新型氨肽酶及其基因的制作方法

專利名稱：新型氨肽酶及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氨肽酶以及編碼該酶的基因。
背景技術(shù)：
在制造醬油、豆醬、其他含有蛋白質(zhì)水解物的天然調(diào)味品中，要使用曲菌。例如，醬油是經(jīng)過制曲和發(fā)酵2個階段制造的。在制曲階段，主要通過曲菌(曲霉屬(Aspergillus)絲狀菌)生產(chǎn)的酶來分解原料。此時，為了使醬油的呈味性更好，重要的是要增加各味中的游離氨基酸的量。
氨基酸是原料蛋白質(zhì)經(jīng)過2階段而生成的。第一階段是蛋白質(zhì)通過蛋白酶作用釋放肽，第二階段是肽酶催化的肽的水解，生成氨基酸。
關(guān)于曲菌的肽酶，報告了來源于米曲霉(Aspergills oryzae)和醬油曲霉(Aspergills sojae)的肽酶(特開平11-346777號、DE95-1952648、WO9851163、WO9628542、WO9615504、WO9851803、WO9814599)。其中顯示了醬油制造過程中亮氨酸氨肽酶的重要性。但是，至今已知的亮氨酸氨肽酶中并未見報告具有耐鹽性。另外，關(guān)于曲霉屬的亮氨酸氨肽酶的基因，雖然有海附等(特開平11-346777號)的醬油曲霉的報告，但關(guān)于該酶的耐鹽性并沒有報告。
另外報告了芽孢桿菌屬(Bacillus)中有具耐鹽性的亮氨酸氨肽酶(Lee，G.D.等、J.Appl.Microbiol.(1988)，85(3))。
淺野等注意到，在大豆發(fā)芽過程中，可在非常短的時間內(nèi)將種子中的貯藏蛋白分解為氨基酸，從大豆子葉中發(fā)現(xiàn)了肽酶類(有效分解含有酸性氨基酸的肽的氨肽酶GX和亮氨酸氨肽酶類)，成功地進(jìn)行了大豆蛋白質(zhì)的有效水解(特開平9-294583號)。
大豆的氨肽酶GX從其酶學(xué)各特性來看，是至今尚未見報告的新型的氨肽酶，除發(fā)芽大豆以外，尚不知其存在。大豆氨肽酶GX具有從在N末端具有谷氨酸等酸性氨基酸的肽中，有效地釋放N末端的酸性氨基酸的活性。因此通過該酶的作用，可以制造游離谷氨酸含量高、呈味性優(yōu)異的醬油。
二宮等采用基因重組技術(shù)，成功地大量生產(chǎn)了大豆的氨肽酶GX(特開2000-325090)，但將通過該方法生產(chǎn)的大豆氨肽酶GX用于醬油釀造，則有GMO問題、成本問題等困難。
發(fā)明的公開本發(fā)明的目的在于提供來源于曲菌的氨肽酶及編碼該氨肽酶的基因，所述氨肽酶對制造游離氨基酸含量高、呈味性優(yōu)異的醬油或蛋白質(zhì)分解物有效。
本研究人為了解決上述課題，進(jìn)行了深入的研究，以與來源于大豆的氨肽酶GX基因具有同源性的構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)EST作為探針，對構(gòu)巢曲霉的基因組DNA文庫進(jìn)行篩選，成功地獲得了編碼來源于構(gòu)巢曲霉的新型氨肽酶的DNA，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明是下述(A)～(D)的任一項(xiàng)表示的蛋白質(zhì)(A)具有序列表SEQ ID NO2氨基酸編號1～519所表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B)具有序列表SEQ ID NO4氨基酸編號1～510所表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(C)由序列表SEQ ID NO2氨基酸編號1-519所表示的氨基酸序列中包含1個或多個氨基酸置換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列構(gòu)成，且具有催化從肽的N末端釋放氨基酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)；(D)由序列表SEQ ID NO4氨基酸編號1～510所表示的氨基酸序列中包含1個或多個氨基酸置換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列構(gòu)成，且具有催化從肽的N末端釋放氨基酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)。
另外本發(fā)明是關(guān)于編碼上述(A)～(D)任一項(xiàng)的核酸分子、包含該核酸分子的重組核酸分子、轉(zhuǎn)化微生物宿主以及使用該轉(zhuǎn)化微生物宿主的氨肽酶的制備方法。本發(fā)明特別包括作為轉(zhuǎn)化微生物宿主的轉(zhuǎn)化絲狀菌，即轉(zhuǎn)化曲菌。
另外，本發(fā)明是具有下述1)～8)的性質(zhì)的氨肽酶。
1)分解N末端含有亮氨酸、甲硫氨酸的肽或蛋白質(zhì)，釋放亮氨酸或甲硫氨酸。
2)最適pH為約7.0～7.5。
3)最適溫度為約37～45℃。
4)以在不存在食鹽條件下的活性為100％時，在3M食鹽濃度下也顯示80％以上的殘存活性。
5)以在0℃、食鹽不存在、保存24小時的條件下的活性為100％時，在0℃、3M食鹽存在、保存24小時的條件下顯示80％以上的殘存活性。
6)以pH7.5、0℃、保存24小時條件下的活性為100％時，在pH5.8～9.5范圍、0℃、保存24小時的條件下顯示60％以上的殘存活性。
7)通過非變性PAGE顯示分子量約550kD，通過還原、加熱SDS-PAGE顯示分子量為22、33kD的。
8)活化時需要鈷離子或鋅離子。
附圖簡要說明

圖1是顯示PepE活性的溫度依賴性的圖。橫軸是溫度，縱軸是假設(shè)37℃時的活性值為100，亮氨酸氨肽酶活性的相對值。
圖2是顯示反應(yīng)液中的食鹽濃度對PepE的影響的圖。橫軸是NaCl濃度(M)，縱軸是假設(shè)未添加NaCl時的活性值為100，各NaCl濃度下的亮氨酸氨肽酶活性的相對值。
圖3是顯示PepE活性的pH依賴性的圖。橫軸是pH，縱軸是假設(shè)磷酸鉀緩沖液(pH7.5)中的活性值為100的亮氨酸氨肽酶活性的相對值。
實(shí)施發(fā)明的最佳形式如上所述，本發(fā)明是氨肽酶的制備方法，其特征在于使用來源于曲菌的氨肽酶、編碼該氨肽酶的核酸分子以及包含上述核酸分子的重組DNA轉(zhuǎn)化的微生物宿主，并培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化微生物宿主。在本說明書中，將本發(fā)明來源于曲菌的氨肽酶蛋白質(zhì)記為PepE，將編碼PepE的基因記為pepE。另外，在本說明書中，“氨肽酶”是指具有催化從肽的N末端依次釋放氨基酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)。
編碼本發(fā)明氨肽酶的核酸分子可以從構(gòu)巢曲霉的染色體DNA或cDNA獲得。具體地說，可以從構(gòu)巢曲霉，例如構(gòu)巢曲霉A26菌株的染色體DNA文庫獲得。可以參考來源于發(fā)芽大豆的氨肽酶GX(特開2000-325090)的基因序列和構(gòu)巢曲霉EST數(shù)據(jù)庫中同源性高的EST片段的核苷酸序列，制備PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))引物，以構(gòu)巢曲霉染色體DNA文庫為模板，通過PCR法獲得含有本發(fā)明的核酸分子的克隆。PCR引物可以例舉具有SEQ ID NO6和7所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
另外，本發(fā)明的核酸分子可以通過例如以具有SEQ ID NO8和9所示的核苷酸序列的寡核苷酸為引物的PCR，再通過以具有SEQ IDNO10和11所示的寡核苷酸為引物的5’-RACE，由構(gòu)巢曲霉的聚合(A)RNA構(gòu)建的cDNA文庫獲得。如上所述得到的含有編碼來源于構(gòu)巢曲霉A26的PepE的基因的基因組DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO1中。另外，cDNA的核苷酸序列和氨基酸序列示于SEQ ID NO2中，單獨(dú)的氨基酸序列示于SEQ ID NO3。比較基因組DNA與cDNA的核苷酸序列，結(jié)果在基因組DNA中未發(fā)現(xiàn)有內(nèi)含子。
本發(fā)明的核酸分子只要編碼本發(fā)明的氨肽酶即可，除具有由SEQID NO2所示的核苷酸序列中核苷酸編號72～1628構(gòu)成的核苷酸序列的DNA之外，也包含除去了5’末端不需要部分的核酸分子?！昂怂岱肿印敝幸舶―NA、RNA和它們的類似物。根據(jù)使用的目的，也可以是只編碼成熟蛋白質(zhì)的核酸分子。另外，在編碼區(qū)，將編碼各氨基酸的密碼子置換為編碼同一氨基酸的其他的等同的密碼子，這也包含在本發(fā)明的核酸分子中。并且，只要是無損所編碼的氨肽酶的活性，本發(fā)明的核酸分子也可以編碼在1個或多個位置上包含1個或多個氨基酸置換、缺失、插入、添加或倒位的氨肽酶。這里，“多個”根據(jù)肽酶蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置和種類不同而不同，通常為2～300個，優(yōu)選2～170個，進(jìn)一步優(yōu)選2～50個，最優(yōu)選2～10個。
編碼與上述的氨肽酶實(shí)質(zhì)上相同的蛋白質(zhì)的核酸分子，可以通過例如定點(diǎn)誘變法，改變pepE的核苷酸序列，使特定部位的氨基酸發(fā)生置換、缺失、插入、添加而獲得。另外，上述改變了的核酸分子也可以通過已知的誘變處理而獲得。誘變處理可以例舉用羥胺等對編碼PepE的DNA進(jìn)行體外處理的方法；將帶有編碼PepE的DNA的埃希氏菌屬(Escherichia)細(xì)菌通過紫外線照射、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸等常規(guī)人工誘變所使用的誘變劑進(jìn)行處理的方法。
另外，上述核苷酸的置換、缺失、插入、添加或倒位等中，也包括因曲菌的菌種或菌株的差異等而天然發(fā)生的變異。通過將具有上述變異的核酸分子在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中表達(dá)，并研究表達(dá)產(chǎn)物的PepE活性，可以獲得編碼與PepE實(shí)質(zhì)上相同的蛋白質(zhì)的核酸分子。另外，通過從編碼具有變異的PepE的核酸分子或帶有該核酸分子的細(xì)胞中，分離與例如序列表SEQ ID NO2中記載的核苷酸序列中由核苷酸編號72～1628構(gòu)成的核苷酸序列的核酸分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有PepE活性的蛋白質(zhì)的核酸分子，可以獲得編碼與PepE實(shí)質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的核酸分子。這里所說的“嚴(yán)謹(jǐn)性條件”是指形成所述特異性雜合體的條件。該條件與每個序列的GC含量和重復(fù)序列的有無等相關(guān)，因而難以明確地確定數(shù)值，但可以以一例說明同源性高的核酸分子，例如具有65％以上同源性的核酸分子彼此雜交、而同源性低的核酸分子彼此不雜交的條件；或者可以例舉通常的DNA印跡雜交的洗滌條件60℃、1×SSC、0.1％SDS，優(yōu)選在相當(dāng)于0.1×SSC、0.1％SDS的鹽濃度下雜交的條件。在這樣的條件下雜交的基因中，可能會包含中途存在終止密碼子、由于活性中心的突變而失活的基因，不過，這些基團(tuán)可以通過與市售的活性表達(dá)載體連接，用后面描述的方法測定PepE活性而簡單地除去。
另外，本發(fā)明的核酸分子也可以從曲霉屬的其他種的微生物，例如米曲霉的染色體DNA或cDNA獲得。具體地說，可以通過PCR法，從米曲霉例如米曲霉RIB40(ATCC42149)的cDNA文庫獲得?？梢愿鶕?jù)上述構(gòu)巢曲霉的PepE核苷酸序列，合成PCR用的寡核苷酸引物，通過以米曲霉例如米曲霉RIB40的菌體構(gòu)建的cDNA文庫為模板的PCR法進(jìn)行制備。作為PCR的引物，例如包括具有用于5’-RACE法的SEQ ID NO12和13所示的核苷酸序列、用于3’-RACE法的SEQ IDNO14和15所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
將對應(yīng)于如上得到的米曲霉RIB40的pepE的基因cDNA的核苷酸序列和氨基酸序列示于SEQ ID NO4，單獨(dú)的氨基酸序列示于SEQ IDNO5。SEQ ID NO2所示的構(gòu)巢曲霉的PepE的氨基酸序列與SEQ IDNO4所示的米曲霉所對應(yīng)的氨肽酶的氨基酸序列具有約77％的同源性，在成熟蛋白質(zhì)部位，約有120個氨基酸殘基不同。在編碼區(qū)，米曲霉的pepE對應(yīng)基因與構(gòu)巢曲霉的pepE的同源性為約71％。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包括編碼蛋白質(zhì)的核酸分子，所述蛋白質(zhì)由序列表的SEQ ID NO4中氨基酸編號1～510所表示的氨基酸序列中包含1個或多個氨基酸置換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸構(gòu)成、且具有催化從肽中釋放氨基酸的反應(yīng)的活性。另外，本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包括與具有由序列表的SEQ ID NO4所示的核苷酸序列中核苷酸編號73～1602構(gòu)成的核苷酸序列的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有催化從肽釋放氨基酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的核酸分子。
在以下所示的實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸分子是如上所述得到的DNA。其核苷酸序列已清楚，因此可以通過PCR或雜交等方法，從構(gòu)巢曲霉A26或米曲霉RIB40，或者構(gòu)巢曲霉或米曲霉的其他菌株的基因組DNA中容易地克隆編碼這些菌株所對應(yīng)的氨肽酶的核酸分子。因此，這樣的核酸分子也在本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明的核酸分子可以應(yīng)用于本發(fā)明的氨肽酶的制備。
本發(fā)明的核酸分子可以應(yīng)用于曲菌等絲狀菌的育種或氨肽酶PepE的制備。例如，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，通過優(yōu)選以多拷貝方式將編碼本發(fā)明的氨肽酶的DNA引入絲狀菌(例如米曲霉)細(xì)胞內(nèi)，可以增加PepE的活性。另外，通過使本發(fā)明的核酸分子在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)，可以制備PepE?？梢詫⑦@樣得到的曲菌等絲狀菌或由此得到的PepE應(yīng)用于醬油、豆醬及其他含有蛋白質(zhì)水解物的調(diào)味品等的制造。
引入本發(fā)明的核酸分子的絲狀菌有米曲霉、黑曲霉(A.niger)、構(gòu)巢曲霉等曲霉屬；粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)等鏈孢霉屬；曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)等根毛霉屬(Rhizomucor)的絲狀菌。特別優(yōu)選曲霉屬絲狀菌。
對于用于將本發(fā)明的核酸分子引入上述絲狀菌的載體并無特別限定，可以使用絲狀菌育種等通常使用的載體。例如，用于米曲霉的載體有pUNG(Lee，B.R.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，44，425-431(1995))、pMARG(Tsuchiya，K.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，40，327-332(1993))、pUSC(Gomi，K.等，Agric.Biol.Chem.51，2549-2555(1987))等。pUNG具有互補(bǔ)米曲霉niaD300(Minetoki，T.等，Curr.Genet.30，432-438(1996))的niaD-(硝酸同化缺損型)的標(biāo)記，pMARG具有互補(bǔ)米曲霉M2-3(Gomi，K.等，Agric.Biol.Chem.，51(9)，2549-2555(1987))的argB-(精氨酸需求)的標(biāo)記，pUSC具有互補(bǔ)米曲霉NS4(Yamada，O.等，Biosci.Biotech.Biochem.，61(8)，1367-1369(1997))的sC-(ATP硫酸化酶缺損型)的標(biāo)記。
在這些載體中，pUNG和pMARG具有葡糖淀粉酶基因(glaA)的啟動子和α-淀粉酶基因(amyB的終止子)，通過在該啟動子的下游符合可讀框地插入本發(fā)明的DNA(例如含有SEQ ID NO2中核苷酸編號72～1628的區(qū))，可以在該啟動子控制下表達(dá)PepE。另外，pUSC不含啟動子，因此使用該載體時，通過用插入了本發(fā)明DNA的pUC19等質(zhì)粒與pUSC共轉(zhuǎn)化來引入絲狀菌宿主，從而可表達(dá)PepE。
另外，可以根據(jù)絲狀菌宿主的不同，分別使用下述表1所示文獻(xiàn)中記載的載體、啟動子和標(biāo)記。表1中，以啟動子天然控制下的基因所編碼的酶名稱來表示啟動子。
表1文獻(xiàn) 啟動子 標(biāo)記絲狀菌宿主特表平4-503450號中性α-淀粉酶 黑曲霉argB黑曲霉argB構(gòu)巢曲霉trpC構(gòu)巢曲霉amdS構(gòu)巢曲霉pyr4粗糙鏈孢霉DHFR粗糙鏈孢霉特開昭62-272988TaKa-淀粉酶米曲霉天冬氨酸蛋白酶 曼赫根毛霉脂酶 曼赫根毛霉葡糖淀粉酶、脂酶 黑曲霉淀粉酶、葡糖淀粉酶、纖維素酶蛋白酶、糖酵解酶特開平7-51067 TaKa-淀粉酶曲霉屬特開平7-115976 記載了新型啟動子序列 米曲霉特開平7-59571 記載了新型啟動子序列 米曲霉日本農(nóng)藝學(xué)會志 α-淀粉酶(anyB)米曲霉Vol.71，No.10(1997)
1018-1023葡糖淀粉酶(glaA) 米曲霉葡糖苷酶(agdA) 米曲霉絲狀菌的轉(zhuǎn)化除了上述文獻(xiàn)所記載的方法之外，還可以采用任何公知的方法。例如米曲霉可以如下進(jìn)行的轉(zhuǎn)化。
將菌體(分生孢子)接種于DPY培養(yǎng)基(2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.5％酵母膏、pH5.0)，在30℃劇烈振蕩培養(yǎng)24小時左右。將培養(yǎng)液用Myracloth(CALBIO CHEM公司制造)或滅菌的紗布等過濾，回收菌體，用滅菌水洗凈，充分瀝干水分。將該菌體移入試管，加入酶液(1.0％Yatalase、(寶酒造(株)制造)、或0.5％NovoZyme(Novo Nordisk公司制造)和0.5％纖維素酶(例如Cellulase Onozuka、Yakuit公司制造)、0.6M(NH4)2SO4、50mM蘋果酸、pH5.5)，在30℃平緩振蕩3小時左右。在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形成的程度，如果良好則在冰中保存。
將上述酶反應(yīng)液用Myracloth過濾，除去菌體殘?jiān)蚝性|(zhì)體的濾液中加入等量的緩沖液A(1.2M山梨糖醇、50mM CaCl2、35mMNaCl2、10mM Tris-HCl、pH7.5)，置于冰中。在0℃以1,500～2,500rpm將其離心5～10分鐘，然后緩慢停止，用緩沖液A清洗沉淀，使其懸浮于適量的緩沖液A中。向100～200μl的原生質(zhì)體懸浮液中加入20μl以下的DNA溶液(5～10μg)，置于冰中20～30分鐘。加入250μl緩沖液B(60％聚乙二醇6000、50mM CaCl2、10mM Tris-HCl、pH7.5)，使其緩慢混合，再加入250μl緩沖液B，緩慢混合，然后再次加入850μl緩沖液B，緩慢混合，在室溫下靜置20分鐘。之后，加入10ml緩沖液A，顛倒試管，在0℃以1,500～2,500rpm離心5分鐘～10分鐘，將沉淀懸浮于500μl緩沖液A中。
將適量的上述懸浮液加入事先分裝并保溫的5ml上層瓊脂中，鋪在底層培養(yǎng)基(含有1.2M山梨糖醇，根據(jù)標(biāo)記不同而配制的選擇性培養(yǎng)基)之上，在30℃下培養(yǎng)。將生長的菌體繼代接種于選擇性培養(yǎng)基，檢查是否為轉(zhuǎn)化體。更優(yōu)選從菌體中制備重組DNA，通過限制酶分析或DNA印跡分析，確認(rèn)已引入本發(fā)明的DNA。
通過將上述得到的轉(zhuǎn)化體在適合所使用的啟動子的條件下培養(yǎng)，使pepE表達(dá)，得到PepE。例如，將米曲霉作為宿主，使用葡糖淀粉酶啟動子作為啟動子時，將轉(zhuǎn)化米曲霉孢子懸浮于含有麥麩、磷酸鉀等的培養(yǎng)基中，在約30℃下培養(yǎng)3天左右，可以產(chǎn)生PepE。根據(jù)需要，用蒸餾水等稀釋培養(yǎng)物，用ストマツカ-等進(jìn)行處理，可得到含有PepE的酶粗提液。得到的粗提液使用凝膠過濾、各種層析等，可以進(jìn)一步純化PepE。得到的PepE再通過鹽析、等電沉淀、凝膠過濾、離子層析、反相層析等純化，可以用于蛋白質(zhì)的分解。不過，將因引入本發(fā)明的核酸分子而PepE活性得到提高的轉(zhuǎn)化微生物的培養(yǎng)物與蛋白質(zhì)分解酶一起，直接與蛋白質(zhì)原料混合，作用于蛋白質(zhì)或其混合物，可以得到游離氨基酸含量高、呈味性強(qiáng)的蛋白質(zhì)水解物。所作用的蛋白質(zhì)原料可以有例如大豆、小麥、小麥谷蛋白等，還可以是脫脂大豆或進(jìn)行了溶脹、增溶等加工的各種蛋白質(zhì)、或從這些原料中分離的蛋白質(zhì)。
可以通過測定吸光度來測定PepE活性，例如向0.75ml 1mM Leu-pNA(50mM磷酸鈉緩沖液、pH7.5)中加入0.02ml酶粗提液、0.015ml100mM氯化鋅，37℃反應(yīng)10分鐘，加入40％乙酸0.25ml，使反應(yīng)終止，然后測定反應(yīng)液在405nm的吸光度。各種制備物中的活性可以以每分鐘生成1μmol對硝基苯胺的酶活性作為1單位(U)進(jìn)行比較。
將轉(zhuǎn)化微生物的培養(yǎng)物或粗制酶作用于蛋白質(zhì)的實(shí)際應(yīng)用條件可以是例如在蛋白質(zhì)分解酶存在的條件下，將轉(zhuǎn)化微生物的培養(yǎng)物混合到0.2～50％濃度的蛋白質(zhì)原料中，在5～60℃下反應(yīng)4小時～10天。
反應(yīng)結(jié)束后，未反應(yīng)的蛋白質(zhì)原料、菌體等不溶物質(zhì)可以用離心或過濾等傳統(tǒng)的分離方法除去。另外，也可以根據(jù)需要通過減壓濃縮、反滲透法等進(jìn)行濃縮，濃縮物可以通過冷凍干燥、減壓干燥、噴霧干燥等干燥處理制成粉末或顆粒。從而可獲得游離氨基酸含量高、呈味性強(qiáng)的蛋白質(zhì)水解物。
實(shí)施例實(shí)施例1.構(gòu)巢曲霉pepE基因組DNA的克隆根據(jù)來源于發(fā)芽大豆的氨肽酶GX的序列，使用構(gòu)巢曲霉的EST數(shù)據(jù)庫(http//www.genome.ou.edu/fungal.html)進(jìn)行同源搜索時，發(fā)現(xiàn)了同源性高的EST obd03al.fl。
如下所述，在該信息的基礎(chǔ)上，從構(gòu)巢曲霉基因組文庫進(jìn)行構(gòu)巢曲霉pepE的克隆。
構(gòu)巢曲霉基因組文庫由Fungal Genetics Stock Center(Kansas City，USA)購入。該文庫是用限制酶將構(gòu)巢曲霉的基因組DNA切斷，然后連接到粘粒載體，引入大腸桿菌(Escherichia coli)而成。文庫的篩選如下進(jìn)行。即，以含有粘粒載體的大腸桿菌作為模板DNA源，通過使用根據(jù)EST obd03al.fl的核苷酸序列合成具有下述序列的寡核苷酸作為引物，通過PCR，篩選包含靶基因的大腸桿菌克隆。
(5’末端用引物)CTC AAA CGG CCA CAT GAC TAC (SEQ ID NO6)(3’末端用引物)GTC T GT TCA AGT GCA TAG CCT G(SEQ ID NO7)<序列表獨(dú)立文本>
SEQ ID NO6、7PCR引物PCR反應(yīng)是94℃3分鐘熱變性后，將94℃30秒、52℃10秒、72℃30秒的反應(yīng)進(jìn)行25個循環(huán)。結(jié)果，在4個克隆中含有靶基因。由這些克隆中回收粘粒載體，測定核苷酸序列。將該核苷酸序列以及由該核苷酸序列編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO2中，單獨(dú)的氨基酸序列示于SEQ ID NO3。
將該基因插入質(zhì)粒pUC19，用得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109菌株以專用編號AJ13856，于2001年3月19日保藏于經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)省產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)在的獨(dú)立行政法人 產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心、日本國茨城縣筑波市東1-1-1中央第6、郵政編碼305-8566)，保藏號為FERM P-18263，于平成14年(2002年)3月11日，在該中心移交為國際保藏，保藏編號FERM BP-7949。
實(shí)施例2、構(gòu)巢曲霉的pepE cDNA的克隆將構(gòu)巢曲霉A26用50ml YG培養(yǎng)基(0.5％酵母膏、2.5％葡萄糖、0.1％微量元素*、pH6.5)，30℃振蕩培養(yǎng)48小時(微量元素*0.1％FeSO4·7H2O，0.88％ZnSO4·7H2O，0.04％CuSO4·5H2O，0.015％MnSO4·4H2O，0.01％Na2B4O7·10H2O，0.005％(NH4)6MoO24·4H2O)。
回收菌體，用液氮冷凍后用研缽粉碎。用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN公司制造)，從粉碎物中進(jìn)行總RNA的制備，用Micro FASTTrack Kit(Invitorogen公司制造)進(jìn)行mRNA的制備。用cDNA合成試劑盒(Promega公司制造)由該mRNA合成cDNA，用cDNA PCR LibraryKit(TaKaRa公司制造)進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建。
以cDNA文庫作為模板，以根據(jù)構(gòu)巢曲霉基因組DNA序列設(shè)計(jì)的具有下述序列的寡核苷酸作為引物，通過PCR和5’-RACE，進(jìn)行pepEcDNA的克隆。
(5’末端用引物)CAC CAC CAT GAG TCT AAC TTG G(SEQ ID NO8)(3’末端用引物)GTC TGT TCAAGT GCA TAG CCT G (SEQ ID NO9)(5’-RACE用的5’末端引物)CGT GGT ACC ATG GTC TAG AGT (SEQ ID NO10)(5’-RACE用的3’末端引物)ATT CGC AGT AAG CCT GCG AG (SEQ ID NO11)<序列表獨(dú)立文本>
SEQ ID NO8～11PCR引物PCR的反應(yīng)條件是94℃9分鐘的熱變性后，將94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒的反應(yīng)進(jìn)行30個循環(huán)，再進(jìn)行72℃5分鐘的反應(yīng)。結(jié)果，由使用SEQ ID NO8和9的引物的PCR得到約1800bp的DNA片段，由使用SEQ ID NO10和11的引物的5’-RACE得到約250bp的擴(kuò)增片段。這些DNA片段的核苷酸序列和由核苷酸序列推斷的氨基酸序列示于SEQ ID NO2。
將上述構(gòu)巢曲霉pepE cDNA片段插入pBluescript，用得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109菌株以專用編號AJ13857，于2001年3月19日保藏于經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)省產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)在的獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心、日本國茨城縣筑波市東1-1-1中央第6、郵政編碼305-8566)，保藏號為FERMP-18264，于平成14年(2002年)3月11日，在該中心移交為國際保藏，保藏編號FERM BP-7950。
實(shí)施例3.米曲霉的pepE同源cDNA的克隆(1)米曲霉cDNA文庫的構(gòu)建將米曲霉RIB40(ATCC42149)用50ml DPY培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)64小時。過濾并收集菌體，共回收1g。將該菌體立即用液氮冷凍，用研缽粉碎，然后用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN公司制造)得到總RNA。用mRNA純化試劑盒(Pharmacia公司制造)從該RNA中純化mRNA，通過cDNA PCR文庫試劑盒(TaKaRa公司制造)或用于cDNA末端快速擴(kuò)增的3’-RACE系統(tǒng)(GIBCO BRL)構(gòu)建cDNA文庫。
(2)米曲霉cDNA文庫的篩選參考實(shí)施例2中得到的構(gòu)巢曲霉的PepE序列，通過以SEQ IDNO12和13表示的寡核苷酸作為引物的5’-RACE，和使用SEQ IDNO14和15的3’-RACE，對米曲霉的pepE進(jìn)行同源cDNA克隆。
(5’-RACE用的5’末端引物)CGT GGT ACC ATG GTC TAG AGT(SEQ ID NO12)(5’-RACE用的3’末端引物)CAT GGG CCC AAT GGT TCC GC (SEQ ID NO13)
(3’-RACE用的5’末端引物)CCA GAT TCG TAA TGA CTC CCG (SEQ ID NO14)(3’-RACE用的3’末端引物)CTA CTA CTA CTA GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC(SEQ IDNO15)<序列表獨(dú)立文本>
SEQ ID NO12～15PCR引物5’-RACE的PCR反應(yīng)是94℃9分鐘的熱變性后，將94℃30秒、53℃30秒、72℃1分鐘的反應(yīng)進(jìn)行35個循環(huán)。由此得到約1400bp的米曲霉pepE片段。3’-RACE的PCR反應(yīng)是95℃9分鐘的熱變性后，將94℃30秒、60℃30秒、72℃1分鐘的反應(yīng)進(jìn)行35個循環(huán)。由此得到約300b的米曲霉pepE同源基因片段。
測定了上述基因片段的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)含有全長pepE同源序列。將該核苷酸序列和由該核苷酸序列編碼的氨基酸序列示于SEQ IDNO4。另外，單獨(dú)的氨基酸序列示于SEQ ID NO5。
將該基因序列插入質(zhì)粒pBluescript，用得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α菌株以專用編號AJ13858，于2001年3月19日保藏于經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)省產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)在的獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心、日本國茨城縣筑波市東1-1-1中央第6、郵政編碼305-8566)，保藏號為FERM P-18265，于平成14年(2002年)3月11日，在該中心移交為國際保藏，保藏編號FERMBP-7951。
實(shí)施例4、米曲霉中pepE的表達(dá)(1)轉(zhuǎn)化米曲霉的制備將實(shí)施例3中得到的米曲霉pepE cDNA連接到pBluescript的SmaI位點(diǎn)，制成質(zhì)粒pBSAopepE。用EcoRI、XbaI從該質(zhì)粒中切出pepEcDNA，連接到含有標(biāo)記基因niaD的載體pUNG1(Lee，B.R.等，AppliedMicrobiology Biotechnology，44，425-431(1995))的葡糖淀粉酶啟動子的下游，制成轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒pNGAPE。用10μg該質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
將米曲霉niaD300菌株的分生孢子接種于DPY培養(yǎng)基，在30℃振蕩培養(yǎng)24小時。用滅菌的紗布過濾培養(yǎng)液，回收菌體，用滅菌水洗滌。將該菌體移入試管，加入20ml酶液(1.0％Yatalase、(寶酒造(株)制造))，在30℃平緩振蕩3小時。在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形成的程度，在冰中保存。
將上述酶反應(yīng)液用Myracloth過濾，除去菌體殘余物，向含有原生質(zhì)體的濾液中加入等量的緩沖液A(1.2M山梨糖醇、50mM CaCl2、35mMNaCl、10mM Tris-HCl、pH7.5)，置于冰中。在0℃以1,500rpm離心5分鐘，然后緩慢停止，用10ml的緩沖液A清洗沉淀2次，使其懸浮于1ml的緩沖液A中。
向100μl原生質(zhì)體懸浮液中加入10μl DNA溶液(10μg)，置于冰中30分鐘。加入250μl緩沖液B(60％PEG(聚乙二醇)6000、50mM CaCl2、10mM Tris-HCl、pH7.5)，使其緩慢混合，再加入250μl緩沖液B，緩慢混合，然后再次加入850μl緩沖液B，緩慢混合，在室溫下靜置20分鐘。之后，加入10ml緩沖液A，顛倒試管，在0℃以1,500rpm離心5分鐘，將沉淀懸浮于500μl的緩沖液A中。
將上述懸浮液加入事先分裝并保溫的5ml上層瓊脂中，覆蓋在Czapek Dox培養(yǎng)基(1.2M山梨糖醇、0.3％硝酸鈉、0.2％氯化鉀、0.1％磷酸鉀、0.05％硫酸鎂7水合物、0.002％硫酸亞鐵7水合物、2％葡萄糖、pH5.5)之上，在30℃下培養(yǎng)。將生長的10株菌體繼代接種于Czapek Dox培養(yǎng)基，得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。
(2)pepE的產(chǎn)生將如上所述得到的轉(zhuǎn)化體在麥麩中培養(yǎng)，對其提取液進(jìn)行氨肽酶活性測定。
將20g麥麩、0.3g磷酸鉀、14ml蒸餾水充分?jǐn)嚢?，然后裝入三角燒瓶，在120℃下高壓滅菌30分鐘，制備培養(yǎng)基。向充分形成了孢子的培養(yǎng)皿中注入8ml滅菌水，攪拌，配制孢子懸浮液，將其散布于上述培養(yǎng)基上。將接種了孢子的培養(yǎng)基充分混合，在30℃培養(yǎng)3天。向上述制備的麩曲中加入10倍量的蒸餾水，用ストマツカ-處理5分鐘，得到酶粗提液。
如上所述制備的酶粗提液中的氨肽酶活性如下測定。即，向0.75ml1mM Leu-pNA(50mM磷酸鈉緩沖液、pH7.5)中加入0.02ml酶粗提液、0.015ml 100mM氯化鋅，在37℃反應(yīng)10分鐘，然后加入0.25ml 40％乙酸，使反應(yīng)終止。通過測定反應(yīng)液在405nm的吸光度，測定活性?；钚允且悦糠昼娚?μmol的對硝基苯胺的酶活性作為1個單位(U)。作為對照，對用只含標(biāo)記基因的載體DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體，也同樣地制備酶粗提液，按照上述方法測定氨肽酶活性。
結(jié)果可見，在引入本發(fā)明基因的菌株中，氨肽酶活性顯著上升(表2)。因而顯示了引入的氨肽酶基因可實(shí)際表達(dá)，產(chǎn)生了氨肽酶。
表2酶粗提液中的氨肽酶活性

實(shí)施例5.PepE的特性分析(1)pepE的純化將20g麥麩培養(yǎng)基裝入300ml燒瓶，在120℃高溫滅菌20分鐘，制備培養(yǎng)基。
配制實(shí)施例4中制備的PepE高表達(dá)轉(zhuǎn)化菌株的孢子懸浮液，將其接種于上述培養(yǎng)基。將接種了孢子的培養(yǎng)基充分混合，在30℃培養(yǎng)5天。中途培養(yǎng)48小時后需攪拌培養(yǎng)基。
將如上所述制備的麩曲浸泡于10倍量(w/w)的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.4)、1mM EDTA、1mM PMSF(苯甲磺酰氟)，在4℃靜置16小時，然后用紗布過濾和離心(4℃、10分鐘、7,500rpm)，得到的上清液作為酶粗提液。
向該酶粗提液中加入硫酸銨，得到40％-60％硫酸銨沉淀部分。將該沉淀溶解于20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.4)中。用0.45μm孔徑的過濾器過濾。預(yù)先用20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.4)、150mM NaCl平衡脫鹽柱(Amersham Pharmacia制造HiTrap Desalting(25ml))，將上述濾液過柱，用同一緩沖液洗脫。將得到的活性部分進(jìn)行超濾濃縮。
接著，預(yù)先用20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.4)平衡陰離子交換柱(Amersham Pharmacia制造HiTrap Q-sepharose HP(25ml))，將上述得到的試樣吸附于柱上，用3倍量柱體積的同一緩沖液洗滌。洗凈后，從0M至1M線性增加緩沖液NaCl的濃度，以柱體積的20倍量進(jìn)行洗脫。將在洗出液中回收的活性部分進(jìn)行超濾濃縮。
用HiLoad 26/60 Superdex 200pg(Amersham Pharmacia制造)，通過凝膠過濾層析來分組分離所得到的試樣。預(yù)先用20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.4)、150mM NaCl平衡該柱，將試樣過柱，用同一緩沖液洗脫，回收活性部分。通過以上操作得到純化PepE。
(2)PepE活性的測定該酶液的氨肽酶活性測定如下進(jìn)行。即，向0.73ml底物溶液(1mMLeu-pNA、50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)、2mM氯化鈷)中加入0.02ml酶粗提液，在37℃反應(yīng)10分鐘，加入0.25ml 40％乙酸，使反應(yīng)停止。測定該反應(yīng)液在405nm的吸光值，計(jì)算活性值。另外，活性是以每分鐘生成1μmol的對硝基苯胺的酶活性作為1個單位(U)。
以下顯示該酶的酶學(xué)各特性。
(i)底物特異性在上述活性測定法中，用X-pNA代替Leu-pNA，測定各種X-pNA的分解活性。以Leu-pNA的分解活性為100，相對活性顯示在下表(表3)中?？芍撁赣行Х纸釴末端含有Leu的肽。
表3PepE的底物特異性

(ii)最適溫度在上述活性測定方法中，在各種溫度下測定LAP活性。以37℃的活性值為100，相對活性顯示在圖1中。
(iii)反應(yīng)液中食鹽濃度的影響在上述活性測定方法中，測定添加各種濃度NaCl時的LAP活性。以NaCl未添加組的活性值為100，相對活性顯示在圖2中。可知該酶在高濃度的食鹽條件下保持充分的活性。
(iv)最適pH在上述活性測定方法中，將各種pH緩沖液加入反應(yīng)液中，使最終濃度為50mM，以此來代替50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)。以磷酸鉀緩沖液(pH7.5)中的LAP活性為100。各pH中的活性顯示在圖3中。
(v)pH穩(wěn)定性將純化酶在50mM各種pH緩沖液中，0℃保存24小時，然后用上述活性測定方法(pH7.5)測定LAP活性。以在pH7.5磷酸緩沖液中保存時的活性值為100，相對活性值顯示在表4中。
表4PepE的pH穩(wěn)定性

(vi)在食鹽溶液中的穩(wěn)定性將純化酶在0℃、0-4M NaCl、20mM磷酸緩沖液(pH7.5)中保存24小時，然后測定在與保存鹽濃度相同的鹽濃度的反應(yīng)液中的活性。結(jié)果顯示在表5中。
表5PepE在食鹽溶液中的穩(wěn)定性

(vii)金屬離子的影響在上述活性測定方法中，用各種2價金屬鹽代替氯化鈷，測定各種X-pNA的分解活性。以加入氯化鈷時的Leu-pNA的分解活性為100，相對活性顯示在表6中。
表6金屬離子對PepE活性的影響

根據(jù)本發(fā)明，提供獲得游離氨基酸含量高、呈味性強(qiáng)的蛋白質(zhì)水解物的方法。特別提供在含有大量食鹽的醬油釀造過程中，有效分解肽的氨肽酶以及編碼該酶的核酸分子，由此可進(jìn)一步提高醬油或蛋白質(zhì)水解物的呈味性。
以可表達(dá)的形式引入本發(fā)明核酸分子的宿主，可以用于生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
序列表<110>味之素株式會社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>新型氨肽酶和編碼所述肽酶的基因<130>Y1J0140<150>JP2001-78930<151>2001-03-19<150>JP2001-293348<151>2001-09-26<160>15<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>3383<212>DNA<213>Aspergillus nidulans<400>1gggagaagtg tcgcaggatc gagtgtttgt cagtgtgctg gtcacggagc cgagccaggt 60gcatattcag attgggcctg cagcatctag agtcttgatt gcaaaggagt ccggagtaaa 120tcactattcc gtgcctttcg acggacattc agggccggtg aggattgcga ttgtccgaca 180tggtagagaa gttaagaccg caacagggcc tgctataacg gaagagtgca cggacggtaa 240agtaaattgg aatgcatttg taggatcaag ttaatcgata taaaattgta ctagacacta 300aaagcgttgg gataaatggt atctagataa cttgtatgat gtttgcaata tcggggcctg 360ttatcgccag gcccggcctc ccagccactg ataagcgtca ctcctcagtt ctccgcatga 420ccgcatcttc cttcgctctt ctccaactct cctctctgtc gatgtcctct tcaccatctc 480tcttgtttcc atatccttag cctttctatt gcatttttat ttatcttttg aatatggcca 540agaaaattct gtctgacatc caccaccatg agtctaactt ggcttaccgc cagtatgccc 600agctgcctga aaccctccac ctcaactacc agcctcctac tgctactgca acccccgccg 660
cacacaccag cccgatccca gaggcaatca accccgacga ttactcgcag gcttactgcg 720attttatgac tgagcatccc accatttttc acgcagtcga tggcttctct aagcaactcg 780aaagcaaggg atacaagtac ctatccgagc gggaattatg gacgccgcag ctcaaacgcg 840gaggaaagta ctatacgact cgcaatggaa gctcgttgat tgcgttctct gtcggccccg 900agtataagag tgggaatggc ctcgctatca tcgccggcca cattgatgcc ctcacggcga 960agctcaagcc cgtctcaaaa cttcccaata aagctggata cattcagatg ggagttgctc 1020cttatgccgg cggtctgggc aagacatggt gggaccgtga tttgtctatc ggcgggaagg 1080ttctcgttcg taacgctagc accggcaagg ttgaatccaa gctagtcaag ttgaactggc 1140cgattgctcg catcccaacg ctagccgaac actttggcgc tccttcgcag gggccattca 1200acaaggaaac acagatggta cctatcattg gagtcgacaa ctctgatctt ttccagtcta 1260ccactccagc ggcagacgag ggcatcgaac ccggcacctt tgcctctacg cagcccccaa 1320aactcatcaa agtgatctcc aaggaacttg gaatcacaaa ctacagcagc attctcagct 1380gggagctaga actttatgac agccagcctg cacgtatcgg cggtattgac aaggatttta 1440tcttcgccgg ccgcatcgat gacaagctct gctgctacgc cgcacaggaa gccctcatgg 1500ctacctccga ccacacctct ccctcttcca tcaagatggt cggttacttt gatgatgagg 1560aaattggtag cttgctccgt cagggtgccc gctccaactt catgtctagc gtcatcgaac 1620gcattgcaca atcctttgca acatcatatg gacccgatct ccttgcccaa accgttgcaa 1680agagcttcct tatctcttct gatgtcatcc acgctgtcaa tcccaacttc ttgaatgtct 1740atctcgagaa ccacgcgcct cgtctcaatg tcggcgtctc cgtctccgca gactcaaacg 1800gccacatgac taccgacagt gtcagctacg gcttcatcaa gcgcgttgct gaaaagtgcg 1860gctctcagct gcaggtcttt caaatccgaa atgactcccg aagcggcgga accattgggc 1920ccatgaccag ctcgcggatt ggaatgaggg ccattgatgt cggtatccca cagttgagca 1980tgcatagcat tcgcgccacc acagggagtc gcgatcctgg gctgggtgtc aagctgttta 2040aggggttctt tgattacttt gaagaggtgg atcgtgagtt ttctgatttt taggttgtga 2100ctcttgtttt ctgtcgaggg gtgctgtcgc gctgcttggc cgtgtctagt ttggtttgca 2160tgattttggt gctagggttg aagtgcttgg gcattaagaa cctcatttag aatggtgact 2220tctttgtata cggggttcgg agtccgtcta tagaggcatg tgtaaggata aaaatcgaat 2280cctacataat tccaggctat gcacttgaac agacaacatc tagattctag gcacgtcaaa 2340ccatacaata tattaagagg cttccgtcta tttgatgctc cacccggcac gaatctcaac 2400agtaagcccc gtagtctact ccgtacttct tgcctgccga aggagaggat ggagatgagg 2460gtgacgaatg cgttgttttc accagtgccc caatgacagt tgcattatcc tcaatttaat 2520cagccccgtc tccttccagt tccaccccag cctttggagc agtccgggca atgctctctg 2580cgacacttac tgtcatgatc cccctacata aacacacggc ttcgcagccc cagccccagc 2640cccattcagg gccaaaagct ctagactgat ccgcatccca ctcacaactc ccatgttcca 2700aatcattgat gtgcgttgtg attgtagtag aaatgcccat tcccccaatg ctccagaaaa 2760ctggcggccg gggttcttgc ccaactgtaa gcgctaggct ccgagataat ctcttagact 2820tggatttcga tctggatctg gggttgctgt gcgatgagag gagttgtgga atcatacggg 2880
aaagcagggg ccgcagagtc ggtaggcagg cgcagactat gccgacgttg cattccactg 2940cggaccaggt tgcggcaccg acgttgtcat ctgcttgtcg ttagtagggg tttttttggg 3000ttgatggagg gacgtacagg ttgggtccga agagtcagcg attcttttta gggacatcaa 3060acggcaaatg cttgttatgc agacgctaga attactcagg attagcagat gcacacaccg 3120accatggaac agaaaacgta caaacccccc accgcaaaaa ttgcaataag agcaactctc 3180tgcttccttg gcaaatcaag actatacaag gcaggtatag ggataactag gatagcaagg 3240tccgtcgcaa tatgcattga agcattggag aaccacagag ccttcgaact gagacatgat 3300cccgggattg ttgggtccca gaaacgtgct actggtatgc agttcaagaa cccgctaagc 3360acagcccatg tgccgattga cga 3383<210>2<211>1916<212>DNA<213>Aspergillus nidulans<220>
<221>CDS<222>(72)..(1628)<400>2tgtcctcttc accatctctc ttgtttccat atccttagcc tttctattgc atttttattt 60atcttttgaa t atg gcc aag aaa att ctg tct gac atc cac cac cat gag 110Met Ala Lys Lys Ile Leu Ser Asp Ile His His His Glu1 5 10tct aac ttg gct tac cgc cag tat gcc cag ctg cct gaa acc ctc cac 158Ser Asn Leu Ala Tyr Arg Gln Tyr Ala Gln Leu Pro Glu Thr Leu His15 20 25ctc aac tac cag cct cct act gct act gca acc ccc gcc gca cac acc 206Leu Asn Tyr Gln Pro Pro Thr Ala Thr Ala Thr Pro Ala Ala His Thr30 35 40 45agc ccg atc cca gag gca atc aac ccc gac gat tac tcg cag gct tac 254Ser Pro Ile Pro Glu Ala Ile Asn Pro Asp Asp Tyr Ser Gln Ala Tyr
50 55 60tgc gat ttt atg act gag cat ccc acc att ttt cac gca gtc gat ggc 302Cys Asp Phe Met Thr Glu His Pro Thr Ile Phe His Ala Val Asp Gly65 70 75ttc tct aag caa ctc gaa agc aag gga tac aag tac cta tcc gag cgg 350Phe Ser Lys Gln Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Lys Tyr Leu Ser Glu Arg80 85 90gaa tta tgg acg ccg cag ctc aaa cgc gga gga aag tac tat acg act 398Glu Leu Trp Thr Pro Gln Leu Lys Arg Gly Gly Lys Tyr Tyr Thr Thr95 100 105cgc aat gga agc tcg ttg att gcg ttc tct gtc ggc ccc gag tat aag 446Arg Asn Gly Ser Ser Leu Ile Ala Phe Ser Val Gly Pro Glu Tyr Lys110 115 120 125agt ggg aat ggc ctc gct atc atc gcc ggc cac att gat gcc ctc acg 494Ser Gly Asn Gly Leu Ala Ile Ile Ala Gly His Ile Asp Ala Leu Thr130 135 140gcg aag ctc aag ccc gtc tca aaa ctt ccc aat aaa gct gga tac att 542Ala Lys Leu Lys Pro Val Ser Lys Leu Pro Asn Lys Ala Gly Tyr Ile145 150 155cag atg gga gtt gct cct tat gcc ggc ggt ctg ggc aag aca tgg tgg 590Gln Met Gly Val Ala Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly Lys Thr Trp Trp160 165 170gac cgt gat ttg tct atc ggc ggg aag gtt ctc gtt cgt aac get agc 638Asp Arg Asp Leu Ser Ile Gly Gly Lys Val Leu Val Arg Asn Ala Ser175 180 185acc ggc aag gtt gaa tcc aag cta gtc aag ttg aac tgg ccg att gct 686Thr Gly Lys Val Glu Ser Lys Leu Val Lys Leu Asn Trp Pro Ile Ala190 195 200 205
cgc atc cca acg cta gcc gaa cac ttt ggc gct cct tcg cag ggg cca 734Arg Ile Pro Thr Leu Ala Glu His Phe Gly Ala Pro Ser Gln Gly Pro210 215 220ttc aac aag gaa aca cag atg gta cct atc att gga gtc gac aac tct 782Phe Asn Lys Glu Thr Gln Met Val Pro Ile Ile Gly Val Asp Asn Ser225 230 235gat ctt ttc cag tct acc act cca gcg gca gac gag ggc atc gaa ccc 830Asp Leu Phe Gln Ser Thr Thr Pro Ala Ala Asp Glu Gly Ile Glu Pro240 245 250ggc acc ttt gcc tct acg cag ccc cca aaa ctc atc aaa gtg atc tcc 878Gly Thr Phe Ala Ser Thr Gln Pro Pro Lys Leu Ile Lys Val Ile Ser255 260 265aag gaa ctt gga atc aca aac tac agc agc att ctc agc tgg gag cta 926Lys Glu Leu Gly Ile Thr Asn Tyr Ser Ser Ile Leu Ser Trp Glu Leu270 275 280 285gaa ctt tat gac agc cag cct gca cgt atc ggc ggt att gac aag gat 974Glu Leu Tyr Asp Ser Gln Pro Ala Arg Ile Gly Gly Ile Asp Lys Asp290 295 300ttt atc ttc gcc ggc cgc atc gat gac aag ctc tgc tgc tac gcc gca 1022Phe Ile Phe Ala Gly Arg Ile Asp Asp Lys Leu Cys Cys Tyr Ala Ala305 310 315cag gaa gcc ctc atg gct acc tcc gac cac acc tct ccc tct tcc atc 1070Gln Glu Ala Leu Met Ala Thr Ser Asp His Thr Ser Pro Ser Ser Ile320 325 330aag atg gtc ggt tac ttt gat gat gag gaa att ggt agc ttg ctc cgt 1118Lys Met Val Gly Tyr Phe Asp Asp Glu Glu Ile Gly Ser Leu Leu Arg335 340 345
cag ggt gcc cgc tcc aac ttc atg tct agc gtc atc gaa cgc att gca 1166Gln Gly Ala Arg Ser Asn Phe Met Ser Ser Val Ile Glu Arg Ile Ala350 355 360 365caa tcc ttt gca aca tca tat gga ccc gat ctc ctt gcc caa acc gtt 1214Gln Ser Phe Ala Thr Ser Tyr Gly Pro Asp Leu Leu Ala Gln Thr Val370 375 380gca aag agc ttc ctt atc tct tct gat gtc atc cac gct gtc aat ccc 1262Ala Lys Ser Phe Leu Ile Ser Ser Asp Val Ile His Ala Val Asn Pro385 390 395aac ttc ttg aat gtc tat ctc gag aac cac gcg cct cgt ctc aat gtc 1310Asn Phe Leu Asn Val Tyr Leu Glu Asn His Ala Pro Arg Leu Asn Val400 405 410ggc gtc tcc gtc tcc gca gac tca aac ggc cac atg act acc gac agt 1358Gly Val Ser Val Ser Ala Asp Ser Asn Gly His Met Thr Thr Asp Ser415 420 425gtc agc tac ggc ttc atc aag cgc gtt gct gaa aag tgc ggc tct cag 1406Val Ser Tyr Gly Phe Ile Lys Arg Val Ala Glu Lys Cys Gly Ser Gln430435 440 445ctg cag gtc ttt caa atc cga aat gac tcc cga agc ggc gga acc att 1454Leu Gln Val Phe Gln Ile Arg Asn Asp Ser Arg Ser Gly Gly Thr Ile450 455 460ggg ccc atg acc agc tcg cgg att gga atg agg gcc att gat gtc ggt 1502Gly Pro Met Thr Ser Ser Arg Ile Gly Met Arg Ala Ile Asp Val Gly465 470 475atc cca cag ttg agc atg cat agc att cgc gcc acc aca ggg agt cgc 1550Ile Pro Gln Leu Ser Met His Ser Ile Arg Ala Thr Thr Gly Ser Arg480 485 490gat cct ggg ctg ggt gtc aag ctg ttt aag ggg ttc ttt gat tac ttt 1598
Asp Pro Gly Leu Gly Val Lys Leu Phe Lys Gly Phe Phe Asp Tyr Phe495 500 505gaa gag gtg gat cgt gag ttt tct gat ttt taggttgtga ctcttgtttt 1648Glu Glu Val Asp Arg Glu Phe Ser Asp Phe510 515ctgtcgaggg gtgctgtcgc gctgcttggc cgtgtctagt ttggtttgca tgattttggt 1708gctagggttg aagtgcttgg gcattaagaa cctcatttag aatggtgact tctttgtata 1768cggggttcgg agtccgtcta tagaggcatg tgtaaggata aaaatcgaat cctacataat 1828tccaggctat gcacttgaac agacaacatc tagattctag gcacgtcaaa ccatacaata 1888tattaagagg cttccgtcta tttgatgc1916<210>3<211>519<212>PRT<213>Aspergillus nidulans<400>3Met Ala Lys Lys Ile Leu Ser Asp Ile His His His Glu Ser Asn Leu1 5 10 15Ala Tyr Arg Gln Tyr Ala Gln Leu Pro Glu Thr Leu His Leu Asn Tyr20 25 30Gln Pro Pro Thr Ala Thr Ala Thr Pro Ala Ala His Thr Ser Pro Ile35 40 45Pro Glu Ala Ile Asn Pro Asp Asp Tyr Ser Gln Ala Tyr Cys Asp Phe50 55 60Met Thr Glu His Pro Thr Ile Phe His Ala Val Asp Gly Phe Ser Lys
65 70 75 80Gln Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Lys Tyr Leu Ser Glu Arg Glu Leu Trp85 90 95Thr Pro Gln Leu Lys Arg Gly Gly Lys Tyr Tyr Thr Thr Arg Asn Gly100 105 110Ser Ser Leu Ile Ala Phe Ser Val Gly Pro Glu Tyr Lys Ser Gly Asn115 120 125Gly Leu Ala Ile Ile Ala Gly His Ile Asp Ala Leu Thr Ala Lys Leu130 135 140Lys Pro Val Ser Lys Leu Pro Asn Lys Ala Gly Tyr Ile Gln Met Gly145 150 155 160Val Ala Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly Lys Thr Trp Trp Asp Arg Asp165 170 175Leu Ser Ile Gly Gly Lys Val Leu Val Arg Asn Ala Ser Thr Gly Lys180 185 190Val Glu Ser Lys Leu Val Lys Leu Asn Trp Pro Ile Ala Arg Ile Pro195 200 205Thr Leu Ala Glu His Phe Gly Ala Pro Ser Gln Gly Pro Phe Asn Lys210 215 220Glu Thr Gln Met Val Pro Ile Ile Gly Val Asp Asn Ser Asp Leu Phe225 230 235 240Gln Ser Thr Thr Pro Ala Ala Asp Glu Gly Ile Glu Pro Gly Thr Phe245 250 255Ala Ser Thr Gln Pro Pro Lys Leu Ile Lys Val Ile Ser Lys Glu Leu260 265 270
Gly Ile Thr Asn Tyr Ser Ser Ile Leu Ser Trp Glu Leu Glu Leu Tyr275 280 285Asp Ser Gln Pro Ala Arg Ile Gly Gly Ile Asp Lys Asp Phe Ile Phe290 295 300Ala Gly Arg Ile Asp Asp Lys Leu Cys Cys Tyr Ala Ala Gln Glu Ala305 310 315 320Leu Met Ala Thr Ser Asp His Thr Ser Pro Ser Ser Ile Lys Met Val325 330 335Gly Tyr Phe Asp Asp Glu Glu Ile Gly Ser Leu Leu Arg Gln Gly Ala340 345 350Arg Ser Asn Phe Met Ser Ser Val Ile GluArg Ile Ala Gln Ser Phe355 360365Ala Thr Ser Tyr Gly Pro Asp Leu Leu Ala Gln Thr Val Ala Lys Ser370 375 380Phe Leu Ile Ser Ser Asp Val Ile His Ala Val Asn Pro Asn Phe Leu385 390 395 400Asn Val Tyr Leu Glu Asn His Ala Pro Arg Leu Asn Val Gly Val Ser405 410 415Val Ser Ala Asp Ser Asn Gly His Met Thr Thr Asp Ser Val Ser Tyr420 425 430Gly Phe Ile Lys Arg Val Ala Glu Lys Cys Gly Ser Gln Leu Gln Val435 440 445Phe Gln Ile Arg Asn Asp Ser Arg Ser Gly Gly Thr Ile Gly Pro Met450 455 460
Thr Ser Ser Arg Ile Gly Met Arg Ala Ile Asp Val Gly Ile Pro Gln465 470 475 480Leu Ser Met His Ser Ile Arg Ala Thr Thr Gly Ser Arg Asp Pro Gly485 490 495Leu Gly Val Lys Leu Phe Lys Gly Phe Phe Asp Tyr Phe Glu Glu Val500 505 510Asp Arg Glu Phe Ser Asp Phe515<210>4<211>1679<212>DNA<213>Aspergillus oryzae<220>
<221>CDS<222>(73)..(1602)<400>4caggcttaaa ccgcattccg acaagatatc tagcctttaa actaagaaat tttccaactc 60ctagccttcg ac atg acc aaa agg agt gtc ctt gat ctc cgt gat tct gcc 111Met Thr Lys Arg Ser Val Leu Asp Leu Arg Asp Ser Ala1 5 10atg gct tat cgc ctg tcg gcc cag ctt cct gag ccc tcc cca gcc acc159Met Ala Tyr Arg Leu Ser Ala Gln Leu Pro Glu Pro Ser Pro Ala Thr15 20 25att gca acc cca gtg gcg agg agt ggc ccc ttc gcc ccg gaa gat tac207Ile Ala Thr Pro Val Ala Arg Ser Gly Pro Phe Ala Pro Glu Asp Tyr30 35 40 45
acg aaa cca tac tgc gaa ttc atg aca gca aac ccc aca atc ttt cac 255Thr Lys Pro Tyr Cys Glu Phe Met Thr Ala Asn Pro Thr Ile Phe His50 55 60gcc gtt gat ggt ttc acc agg cag ctc gaa agc cag gga tac aag cgc 303Ala Val Asp Gly Phe Thr Arg Gln Leu Glu Ser Gln Gly Tyr Lys Arg65 70 75ctt ccc gag cgc gag acg tgg aac tcc aag tta gag aag ggt ggg aag 351Leu Pro Glu Arg Glu Thr Trp Asn Ser Lys Leu Glu Lys Gly Gly Lys80 85 90tac tac gtc act cgg aat ggt agt gct ttc atc tca ttc tca att gga 399Tyr Tyr Val Thr Arg Asn Gly Ser Ala Phe Ile Ser Phe Ser Ile Gly95 100 105aga gat tat aaa agt ggc aat gga atg gcc att gtt gca ggt cat atc 447Arg Asp Tyr Lys Ser Gly Asn Gly Met Ala Ile Val Ala Gly His Ile110 115 120 125gat gca ctc acc gcc aaa ttg aag ccc gtg tcc aag ctg ccc aac aag 495Asp Ala Leu Thr Ala Lys Leu Lys Pro Val Ser Lys Leu Pro Asn Lys130 135 140gct ggc ttt tcc cag ctc gga gtt gcg ccc tac gca ggc gct ctg agt 543Ala Gly Phe Ser Gln Leu Gly Val Ala Pro Tyr Ala Gly Ala Leu Ser145 150 155gac aca tgg tgg gac cgc gat ctc tca ata ggt ggc cgt gtt ctg gtc 591Asp Thr Trp Trp Asp Arg Asp Leu Ser Ile Gly Gly Arg Val Leu Val160 165 170caa gac tcc aac acc ggg aaa gtc gag tcc aaa tta gtc aaa ttg gac 639Gln Asp Ser Asn Thr Gly Lys Val Glu Ser Lys Leu Val Lys Leu Asp175 180 185
tgg ccc att gct cgg atc cca acc ctg gca cct cat ttc ggg gct ccc 687Trp Pro Ile Ala Arg Ile Pro Thr Leu Ala Pro His Phe Gly Ala Pro190 195 200 205tcg caa ggc ccc ttc aac aaa gag act cag atg gtg cct ata att ggc 735Ser Gln Gly Pro Phe Asn Lys Glu Thr Gln Met Val Pro Ile Ile Gly210 215 220gtt gat aac tcc gat ctt ttc cag cag caa gcc cca tcc aag ata gat 783Val Asp Asn Ser Asp Leu Phe Gln Gln Gln Ala Pro Ser Lys Ile Asp225 230 235caa gac aac ggg atc aaa cct ggt aca ttt gca gcc acg caa ccg gaa 831Gln Asp Asn Gly Ile Lys Pro Gly Thr Phe Ala Ala Thr Gln Pro Glu240 245 250aag ctt gtc aaa gtc ata tcc aag gag ctt ggt atc aca gac tac agc 879Lys Leu Val Lys Val Ile Ser Lys Glu Leu Gly Ile Thr Asp Tyr Ser255 260 265tcg att ata agc tgg gag ctg gag ctg tat gac agt caa cca gca caa 927Ser Ile Ile Ser Trp Glu Leu Glu Leu Tyr Asp Ser Gln Pro Ala Gln270 275 280 285gtt ggt ggc ctg gac aag gac ctg att ttt gct ggt cgc att gac gat 975Val Gly Gly Leu Asp Lys Asp Leu Ile Phe Ala Gly Arg Ile Asp Asp290 295 300aag ctc tgc tgc tat gcc gct cag gaa gct ctg ctt gcc tca tcc gac 1023Lys Leu Cys Cys Tyr Ala Ala Gln Glu Ala Leu Leu Ala Ser Ser Asp305 310 315agt act tca act agc tct atc aag atg gtc ggt atg ttt gat gac gag 1071Ser Thr Ser Thr Ser Ser Ile Lys Met Val Gly Met Phe Asp Asp Glu320 325 330gaa att gga agc ctg ctt cgc cag gga gct cga tcc aac ttc atg agc 1119
Glu Ile Gly Ser Leu Leu Arg Gln Gly Ala Arg Ser Asn Phe Met Ser335 340 345agt gtc ata gag cgt att acg gaa gcc ttc tca ccc aat tac ggt cct 1167Ser Val Ile Glu Arg Ile Thr Glu Ala Phe Ser Pro Asn Tyr Gly Pro350 355 360 365aac gtg ctg tct caa act gtg gcg aac agc ttc ttc gtg tct tcg gac 1215Asn Val Leu Ser Gln Thr Val Ala Asn Ser Phe Phe Val Ser Ser Asp370 375 380gtc atc cat gcg gtc aat ccg aac ttc ctt ggt gtc tat ctt gag aac 1263Val Ile His Ala Val Asn Pro Asn Phe Leu Gly Val Tyr Leu Glu Asn385 390 395cat gct ccc cgt ctg aac gtc ggt gtg gcc gtc tcg gct gac tct aac 1311His Ala Pro Arg Leu Asn Val Gly Val Ala Val Ser Ala Asp Ser Asn400 405 410ggc cat atg aca aca gac agt gtg agc tac gga ttc atc aag cgt gtc 1359Gly His Met Thr Thr Asp Ser Val Ser Tyr Gly Phe Ile Lys Arg Val415 420 425gct gat cga tgt ggc tcg acc ttg cag gtc ttc cag att cgt aat gac 1407Ala Asp Arg Cys Gly Ser Thr Leu Gln Val Phe Gln Ile Arg Asn Asp430 435 440 445tcc cgt agt ggc ggg act att gga ccc atg acc agt tct cgc att ggc 1455Ser Arg Ser Gly Gly Thr Ile Gly Pro Met Thr Ser Ser Arg Ile Gly450 455 460atg agg gcc att gac gtg ggg atc ccg cag ttg agt atg cac agt atc 1503Met Arg Ala Ile Asp Val Gly Ile Pro Gln Leu Ser Met His Ser Ile465 470 475cgt gcg act acc ggt agt ttg gat ccg gga ttg ggt gtg aag ctg ttc 1551Arg Ala Thr Thr Gly Ser Leu Asp Pro Gly Leu Gly Val Lys Leu Phe
480 485 490aag ggc ttt ttc gac tat ttc gag gag gtg gac aag gaa ttt gca gat1599Lys Gly Phe Phe Asp Tyr Phe Glu Glu Val Asp Lys Glu Phe Ala Asp495 500 505ttc tgatgcgctc ctctggaata ctaggaaatg tttccatcga taagtatgca 1652Phe510ctatctggga ttccgatgtt ggatctg 1679<210>5<211>510<212>PRT<213>Aspergillus oryzae<400>5Met Thr Lys Arg Ser Val Leu Asp Leu Arg Asp Ser Ala Met Ala Tyr1 5 10 15Arg Leu Ser Ala Gln Leu Pro Glu Pro Ser Pro Ala Thr Ile Ala Thr20 25 30Pro Val Ala Arg Ser Gly Pro Phe Ala Pro Glu Asp Tyr Thr Lys Pro35 40 45Tyr Cys Glu Phe Met Thr Ala Asn Pro Thr Ile Phe His Ala Val Asp50 55 60Gly Phe Thr Arg Gln Leu Glu Ser Gln Gly Tyr Lys Arg Leu Pro Glu65 70 75 80Arg Glu Thr Trp Asn Ser Lys Leu Glu Lys Gly Gly Lys Tyr Tyr Val85 90 95
Thr Arg Asn Gly Ser Ala Phe Ile Ser Phe Ser Ile Gly Arg Asp Tyr100 105 110Lys Ser Gly Asn Gly Met Ala Ile Val Ala Gly His Ile Asp Ala Leu115 120 125Thr Ala Lys Leu Lys Pro Val Ser Lys Leu Pro Asn Lys Ala Gly Phe130 135 140Ser Gln Leu Gly Val Ala Pro Tyr Ala Gly Ala Leu Ser Asp Thr Trp145 150 155 160Trp Asp Arg Asp Leu Ser Ile Gly Gly Arg Val Leu Val Gln Asp Ser165 170 175Asn Thr Gly Lys Val Glu Ser Lys Leu Val Lys Leu Asp Trp Pro Ile180 185 190Ala Arg Ile Pro Thr Leu Ala Pro His Phe Gly Ala Pro Ser Gln Gly195 200 205Pro Phe Asn Lys Glu Thr Gln Met Val Pro Ile Ile Gly Val Asp Asn210 215 220Ser Asp Leu Phe Gln Gln Gln Ala Pro Ser Lys Ile Asp Gln Asp Asn225 230 235 240Gly Ile Lys Pro Gly Thr Phe Ala Ala Thr Gln Pro Glu Lys Leu Val245 250 255Lys Val Ile Ser Lys Glu Leu Gly Ile Thr Asp Tyr Ser Ser Ile Ile260 265 270Ser Trp Glu Leu Glu Leu Tyr Asp Ser Gln Pro Ala Gln Val Gly Gly275 280 285Leu Asp Lys Asp Leu Ile Phe Ala Gly Arg Ile Asp Asp Lys Leu Cys
290 295 300Cys Tyr Ala Ala Gln Glu Ala Leu Leu Ala Ser Ser Asp Ser Thr Ser305 310 315 320Thr Ser Ser Ile Lys Met Val Gly Met Phe Asp Asp Glu Glu Ile Gly325 330 335Ser Leu Leu Arg Gln Gly Ala Arg Ser Asn Phe Met Ser Ser Val Ile340 345 350Glu Arg Ile Thr Glu Ala Phe Ser Pro Asn Tyr Gly Pro Asn Val Leu355 360 365Ser Gln Thr Val Ala Asn Ser Phe Phe Val Ser Ser Asp Val Ile His370 375 380Ala Val Asn Pro Asn Phe Leu Gly Val Tyr Leu Glu Asn His Ala Pro385 390 395 400Arg Leu Asn Val Gly Val Ala Val Ser Ala Asp Ser Asn Gly His Met405 410 415Thr Thr Asp Ser Val Ser Tyr Gly Phe Ile Lys Arg Val Ala Asp Arg420 425 430Cys Gly Ser Thr Leu Gln Val Phe Gln Ile Arg Asn Asp Ser Arg Ser435 440 445Gly Gly Thr Ile Gly Pro Met Thr Ser Ser Arg Ile Gly Met Arg Ala450 455 460Ile Asp Val Gly Ile Pro Gln Leu Ser Met His Ser Ile Arg Ala Thr465 470 475 480Thr Gly Ser Leu Asp Pro Gly Leu Gly Val Lys Leu Phe Lys Gly Phe485 490 495
Phe Asp Tyr Phe Glu Glu Val Asp Lys Glu Phe Ala Asp Phe500 505 510<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>6ctcaaacggc cacatgacta c 21<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>7gtctgttcaa gtgcatagcc tg 22<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物
<400>8caccaccatg agtctaactt gg22<210>9<211>22<212>DNA倱<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>9gtctgttcaa gtgcatagcc tg22<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>10cgtggtacca tggtctagag t 21<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物
<400>11aatcgcagta agcctgcgag 20<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>12cgtggtacca tggtctagag t 21<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>13catgggccca atggttccgc 20<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>14
ccagattcgt aatgactccc g 21<210>15<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>15ctactactac taggccacgc gtcgactagt ac 3權(quán)利要求
1.下述(A)～(D)的任一項(xiàng)所示的蛋白質(zhì)(A)具有序列表SEQ ID NO2氨基酸編號1～519所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B)具有序列表SEQ ID NO4氨基酸編號1～510所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(C)由在序列表SEQ ID NO2氨基酸編號1～519所示的氨基酸序列中包含1個或多個氨基酸置換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列構(gòu)成，且具有催化從肽的N末端釋放氨基酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)；(D)由在序列表SEQ ID NO4氨基酸編號1～510所示的氨基酸序列中包含1個或多個氨基酸置換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列構(gòu)成，且具有催化從肽的N末端釋放氨基酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)。
2.編碼下述(A)～(D)任一項(xiàng)所示的蛋白質(zhì)的核酸分子(A)具有序列表SEQ ID NO2氨基酸編號1～519所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B)具有序列表SEQ ID NO4氨基酸編號1～510所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(C)由在序列表SEQ ID NO2氨基酸編號1～519所示的氨基酸序列中包含1個或多個氨基酸置換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列構(gòu)成，且具有催化從肽的N末端釋放氨基酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)；(D)由在序列表SEQ ID NO4氨基酸編號1～510所示的氨基酸序列中包含1個或多個氨基酸置換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列構(gòu)成，且具有催化從肽的N末端釋放氨基酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求2的核酸分子，所述核酸分子是下述(a)～(d)的任一項(xiàng)所示的DNA(a)含有由序列表SEQ ID NO2中記載的核苷酸序列中核苷酸編號72～1628構(gòu)成的核苷酸序列的DNA；(b)含有由序列表SEQ ID NO4中記載的核苷酸序列中核苷酸編號73～1602構(gòu)成的核苷酸序列的DNA；(c)與上述(a)的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)性條件下雜交，且編碼具有催化從肽的N末端釋放氨基酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的DNA；(d)與上述(b)的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)性條件下雜交，且編碼具有催化從肽的N末端釋放氨基酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)的DNA。
4.權(quán)利要求3的核酸分子，所述核酸分子具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
5.一種重組核酸分子，所述核酸分子含有權(quán)利要求2的核酸分子。
6.一種轉(zhuǎn)化微生物宿主，其中權(quán)利要求2的核酸分子以可表達(dá)的形式引入到所述轉(zhuǎn)化微生物宿主中。
7.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)化微生物宿主，所述轉(zhuǎn)化微生物宿主是絲狀菌或酵母或埃希氏菌屬(Escherichia)細(xì)菌。
8.一種氨肽酶的制備方法，其特征在于培養(yǎng)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)化微生物宿主，使引入到所述轉(zhuǎn)化微生物宿主中的核酸分子表達(dá)，回收所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
9.具有下述1)～8)的性質(zhì)的氨肽酶1)分解在N末端含有亮氨酸、甲硫氨酸的肽或蛋白質(zhì)，釋放出亮氨酸或甲硫氨酸；2)最適pH為7.0～7.5；3)最適溫度為37～45℃；4)以在不存在食鹽的條件下的活性為100％時，在3M食鹽濃度下顯示80％以上的殘存活性；5)以在0℃、食鹽不存在、保存24小時的條件下的活性為100％時，在0℃、3M食鹽存在下、保存24小時的條件下顯示80％以上的殘存活性；6)以在pH7.5、0℃、24小時保存條件下的活性為100％時，在pH5.8～9.5范圍、0℃、保存24小時的條件下顯示60％以上的殘存活性；7)在非變性聚丙烯酰胺凝膠上顯示550kD的分子量，在變性聚丙烯酰胺凝膠上顯示22、33kD的分子量；8)活化時需要鈷離子或鋅離子。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供來源于曲菌的可有效分解難分解的肽氨肽酶，以及編碼該氨肽酶的基因。本發(fā)明提供來源于構(gòu)巢曲霉的氨肽酶及編碼該酶的核酸分子。本發(fā)明特別提供具有序列表SEQ ID NO2氨基酸編號1～519表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或由在該氨基酸序列中包含1個或多個氨基酸置換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列構(gòu)成，且具有催化從肽的N末端釋放氨基酸的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)；以及編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子。
文檔編號C12N9/62GK1501975SQ0280672
公開日2004年6月2日 申請日期2002年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月19日
發(fā)明者鯉渕恭子, 二宮大記, 小島麻里, 上田要一, 丸山潤一, 北本勝彥, 一, 彥, 記, 里, 鯉 恭子 申請人:味之素株式會社