leu Ser Phe Val Val Leu Cys Cys Thr Tyr180 185 190Leu Lys Val Leu Lys Val Ala Arg Phe His Cys Lys Arg Ile Asp Val195 200 205Ile Thr Met Gln Thr Leu Val Leu Leu Val Asp Leu His Pro Ser Val210 215 220Arg Glu Arg Cys Leu Glu Glu Gln Lys Arg Arg Arg Gln Arg Ala Thr225 230 235 240Lys Lys Ile Ser Thr Phe Ile Gly Thr Phe Leu Val Cys Phe Ala Pro245 250 255Tyr Val Ile Thr Arg Leu Val Glu Leu Phe Ser Thr Val Pro Ile Gly260 265 270Ser His Trp Gly Val Leu Ser Lys Cys Leu Ala Tyr Ser Lys Ala Ala275 280 285Ser Asp Pro Phe Val Tyr Ser Leu Leu Arg His Gln Tyr Arg Lys Ser290 295 300Cys Lys Glu Ile Leu Asn Arg Leu Leu His Arg Arg Ser Ile His Ser305 310 315 320Ser Gly Leu Thr Gly Asp Ser His Ser Gln Asn Ile Leu Pro Val Ser325 330 335Glu<210>99
            
<211>21<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>99cgagaaggtg ctcaaggtgg c 21<210>100<211>30<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>100gagaagagct ccactagcct ggtgatcaca30<210>101<211>36<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>101gaattcatga actcgtggga cgcgggcctg gcgggc 36<210>102<211>32<212>DNA<213>未知<220>
            
<223>新序列<400>102ctcgagtcac tcagacaccg gcagaatgtt ct 3權利要求
            
1.一種由SEQ ID NO.2的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體。
            
2.權利要求1所述的G蛋白偶聯受體的非內源性組成型活化形式。
            
3.一種含有載體和SEQ ID NO.1的cDNA的質粒。
            
4.一種含有權利要求3所述質粒的宿主細胞。
            
5.一種由SEQ ID NO.4的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體。
            
6.權利要求5所述的G蛋白偶聯受體的非內源性組成型活化形式。
            
7.一種含有載體和SEQ ID NO.3的cDNA的質粒。
            
8.一種含有權利要求7所述質粒的宿主細胞。
            
9.一種由SEQ ID NO.6的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體。
            
10.權利要求9所述的G蛋白偶聯受體的非內源性組成型活化形式。
            
11.一種含有載體和SEQ ID NO.5的cDNA的質粒。
            
12.一種含有權利要求11所述質粒的宿主細胞。
            
13.一種由SEQ ID NO.8的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體。
            
14.權利要求13所述的G蛋白偶聯受體的非內源性組成型活化形式。
            
15.一種含有載體和SEQ ID NO.7的cDNA的質粒。
            
16.一種含有權利要求15所述質粒的宿主細胞。
            
17.一種由SEQ ID NO.10的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體。
            
18.權利要求17所述的G蛋白偶聯受體的非內源性組成型活化形式。
            
19.一種含有載體和SEQ ID NO.9的cDNA的質粒。
            
20.一種含有權利要求19所述質粒的宿主細胞。
            
21.一種由SEQ ID NO.12的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體。
            
22.權利要求21所述的G蛋白偶聯受體的非內源性組成型活化形式。
            
23.一種含有載體和SEQ ID NO.11的cDNA的質粒。
            
24.一種含有權利要求23所述質粒的宿主細胞。
            
25.一種由SEQ ID NO.14的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體。
            
26.權利要求25所述的G蛋白偶聯受體的非內源性組成型活化形式。
            
27.一種含有載體和SEQ ID NO.13的cDNA的質粒。
            
28.一種含有權利要求27所述質粒的宿主細胞。
            
29.一種由SEQ ID NO.16的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體。
            
30.權利要求29所述的G蛋白偶聯受體的非內源性組成型活化形式。
            
31.一種含有載體和SEQ ID NO.15的cDNA的質粒。
            
32.一種含有權利要求31所述質粒的宿主細胞。
            
33.一種由SEQ ID NO.18的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯受體。
            
34.權利要求33所述的G蛋白偶聯受體的非內源性組成型活化形式。
            
35.一種含有載體和SEQ ID NO.17的cDNA的質粒。
            
36.一種含有權利要求35所述質粒的宿主細胞。
            
全文摘要
            
本專利文件公開的發明涉及具有顯著活性的跨膜受體，更具體而言，涉及人G蛋白偶聯受體和人GPCR的突變(非內源性)形式。
            
文檔編號C12N15/09GK1516706SQ02808787 
            
公開日2004年7月28日 申請日期2002年2月26日 優先權日2001年2月26日
            
發明者廖王蓁, D·T·查爾默斯, D·P·貝漢, D·馬切耶夫斯基－萊尼奧爾, J·N·萊昂納德, 林伊玲, D·奧爾圖諾,  寂, 幸 蛩夠 萊尼奧爾, 查爾默斯, 萊昂納德, 貝漢 申請人:阿倫納藥品公司
            


                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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