一種制備自給自足發酵培養基的方法

專利名稱：一種制備自給自足發酵培養基的方法
技術領域：
本發明涉及一種從可再生原料中制備自給自足發酵培養基的方法。
更準確地，本發明涉及一種處理可再生原料的特殊方法，這樣可將其直接用于發酵以直接生產代謝物。
在本發明中，“可再生原料”這種表述可以被理解成廉價的、未精練的、通常是無毒的，并且實氮和碳源的食品工業廢料。更具體地，它還包括淀粉工業的副產物，更進一步地，還可以是小麥、豌豆、土豆淀粉工業的副產物。
“自給自足發酵培養基”這種表述也可以被理解成包含了所有微生物的生長所必需的營養素，并且對于生產所需的理想代謝物是必須和充足的，而不需要另外添加任何營養添加劑。
依照本發明的發明目的，“代謝物”可以被理解為通過碳源的發酵途徑得到的轉換產物，碳源被微生物直接吸收。它們將是選自有機酸和氨基酸中的有利的代謝物，并且優選的有機酸可以是左旋乳酸、葡萄糖酸、檸檬酸，氨基酸可以是左旋賴氨酸或者左旋蘇氨酸。
通常認為對于生產理想代謝物的發酵，選擇一種可再生原料作為基料，要靠它的實用性、費用和允許的高生產率的能力來確定。
然而還認為，發酵培養基不但要包括添加礦物質和有機鹽的碳源，還包括添加礦物和有機鹽的氮源。
發酵領域的專家認為“碳源”可以從諸如糖蜜、小麥、玉米、稻米、木薯或土豆淀粉水解物這樣的可再生原料中獲得，但是“直接同化碳源”是糖，糖是從所述碳源中提煉或提純的，例如葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和糊精。
“氮源”或蛋白質營養素的例子是，它們的部分可以是酵母抽提物、玉米漿、原生漿、糖蜜蛋白質、肉質提取物或者豆漿。然而通常優選的是酵母抽提物可以作為氮源使用，也可以作為維他命的添加物，以及礦物質的添加物。
在大多情況下，由“直接同化氮源”，即葡萄糖或者果糖，以及酵母抽提物構成的發酵培養基，可以主要的用在大量的發酵上，這樣的發酵可以引起有機酸的產生，例如乳酸、丙酸、葡萄糖和檸檬酸等等，本質上的氨基酸，例如賴氨酸或者其他的工業價值的代謝物。
在WO98/54351的專利申請說明書中是這樣的，例如描述了用來生產左旋賴氨酸的培養基制備方法，從包含蔗糖的組中選擇出一種碳源，但是也有從各種各樣的原料(例如玉米和小麥)中獲得的糖蜜、淀粉和淀粉水解物，作為碳源。
然而另外添加一種氮源就是必要的了，氮源從包含了酵母抽提物或者糖蜜、蛋白質、縮氨酸和氨基酸、玉米或者小麥的可溶物的組中選擇出。
在有機酸領域，這里選擇出一個用在乳酸生產上的例子在美國專利5416020中描述了一種從乳清滲透物和乳清中生產左旋賴氨酸的方法，在這種方法中酵母抽提物在二價錳元素存在下、以同Lactobacillusdelbrueckii sub.bulgaricus ATCC55163的變形異種一起被添加，這樣可以產生本質上的左旋賴氨酸。
乳清滲透物實際上包括了75％到80％重量的乳糖，但不包括大尺寸的蛋白質，因此對微生物的生長必要的氮源就是缺乏的，因此，用酵母抽提物作為補充物就是必要的。補充的乳清基本上包含重量范圍65％到75％的乳糖。
然后酵母抽提物就可以提供具有營養物的發酵培養基，通過乳清滲透物和乳清本身提供的營養物不是充分的。
—美國專利4467034中示出了以乳清作為的原料產生乳酸的可能性，它用了新型的Lactobacillus bulgaricus DSM 2129。乳清仍然要用氮源補充，即肉質提取物、玉米漿或者豆漿同時補充維他命和天然鹽。
在這些情況下，這些發酵培養基的使用需要依照氮/碳比率的絡合劑化合，加上另外用在理想的微生物的有效的生產率的必要的附加物。
這些介質也被用在生物質的生產上(例如用在制備乳酸酵母)，但由于考慮到微生物新陳代謝的需要，也顯示出了同樣的困難。
然而，此外還認為這些介質具有不可推斷出的工業規模生產這些所需的相同代謝物的缺陷(根據它們的組成難于有標準的介質和隨后的凈化步驟所致的附加成本)。
前述內容的結論是一個沒有令人滿意的簡單、有效的方法，該方法使不必使用繁瑣的、大量的、昂貴的步驟而制備一種發酵培養基，發酵培養基的碳源和氮源在這種水平上的選擇和結合成可以生產出適合想要發酵的平衡發酵培養基。
期望研究出一種方法，它比已經存在的這些方法在實際應用中有更好的反映，申請人的公司已經發現通過直接從可再生原料中制備自給自足發酵培養基的方法可以達到這個目標。
更具體地說，依照申請人的公司的發明描述的方法能從可再生原料中制備出可產生代謝物的發酵培養基，該方法的特征在于—從由小麥、豌豆、和土豆的可溶物，優選的是小麥可溶物的組中選擇出可再生原料，—處理所述可再生原料以從中釋放出可直接被微生物吸收的碳源和氮源，—回收由此獲得的自給自足發酵培養基。
因此，依照本發明方法的第一步驟包括從包含小麥、豌豆、和土豆的可溶物，優選的是小麥可溶物的組中選擇出可再生原料。
申請人的公司已經克服了技術上的偏見，該偏見認為主要從碳源和氮源的單獨來源中制備發酵培養基時，必須重新構成復合的發酵培養基，還必須添加維他命、增長因子和痕量元素。
上面已經說到，實際上通常認為在該技術領域中，利用一種復合的發酵培養基，可以生產出具有好產量和產率的所需代謝物。
然而，這種情形伴生一種特別的重要缺陷，它包括高費用和調整其達到生產微生物要求的困難。
經過大量長期和艱苦的學習研究，申請人的公司已經發現在可再生的原料中，更進一步地說在小麥、豌豆和土豆淀粉工業的剩余物中，適合實際應用需要的發酵培養基。
更進一步地，這里又一次克服了另一個技術缺陷，申請人的公司已經發現可再生的原料可從包含了小麥、豌豆和土豆的可溶物的組中方便地選擇出，然而一般認為這些可溶物僅僅作為用來構成發酵培養基的氮源。
依照申請人的公司的發明，已經發現這些可溶物可以直接使用，經過處理后，不但作為一種氮源，而且作為碳和微量元素的獨特的來源，或者甚至是維他命來源，這對于通過一種理想的微生物的發酵是必需和足夠的。
例如小麥的可溶物可以從小麥“B”淀粉的分離流中獲得，小麥“B”淀粉的分離流在濕小麥淀粉磨制過程中從分離淀粉中獲得。
B淀粉或者第二種淀粉是基本上由小淀粉顆粒或者被損壞顆粒的占主要比例的淀粉所構成。
除了這種B淀粉，我們知道小麥的可溶物也包括不可忽略量的高分子量蛋白質，該蛋白質能夠構成用在重要的微生物中的蛋白質來源。
至于土豆的可溶物，它們可以通過回收可溶物部分而得到，此可溶物部分從粉碎的土豆中在起始階段提取的淀粉中獲得。
豌豆的可溶物由豌豆的浸漬水產生，并且在粉碎和分離豌豆的各種組成之前被回收。
因此依照本發明的方法的第二步驟包括處理所述的可再生原料，以從中釋放出可被微生物直接吸收的碳源和氮源。
這里的可再生原料除了包括作為氮源的縮氨酸和游離氨基酸外，還包括作為碳源或者葡萄糖來源的淀粉，而且包括高分子量的蛋白質。
然而，一些可以直接吸收淀粉或者高分子量蛋白質的微生物是可以接受的，因為它們具有對它們的生長和生產理想代謝物起到衰減作用所必需的酶結構。對于其他的微生物，需要把它們置于經過處理的碳源和氮源下，以便于被直接吸收。
因此這些處理要適應理想的微生物的生理機能要求。
在依照本發明的方法中的第一具體實施例中，例如對于微生物，缺乏的淀粉酶、通過對所述的可溶物加熱到至少60℃，用α酶和葡萄糖淀粉酶和隨意的使用一種酶進行處理，該酶能夠降解從具有半纖維素酶、果酸酶和木聚糖酶的組中選擇出的植物來源的體壁的多糖，則可發酵的糖可以方便的從可溶物中釋放出。
在依照本發明的方法中的第二具體實施例中，對于不能吸收高分子量的蛋白質的微生物，通過用蛋白水解酶(例如選自堿性蛋白酸和酸性蛋白酸進行處理)，被吸收的氨基酸和/或縮氨酸從可溶物中被方便的釋放出。
在PH值為7和溫度為60℃的條件下實施6個小時的處理，使用劑量為1％的干基劑量，可以方便地用堿性蛋白酶進行處理。
至于用來實施蛋白質水解的合適的酸性蛋白酶，它們可以從胰液素、胰島素、胰凝乳蛋白酶和類似物中選擇出。
在PH值為4.5和溫度為60℃的條件下實施6個小時的處理，使用劑量為1％的干基劑量，可以方便地用酸性蛋白酶進行處理。
蛋白質水解步驟形成了肽，另外肽還可以對某種微生物起到活化的作用。
最后，在依照本發明的方法中的第三具體實施例中，通過液化和糖化對可溶物進行處理，另一方面，也可以對不能直接同化存在于所述可溶物的碳源和氮源的微生物實施發酵處理。
下面我們將舉例說明可溶物的微量元素，或者甚至其中的維他命使得對于大量的發酵過程起到特殊的作用。
因此依照本發明的方法的第三步驟包括回收這樣制得的自給自足的發酵培養基和直接將它使用到發酵中。
最好選擇使自給自足的發酵培養基經過微量過濾步驟以去除掉其中的不可溶的雜質。
使用一些其他被本領域的技術人員熟知的裝置可以實施這個步驟，例如薄膜微量過濾法，薄膜孔經的尺寸隨所述不可溶的雜質的尺寸而改變，例如可以使用一個0.14μm的薄膜。
這些培養基對于生產乳酸、賴氨酸、乙醇、酶特別適宜，生產從麥芽糖和右旋糖苷組中選擇出的多聚糖，和生產與其相關的微生物種群如乳酵素或者酵母也是特別合適的。
如果希望無需實施麻煩和昂貴的凈化步驟而回收生產出的代謝物，申請人公司提議的特殊的溶液也具有這樣的優點，該溶液用在依照本發明的自給自足的發酵培養基上。
實際上一般認為，在使用小麥的可溶物的情況下，B淀粉或者第二種淀粉包括如戊聚糖和脂類的這種雜質。
這些雜質(其中一些可以無需傳統的凈化和軟化處理)發現在這些雜質的水解產物中，這樣會使B淀粉不適宜例如用在食物級的葡萄糖生產中，這就是為什么認為B淀粉工業應用存在困難的原因。
在這些情況下，申請人的公司具有一定的優勢，不僅已經研究出一種處理這些小麥的可溶物，可以產生自給自足的發酵培養基的方法，而且提供了一種制備這樣質量的代謝物的溶液，該溶液可以不必要求所述代謝物過分苛求的凈化方法。
這種溶液包括減少自給自足的發酵培養基的量，并且用可以直接同化的碳源補充，從而用一定數量的必需的碳源提供給選擇出的微生物，該碳源既用于它的生長，并且可以生產出理想的代謝物，而且沒有產量或者產率的損失。
然而要調整自給自足的發酵培養基的剩余部分，從而保證微生物必須的氮、天然鹽和維他命成分供應，這將在下面的賴氨酸發酵中作舉例說明。
本發明的其他的特征和優點將通過閱讀下面的例子會顯而易見，盡管以例舉方式給出但不受限制。
例1小麥的可溶物包括20％的干物質，其是從小麥“B”淀粉的分離流中制得的經過60℃、12個小時的加熱，用0.05％的干基的來自NOVO的α酶TERMAMYLLC處理。
從這樣被處理的小麥的可溶物中可以獲得三種自給自足的發酵培養基，從這樣被液化的小麥的可溶物的淀粉的糖化中可以獲得第一產物(產品A)，對被液化的小麥的可溶物進行蛋白酶處理可以獲得第二產物(產品B)，同時實施上面的兩種處理可以獲得第三產物(產品B)。
對于產品A的生產，這樣液化可溶物被引入介于15％到20％之間的DM中，用0.5％干基的來自GENENCOR的淀粉水解酶OPTIDEX L 300和用0.3％的干基的來自GENENCOR的半纖維素酶SPEZYME CP，以60℃的溫度實施3到5個小時的處理，從而可以釋放出可發酵的糖。通過在0.14μm薄膜上的微量過濾，不能溶解的物質被移掉。
依照本發明，產品A具有14.6％干物質，具有的成分在下面的表I中被示出。
表I
為了制備產品B，這樣液化的小麥的可溶物也被引入介于在15％到20％之間的DM中(PH值用1N氫氧化鈉調整到7.5～8之間)，并用0.2％到1％干基的ALCALASENOVO，以60℃的溫度實施4到6個小時的處理，獲得的產品具有一個最后的從6.5到7范圍的PH值。通過在0.14μm薄膜上的微過濾，不能溶解的物質被移掉。
依照本發明，產品A具有14.8％干物質，具有的成分在下面的表II中被示出。
表II
為了制備產品C，在如同制備產品A的相同的條件下，所有的小麥的可溶物先被糖化，然后在如同可能獲得產品B的相同的條件下，使用ALCALASE進行處理。通過在0.14um薄膜上的微過濾，不能溶解的物質被移掉。
依照本發明，產品C具有18.4％干物質，具有的成分在下面的表III中被示出。
表III
依據本發明的這三種小麥可溶物基的自給自足的發酵培養基中產生的氨基物具有著顯著量的酸性氨基酸和非極性基團的氨基酸，即DM的數量級各自在2250mg/kg和1050mg/kg的范圍。
例2在土豆的可溶物中，實施在例1中產生產品A的處理方法，將獲得下面的自給自足的發酵培養基D。
下面的表IV表示出了這種自給自足的發酵培養基的構成。
表IV
在這種自給自足的發酵培養基中依照本發明產生的氨基酸具有有著顯著量的酸性氨基酸和非極性基團的氨基酸，即DM的數量級各自在2730mg/kg和1100mg/kg的范圍。
另外，這樣獲得的發酵培養基具有豐富的維他命B7(含量是傳統方法獲得的酵母提取物的4倍)和維他命B3。
例3在豌豆的可溶物中，實施在例1中產生產品A的處理方法，將獲得下面的自給自足的發酵培養基E。
下面的表V表示出了這種自給自足的發酵培養基的成分。
表V
在這種自給自足的發酵培養基中依照本發明產生的氨基酸具有有著顯著量的堿性基團的氨基酸和酸性基團的氨基酸，即DM的數量級各自在13150mg/kg和26780mg/kg的范圍。
例4下面的表VI示出了在發酵桶中獲得的左旋賴氨酸的產率和產量，發酵桶具有15L的可用容積，依照本發明的方法對13L的小麥的可溶物進行了處理(實施例1的產物A到C)。
作為“標準的培養基”對照物，由80g/l的葡萄糖、10g/l的酵母抽提物和0.5g/l的(NH4)2HPO4構成的發酵培養基被測試。
使用依照本發明的具有150到180g/l的容量的干物質量的自給自足的發酵培養基，所述介質含有80g/l標準的“葡萄糖當量”。
依靠對小麥的可溶物的處理方法，因此這些“碳或氮當量”被直接同化，或者不用在考慮過的微生物上。
對在例1中的產品C中沒有被微過濾的(稱為“粗”產品C)自給自足的發酵培養基當量被作為一個“未微過濾”對照物也被測試。
使用從一個7h的預先培養的lactococcus lactis菌株(strain)得到的1.5l的培養基對這些發酵桶進行接種。
PH值設定為6.5，用NH4OH為調節12，溫度是40度。
表VI
這個表格表示出了LACTOCOCCUS LACTIS屬的微生物生產左旋賴氨酸，公基于小麥的可溶物的自給自足培養基，其中通過適當的處理(在這種情況下，就是小麥B淀粉的液化和糖化以及使用ALCALASE蛋白質水解蛋白質)，碳源和氮源被直接地同化，使獲得一定的產量和產率成為可能，這至少等價于使用標準生產培養基獲得的產率和產量，在純葡萄糖和酵母抽提物基礎上的標準生產培養基會更昂貴。
因此被液化、糖化、蛋白質水解的小麥的可溶物可以方便地使用于乳酸的發酵上。對沒有被微過濾的產品進行測試也顯示出這種特殊的發酵，不可溶的雜質在哪種方式下也不會影響左旋乳酸的產量和產率。
最后，對所有的試驗，在發酵后，確定生物的數量。
依照本發明的方法的被處理的可溶物是顯而易見的，在這種情況下通過液化、糖化、蛋白質水解，證明對作為重組的標準介質的L.Lactis的生長是有效的。因此，依照本發明的自給自足的培養基是適合生物的量的生產，特別適合賴氨酸酵母的生產。
例5對于生產高質量代謝物過分的使用小麥的可溶物，因此研究繁瑣的凈化技術的可行性是令人痛惜的。
依照本發明的下述方法，有可能限制補充被處理的小麥的可溶物，通過控制發酵的環境，也就是說完全了解所關注微生物的營養要求。
如例4中所示，在用LACTOCOCCUS LACTIS生產左旋賴氨酸的情況下，可能使產品C的干基量達到40g/l(20g/l葡萄糖當量)以及通過添加另外的85g/l葡萄糖(也就是在小麥的淀粉水解物中產生的)的補償減少的所需碳源和氮源。
下面的表VII表示出了獲得的結果。
表VII
氮源、碳源和微量元素的“剩余的”補充使保持等效產率和產量成為可能，對于已通過3.75系數降低了的雜質量而言。
例6S.cerevisiae類型的酵母的發酵被常規的應用在乙醇生產上。
使用依照本發明的自給自足的發酵培養基，和補充了鹽類所構成的常規培養基相比較，與由作為氮源的酵母抽提物以及作為碳源的葡萄糖可以研究酵母的生物量生產。
在從例1中的產品A中制備的培養基中以80g/l的量實施S.cerevisiae生物量的生產。
參照物培養基由45g/l的葡萄糖、5g/l的酵母抽提物，10g/l的(NH4)2SO4以及5g/l的KH2PO4和2g/l的MgSO4構成。
通過用氫氧化物鈉將PH值調整為5，溫度設定為30度，并且在一個2L反應器中進行培養，并帶有600rpm的攪拌和1vvm的通風。
下面的表格VIII表示出了在整個事件過程中兩種發酵培養基中的酵母的生長的結果。
表VIII
*表示不確定這個結果同樣表示出了依照本發明的自給自足的發酵培養基特別適用于酵母生物量的生產，并且通過推廣，對于所有的其合成隨著所述酵母的生長的代謝物的生產也適用，這在乙醇的生產中也是如此。
例7使用依照本發明的自給自足的發酵培養基，與由作為氮源的酵母抽提物以及作為碳源的葡萄糖和補充了鹽類所構成的常規培養基相比較，可以研究乙醇的生產量。
在從例1中的產品A中制備的培養基中以180g/l的量實施S.cerevisiae生物量的生產。
培養基的培養基包括10g/l的葡萄糖、5g/l的酵母抽提物，10g/l的(NH4)2SO4以及5g/l的KH2PO4和2g/l的MgSO4。
用標準的的氫氧化鈉將PH值調整為5，溫度設定為30度，并且在一個15L的反應器中進行培養，并帶有200rpm的攪拌。
下面的表格VIII表示出了在整個時間過程中于兩種發酵培養基中的酵母的生長的結果。
表VIII
因此，依照本發明的自給自足的發酵培養基特適用于乙醇的生產。
權利要求
1.一種從可再生原料中制備自給自足發酵培養基，用于代謝物生產的方法，它包括—從由小麥、豌豆、和土豆的可溶物，優選的是小麥可溶物的組中選擇出可再生原料，—處理所述可再生原料，以從中那里釋放出可直接被微生物吸收的碳和氮源，—回收由此獲得的自給自足發酵培養基。
2.如權利要求1所述的方法，其中對自給自足的發酵培養基實施一個微過濾步驟，從中移除掉不可溶的雜質。
3.如權利要求1所述的方法，其中對可再生的原料用酶進行淀粉的液化和糖化處理，從中釋放出一定量的可被直接同化的碳源。
4.如權利要求1所述的方法，其中對可再生的原料用水解蛋白酶處理，水解蛋白酶從堿性蛋白酶中選擇出，從而從其中釋放出一定量的可被直接同化的氮源。
5.一種從權利要求1所述的方法制備的自給自足發酵培養基中制備可以生產易提純代謝物的發酵培養基的方法，其特征在于用可直接同化碳源補充到該發酵培養基中。
6.依照權利要求1的方法獲得的發酵培養基。
7.生產乳酸的方法，包括一個使用依照權利要求6的發酵培養基的發酵步驟。
8.生產賴氨酸的方法，包括一個使用依照權利要求6的發酵培養基的發酵步驟。
9.生產多糖的方法，該多糖從麥芽糖和右旋糖苷、更優選的是麥芽糖的組中選擇出，該方法包括一個使用依照權利要求6的發酵培養基的發酵步驟。
10.生產微生物種群的方法，包括一個使用依照權利要求6的發酵培養基的發酵步驟。
11.生產酶的方法，包括一個使用依照權利要求6的發酵培養基的發酵步驟。
12.生產乙醇的方法，包括一個使用依照權利要求6的發酵培養基的發酵步驟。
全文摘要
本發明涉及一種從可再生原料中制備自給自足發酵培養基,用于從可再生的原料中生產代謝物的方法,其特征在于它包括從由小麥、豌豆、和土豆的可溶物,優選的是小麥可溶物的組中選擇出可再生原料,處理所述可再生原料,以從中釋放出可直接被微生物同化的碳和氮源,以及回收這樣獲得的自給自足發酵培養基。
文檔編號C12P19/10GK1422947SQ0215758
公開日2003年6月11日 申請日期2002年10月30日 優先權日2001年10月30日
發明者C·富阿什, L·西格爾哈 申請人:羅凱脫兄弟公司