專利名稱：一種提高黃芪毛狀根中黃芪多糖的方法
技術領域：
本發明屬基因工程技術領域。具體涉及一種提高黃芪毛狀根中黃芪多糖的方法。
本發明提供了一種提高黃芪毛狀根中黃芪多糖的方法，該方法是通過基因工程方法發根農桿菌介導，將在強啟動子和強終止子調控下的葡萄糖苷轉移酶(又稱ADP、UDP，葡萄糖苷轉移酶)基因導入黃芪毛狀根中。
PCR和Southern雜交表明此基因已經整合到毛狀根基因組中并且以單拷貝的形式存在。轉基因毛狀根的生長量及葡萄糖苷轉移酶酶活性均比對照顯著提高，并且多糖產量亦得到顯著提高(高于對照68.8％，其中最高幅度為127％)。
表1 轉葡萄糖苷轉移酶基因黃芪毛狀根生長量、多糖含量、葡萄糖苷轉移酶活性與多糖產量和對照組比較表組別干重 多糖含量 GBSS活性多糖產量(g) (mg/g毛狀根) (U) (mg)對照1.08±0.2219.38±0.92 1.60±0.04 20.87±3.16轉基因毛狀根1.66±0.18**21.29±4.38 37.01±16.20**35.22±7.06**注對照為普通毛狀根，即用發根農桿菌直接誘導未攜帶外源基因的毛狀根另附PCR鑒定圖和液體培養的轉基因黃芪毛狀根生長圖通過轉基因(葡萄糖苷轉移酶)方法可以顯著提高黃芪毛狀根中有效成分黃芪多糖的含量，從而為工業化生產提供了高產的原材料。
以發根農桿菌誘導生成的黃芪毛狀根具有生長迅速、遺傳穩定、易于擴大培養等優點，如果能夠增加其中黃芪多糖的含量，將有利于工業化生產，解決品質退化問題。本技術應用基因工程方法，顯著提高了黃芪毛狀根中的黃芪多糖的含量。
實施例2cDNA的合成操作程序I.按照下表配制反應混合液反應液 反應量cDNA合成緩沖液*4uldNTP(10mM) 2ulOlig(dT)(12.5uM)1ulmRNA0.2-2ugAMV(20U/ul) 1ulddH2O --Total 20ul
*cDNA合成緩沖液(250mM Tris-HCl，40mM MgCl2，150mMKCl，5mM DTT，pH8.5)II.混勻后，55℃保溫60min，65℃保溫10min，滅活AMV，瞬間離心，將溶液集于離心管底部。
實施例3一步法提取膜莢黃芪(Astragalus membranaceus Bge.)中的總RNA，經逆轉錄為cDNA第一鏈，用PCR方法克隆淀粉粒結合淀粉合成酶(葡萄糖苷轉移酶，又稱ADP(UGP)葡萄糖苷轉移酶)表達框序列，使用引物序列如下正向引物P15’-CCTCTAGATGTTGCTCCTTACTGCTCTCT C-3’，逆向引物P25’-CCGAGCTCTGTG GGCTACAAAATCCTTCTG-3’。PCR循環條件如下94℃預變性5min；然后94℃變性30sec，55℃復性30sec，72℃延伸1.5min，共30個循環；最后72℃延伸7min結束反應。擴增出的片段約2.0kb，經0.8％凝膠電泳純化后測序鑒定序列的正確性。然后載入載體質粒pBI121獲得質粒pBI-葡萄糖苷轉移酶，并轉入大腸桿菌DH5α。重組后的葡萄糖苷轉移酶基因獲得強啟動子CaMV和強終止子NOS-ter。
實施例4將含質粒pBI-葡萄糖苷轉移酶的大腸桿菌和大腸桿菌pRK2013及發根農桿菌LBA9402進行共培養(三親雜交)篩選抗性農桿菌誘導黃芪幼苗，獲得轉基因黃芪毛狀根。同時，用未轉基因的農桿菌直接誘導黃芪幼苗，獲得的毛狀根作為對照。
實施例5三親雜交法
LBA9402、pRK2013和pBI-葡萄糖苷轉移酶三種細菌分別在YMB(Rif)、LB、LB(Kan)培養基上培養，挑單菌落分別用相應的液體培養基振蕩培養12小時，將其稀釋至濃度相近，混合后滴于無菌濾片上，然后在YMB培養平板上培養18小時。用1mM MgSO4沖洗濾片，洗液在YMB(Rif，Kan)平板上涂布。三天后可見到菌落出現。挑單菌落進行分子鑒定。
實施例6YMB培養基組成(g/L)甘露醇 10酵母提取物 0.4NaCl 0.1MgSO47H2O 0.2K2HPO40.5調pH至7.2后高壓滅菌實施例7LB培養基組成(g/L)胰化蛋白胨 10酵母提取物 5NaCl 10調pH至7.0后高壓滅菌實施例8黃芪毛狀根的繼代培養按照胡之璧等提供的方法誘導和培養膜莢黃芪毛狀根，在250ml的三角瓶中加入100ml MS培養基，接種0.1g(鮮重)，25℃黑暗條件下搖床(80rpm)培養，共培養35天。
實施例9生長量的測定每5天取樣一次，每次取樣5瓶，冷凍干燥后稱重，以干重表示毛狀根的生長量。
實施例10將不同株系的毛狀根分別在MS液體培養基中擴大培養，選用的培養基參照標準配方，但其中的硝酸銨成分因為抑制毛狀根的生長，因而用1％水解酪蛋白代替作為氮源。去除了其中的激素成分，采用3％的蔗糖作為碳源。暗培養14天后，分別測定生長量、多糖含量和葡萄糖苷轉移酶酶活性。其中，以干重作為生長量指標；多糖的提取和測定參見Shan等；葡萄糖苷轉移酶酶活性的測定參見Fujita等提供的方法。
實施例11MS培養基組成(mg/L)大量元素KNO31900CaCl2·2H20 440MgSO4·7H2O 370KH2PO4170微量元素KI 0.83
H3BO36.2MnSO4.4H2O 22.3ZnSO4.7H2O 8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4·5H2O0.025CoCl2·6H2O0.025Fe鹽Na2EDTA.2H2O 37.3FeSO4.7H2O 27.8有機元素肌醇 100煙酸 0.5鹽酸吡哆醇0.5鹽酸硫酸胺素 0.4甘氨酸2.0實施例12總DNA的提取采用CTAB方法，取材料0.5g置于陶瓷研缽中，加入液氮快速研磨至細粉末狀，加入500μl 2×CTAB(2％CTAB，0.1M Tris-HCl pH8.0，0.02M EDTA，1.4M NaCl，2％β-Mercaptoethanol)提取緩沖液，混勻，60℃水浴30min后，加500μl水飽和苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)反復混勻，10000rpm離心10min。吸取上清液至一新的Eppendorf管中，加入1/10體積的3M NaAc和等體積的異丙醇，混勻后于-20℃靜置20min，10000rpm離心10min沉淀DNA，棄上清液，沉淀依次用70％乙醇和無水乙醇漂洗，自然干燥后溶于含RNase的ddH2O中，分光光度法和凝膠電泳檢測濃度和純度，將每管DNA濃度調至50-100ng/μl，4℃保存備用。
實施例13葡萄糖苷轉移酶的提取取5g毛狀根材料，加1ml提取緩沖液(pH6.8，55mM Tris-HCl，2.3％SDS，5％2-mercaptoethanol，10％甘油)，冰上研磨，勻漿液過濾，混懸液13000g離心1min。沉淀經提取液洗滌3次后，重蒸水洗滌2次。再用丙酮洗滌2次，然后減壓蒸干，保存于-20℃待用。
實施例14葡萄糖苷轉移酶活性測定取提取的葡萄糖苷轉移酶0.2-3mg，加入200μl反應緩沖液(100mM甘氨酰-NaOH，pH8.5，100mM KCl，2.5mM MgCl2，0.5mMEDTA，1mM ADP-葡萄糖)，混勻后35℃保溫30min，4℃離心5min終止反應。取150μl，在以下緩沖液中反應，100mM甘氨酰-NaOH(pH8.5)，100mM KCl，2.5mM MgCl2，0.5mM EDTA，0.2mM磷酸烯醇丙酮酸，0.1mM NADH，11.5IU丙酮酸激酶，2.5IU乳酸脫氫酶(總體積1ml)。加入乳酸脫氫酶后即開始測定340nm的光吸收的下降量。
實施例15多糖的提取取毛狀根1g，加35ml水浸泡2小時，水煮3次，每次0.5小時。水煎液過濾，濾液定容至90ml，取50ml于半透膜袋中透析過夜。
實施例16多糖含量測定取多糖液2ml，然后分別加80％苯酚50ul，95％的濃硫酸5ml，反應2hr后測定485nm處光吸收。標準曲線按照如下方法繪制配制100ug/ml的葡萄糖標準液，按照下表配制反應的標準液，然后分別加80％苯酚50ul，95％的濃硫酸5ml，反應2hr后測定487nm處光吸收，以此表為標準繪制標準曲線。標號012345678910葡萄糖(ml) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
權利要求
1.一種提高黃芪毛狀根中黃芪多糖的方法，其特征在于該方法是通過基因工程方法發根農桿菌介導，將在強啟動子和強終止子調控下的葡萄糖苷轉移酶基因導入黃芪毛狀根中。
全文摘要
本發明屬基因工程技術領域。本發明提供了一種提高黃芪毛狀根中黃芪多糖的方法。應用本發明的方法能夠增加黃芪多糖含量，有利于工業化生產，解決品質退化問題。
文檔編號C12N15/56GK1421528SQ0215519
公開日2003年6月4日 申請日期2002年12月17日 優先權日2002年12月17日
發明者吳曉俊, 胡之璧, 劉滌, 趙淑娟 申請人:上海中醫藥大學