專利名稱：使用兩組同源引物的pcr方法及其反應液和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學技術，特別是涉及一種聚合酶鏈式反應的方法及其反應液和在制備醫學微生物核酸檢測試劑中應用。
背景技術：
經典聚合酶鏈式反應方法發明于八十年代中期，它采用正、反引物各一個來擴增特定的基因。十幾年來已發展了若干同時使用二對或更多引物的PCR方法，其中，主要有多重引物PCR和簡并引物PCR。
多重PCR是在一個反應管內同時擴增二個或二個以上的目標基因，多重PCR的每一對引物順序與相應的目標基因匹配，引物彼此之間不存在同源性。多重PCR也已用于擴增同一基因的不同區域，但引物對之間需相隔較遠，否則相互干擾，這種情況下引物間相互也無同源性。
簡并引物PCR方法是根據一段多肽的氨基酸順序而非核酸順序來設計引物的，由于氨基酸密碼子的高度簡并性，對應5-6個氨基酸多肽的核苷酸順序通常有32，64，128種或更多的可能性，所以，一套簡并引物往往包括幾十種引物，通常是在寡核苷酸合成過程中制備的，每一個引物的長度相同。簡并引物PCR方法也用來擴增病毒核酸或其他基因的高度變異區，其引物同樣具有上述特征。
本發明的正反兩組同源引物PCR方法也使用二對以上的引物，但是在原理、引物特性和用途上均與多重PCR和簡并引物PCR大不相同。本發明的兩組同原引物是根據目標基因各種變種的順序而設計的，每組引物的數量有限，相互之間高度同源，長度可相同或有差異，其目的是能使PCR在嚴謹的條件下擴增各種變種，從而減少或消除PCR擴增的假陰性。
PCR已廣泛用于人體內微生物的檢測包括感染性疾病的臨床診斷，其原理是病毒，細菌或其他微生物的基因順序與人體不同，根據目標微生物的某種基因順序可以設計高度專一的引物，如果人感染該微生物，則從人體某些部位如血液中提取DNA或RNA，通過PCR方法能擴增得到該微生物特定的基因片段，反之則否。但是，臨床診斷實踐表明現行的PCR方法往往存在較嚴重的假陽性和假陰性問題。假陽性是由于樣品中存在干擾物質或操作過程中極微量模板的污染所造成的。針對假陽性原因可分別通過改進引物設計，提高PCR反應嚴謹性，增加產物檢測手段如核酸雜交，和創造良好的檢測環境，加強檢測人員訓練，規范操作程序，采取各種技術措施如加入UDG的方法或封閉式的實時熒光定量方法來加以克服。
相對而言，PCR診斷的假陰性問題更為嚴重，既未被充分認知，又未找到有效的克服辦法。以在我國感染率極高的乙型肝炎病毒(HBV)為例，大量的關于HBV的PCR診斷和免疫診斷診比較研究表明，乙型肝炎病毒表面抗原陽性的，即用免疫方法確認感染HBV并處活動期的病人中，均有一部分未能用PCR方法檢出，有時假陰性高達50％。假陰性的造成除了由于PCR反應的不穩定性，樣品DNA或RNA提取過程失當等技術方面原因外，主要是由于HBV病毒的核酸順序的多變性。至今，已提交基因庫的各種HBV變種分離株和克隆的全基因或部分基因順序已超過一千種，相互之間幾乎都各不相同。所以，盡管每一位研究者都認識到并強調在HBV基因組的保守區來尋找選擇引物，實際上卻很難找到一對引物既具有作為優秀引物的的嚴謹性，同時又能與所有變種的順序匹配。對文獻報導的若干HBV引物的分析表明，幾乎每對引物的順序都與相當數量的變種的順序存在嚴重的錯配。在嚴謹的PCR反應條件下或樣品中病毒濃度較低的情況下，核酸順序與引物順序有嚴重錯配的變種就得不到擴增產物。為了減少假陰性可以降低PCR反應的嚴謹性例如降低退火溫度，使引物與變種模板能在有較嚴重錯配的情況下退火，但是低溫退火必然增加非專一產物的形成。另一種方法是在引物中采用脫氧次黃嘌呤核苷酸(dITP)或其他互補專一性差的特殊核苷酸來替代A，C，T或G。但這種方法有若干缺點。1dITP或其他特殊核苷酸都是非天然核苷酸。2dITP雖能與四種核苷酸互補，但不及A與T之間或G與C之間的互補強，如果引物內需要用二個或多個dITP來取代的話，引物與模板的結合強度就更低。3當含dITP的引物摻入擴增鏈后，含dITP的鏈又成為下一輪擴增的模板，A，T，C和G都有可能摻入，最后PCR產物就分子的順序而言將是復雜的異源性混合物。
發明內容
發明所要解決的技術問題本發明所需要解決的技術問題是提供一種使用兩組同源引物的聚合酶鏈式反應方法及其反應液和在制備醫學微生物核酸檢測試劑中的應用，以突破現有技術中設計于同源基因的正反引物僅一對的常規，克服同源基因檢測中不能同時避免假陰性或非轉一性產物的缺陷。
技術方案本發明則采用兩組數量有限，長度完全相同或略有差別，順序高度同源的引物，在嚴謹的條件下進行PCR，以克服用臨床診斷的假陰性問題。
所用的正、反引物為同源的分別針對已知目標基因同一區段設計的2組引物，每組包括1-3條引物。也就是說，使用一組正引物和一個反引物，或者使用一組反引物和一個正引物，或者同時使用一組正引物和一組反引物進行PCR反應，根據測定需要和目標基因的變化程度而決定。
一組正引物或一組反引物的各個引物不僅有相同的目標基因，而且位于基因的同一部位，引物間彼此高度同源。
同源引物PCR方法中的引物順序是根據目標基因的各種變種的順序來選擇設計的，每一個引物均與一個或若干變種的順序完全匹配或高度匹配，各條引物與模板的錯配堿基數為0-3。使用兩組同源引物能與所有變種或比使用一個引物時與更多的變種的順序完全匹配或高度匹配，從而減少或消除因引物順序與模板順序存在嚴重錯配而導致的假陰性。
兩組同源引物內引物間長度完全相同或有1-10核苷酸的差異；相應地引物在基因中的位置也完全相同或有1-10核苷酸參差，也可以說，每組同源引物的各引物在目標基因中的5’起始位置相差0-10核苷酸。由此，應用同源引物方法的PCR擴增產物的長度完全相同或有若干個堿基的差別。因為PCR產物的長度通常大于200堿基，所以，即使PCR產物長度有若干堿基差別，也顯示出相同的電泳條帶。
當樣品中只存在某一種變種時，其中一個引物與模板的匹配是顯著高于其他引物，在嚴謹的PCR條件下，該引物與模板退火，在擴增中起全部或主要的作用。
設計同源引物時，除了考慮引物順序與目標基因各變種順序匹配，每一個引物自身應有良好的嚴謹性，同時要使正同源引物之間，反同源引物之間和正、反同源引物之間均只有較低的3’端互補堿基數。從而使同源引物PCR的有效引物的作用不受其他引物的干擾。
本發明的同源引物聚合酶鏈式反應的反應液，其組成包括2組正反引物、四種脫氧核糖核酸、鎂離子、緩沖液、耐熱DNA聚合酶和目標DNA，正反引物組在反應液中的濃度范圍上限比標準PCR高，單組同源引物的濃度之和為0.1-2μM。
所說的同源引物聚合酶鏈式反應方法在制備醫學微生物核酸檢測試劑中有其獨特的應用，比如將正、反引物組分別設計于同種病毒的不同基因型、血清型或其亞型的基因同源區段，如乙型肝炎病毒不同血清型；或設計于同屬細菌的不同種、亞種、變種或其變異株的基因同源區段，如嗜酸乳桿菌的16S RNA基因。
有益效果現有技術檢測等位基因的PCR，或者是檢測等位基因點突變的PCR，如果在同一管反應，往往一個引物有等位突變，同時共享另一引物，必須在引物合成時在二對或多對引物上標上不同顏色的熒光基團加以區別，否則無法區分是由于等位突變還是由于沒有目標基因造成的陰性結果。
本發明針對等位突變設計同源引物組，可以不對上述情況加以區別，只要存在目標基因，即可獲得可靠的陽性結果，消除了因為等位突變造成的假陰性。
現有PCR技術測定某一種、屬的或其他特定范圍內的微生物是一種對于多種困難因素的平衡和選擇1〕需要選擇高嚴謹性引物，則對引物的位置有較大的限制；2〕如果在基因順序變化相對保守的區域內選擇引物，由于不同種、不同屬的微生物基因之間存在廣泛的的同源性，PCR引物除了與所有目標微生物的基因順序匹配，但往往也可能與一些非目標微生物的基因匹配，使PCR檢測的專一性受到干擾可能產生假陽性結果；3〕如果在基因順序變化相對活躍的區域選擇引物，則PCR引物可能僅與一部分目標微生物的基因的順序完全匹配或高度匹配，而與另一部分目標微生物的基因順序不匹配，在嚴謹的PCR反應條件下，這部分微生物的基因就不被擴增而造成假陰性，如果降低PCR反應的嚴謹性，則會使非目標微生物的干擾大大增強。
同源引物組PCR則提供了一種新的、簡單的方法，使引物的選擇范圍極大的擴展，可以在基因順序變化相對保守的區域內，也可以在基因順序變化相對活躍的區域選擇引物。同時擴大了目標微生物的檢測范圍，在理想狀態下，可以檢測整個種乃至整個屬的微生物，而避免漏檢某些變異株。
同源引物PCR也可以進一步設計為定量檢測。
具體實施例方式
實施例1.
實施例1以已知的HBV變種的順序為例，用兩組同源引物方法來克服假陰性。
所設計的正引物組和反引物組均包括三個引物，表1以HBV核酸順序(E00010，見核苷酸序列表)為準，列述了每一個引物的長度，位置和其他基本特性。
表2列述了每個引物的順序，字體加深的堿基表示一組同源引物內相互間不完全相同的堿基。
表1.六個乙肝病毒引物的名稱和基本特性
表2.六個乙肝病毒引物的順序
表1和表2數據表明，正引物組的引物長度差最大為4個堿基，反引物組三個引物的長度完全相同。每一組引物內引物間順序的同源性均超過90％。
表3分析了正、反引物組與HBV核酸順序的匹配情況。由表3可知正引物HBV15’與HBV病毒E00010的順序完全匹配，近似解鏈溫度和專一結合強度分別高達90.4℃和574點；反引物HBV13’與HBV病毒E00010的順序有1個堿基錯配，但近似解鏈溫度和專一結合強度仍分別高達86.9C和627點。應用以上引物組在高退火溫度下至少其中的一對引物能勝任擴增。
表3.六個引物的近似解鏈溫度和與E00010HBV的專一結合強度
根據HBV全序列的同源性和其他特性可分成7種基因型，每一種包括一種或幾種血清型及其亞型。表4列述了引物與7種基因型的代表性病毒株核酸順序的匹配情況。表4說明3個正引物與7個基因型順序完全匹配或有一個堿基錯配；而3個反引物與7個基因型順序完全匹配或有0-2個堿基錯配，但所有引物與7個基因型的模板專一結合強度都超過515點。所以用本發明引物組能在高溫下擴增7個基因型的每一個代表病毒株。
表4.六個引物與各種基因型HBV代表性病毒株順序的的匹配情況
截止2002年上半年基因庫收錄約220個由中國發表或與中國直接有關的HBV核酸的全順序或部分順序，以從為分析樣本測試上述引物組的同源性特征。其中，與正引物1或3完全匹配的病毒株分別有104和101株，所以至少有205個病毒株順序與三個正引物中的一個完全匹配。在全部220株中有三株的核酸順序與正引物1和正引物2在3’端有嚴重錯配，但與正引物3匹配很好。其余十來個變株的順序與正引物僅在引物的靠近5’一側有1-3個錯配，其近似解鏈溫度和與模板專一結合的強度分別在80℃和500點以上。
所以，本發明的正引物組能與220個變株中的每一個病毒株在高溫下退火。在基因庫收錄的220個HBV基因順序中多數是部分順序而不是全順序，在基因庫中列出反引物區域順序的約有90個，其中，與反引物1或3完全匹配的病毒株分別有61株和15株，所以至少有76個病毒株與三個反引物中的一個完全匹配。其余十來個變株的順序與正引物僅在引物的靠近5’一側有1-2個錯配，其近似解鏈溫度和與模板專一結合的強度也分別在80℃和500點以上，所以，本發明的反引物組能與90個變株中的每一個病毒株在高溫下退火。
當前，基因庫收錄的人HBV核酸順序1000個以上，從全順序看所包括的變異比上述的220株更多，但就本發明的引物順序區域看，上述220種變株幾乎包括了所有的變異種類。所以，本發明引物組能擴增目前已知的幾乎每一個HBV變種。
標準PCR只使用一對引物，設計引物時只需要考慮引物自身的互補和二個引物間的互補。本發明共有六個引物，除了考慮六個引物的自身互補還要顧及6個引物間15種可能的互補。表5列述了全部21種引物3’端堿基的互補情況。
表5.六個乙肝病毒引物自身和相互間最穩定3’二聚物形成特性
表5數據表明，六個引物自身和相互間都沒有嚴重的3’端互補，在高退火溫度下不易形成引物二聚體。
實施例2.
用兩組同源引物的PCR方法對110份HBV血清樣品進行檢測試驗，陰性對照為5份正常人血清(預先經ELISA檢測HBsAg、HBsAb、HBcAb、HBeAg和HBeAb均為陰性)。PCR反應采用Clontech公司Advantage-2試劑盒。每份樣品取200μL血清加入等體積的裂解液(配方為Tris.HCl，8％，Tween20，2％)，混勻，95℃水浴裂解15min。取出，12000rpm離心15min，取上清液進行PCR反應。反應母液Taq酶1μL，dNTP1μL，10Xbuffer，5μL，表2的2組六條引物各2uL使濃度為0.5μM，dd水3μL。每管加2μL反應母液，3μL血清裂解液。反應條件先95℃變性2min，然后以95℃ 30sec-72℃ 30sec-72℃ 30sec進行30個循環，最后72℃延伸2min。電泳檢測結果顯示所有HBV血清均獲得PCR陽性結果，無一例陰性，陰性對照無陽性擴增產物。
實施例3實施例3是設計用兩組同源引物PCR方法來測定人陰道的總乳酸桿菌。陰道微生態是一個含有很多微生物種群的復雜體系。其中，乳酸桿菌活動造成的微pH環境和H2O2對疾病包括艾滋病的防治有重要作用。乳酸桿菌共有幾十個種，在人陰道中已發現的常駐乳酸桿菌有嗜酸乳桿菌(L.acidophillus)等十余種(見表9)，目前常用編碼16sRNA的基因來鑒別微生物種，基因庫已收錄的順序不下幾萬種。16sRNA基因含約1500個堿基(見核苷酸序列表)，無論是在基因的哪一區域都找不到一個引物，能與表9所列十幾種菌種的16sRNA基因順序完全匹配或高度匹配，又與陰道中存在的其他微生物的16sRNA基因順序完全不匹配或有嚴重錯配，所以無法用標準PCR方法來測定陰道的總乳酸桿菌。本發明設計的兩組同源引物能擴增所有這十幾種乳酸桿菌而不受陰道中所有非乳酸桿菌的干擾，引物的順序，與模板和非模板順序的結合強度及錯配等特性列于表6-11。
表6.六個乳酸桿菌引物名稱和基本特性
表7.六個乳酸桿菌引物的順序
表8.六個乳酸桿菌引物對不同模板的專一結合強度
表9.六個引物與陰道主要乳酸桿菌16s rDNA基因模板的匹配情況
表10.乳酸桿菌引物與人陰道主要干擾菌群16s rDNA模板的錯配情況
表11.六個乳酸桿菌引物相互間最穩定3’二聚物形成特性
實施例4.
用兩組同源引物的PCR方法對嗜酸乳桿菌(L.acidophillus)、陰道乳桿菌(L.vaginalis)、格氏乳桿菌(L.gasseri)、乳酸乳桿菌(L.lactis)、卷曲乳桿菌(L.crispatus)、羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)、德氏乳桿菌(L.delbruekii)、保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)、發酵乳桿菌(L.fermentum)、短乳桿菌(L.brevis)、布乳桿菌氏乳桿菌(L.buchneri)、植物乳桿菌(L.plantarum)、唾液乳桿菌(L.salivarius)和干酪乳桿菌(L.casei)菌種樣品進行檢測試驗，陰性對照為雙歧桿菌(bifidobacterium)、腸球菌(Entercoccus)、鏈球菌(Streptococcus)和葡萄球菌(Staphylococcus)的代表菌。PCR反應采用Clontech公司的Advantage-2試劑盒。每份樣品取3μL的細菌裂解液直接進行PCR反應。反應母液除用表7的2組六條引物各2μL使濃度為0.6μM外同實施例2。每管加2μL反應母液。反應條件先95℃變性2min，然后以95℃ 30sec-72℃ 30sec-72℃ 30sec進行25個循環，最后72℃延伸2min。電泳檢測結果顯示所有乳酸桿菌菌種均獲得PCR陽性結果，無一例陰性，陰性對照菌種無陽性擴增產物。核苷酸序列乙型肝炎病毒HBV(E00010)1 gaattccact gccttccacc aaactctgca ggatcccaga gtcaggggtc tgtatcttcc61 tgctggtggc tccagttcag gaacagtaaa ccctgctccg aatattgcct ctcacatctc121 gtcaatctcc gcgaggactg gggaccctgt gacgaacatg gagaacatca catcaggatt
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權利要求
1.一種同源引物的聚合酶鏈式反應方法，依次包括如下步驟(1)模板變性；(2)引物退火；(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互補DNA鏈；(4)按步驟(1)-(3)循環進行擴增反應；其特征在于，正、反引物為同源的分別針對已知目標基因同一區段設計的2組引物，每組包括1-3條引物。
2.根據權利要求1所述的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于各條引物與模板的錯配堿基數為0-3。
3.根據權利要求1或2所述的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于每組同源引物的各引物間長度差異為0-10核苷酸。
4.根據權利要求1或2所述的聚合酶鏈式反應方法，其特征在于每組同源引物的各引物在目標基因中的5’起始位置相差0-10核苷酸。
5.一種權利要求1所述的同源引物聚合酶鏈式反應的反應液，組成包括2組正反引物、四種脫氧核糖核酸、鎂離子、緩沖液、耐熱DNA聚合酶和目標DNA，其特征在于每組同源引物的濃度之和為0.1-2μM。
6.權利要求1所述的同源引物聚合酶鏈式反應方法在制備醫學微生物核酸檢測試劑中的應用，其特征在于正、反引物組分別設計于同源基因的同一區段。
7.根據權利要求6所述的聚合酶鏈式反應方法的應用，其特征在于正、反引物組分別設計于同種病毒的不同基因型、血清型或其亞型的基因同源區段。
8.根據權利要求6或7所述的聚合酶鏈式反應方法的應用，其特征在于正、反引物組分別設計在相當于乙型肝炎病毒E00010株的第387-433Nt和第709-748Nt區段。
9.根據權利要求6所述的聚合酶鏈式反應方法的應用，其特征在于正、反引物組分別設計于同屬細菌的不同種、亞種、變種或其變異株的基因同源區段。
10.根據權利要求6或9所述的聚合酶鏈式反應方法的應用，其特征在于正、反引物組分別設計在相當于嗜酸乳桿菌的16SRNA的第291-327Nt和第784-820Nt區段。
全文摘要
本發明屬分子生物學技術，提供一種使用兩組同源引物的聚合酶鏈式反應方法及其反應液，即將聚合酶鏈式反應使用正、反引物各一條擴展為使用各一組同源的分別針對已知目標基因同一區段設計的引物組，每組包括1－3條引物，各引物與模板的錯配堿基數為0－3，各引物間長度差異為0－10核苷酸，在基因中的5’起始位置相差0－10核苷酸。由于本方法根據已知的待測序列設計具有高嚴謹性的引物組，故可以減少或消除同源基因PCR檢測的假陰性，在制備醫學微生物如病毒、細菌等核酸檢測試劑中具備廣泛的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK1511955SQ0216038
公開日2004年7月14日 申請日期2002年12月30日 優先權日2002年12月30日
發明者徐定邦, 朱德芬, 謝文凱, 徐文慧 申請人:徐定邦, 徐文慧