專利名稱：紅曲霉突變株及其于制備具降血壓活性發酵產物之用途的制作方法
技術領域：
本發明提供了紅曲霉突變株，及其用于制備降血壓活性物質之用途。
背景技術：
近年來，高血壓等心血管疾病已成為為導致死亡之主要原因之一，且罹患此種疾病之人口亦逐年成長。由于高血壓為一種慢性疾病，患者必須長期服用降血壓藥物。根據日本1999年的統計資料顯示，日本一年降血壓藥物市場穩定維持在500億日圓，而與控制血壓相關的保健食品，其市場亦由1997年之14億日圓成長至1999年之72億日圓。故全世界對于具有降血壓活性之藥物或健康食品之需求，亦日益增加。
自古以來，紅曲霉屬已為中國之傳統食藥菌種，其亦廣泛使用于制造各種食品。日本公開特許專利第61197524號案發現曲霉屬(Aspergillus)及紅曲霉屬(Monascus)之代謝產物中含有可改善高血壓之物質。Kohama等人于1987年(Chemical and Parmaceutical Bulletin，352484-2489)發現紅曲霉發酵液中之γ氨基丁酸(GABA)及乙酰膽堿(Ach)具有降血壓之功效。日本公開特許專利第62298598號案則揭示由紅曲霉發酵液中收集降血壓物質之方法。日本公開特許專利第03090031號案系提供紅曲霉之改良培養基，以提升降血壓物質之產量。日本公開特許專利第2000279163號案系揭示利用紅曲霉制備之降血壓食品，其中含有γ氨基丁酸及葡萄糖胺。WO01/31048 A1號案系揭示將紅米以紅曲霉發酵后，由其中制備氧化氮供體組合物(nitricoxide donor composition)，該組合物具有血管舒張及降血壓之功效。
Blanc等人于1995年(Intemational Journal of Food Microbiology；27，201-213)發現紅曲霉會產生一種真菌毒素，桔霉素(citrinin)，而使紅曲色素之安全性受到重視。日本專利第7274978號案利用突變方法降低桔霉素之產生(低于1ppm)，惟其產物系為紅色素，并非用于制備降血壓物質。
紅霉菌屬雖已廣泛用于制造降血壓物質，但其產物之桔霉素含量高，致所生產之發酵產物有安全性上之考慮。
發明內容
本發明提供了一種新的紅曲霉(Monascus prupureus)突變株，其可于無須加工處理之條件下，以價格低廉之天然原料，以固體或液體方式培養，直接生產具有降血壓活性之發酵產物，且該產物之桔霉素含量甚低。
本發明并提供利用本發明紅曲霉株制備具有降血壓活性之發酵產物的方法。
本發明另提供利用本發明新的紅曲霉突變株所產生的發酵產物制得的藥物組合物及食品添加劑。
具體實施例方式
本發明提供由紅曲霉(Monascus purpureus)突變衍生篩選出之紅曲霉突變株。當此突變株于每公升含有再來米粉約60克，大豆粉約30克及MgSO4.7H2O約5克之培養基中培養，而發酵產物中γ氨基丁酸之濃度達約0.03毫克/毫升時，其中桔霉素之含量約小于1.0ppm，較佳為約小于0.5ppm，更佳為約小于0.15ppm。
根據本發明，紅曲霉突變株之母株系為任意可產生之γ氨基丁酸之紅曲霉菌株。例如可獲自臺灣新竹食品工業發展研究所之紅曲霉CCRC 31497(其相當于ATCC 16375，CBS 280.34，IFO 4489)、CCRC 31498(其相當于ATCC 16358，CBS 281.34，IFO 4486)、CCRC31499(其相當于早期命名之紫紅曲(Monascus anka)ATCC 16360，CBS283.34，IFO 4478，KFCC 11832)、CCRC 31501(其相當于ATCC 16362，CBS 285.34，IFO 4485)、CCRC 31504(其相當于ATCC 16367，CBS288.34，IFO 4484)、CCRC 31541(其相當于ATCC 16379，IFO 5965)或CCRC 31542(其相當于ATCC 16365，CBS 109.07，IFO 4513)。
根據本發明，其中之突變株指其對應于母株之基因序列，至少有一個核苷酸不同，而所改變之核苷酸序列可改變其細胞生理。本發明之突變株可藉由許多方法獲得，其包含以隨機誘變(例如化學誘變劑、轉座子或放射線)之方式處理母株，或以核酸重組技術將母株基因之核苷酸序列中，取代、插入或刪除一或多個核苷酸(請參見如Sambrook，J.Cold Spring Harbor Press，Plainview N.Y.；Ausubel，R.M.等人(1995)Current protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York N.Y.)。再以篩選之方式選擇γ氨基丁酸產量較母株高，且桔霉素產量較母株低之突變株。
根據本發明紅曲霉突變株之較佳實施方案，該紅曲霉突變株具有與紅曲霉M022及M1033相同之性質，其中紅曲霉M022及紅曲霉M1033株已于2002年6月21日根據布達佩斯條約之規定保藏于美國典型培養物保藏中心，其保藏號分別為PTA-4486及PTA-4485。
根據本發明，利用紅曲霉突變株制備發酵產物之方法，可于固體或液體培養基中發酵進行。
根據本發明，其中上述培養基中之碳源及氮源可為任意之公知原料。其較佳為天然原料，其中碳源包括但不限定為再來米粉、玉米淀粉、米淀粉、小麥淀粉、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖及甘油，或其組合；而氮源包括但不限定為大豆粉、黃豆蛋白、消化蛋白、酵母萃取物、玉米浸漬液、麩胺酸、氯化銨及硝酸鉀，或其組合。
根據本發明制備方法之較佳實施反案，其中該培養基之pH值約介于3至9，較佳為約介于5至7。
根據本發明，所制得之發酵產物中具有降血壓活性物質，例如γ氨基丁酸、葡萄糖胺及乙酰膽堿。其中γ氨基丁酸是中樞神經系統中主要抑制神經傳導之物質，與其有關之受體有GABAA及GABAB，于動物實驗中發現GABAA之活動會伴隨降血壓、抗痙攣及抗憂慮等生理現象之出現，許多實驗亦證明γ氨基丁酸具治療高血壓之活性，且許多降血壓藥物均系藉由控制γ氨基丁酸之量，以達降血壓之效果。故γ氨基丁酸含量可作為測定降血壓活性之重要指針。
本發明紅曲霉突變株所制得之發酵產物中桔霉素之含量約低于1.0ppm，較佳為約小于0.5ppm，更佳為約小于0.15ppm。
根據本發明，所制得之降血壓發酵產物可直接作為藥物組合物之活性成分或食品添加劑。發酵產物中之降血壓活性物質可進一步藉由各種公知技術予以純化(例如Kohama等人(Chemical andParmaceutical Bulletin，1987，352484-2489)及日本公開特許專利第62298598號案所揭示之純化萃取方法)。
下述實施例僅系用于例示本發明，而非用以限定本發明。
實施例1一般分析方法γ氨基丁酸含量之分析將0.6毫升菌株發酵液與0.6毫升氯化鑭(140mM)混合均勻后，于60℃水浴下反應30分鐘，將該混合物離心。取出0.1毫升之上清液，將其與50微升KOH(1M)及850微升之水進行反應，5分鐘后進行離心并保留其上清液備用。
將550微升之該上清液樣品加入150微升之NADP(4mM)、200微升之磷酸緩沖液(pH8.6)及50微升之GABASE(2單位/毫升)，經混合后立即利用分光光度計測量其OD340之吸光值，并記錄其結果；再于其中加入50微升之α-氧代戊二酸，經反應60分鐘后，再次測量其OD340之吸光值，并計算反應前后OD340吸光值之差值。將此差值與GABA標準品比較后，計算其濃度。
桔霉素含量分析將菌株發酵液以HPLC予以測定。其步驟包括先將7毫升發酵液之pH值調整至3.5，待反應1小時后，再加入3毫升乙酸乙酯，30分鐘后收集該乙酸乙酯層，并重復此添加乙酸乙酯及收集之步驟兩次。將此收集液干燥。
以1毫升之甲醇溶解此干燥之收集樣品后，將此甲醇溶液以0.2微米孔徑之濾膜過濾后，取10微升進行HPLC分析。其分析之條件如下柱 μBondapak C18(10微米，Waters，來源地)流速每分鐘1.0毫升檢測儀 UV檢測儀(Waters photodiary assay 996，分析波長225-345毫微米)移動相(梯度)0.8％磷酸乙腈2-丙醇為60∶35∶5至25∶70∶5進行時間20分鐘滯留時間11分鐘經測得之數值與桔霉素標準品(Sigma)比較后，計算其濃度。
實施例2本發明突變株之誘發及篩選將紅曲霉CCRC 31499(即ATCC 16360)接種于PDA(融合形馬鈴薯20％，葡萄糖(Bacto Dextrose)2％，瓊脂2％)斜面上，于30℃下培養7天后，以無菌水將孢子洗下。將每毫升含有107以上孢子之收集液，以UV光照射2分鐘，經連續稀釋后涂抹于PDA平板上。于30℃下培養2至3天后，將其中之菌落接種于培養基(其每公升中含有再來米粉60克，大豆粉30克及MgSO4.7H2O 5克)，測試該所得突變株之穩定性，以及γ氨基丁酸及桔霉素之產量。
最后分離選出一穩定之突變株，命名為紅曲霉M022。將該突變株接種于PDA斜面上，于30℃下培養7天后，以無菌水將孢子洗下。將此孢子接種(5×105個孢子)于含有50毫升培養基(每公升中含有再來米粉60克，大豆粉30克及MgSO4.7H2O 5克)之三角搖瓶中，于30℃、150rpm下震蕩培養5至7天后收集其發酵液，并測量此發酵液中γ氨基丁酸及桔霉素之含量，結果為每毫升發酵液之γ氨基丁酸含量為0.039毫克，而桔霉素之含量為小于0.15ppm。于相同條件下，母株紅曲霉CCRC 31499發酵液中γ氨基丁酸含量為每毫升0.031毫克，而桔霉素之含量為2.1ppm。
再將紅曲霉M022依上述方法進行突變篩選，結果獲得另一株突變株，命名為紅曲霉M1033，其于培養基(每公升中含有面粉80克，酵母萃取物10克及麩胺酸10克)培養后，發酵液中γ氨基丁酸含量為每毫升2.07毫克，而桔霉素之含量小于0.15ppm。于相同條件下，紅曲霉M022發酵液中γ氨基丁酸含量為每毫升0.834毫克，而桔霉素之含量為小于0.15ppm。
紅曲霉M022于培養基中之特征如下CYA培養基(每公升中含有蔗糖30克，NaNO33克，K2HPO41.0克，MgSO40.5克，KCl 0.5克，FeSO40.01克，酵母萃取物1克，瓊脂15克)培養7天后，菌落呈橘黃色，大小為11至14毫米，氣生菌絲呈白色；
培養10天后，菌落呈橘黃色，大小為12至16毫米，氣生菌絲呈白色；分生孢子柄呈無色，分支不規則；分生孢子呈梨形，大小為3-4×9.5-12.5微米，平滑，壁厚約2微米；于CYA培養基中培養21天，仍未發現有性世代。MEA培養基(每公升含有麥芽萃取物20克，胨1克，葡萄糖20克，瓊脂15克)培養7天后，菌落呈橘紅色，大小為28至30毫米，氣生菌絲呈白色；培養10天后，菌落呈橘紅色，大小為34至37毫米，氣生菌絲呈白色；分生孢子柄呈紅色，分支不規則；于MEA培養基中培養21天，子囊果仍未完全成熟，子囊孢子呈卵形(4.5-5×5-6微米)。
紅曲霉M1033于培養基中之特征如下CYA培養基(每公升中含有蔗糖30克，NaNO33克，K2HPO41.0克，MgSO40.5克，KCl 0.5克，FeSO40.01克，酵母萃取物1克)培養7天后，菌落呈橘黃色，大小為13至14毫米，氣生菌絲短小且十分稀少；培養10天后，菌落呈橘黃色，大小為17至18毫米，氣生菌絲短小且十分稀少；分生孢子柄呈無色，不規則分支部分呈「之」字形分支，外壁平滑；分生孢子呈梨形或橢圓形，大小為6-12×8.5-13微米；
子囊果大小為30-35微米，子囊孢子呈卵形，大小為4.5-5×5.5-6。
MEA培養基(每公升含有麥芽萃取物20克，胨1克，葡萄糖20克，瓊脂15克)培養7天后，菌落呈橘紅色，大小為29至30毫米，氣生菌絲短小且十分稀少；培養10天后，菌落呈橘紅色，大小為41至42毫米，氣生菌絲短小且十分稀少；分生孢子柄呈無色，分支不規則；于MEA培養基中培養21天，子囊果仍未完全成熟。
有關本發明紅曲霉M022及M1033突變株與其母株CCRC 31499之比較顯示于下表1。
表1
a于CYA培養基中培養。
b培養基每公升中含有再來米粉60克，大豆粉30克及MgSO4.7H2O5克。
c培養基每公升中含有面粉80克，酵母萃取物10克及麩胺酸10克。
實施例3生產γ氨基丁酸之pH值根據實施例2所述之方法，以每公升中含有面粉80克，酵母萃取物10克及麩胺酸10克之培養基培養，分別測定于不同pH值之條件下，發酵液中γ氨基丁酸及桔霉素之含量。表2所示結果顯示紅曲霉M022及M1033突變株于不同之pH值條件下，皆能產生高量之γ氨基丁酸，且桔霉素之含量皆非常低(＜0.15ppm)。
表2起始pH(滅菌前) 滅菌后pH值 突變株M022a突變株M1033apH3.0 3.3 0.068 -pH4.0 4.5 0.377 0.568pH4.5 - 1.512pH5.0 5.4 0.465 2.141pH5.5 - 2.572pH6.0 5.8 0.867 2.728pH6.5 - 2.736pH7.0 6.3 0.821 2.688pH8.0 6.9 0.585 -pH9.0 7.3 0.3 14-″-″表未測試aγ氨基丁酸之含量單位為毫克/毫升*桔霉素含量均低于檢測值0.15ppm
權利要求
1.一種紅曲霉(Monascus prupureus)突變株，其若于每公升含有再來米粉約60克，大豆粉約30克及MgSO4.7H2O約5克之培養基中培養，當發酵產物中γ氨基丁酸之濃度約為0.03毫克/毫升時，其中桔霉素之含量約小于1.0ppm。
2.根據權利要求1之紅曲霉突變株，其為紅曲霉ATCC 16360之突變株。
3.根據權利要求2之紅曲霉突變株，其中該突變株具有紅曲霉M022菌株相同之性質，該紅曲霉M022于2002年6月21日保藏于美國典型培養物保藏中心，保藏號為PTA-4486；或具有紅曲霉M1033菌株相同之性質，該紅曲霉M1033于2002年6月21日保藏于美國典型培養物保藏中心，保藏號為PTA-4485。
4.根據權利要求3之紅曲霉突變株，其中該突變株是紅曲霉M022，其于2002年6月21日保藏于美國典型培養物保藏中心，保藏號為PTA-4486。
5.根據權利要求3之紅曲霉突變株，其中該突變株是紅曲霉M1033，其于2002年6月21日保藏于美國典型培養物保藏中心，保藏號為PTA-4485。
6.一種制備發酵產物之方法，其是在適當之條件下培養根據權利要求1至5中任一項之紅曲霉突變株，其中該發酵產物包含γ氨基丁酸且其桔霉素含量約小于1.0ppm。
7.根據權利要求6之方法，其中該發酵產物具降血壓活性。
8.根據權利要求6之方法，其中該紅曲霉突變株是在固體或液體培養基中培養。
9.根據權利要求8之方法，其中該培養基之pH值約介于3至9。
10.根據權利要求9之方法，其中該培養基之pH值約介于5至7。
11.根據權利要求6之方法，其中該發酵產物之桔霉素含量約小于0.5ppm。
12.根據權利要求11之方法，其中該發酵產物之桔霉素含量約小于0.15ppm。
13.根據權利要求7之方法，其中該發酵產物可直接作為藥物的活性成分或食品添加劑。
14.根據權利要求7之方法，其可進一步包括純化降血壓活性成分之步驟，以得純化之降血壓活性成分。
15.一種藥物組合物，其是利用權利要求1至5中任一項之紅曲霉突變株生產之發酵產物制得，其中該發酵產物中之桔霉素含量約小于1.0ppm。
16.根據權利要求15之藥物組合物，其用于降低血壓。
17.根據權利要求15之藥物組合物，其中該發酵產物之桔霉素含量約小于0.5ppm。
18.根據權利要求17之藥物組合物，其中該發酵產物之桔霉素含量約小于0.15ppm。
19.根據權利要求15之藥物組合物，其是由權利要求6至14中任一項之方法制備得之發酵產物制得。
20.根據權利要求19之藥物組合物，其是將該發酵產物再進一步純化而制得。
21.一種食品添加劑，其是利用權利要求1至5中任一項之紅曲霉突變株生產之發酵產物制得，其中該發酵產物中之桔霉素含量約小于1.0ppm。
22.根據權利要求21之食品添加劑，其具有降低血壓活性。
23.根據權利要求21之食品添加劑，其中該發酵產物之桔霉素含量約小于0.5ppm。
24.根據權利要求23之食品添加劑，其中該發酵產物之桔霉素含量約小于0.15ppm。
25.根據權利要求21之食品添加劑，其是由權利要求6至14中任一項之方法制備得之發酵產物制得。
26.根據權利要求25之食品添加劑，其是將該發酵產物再進一步純化而制得。
全文摘要
本發明涉及紅曲霉(Monascus prupureus)之突變株，其可用以生產制備具降血壓活性之發酵產物，且所得產物中桔霉素含量極低。本發明同時提供利用此紅曲霉突變株制備具降血壓活性發酵產物之方法，及該發酵產物于降血壓之用途。
文檔編號C12P13/00GK1511942SQ02158370
公開日2004年7月14日 申請日期2002年12月30日 優先權日2002年12月30日
發明者陳彥霖, 黃英娥, 林明志, 陳建州, 袁國芳 申請人:食品工業發展研究所