專利名稱：用基于轉錄的擴增來擴增和檢測hbvdna的方法
技術領域：
本發明涉及用于擴增HBV DNA的基于轉錄的擴增方法。
核酸擴增方法應用于分子生物學和重組DNA技術領域。這些方法用于增加特異核酸序列的拷貝數，這些特異核酸序列少量存在并常常存在于同時也存在有多種其他核酸序列(包括RNA和DNA)的環境中。使用核酸擴增方法尤其有助于核酸的檢測和定量，其對于診斷例如傳染病、遺傳病和各種類型的癌癥是重要的。核酸擴增方法也應用于其他領域，在這些領域中研究其中可能微量存在核酸的樣品，例如法醫學、考古學或者確定親權。
已知幾種核酸擴增技術基于不同的作用機制。在歐洲專利申請EP200362和EP 201148中描述了一種核酸擴增的方法，其稱為“聚合酶鏈反應”(PCR)。
本發明涉及一種不同類別的核酸擴增方法，即“基于轉錄的擴增技術”。采用這些方法可以從含有可被RNA聚合酶識別的功能啟動子的DNA模板獲得多重RNA拷貝。將這些RNA拷貝作為目標，從中可以獲得新的DNA模板等等。Gingeras等人在WO 88/10315中和Burg等人在WO 89/1050中描述了這些方法。Davey等人在EP 323822(涉及NASBA方法)中，Gingeras等人在EP 373960中和Kacian等人在EP 408295中描述了基于等溫轉錄的擴增技術。基于轉錄的擴增反應也可以用熱穩定的酶來進行。基于轉錄的擴增通常在大約41攝氏度的溫度進行。熱穩定的酶使得反應能夠在更高的溫度進行。在以ToyoBoseki KK的名義申請的EP 682121中描述了這種熱穩定方法。
EP 323822、EP 373960和EP 408295中描述的方法是等溫連續方法。采用這些方法需要四種酶活性來完成擴增依賴RNA的DNA聚合酶活性、依賴DNA的DNA聚合酶活性、RNA酶(H)活性和RNA聚合酶活性。這些活性中的一些可以聯合在一種酶中，所以通常只有2或3種酶是必需的。逆轉錄酶如AMV(禽成肌細胞瘤病毒)或MMLV(莫洛尼鼠白血病病毒)逆轉錄酶具有依賴RNA和DNA的DNA聚合酶活性以及固有的RNA酶H活性。另外，也可以向基于轉錄的擴增反應的反應混合物中加入RNA酶，例如大腸桿菌(E.coli)RNA酶H。
依賴DNA的RNA聚合酶從含有可被RNA聚合酶識別的啟動子的DNA模板合成多重RNA拷貝。RNA聚合酶的例子為來自大腸桿菌和噬菌體T7、T3和SP6的聚合酶。通常與基于轉錄的擴增方法一起使用的RNA聚合酶的例子為T7聚合酶。因此，結合入用于產生RNA多重拷貝的模板中的啟動子為T7-啟動子。含有啟動子的模板通常必須從含有目標序列的核酸開始來產生。該核酸可能存在于用作擴增反應輸入的起始材料中。在起始材料中存在的核酸通常含有目標序列，該目標序列作為長得多的序列的一部分。額外的核酸序列可以存在于目標序列的3′和5′末端。可以通過將下列物質放在一起來開始擴增反應來自起始材料的該核酸；適當的酶，這些酶一起提供上述的活性；和至少一種(但通常為兩種)寡核苷酸。這些寡核苷酸中至少一種應當含有RNA聚合酶啟動子的序列。雖然單鏈或雙鏈DNA同樣可用作輸入材料，但是如果輸入材料為單鏈RNA，則基于轉錄的擴增方法就特別有用。當基于轉錄的擴增方法應用于含有單鏈RNA(附加序列位于目標序列的3′末端和5′末端)的樣品時，適宜用于現有技術中所描述的方法的寡核苷酸對由下列組成-第一寡核苷酸(通常稱為“啟動子-引物”或“正向-引物”)，其能夠與目標序列的3′末端雜交，并具有連接到其5′末端上的啟動子序列(優選的為T7啟動子)(該寡核苷酸的雜交部分具有與用作輸入材料的目標RNA相反的極性)。
-第二寡核苷酸(通常稱為“反向引物”)，其含有目標序列的5′末端(該寡核苷酸具有與目標RNA相同的極性)。
當將這樣的寡核苷酸對、同具有適當活性的所有的酶和足夠量的必需的核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸一起構成一個反應混合物，并在適當的條件下(即在適當的緩沖條件下和于適當的溫度下)保持足夠的時間時，等溫連續擴增反應就將開始。上述主題的許多變體已經在現有技術中進行了描述。基于轉錄的擴增反應包括從模板合成單鏈RNA轉錄物，該模板含有可被RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)識別的啟動子(例如T7啟動子)。含有啟動子序列的正向引物可作為引物來起始與目標RNA互補的DNA鏈的合成。
引物通過依賴RNA的DNA聚合酶活性進行延伸。所形成的RNA-cDNA雜化物通過RNA酶H來降解。這使得特異的反向引物與cDNA雜交。該引物通過依賴RNA的DNA聚合酶進行延伸直至cDNA的5′末端，結果導致雙鏈啟動子序列的形成，由此作為正向引物一部分的啟動子序列被用作模板。然后通過依賴DNA的RNA聚合酶將該雙鏈啟動子用于產生許多新的RNA分子，這些RNA分子與目標RNA互補。在該起始階段之后，擴增進入循環階段。
實際上，從樣品中的單鏈RNA開始，一旦將所有的成分放在一起，并將混合物置于適當的溫度以讓酶都有活性，整個一系列事件就會發生。該方法的操作者不需要通過干預來完成這些步驟中的任何一個。
正如上面所解釋的，基于轉錄的擴增方法對于從單鏈RNA開始的擴增特別有用。含有將要擴增的核酸的起始材料可以不含有以指定長度的RNA的形式存在的目標核酸。當對于含有目標序列(只以雙鏈DNA的形式存在，環狀或線性)的起始材料施行基于轉錄的擴增方法時，必須將DNA轉變成單鏈核酸。這可以通過在應用升高的溫度(直至100攝氏度)的條件而分離雙鏈DNA的鏈來完成。然后可以將在擴增中用作引物的第一寡核苷酸與單鏈中的一條進行退火。在通常的基于轉錄的擴增方法中使用的酶不能耐受如此的高溫，因此其只能在分離DNA鏈之后加入。當一個寡核苷酸與單鏈DNA進行退火并進行延伸時，就再次形成雙鏈DNA，然后必須將反應混合物經歷升高的溫度，該溫度足夠高以將雙鏈DNA再次分解成其分離的鏈。酶將會再次失活，在實施加熱步驟之后要加入新的酶。現在可以加入第二寡核苷酸，并與從在第一步中延伸的第一寡核苷酸所形成的鏈進行退火。由于一個寡核苷酸含有依賴DNA的RNA聚合酶的5′啟動子序列(見上)，所以獲得含有雙鏈功能啟動子的雙鏈DNA模板，從中可以發生RNA產生的第一步。結果產生的RNA轉錄物可以進入擴增的循環階段，并且該過程進一步將等溫進行。
從上述中明顯的是，從雙鏈DNA開始基于轉錄的擴增方法會是一個繁瑣的過程。其要求操作者進行幾個特殊的操作，樣品必須反復加熱和冷卻，以及酶必須在每次加熱步驟之后進行補充。
一些研究已經進入開發能夠從dsDNA開始的基于轉錄的擴增方法，而避免上述的將dsDNA轉變成ssRNA的繁瑣的程序，ssRNA可以用作循環等溫的基于轉錄的擴增的輸入。
在WO 9925868中公開了相當簡單的用于dsDNA的基于轉錄的擴增方法。
根據WO 9925868所描述的方法，樣品中的dsDNA可以直接采用基于轉錄的擴增方案來擴增，而根本不需任何的加熱處理步驟[超過90℃]，或者在一個優選的實施方案中只需一個起始的加熱步驟。相對短的dsDNA在該方法中優選。實際上，該方法并沒有根本上不同于用來擴增ssRNA的常規的基于轉錄的擴增方案。
作為另一種選擇，起始材料中的雙鏈DNA可以在擴增開始之前轉錄成RNA。這一額外的步驟可以依靠酶來進行，例如大腸桿菌RNA聚合酶，該酶可在無啟動子序列(也稱為聚合酶結合位點)存在的情況下將雙鏈DNA轉錄成RNA。這一具有額外步驟的方法有助于通過基于轉錄的擴增方法來擴增雙鏈DNA，其已在PCT專利申請no.WO 9602668中進行了描述。在該程序中所描述額外步驟不僅包括額外的處理步驟和處理時間，而且包括附加成分即大腸桿菌RNA聚合酶的使用。
在EP 397269中描述了制備用于基于轉錄的擴增方法的合適模板的另一種方法。
在該專利中描述了一種方法，由此dsDNA用限制性內切酶進行預處理。在用限制性內切酶處理之后，只需一個加熱分離步驟就可形成單鏈DNA(ssDNA)。在該方法中使用正向引物(啟動子-引物)，其3′部分含有與DNA單鏈中的一條的準確3′末端互補的序列，以及5′末端含有可被RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)識別的啟動子序列。當啟動子-引物與DNA單鏈的3′末端雜交時，就形成了雙鏈復合物，其中正向引物的5′啟動子序列可以作為用于從DNA鏈3′末端開始延伸反應的模板。因此，通過依賴DNA的DNA聚合酶可形成雙鏈啟動子，結果產生的復合物可以作為對于依賴DNA的RNA聚合酶的模板從而合成RNA的多重拷貝。
在WO 9104340中也公開了幾個對于單鏈DNA開始基于轉錄的擴增反應的方法。可以再次用限制性內切酶在DNA上形成適當的3′末端，其能夠與啟動子引物的3′序列雜交。
在WO 9104340中公開了怎樣可以用切割ssDNA的限制性內切酶形成ssDNA上指定的3′末端。在同樣方法的另一個實施方案中，切割dsDNA的限制性內切酶和能夠與目標ssDNA雜交的限制性寡核苷酸一起使用，因此形成雙鏈DNA片段，其可用限制性內切酶進行切割從而形成適當的3′末端。在這種方法中，限制性內切酶切割雙鏈復合物之后會剩下小片段的限制性寡核苷酸。可是，根據WO9104340的公開內容，顯然以這樣的方式挑選限制性寡核苷酸，使其在消化之后剩下的片段太小而不能保持與ssDNA 3′末端的雜交，因此將掉下去而為啟動子寡核苷酸讓出空間。可是，雖然用現有技術方法中所使用的限制性內切酶進行預處理可以導致靈敏的基于轉錄的測定，但是其需要許多額外的處理步驟和處理時間。
乙型肝炎病毒(HBV)感染在人類中很普遍。該引起乙型肝炎的病毒看來似乎只感染人和黑猩猩。
肝炎感染通過三種一般機制傳播(1)通過腸胃外接種受感染的血液或體液，其可以大量如輸血或者以微量如通過偶然的皮膚刺破發生；(2)通過親密的家庭或性接觸；和(3)通過一些母親，她們將病毒傳播給她們的新生兒。在自然條件下，HBV并非高傳染性。通過吸入傳播即使有也很少發生。通過受到污染的血液或血液制品的傳播途徑是對于人類健康的主要威脅。
HBV的感染常常導致亞臨床的或急性自限的肝臟疾病，或者可以導致慢性長期感染。慢性HBV感染引發多種疾病實體，其從最嚴重形式的慢性活動性肝炎，至嚴重性稍小的慢性遷延性肝炎，至無癥狀的帶毒者狀態。最近已經開發出多種診斷測定來幫助臨床醫生區分乙型肝炎病毒感染和其他形式的病毒性肝炎(即甲型肝炎、丙型肝炎或戊型肝炎)。可是，區別急性乙型肝炎感染和有癥狀的慢性乙型肝炎感染的能力仍然存在問題。由于慢性活動性肝炎和慢性遷延性肝炎患者常常表現出肝炎的循環模式，因此這就尤其是真實的問題，該循環模式以肝損傷的急性惡化和正常肝功能的交替出現為特征。
在HBV感染之后，血清中存在大量的病毒和相關顆粒。在有癥狀的感染階段，急性和慢性HBV患者都具有升高的肝酶水平，在他們的血清中具有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，并產生對于核衣殼抗原(HBcAg)的抗體。沒有檢測到對于HBsAg或乙型肝炎e抗原(HBeAg)特異的抗體。通常觀察不到對于HBsAg的抗體的出現，直至大約循環的HBsAg消失之后兩個月。已知存在于血清中的病毒顆粒脫去它們的表面包被從而暴露出核衣殼，其稱為核心抗原(HBcAg)。HBcAg的抗體產生出現在HBV感染的急性階段期間的早期，并能夠持續許多年，且慢性感染的患者能夠產生高滴度的抗HBc抗體。
HBsAg確定為急性或慢性乙型肝炎感染的最重要的標記，其能夠在受感染的個體的血清中檢測到。供體血液的HBsAg篩選例如對于避免乙型肝炎的傳播是必需的。很清楚的是，在診斷性HBV測定中其靈敏度具有最大的重要性。
HBV是已知最小的DNA病毒；其基因組顯示出高度緊湊的組織。在HBV復制循環中獨特的方面為，前基因組mRNA作為第一條病毒DNA鏈合成的模板。HBV DNA聚合酶的RNA酶H活性隨后切除mRNA，然后合成互補的DNA鏈，從而產生部分雙鏈的DNA分子以裝入病毒體。在病毒成功進入之后，部分雙鏈的DNA分子轉變成完全雙鏈的DNA分子。
在受感染的宿主的血液中可檢測到HBV DNA，這些宿主在超過90％情況中是HBsAg和HBeAg陽性。當前測量感染顆粒數量的技術方法為通過測量血清或血漿中病毒DNA的數量，因為其最可靠地反映出復制的病毒的數量。有幾種測定法可用于此目的，例如分枝DNA(bDNA)測定法(Hendricks DA，Stowe BJ，Hoo BS，Kolberg J，IrvineBD，Neuwald PD，Urdea MS，Perrillo RP，1995.用分枝DNA(bDNA)信號擴增測定法定量人血清中的HBV DNA(Quantitation of HBVDNA in human serum using a branched DNA(bDNA) signalamplification assay).Am J Clin Pathol 104537-546)、DNA雜交測定法和定量PCR(Pawlotsky JM，Bastie A，Lonjon I，Remire J，DarthuyF，Soussy CJ，Dhumeaux D，1997。對于臨床樣品中HBV DNA的常規檢測和定量應當使用什么技術呢？(What technique should be usedfor routine detection and quantification of HBV DNA in clinicalsamples？)Journal of Virological Methods 65245-253；Zaaijer HL，terBorg F， Cuypers HT，Hermus MC，Lelie PN，1994。用于檢測乙型肝炎病毒DNA的方法的比較(Comparison of methods for detection ofhepatitis B Virus DNA).J Clin Microbiol 322088-2091)。可是這些測定法中的大部分只有有限的靈敏度。
本發明涉及包括限制性內切酶消化的基于轉錄的擴增方法。該方法使得能夠進行乙型肝炎病毒DNA的靈敏和特異的擴增(以及隨后的檢測)。使用本發明的方法，HBV DNA能夠以比使用現有技術的基于轉錄的擴增方法更有效的方式進行擴增和檢測。與現有技術方法相比較，使用限制性內切酶不會使本發明方法中所用的程序變得復雜。
本發明提供基于轉錄的擴增目標HBV核酸序列的方法，該方法從可選存在于樣品中的HBV DNA開始，其包括下列步驟-在擴增緩沖液中溫育懷疑含有HBV的樣品，該溫育體系中含有一種或多種能夠在所選限制位點切割DNA的限制性內切酶，該限制性內切酶在DNA鏈中的一條上形成指定的3′末端，和啟動子引物，該啟動子引物具有包含被依賴DNA的RNA聚合酶所識別的啟動子序列的5′區域和與指定的DNA鏈的3′末端互補的3′區域，第二引物，其具有與啟動子引物相反的極性且含有目標序列的5′末端，和在HBV ssDNA的情況下，含有限制性引物；-將如此形成的反應混合物在適當的條件下保持足夠的時間，以進行限制性內切酶的消化；-將樣品以一定的溫度和時間進行加熱處理，該溫度和時間足以失活限制性內切酶和/或至少部分地導致雙鏈的單鏈化；-向樣品中加入下列試劑，具有依賴RNA的DNA聚合酶活性的酶具有依賴DNA的DNA聚合酶活性的酶具有RNA酶H活性的酶具有RNA聚合酶活性的酶；和-將如此形成的反應混合物在適當的條件下保持足夠的時間，以進行擴增。必需的(適當的)三磷酸核苷可以在用限制性內切酶溫育步驟期間就已經存在，例如作為該擴增緩沖液的一部分。可是，它們也可以在該程序中的稍后階段加入，例如在加熱處理之后與酶一起加入。
本領域的技術人員知道用于基于轉錄的擴增方法的酶和實行基于轉錄的擴增方法的條件，并且知道所有可以作出的優化基于轉錄的擴增反應的通常修飾。例如，正向引物即啟動子引物可以在位于引物5′末端的啟動子序列和位于引物3′末端的雜交序列之間含有嘌呤區域。
引物的序列主要由所選擇的限制位點的位置來決定。正向引物的3′末端應當與緊接著限制位點的目標序列進行退火。引物的長度可以變化，只要其長足夠能在擴增反應所使用的條件下進行雜交。引物的雜交部分一般由大約10至大約35個核苷酸組成。
如果目標為HBV ssDNA，在根據本發明的方法中所使用的限制性引物就要求它們所顯示的與正向引物的重疊區為最小；并且以使限制性內切酶可以真正有效地切割DNA的方式結合入限制位點序列。
限制性內切酶是能夠在所選位點(即被該酶識別的特異的核苷酸序列)切割dsDNA的酶。在為本發明的方法選擇適當的限制性內切酶時，應當注意挑選在HBV DNA的所有變體中都存在的限制位點(例如，如果進行擴增是為了檢測樣品中所有的病毒HBV DNA，則應挑選在乙型肝炎病毒的所有基因型中都存在的限制位點)。限制位點應當不存在于所使用的正向和反向引物之間的DNA序列之內。
限制性內切酶的添加導致指定的DNA目標鏈的3′末端的形成，其對于和啟動子引物的雜交部分的結合是有用的。另外的方面是，由于消化，DNA那部分的變性將會得到改善，因此有助于引物的結合。含有T7-啟動子序列的啟動子寡核苷酸應當以這樣的方式進行設計，即雜交部分與正位于限制位點上游的模板相互作用。具有依賴DNA的DNA聚合酶活性的酶(通常為逆轉錄酶，如MMLV-RT或AMV-RT)能夠用引物作為模板來延伸由限制性內切酶消化所形成的DNA目標鏈的3′末端。將會形成雙鏈T7-啟動子序列，從而能夠開始生產擴增子RNA。
令人驚奇的是，已經發現限制性內切酶能夠在適宜于和適合于基于轉錄的HBV DNA擴增程序的環境中有效地作用。換言之，已經發現使用限制性內切酶來切割用作基于轉錄的擴增的輸入材料的HBVDNA，不會導致復雜的和附加的樣品處理。將限制性內切酶的使用合并入那些通常已經是基于轉錄的DNA擴增流程的一部分的步驟之中從而成為其中的一部分。
所有的現有技術方法都描述了限制性內切酶在制備用于基于轉錄的擴增的DNA模板中的用途，其以真正的基于轉錄的擴增之前的分離的預處理形式進行。因此，現有技術在制備DNA模板中使用限制性內切酶導致樣品的附加處理，如分離的限制性內切酶失活步驟和分離的DNA純化步驟。其使得整個擴增程序變得復雜，尤其對于自動化的過程，并增加了污染的風險。
雖然在WO 9104340中已經公開了與限制性內切酶一起添加限制性寡核苷酸，但是其沒有先于本發明公開怎樣能夠將限制性內切酶(和寡核苷酸)的使用與基于轉錄的擴增有效地聯合在一起。
在現有技術中沒有公開以何種方式能夠將限制性內切酶的使用與基于轉錄的擴增聯合在一起而不需附加的樣品處理和試劑添加步驟。
本發明的方法提供了這種聯合而沒有使現有技術的基于轉錄的DNA擴增過程變得復雜。
本發明的方法幾乎沒有不同于一般的基于轉錄的擴增方法。所采取的僅有的附加步驟為將用限制性內切酶對樣品進行“內置溫育(builtin incubation)”，這表示以這種方式使用限制性內切酶，即實際的樣品處理不會不同于常規的/現有技術的基于轉錄的DNA擴增過程。
在本發明方法中所優選使用的限制性內切酶當然是在將其添加到含有擴增緩沖液(含有相對較高濃度的鹽)的反應混合物中的條件下仍相對穩定和保持高活性的酶。
在添加限制性內切酶之后，需要將樣品在適當的條件下進行溫育并保持合適的時間以使酶起作用。可以將樣品和限制性內切酶進行溫育相對較短的時間，優選溫育大約10-20分鐘，更優選于大約35至大約45℃且特別是大約37-41℃溫育大約15分鐘，這顯然依賴于所使用的限制性內切酶的特性。事實上，與常規的基于轉錄的DNA擴增方法相比較，這是要采取的僅有的附加措施。
本發明的方法包括在用限制性內切酶溫育之后加熱樣品的步驟。在該加熱期間，使得限制性內切酶失活和導致雙鏈DNA[至少部分地]變成單鏈。該加熱步驟已經是進行基于轉錄的擴增方法的流程中的一部分。這些方法包括在引物添加之后樣品的加熱處理，從而形成對于引物退火最佳的環境(核酸伸展開來，核酸的鏈或內環分離開，和在冷卻期間便于引物和模板的雜交)。
用酶溫育之后的加熱步驟可以在大約50℃或更高的較低溫度進行，但優選在超過90℃(優選95+/-3℃)的溫度下通過短時間的溫育(大約5-10分鐘)來進行。
此后，可以將樣品冷卻至對于進行基于轉錄的擴增反應適當的溫度(通常為大約41℃)。
由于加熱，至少導致一部分的雙鏈DNA變成單鏈。當引物(尤其是啟動子寡核苷酸)在樣品加熱之前已經存在時，加熱處理也可以有助于引物與DNA的退火。
因此，在樣品經過限制性內切酶的處理之后不需從樣品中純化出DNA。在加熱處理中可簡單地將酶失活，該加熱處理已經成為基于轉錄的擴增程序的一部分。用本發明的方法已經證明這足夠消除限制性內切酶干擾實際的基于轉錄的擴增方法的風險。
在加熱處理之后，以通常的方式加入用于基于轉錄的擴增的其他擴增試劑，然后基于轉錄的擴增可以技術人員已知的通常方式來進行。
擴增酶只是在加熱處理之后加入以防止在加熱處理期間酶的降解(當然除非使用熱穩定的酶)。
本發明方法的主要優點為，盡管使用了額外的試劑(例如限制性內切酶)，但這不會導致要進行額外的(分離的)反應步驟或操作。
不需額外的樣品處理的事實尤其重要，因為每個額外的樣品處理都會增加污染風險，這是無論如何都要避免的，尤其是在擴增反應中。此外，如果需要額外的樣品處理，這將會使得方法的自動化操作復雜化。
本發明的方法也可用于單鏈DNA。當DNA是單鏈時，限制性寡核苷酸或限制性引物含有與包括目標DNA的限制位點的區域互補的序列，將其和限制性內切酶一起添加。
限制性寡核苷酸[限制性引物]與單鏈DNA雜交，并形成能夠被限制性內切酶切割的雙鏈復合物。又一試劑的添加(限制性寡核苷酸)不會使得實踐者進行額外的步驟。限制性寡核苷酸可以簡單地和限制性內切酶及其他對于擴增所必需的寡核苷酸一起添加。因此，不需打開擴增系統來再次添加試劑。
在本發明的優選實施方案中，限制性寡核苷酸的功能可以合并入也含有可被依賴DNA的RNA聚合酶識別的啟動子序列的寡核苷酸(聯合型啟動子和限制性引物)。采用這種方式，對于擴增只需兩種寡核苷酸，即啟動子[或正向]引物，其合并有與包含限制位點的目標區域互補的序列，和第二[或反向]引物。包含該優選[聯合型啟動子和限制性]引物的限制位點的序列應當優選地以這種方式配置，即-在消化之后，引物的剩余部分會在加熱期間從目標上變性，-目標雜交序列的剩余部分足夠長以用于結合新的聯合型啟動子和限制性引物，-如果對于限制性內切酶的活性是必需的，那么限制位點周圍的額外核苷酸包括在雜交之內。
因此，聯合型啟動子和限制性引物的一部分現在將作為限制性寡核苷酸；其將與目標DNA進行退火，從而導致含有可被限制性內切酶識別的限制位點的dsDNA。隨后限制性內切酶將切割該dsDNA，從而提供出指定的DNA上的3′末端。
優選，相對于目標DNA的存在數量，應當存在至少1000倍過量的聯合型啟動子和限制性引物，這對于基于轉錄的擴增反應中的常規啟動子引物也已是通常水平。
本發明的方法提供了在懷疑含有乙型肝炎病毒(HBV)的樣品中有效和靈敏地擴增和檢測病毒DNA的方法，尤其是用此處所描述的HBV引物和HBV探針。所以，這些HBV引物和HBV探針代表了本發明的另一個實施方案。
在本發明方法中所選的限制位點優選為在HBV的不同基因型中保守的限制位點。
如果目標序列和限制位點位于HBV基因組中編碼表面抗原的那部分內，就可獲得好結果。
在本發明的方法中特別有用的位于HBsAg編碼區域內的保守限制位點(與切割這些位點的限制性內切酶一起)為位于根據EcoRI位點的核苷酸247-252上的XbaI位點、位于根據EcoRI位點的核苷酸253-258上的BssSI位點和位于根據EcoRI位點的核苷酸178-183上的AvrII位點。
當然，引物的寡核苷酸序列主要由所選擇的限制位點的位置來決定。引物的長度可以變化，只要其長足以能在擴增反應所使用的條件下進行雜交即可。引物的雜交部分一般由大約10至大約35個核苷酸組成，更優選由大約15至大約30個核苷酸組成。
正向引物的5′末端應當與緊接著限制位點的目標序列進行退火。
反向引物的位置的關鍵性稍小，其應當優選具有保守區域部分的序列，該保守區域離正向引物足夠遠，從而讓探針能夠在正向和反向引物區域之間的區域內與擴增出的目標序列雜交。
優選的限制性引物為與正向引物有著最小重疊的寡核苷酸，其以使限制性內切酶能夠真正切割如此形成的dsDNA的方式包含限制位點的序列并且其長足以能夠以充分的方式與HBV DNA雜交。
在與XbaI、AvrII和/或BssSI限制性內切酶聯合中特別有用的寡核苷酸正向引物是本發明的優選實施方案。特別地，含有下列部分中至少10個和優選多于15個核苷酸[從切割位點算起]的寡核苷酸序列是優選的與限制性內切酶XbaI聯合時，SEQ ID No 1的HBV雜交部分[該雜交部分照此為SEQ ID No 10]；與限制性內切酶BssSI聯合時，SEQ ID No 2的HBV雜交部分[該雜交部分照此為SEQ ID No 11]；和/或與限制性內切酶AvrII聯合時，SEQ ID No 3的雜交部分[該雜交部分照此為SEQ ID No 12]。
能夠用作限制性引物的寡核苷酸包含在相關HBV DNA限制位點兩側的至少10個和優選多于15個核苷酸，尤其是在下列位點兩側的核苷酸，即位于根據EcoRI位點的核苷酸247-252的XbaI位點、位于根據EcoRI位點的核苷酸253-258的BssSI位點和位于根據EcoRI位點的核苷酸178-183上的AvrII位點。
特別合適的限制性引物具有SEQ ID No 8和SEQ ID No 9中所描繪的寡核苷酸序列。
用于檢測所擴增的HBV目標的合適探針含有10至大約35個且更優選大約15至大約30個與所擴增的HBV目標雜交的核苷酸，以及含有SEQ ID No 6和SEQ ID No 7的HBV雜交部分中的至少10個且優選多于15個核苷酸。(這些序列的HBV雜交部分出示在表1中，并分別標明為SEQ ID No 13和SEQ ID No 14。進一步提供了顯示于表1中的探針，在其兩個末端具有非HBV的核苷酸，這些非HBV的核苷酸完全地或者有時與少許HBV核苷酸一起形成探針的“主干”；該主干為所選擇的檢測系統的一部分。)合適的反向引物含有HBV保守區域中的大約10至大約35個且更優選大約15至大約30個核苷酸。優選的反向引物含有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5中的至少10個且優選多于15個核苷酸。
本發明的另一個實施方案為適合根據本發明進行HBV DNA的基于轉錄的擴增和檢測的測試試劑盒，其含有-此處所描述的限制性內切酶，-如此處所說明的，與所選限制性內切酶的切割位點相應的正向引物，其和啟動子序列一起提供，-進行基于轉錄的擴增反應的其他試劑，-檢測所擴增的HBV DNA的方法，和-使用說明書。
附圖簡述
圖1包括限制性內切酶消化的DNA NASBA的圖解顯示。限制性內切酶(箭頭)只是在NASBA的起始階段有活性。在消化之后，正向引物與模板雜交。AMV RT將會用正向引物來延伸包含T7啟動子序列(暗灰色)作為模板的DNA目標鏈(黑色)的3′末端。T7 DdRp會識別出雙鏈T7啟動子序列，于是開始產生RNA擴增子(淺灰色)。RNA擴增子序列與目標DNA鏈互補。在循環階段期間，可用分子信標技術來擴增和檢測RNA擴增子。只是在循環階段期間需要RNA酶H和反向引物。
圖2有和沒有XbaI消化的HBV DNA聯合正向引物S-p3.8的NASBA。在用XbaI消化之后，S-p3.8可用作目標DNA延伸的模板。引物S-p4.5用作反向引物而分子信標S-WT2用作探針。沒有模板的樣品(NT)作為負對照。
圖3有和沒有BssSI消化的HBV DNA聯合正向引物S-p3.10的NASBA。在用BssSI消化之后，S-p3.10可用作目標DNA延伸的模板。引物S-p4.5用作反向引物而分子信標S-WT2用作探針。沒有模板的樣品(NT)作為負對照。
圖4有和沒有XbaI消化的HBV DNA聯合正向引物S-p3.10的NASBA。在用XbaI消化之后，S-p3.10不可用作目標DNA延伸的模板。引物S-p4.5用作反向引物而分子信標S-WT2用作探針。沒有模板的樣品(NT)作為負對照。
圖5有和沒有BssSI消化的HBV DNA聯合正向引物S-p3.8的NASBA。在用BssSI消化之后，S-p3.8可作用作目標DNA延伸的模板。引物S-p4.5用作反向引物而分子信標S-WT2用作探針。沒有模板的樣品(NT)作為負對照。
圖6有和沒有AvrII消化的HBV DNA聯合正向引物S-p3.5的NASBA。在用AvrII消化之后，S-p3.5可用作目標DNA延伸的模板。引物S-p4.4用作反向引物而分子信標S-WT4用作探針。沒有模板的樣品(NT)作為負對照。
本發明通過下面的實施例進行進一步的舉例說明。
實施例1HBV DNA的擴增兩個保守的限制性位點(XbaI和BssSI)編碼于HBV DNA的S-gen的保守區域(根據EcoRI位點的nt 244-285)內。當S-區域的這部分能夠成為負極性的單鏈DNA時，加入與包含限制位點序列的區域互補的寡核苷酸(“限制性引物”(RP))，從而為所有存在的基因組DNA形成雙鏈限制位點。用Nuclisens Extractor(Organon Teknika)從被3×109geq/ml的HBV基因型A感染的血漿的一系列稀釋液中分離出HBV DNA。按照所述對于分離RNA的標準程序(Operator ManualExtractor，41001-9，rev A，1999)可獲得50μl的提取液。每次測定用5μl的提取液。限制性內切酶消化在下列條件下進行NASBA緩沖液(40mM Tris-HCl pH8.5，12mM MgCl2，70mM KCl，15％v/v DMSO，5mM DTT，1mM的各種dNTP，2mM ATP，2mM CTP，2mM UTP，1.5mM GTP，0.5mM ITP，0.2μM正向引物(對于XbaI為S-p3.8，對于BssSI為S-p3.10，表1)，0.2μM反向引物(S-p4.5，表1)，0.1μM分子信標探針(S-WT2，表1)，0.17μM限制性引物(RP-3，表1))和0.2單位的限制性內切酶BssSI(New England BioLabs，Inc.，Beverly，MA，USA)或3.0單位的限制性內切酶XbaI(New England BioLabs，Inc.，Beverly，MA，USA)。在于41℃溫育15分鐘之后，加熱失活限制性內切酶，并將DNA模板于95℃變性5分鐘。將反應混合物冷卻至41℃并保持3分鐘，在此期間發生引物的雜交。隨后加入NASBA酶(2.1μg BSA，0.08單位的RNA酶H，32單位的T7 RNA聚合酶和6.4單位的AMV逆轉錄酶)，并通過輕輕地敲打和短時間的離心將反應混合物混和，然后開始擴增和實時檢測。將反應混合物在NucliSensEasyQ Analyzer(Organon Teknika)中于41℃溫育120分鐘，并每分鐘進行熒光監測。反應物于485nm激發，于518nm測量到發射信號。
實施例1.1包括XbaI消化的HBV DNA的擴增進行有和沒有使用限制性內切酶XbaI處理的NASBA測定。在NASBA條件下的最佳XbaI濃度這樣確定即能夠消化109拷貝的含有HBV DNA的擴增子區域的PCR片段，且結果顯示為3個單位。S-p3.8用作正向引物，并能夠在XbaI消化之后被AMV RT用作模板來延伸模板DNA。沒有消化時獲得3×106geq/ml的靈敏度，而消化之后靈敏度為3×103geq/ml，這表明靈敏度增加了1000倍(圖2)。另外，沒有消化時到達陽性的時間(TTP)為大約16分鐘，而在XbaI消化之后其為大約6分鐘，這表明TTP減少了大約10分鐘(圖2)。這兩者都是擴增反應改善的指標。
實施例1.2包括BssSI消化的HBV DNA的擴增用同樣的HBV DNA提取物和與上述同等的反應條件來進行有和沒有使用限制性內切酶BssSI處理的NASBA反應。在NASBA條件下的最佳BssSI濃度這樣確定即能夠消化109拷貝的含有HBV DNA的擴增子區域的PCR片段，結果顯示為0.2個單位。S-p3.10用作正向引物，并能夠在BssSI消化之后被AMV RT用作模板來延伸模板DNA。用限制性內切酶BssSI處理的結果再次獲得了顯著的測試改善(圖3)。沒有消化時只獲得3×107geq/ml的靈敏度，而消化之后靈敏度為3×104geq/ml，這再次表明作為消化的結果靈敏度增加了1000倍(圖3)。另外，沒有消化時到達陽性的時間(TTP)為大約21分鐘，而在BssSI消化之后其為大約11分鐘，這再次表明TTP減少了大約10分鐘(圖3)。這些結果證明在NASBA反應之前用限制性內切酶消化HBV DNA能夠在相當程度上改善HBV DNA的擴增并因此改善HRV DNA的檢測。
實施例1.3包括XbaI消化的HBV DNA的擴增-2為了測試由其本身消化還是限制性內切酶與所選引物的聯合是改善的測定結果的基本原因，用引物S-p3.10代替S-p3.8再次進行包括XbaI消化的測定。在XbaI消化之后，AMV RT不能用S-p3.10作為模板來延伸目標序列。正如能夠在圖4中所見的，在聯合S-p3.10的XbaI消化之后只獲得了靈敏度的輕微增加(10倍)和TTP的少量減少(大約5分鐘，從21至16分鐘)。這表明在NASBA起始期間模板的延伸是獲得改善的結果的原因，這些改善的結果可用XbaI與引物S-p3.8和用BssSI與引物S-p3.10來獲得。
實施例1.4包括BssSI消化的HBV DNA的擴增-2為了測試目標的延伸是否的確為測定結果改善的基本原因，用引物S-p3.8代替S-p3.10再次進行包括BssSI消化的測定。在BssSI消化之后，AMV RT能夠用S-p3.8作為模板來延伸目標序列。可是，在BssSI消化之后只有17個核苷酸參與了引物和目標序列的雜交，而其通常為大約20個核苷酸。盡管有這些差異，但是在BssSI消化之后再次獲得了明顯的測試改善(圖5)。可以使用引物S-p3.8與S-p4.5、限制性引物RT-3和分子信標S-WT2，用NASBA中包括的XbaI和BssSI來進行雙消化，這與單消化NASBA測定相比并沒有降低擴增效率。
實施例1.5包括AvrII消化的HBV DNA的擴增限制位點(AvrII)編碼于HBV DNA的S-gen的另一個保守區域(根據EcoRI位點的nt177-192)內。如在NASBA中一樣使用正向引物S-p3.5、反向引物S-p4.4、分子信標S-WT4和限制性引物RT-1(表1)。在AvrII消化之后，AMV RT能夠用S-p3.5作為模板來延伸HBV DNA的目標鏈。使用與上述同樣的反應條件。使用與上述同樣的HBV DNA提取物來進行有和沒有使用限制性內切酶AvrII處理的NASBA反應，每個反應使用2單位的AvrII。沒有消化時獲得＞108geq/ml的靈敏度，而消化之后靈敏度為1×105geq/ml，這表明作為消化的結果靈敏度增加了＞103倍(圖6)。這些結果再次證明在NASBA反應中包括的HBV DNA的限制性內切酶消化能夠在相當程度上改善HBV DNA的擴增。
表1 引物和探針序列
*T7-啟動子序列用斜體表示，嘌呤序列用小寫字母表示，探針的主干序列用加下劃線的斜體表示，并標明了限制位點。
序列表<110>Akzo Nobel NV<120>用基于轉錄的擴增來擴增和檢測HBV DNA的方法<130>2001.633<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1aattctaata cgactcacta tagggagact cgtggtggac ttctctca 48<210>2<211>50
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2aattctaata cgactcacta tagggagaag gtggacttct ctcaattttc 50<210>3<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3aattctaata cgactcacta tagggagagg acccctgctc gtgttacagg c 51<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4gaaccaacaa gaagatgagg ca 22
<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5gggactgcga attttggcca20<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>6cgatcgaggg actgcgaatt ttggccgatc g 31<210>7<211>39<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>探針<220>
<221>misc feature<222>(9)..(10)<223>n＝肌苷<400>7ggatccctng aaaattgaga gaagtccacc acgggatcc 39<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8aataccgcag agtctagact cgtgg 25<210>9<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9catcaggayt cctagga17<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10gactcgtggt ggacttctct ca 22<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11ggtggacttc tctcaatttt c 21<210>12<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>12ggacccctgc tcgtgttaca ggc23<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>13agggactgcg aattttggcc20<210>14<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<220>
<221>misc feature
<222>(4)..(5)<223>n＝肌苷<400>14cctngaaaat tgagagaagt ccaccacg 28
權利要求
1.基于轉錄的擴增目標HBV核酸序列的方法，該方法從可選存在于樣品中的HBV DNA開始，其包括下列步驟-在擴增緩沖液中溫育疑似含有HBV的樣品，該溫育體系中含有一或多種能夠在所選限制位點切割該HBV DNA的限制性內切酶，該限制性內切酶在該HBV DNA鏈上形成指定的3′末端；啟動子引物，該啟動子引物的5′區域包含被依賴DNA的RNA聚合酶所識別的啟動子序列且其3′區域與該DNA鏈的指定的3′末端互補；第二或反向引物，其具有與啟動子引物相反的極性且含有該目標序列的5′末端；以及在HBV ssDNA作為目標序列的情況下，含有限制性引物；-將如此形成的反應混合物在適當的條件下保持足夠的時間，以進行限制性內切酶的消化；-將如此獲得的樣品以足以失活限制性內切酶和/或至少部分地導致雙鏈的單鏈化的溫度和時間進行加熱處理；-向樣品中加入下列試劑，具有依賴RNA的DNA聚合酶活性的酶具有依賴DNA的DNA聚合酶活性的酶具有RNA酶H活性的酶具有RNA聚合酶活性的酶；和-將如此形成的反應混合物在適當的條件下保持足夠的時間，以進行擴增。
2.根據權利要求1的方法，其中該DNA為雙鏈HBV DNA。
3.根據權利要求1的方法，其中該DNA為單鏈且使用聯合型啟動子和限制性引物從而聯合了啟動子引物的功能和限制性引物的功能，該聯合型啟動子和限制性引物含有與包括目標ssDNA的限制位點的區域互補的序列和可被依賴DNA的RNA聚合酶識別的啟動子序列。
4.根據權利要求1的方法，其中于加熱處理前向起始的溫育混合物中加入適當的三磷酸核苷。
5.根據權利要求1的方法，其中所用逆轉錄酶聯合具有依賴RNA的DNA聚合酶活性的酶和具有依賴DNA的DNA聚合酶活性的酶的活性。
6.根據權利要求1的方法，其中使用本身具有RNA酶H活性的逆轉錄酶，從而代替以下3種酶，即具有依賴RNA的DNA聚合酶活性的酶、具有依賴DNA的DNA聚合酶活性的酶以及具有RNA酶H活性的酶。
7.根據權利要求1的方法，其中溫育溫度為35℃至大約45℃，優選為大約37-41℃。
8.根據權利要求1的方法，其中加熱步驟在92-98℃的溫度進行，優選在大約95℃。
9.根據權利要求1的方法，其中使用在HBV不同基因型中保守的位點切割HBV DNA的限制性酶。
10.根據權利要求1的方法，其中限制位點位于HBV基因組中編碼表面抗原的部分內。
11.根據權利要求10的方法，其中限制位點為位于根據EcoRI位點的核苷酸247-252的XbaI位點、位于根據EcoRI位點的核苷酸253-258的BssSI位點或位于根據EcoRI位點的核苷酸178-183的AvrII位點，并且所使用的限制性內切酶分別為XbaI、BssSI或AvrII限制性內切酶。
12.根據權利要求1的方法，其中限制性引物為含有10至大約35個且更優選大約15至大約30個核苷酸的寡核苷酸，這些核苷酸與HBV目標雜交并含有在下列位點兩側的至少10個且優選多于15個核苷酸位于根據EeoRI位點的核苷酸247-252的XbaI位點、位于根據EcoRI位點的核苷酸253-258的BssSI位點或位于根據EcoRI位點的核苷酸178-183的AvrII位點。
13.根據權利要求12的方法，其中限制性引物具有SEQ ID No 8和SEQ ID No 9中所描繪的寡核苷酸序列。
14.根據權利要求1的方法，其中啟動子或正向引物為包含與HBV目標雜交的10至大約35個且更優選大約15至大約30個核苷酸以及含有下列序列中的至少10個且優選多于15個核苷酸[從切割位點算起]的寡核苷酸與限制性內切酶XbaI聯合時，SEQ ID No 10；或與BssSI聯合時，SEQ ID No 11；或與AvrII聯合時，SEQ ID No 12；該寡核苷酸連接于啟動子序列。
15.根據權利要求14的方法，其中啟動子寡核苷酸具有SEQ ID No1、SEQ ID No 2或SEQ ID No 3中所分別描述的核苷酸序列。
16.根據權利要求1的方法，其中用雜交探針另外檢測所擴增出的HBV核酸，該雜交探針含有包含10至大約35個且更優選大約15至大約30個核苷酸的寡核苷酸序列，這些核苷酸可與所擴增出的HBV目標雜交并含有SEQ ID No 13和SEQ ID No 14中的至少10個且優選多于15個核苷酸。
17.根據權利要求16的方法，其中探針具有SEQ ID No 6和SEQID No 7的寡核苷酸序列。
18.根據權利要求1的方法，其中第二或反向引物為包含10至大約35個且更優選大約15至大約30個核苷酸并含有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5中的至少10個且優選多于15個核苷酸的寡核苷酸。
19.具有選自從SEQ ID No 1至并包括SEQ ID No 14的核苷酸序列的寡核苷酸。
20.適合用于根據權利要求1擴增HBV核酸的整套寡核苷酸引物，其含有根據權利要求14的啟動子引物和根據權利要求18的反向引物。
21.適合根據權利要求1進行HBV DNA的基于轉錄的擴增和檢測的測試試劑盒，其含有此處所描述的限制性內切酶；如此處所說明的與所選限制性內切酶的切割位點相應的正向引物，其和啟動子序列、用于進行基于轉錄的擴增反應的其他試劑、用于檢測所擴增出的HBVDNA的方法和使用說明書一起提供。
全文摘要
本發明提供基于轉錄的擴增目標HBV核酸序列的方法，該方法從可選存在于樣品中的HBV DNA開始，其包括下列步驟在擴增緩沖液中溫育懷疑含有HBV的樣品，該溫育體系中含有一種或多種能夠在選擇出的限制位點切割HBV DNA的限制性內切酶，該限制性內切酶形成指定的此HBV DNA鏈的3′末端；該溫育體系中含有啟動子引物，該啟動子引物具有包含被依賴DNA的RNA聚合酶所識別的啟動子序列的5′區域和與指定的DNA鏈的3′末端互補的3′區域；該溫育體系中含有第二或反向引物，其具有與啟動子引物相反的極性且含有該目標序列的5′末端；且在HBV ssDNA作為目標序列的情況下，該溫育體系中含有限制性引物；將如此形成的反應混合物在適當的條件下保持足夠的時間，以進行限制性內切酶的消化；將如此獲得的樣品以一定的溫度和時間進行加熱處理，該溫度和時間足以失活限制性內切酶和/或至少部分地導致雙鏈的單鏈化；向樣品中加入下列試劑，具有依賴RNA的DNA聚合酶活性的酶、具有依賴DNA的DNA聚合酶活性的酶、具有RNA酶H活性的酶、具有RNA聚合酶活性的酶；和將如此形成的反應混合物在適當的條件下保持足夠的時間，以進行擴增。
文檔編號C12Q1/68GK1501983SQ02807389
公開日2004年6月2日 申請日期2002年3月6日 優先權日2001年3月7日
發明者B·A·L·M·戴曼, I·M·弗蘭岑, A·M·W·斯特里杰普, B A L M 戴曼, W 斯特里杰普, 弗蘭岑 申請人:拜奧默里克斯有限公司