用以制造樟芝培養物的方法以及由所述方法獲得的產物的制作方法

專利名稱：用以制造樟芝培養物的方法以及由所述方法獲得的產物的制作方法
技術領域：
本發明涉及建立一種適于從一樟芝(Antrodia camphorata)培養物中大規模地制造出具藥理活性之濾出物的培養條件，具體地，該培養條件是藉由令培養期間的振蕩速率及/或pH值最佳化來建立。本發明亦涉及一種經由一系列部分分離過程而從一樟芝培養物中獲得具藥理活性之組合物的方法。本發明亦涉及利用前述組合物來制備藥學組合物。
在臺灣民俗醫學上，樟芝的子實體被認為對于中毒、腹瀉、腹痛、高血壓、皮膚搔癢及肝癌所引起的癥狀具有某種醫藥功效。然而，由于嚴苛的宿主專一性(host specificity)與在自然界中的稀有性，以及在人工栽培上的失敗，所以「牛樟芝」在市面上極為昂貴。無疑地，發展出大規模人工培養此種真菌的低成本制法是極具產業價值的。
目前，本案發明人已發現樟芝于浸沒式發酵培養時可展現出所希望的藥理活性，特別是抗腫瘤活性。如美國專利申請案第09/566,834號所揭露者，樟芝已被成功地小規模培養于諸如馬鈴薯右旋糖培養液(PDB)以及含有果糖作為主要碳源的合成培養基內。利用杭特氏座標系(Hunter′s coordinate system)進行測量，所得培養物顯現出紅色度指標為a≥3的暗紅色外觀，而此色澤與對于某些腫瘤細胞品是之生長的顯著抑制效應相關。更重要的是，作用于腫瘤細胞的活性成份雖然仍未被鑒定出，但已被發現能從真菌菌絲體分泌至培養物之液相中，使得從培養物中能輕易地獲取具藥理活性之組合物，以供產業利用。
因此，若此一有利之方法能被最佳化以供用于大量制造真菌培養物，當是極為希望的。更優選為針對一希望藥理活性來部分分離粗制濾出物，以獲得富含所希望活性的有用組合物。
因此，本發明之第一實施方案是提供一種用以制造具有藥理活性之樟芝培養物的方法，其包含(a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適于該分離株生長的培養基中，以獲得第一培養物；(b)令從步驟(a)培養而得之第一培養物接受被設定在第一預定速率下的第一振蕩階段，歷時一段可令被接種之分離株進一步生長的時間，以獲得一增殖有菌絲體的第二培養物；以及
(c)令得自于步驟(b)之第二培養物接受被設定在不同于第一預定速率之第二預定速率下的第二振蕩階段，令該分離株處于生理壓力下。
依據本發明之第二實施方案，其是提供一種用以制造具有藥理活性之樟芝培養物的方法，其包含(a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適于該分離株生長的培養基中；以及(b)將得自于步驟(a)之培養物予以培養，藉由在整個步驟(b)期間將培養物之pH值調整至pH4.5至5.4的范圍內。
優選地，樟芝培養物的pH值在整個步驟(b)期間被調整至pH4.6至5.3之范圍內，且更優選為pH4.7至5.2之范圍內。
本發明亦提供一種用以獲得一系列液態分離部分的方法，該等分離部分是針對一諸如抗腫瘤活性的希望藥理活性而從樟芝培養物中分離出。因此，本發明之第三實施方案是提供一種用以從樟芝培養物獲得一具有藥理活性之組合物的方法，其包含(a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適于該分離株生長的培養基中；(b)將步驟(a)所得之培養物予以培養；以及(c)從該培養物中移除大部分的不溶性物質，從而獲取一具有藥理活性的溶液；以及(d)將步驟(c)所得之溶液予以處理，以獲得含有分子量不超過約10kDa之真菌分子的藥理活性組合物。
優選地，所獲得之組合物含有具分子量不超過約3kDa且更優選為不超過約1kDa之真菌分子。
本發明之第四實施方案是提供一種用以從樟芝培養物獲得具有藥理活性之組合物的方法，其包含(a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適于該分離株生長的培養基中；(b)將步驟(a)所得之培養物予以培養；(c)從該培養物中移除大部分的不溶性物質，從而獲取一具有藥理活性的溶液；(d)將步驟(c)所得之溶液予以處理，以獲得含有分子量不超過約1kDa之真菌分子的分離部分；以及(e)令步驟(d)所得之分離部分通過一水不混溶相，并從該水不混溶相獲得該具藥理活性的組合物。
前述步驟(e)中之水不混溶相是優選為一含有有效量之吸附劑的固定相，該吸附劑能選擇性地吸附疏水性真菌分子。將該固定相予以洗脫，以獲得具有藥理活性的分離部分。
在本發明一個優選實施方案中，令步驟(e)所得之洗脫物進一步接受逆相分配層析，如在LichrosorbR RP-18柱(Merck)中進行，以獲得數個具有藥理活性的分離部分。
本發明更提供數種藥學組合物，以供治療癌癥或腫瘤疾病，該等藥學組合物含有依據本發明之任一方法所得的產物。
本發明更提供一種用以在需治療之病人體內治療癌癥或腫瘤疾病的方法，該方法是藉由將一個含有依據本發明之任一方法所得之產物的組合物處方給該病人。
圖4顯示出源自于放大規模樟芝培養物之濾出物的抗腫瘤活性；圖5為一流程圖，其顯示出一樟芝濾出物針對分子量進行純化的流程；圖6為一柱狀圖，其顯示依據圖5所分離出之培養物濾出物的抗腫瘤活性，其中受測細胞株包括有MRC-5、HeLa、AGS、Hep G2以及MCF-7；圖7為一柱狀圖，其將以AmberliteR XAD-4從一濾出物分離部分所分離出之分離部分的抗腫瘤活性予以比較，該濾出物分離部分含有分子量不超過約1kDa之真菌分子，其中受測細胞株包括有MRC-5、HeLa、AGS、Hep G2以及MCF-7；圖8為圖7之乙酸乙酯洗脫物在一個LichrosorbR RP-18柱中進行部分分離的光譜曲線；以及圖9-11顯示圖8中所分離出數個分離部分的抗腫瘤活性。
在本說明書中，「適合之培養基」此用語意指任何可以提供適于樟芝生長之人工環境并維持其藥理活性的培養基。優選地，本發明所使用之培養基適于促使菌絲體中生成具藥理活性之物質，并促使該(等)物質分泌至胞外。
適用于本發明之培養基包括被稱為「馬鈴薯右旋糖培養液(potatodextrose broth)」的天然培養基，以及任何含有果糖作為主要碳源的合成培養基。馬鈴薯右旋糖培養液可藉由諸如將一由300.0克切成丁狀之馬鈴薯、20.0克右旋糖與1.0升蒸餾水所構成的混合物予以濕熱滅菌，而在實驗室中制備，抑或是購自于諸如DIFCO等商業來源。
最佳之培養基為任何含有果糖作為主要碳源的合成培養基。若有需要，葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、玉米淀粉及麥芽萃出物等其他碳源以及此等之組合亦可被囊括于合成培養基中，以作為助劑。優選地，以該合成培養基之總體積為基準，該碳源優選在1.5至2.5重量％之范圍內，且更優選為呈1.5至2重量％之含量。
除了碳源以外，合成培養基可包含有氮源、微量元素(諸如無機鹽)，以及任選之維生素或其他生長因子。氮源包括但不限于硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、酪蛋白氨基酸(casamino acid)、酵母膏、蛋白胨(peptone)及胰胨(tryptone)以及此等之組合。優選地，依據本發明，該合成培養基是含有酵母膏作為氮源。以該合成培養基之總體積為基準，該氮源優選在0.2至2.0重量％之范圍內，且更優選為呈0.5重量％之含量。
依據本發明，任何可得之樟芝分離株均可供用于培養方法中，只要所使用之微生物具有生成可檢測量之具藥理活性代謝物的能力。可供使用之樟芝分離株包括有但不限于CCRC 35396(1994年12月1日被寄存于食品工業發展研究所(臺灣新竹市)之菌種保存及研究中心(CCRC)、35398(1994年12月1日)、35716(2000年5月3日)、36401(2000年1月27日)、36795(2000年1月27日)以及930032(2000年1月27日)。依據本發明之一優選實施方案，樟芝CCRC930032被用以制備培養物濾出物，該分離株亦以寄存編號PTA-1233被寄存在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，以作為專利程序之用。
為評估對于腫瘤細胞生長的抑制能力，令樟芝之粗制濾出物及其分離部分接受MTT比色分析。
使用于本說明書之用語「MTT比色分析(MTT colorimetric assay)」或「MTT-四氮唑分析(MTT-tetrazolium assay)」是指在1980年代，由美國國家癌癥研究所癌癥治療部門之發展性治療計劃所構建的一個抗癌藥劑篩選流程(請參見諸如Alley，M.C.，et al.，Feasibility of drugscreening with panels of human tumor cell lines using a microculturetetrazolium assay.Cancer Res.48589-601，1988；Scudiero，D.A.，et al.，Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth anddrug sensitivity in culture using human and other tumor celllines.CancerRes.484827-4833，1988；Vistica，D.T.，et al.，tetrazolium-based assaysfor cellular viabilitya critical examination of selected parametersaffecting formazan.Cancer Res.512515-2520，1991；Monks，A.，et al.，Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel ofcultured human tumor cell lines.J.Nat.Cancer Inst.83757-766，1991)。
在此分析中，具潛力之抗癌藥劑抑或源自于植物或微生物的天然產物(在此例中，即為源自于該五個樟芝分離株)被測試其對抗數組細胞株的能力，各組細胞株是代表人類惡性腫瘤的一種主要臨床分類。每個孔的活細胞數目是與甲(formazan)的生成量成正比，甲經由溶解化而被光譜儀所測量。原則上，生物活性物質或含有此等物質的天然產物可以抑制或甚至停止細胞生長，因而僅形成少量的甲利用MTT比色分析，可檢視諸如振蕩速率及pH值等在真菌培養上之重要參數，以評估此等參數在培養期間對于樟芝之藥理活性的效應。
在第一組實驗中，將一樟芝培養物分成兩份，并令之分別經歷二個不同的振蕩流程，其中一流程是被實行來將一恒定且劇烈的振蕩施加至真菌，而另一流程則為從溫和至劇烈的兩階段振蕩。經比較后，依據本發明之兩階段振蕩可致使藥理活性的早期產生。提供第一階段的溫和振蕩是為獲致被接種之真菌的營養生殖，以獲得培養生殖之菌絲體。培養結束時所獲取之菌絲體沉淀(mycelial pellets)的增大尺寸可用以指出溫和振蕩階段的成功與否。將振蕩速率從溫和轉換為劇烈的適當時機會依據選定之真菌分離株而定，而在廣泛之范圍變化。一般而言，當依據培養物之最終體積為基準而以10％v/v之量來接種一真菌分離株時，溫和振蕩可持續進行約3天(或約72小時)，隨后再升高振蕩速率。提供后續階段的劇烈振蕩是令真菌處于生理壓力下。在此一壓力下，會迫使樟芝加以因應而進行數個生理變化，包括促進不以恒定方式表現之二次代謝物的生成。據信，某些具有生理活性之真菌分子可藉由此種方法被「壓迫而產出」。可將生理壓力施加至樟芝的其他培養參數，諸如通氣速率、營養調整及熱壓力等，亦可單獨地運用或與本發明之振蕩速率此參數合并運用。適當的振蕩速率可參照前述內容進行實驗而測得，抑或是基于后述數據而依據諸如1995年由Pauline M.Doran所編纂并由Academic Press Ltd.出版之BioprocessEngineering Principles此書第150至151頁中所述方程式來進行估計。在某些情形下，當妥適地施加兩階段振蕩時，真菌培養物會在第6天時轉變為紅色。
在本發明之一優選實施方案中，兩階段振蕩是在一具預置有3升培養基的5升發酵槽(B.Braun)中進行，其中振蕩于開始時是被設定在一為不超過約300rpm且優選為約200rpm之速率下，隨后升高至一為不超過約400rpm且優選為約500rpm之速率下。在本發明之另一優選實施方案，兩階段振蕩是在一具預置有160升培養基之250升發酵槽(Bio-Top)中進行，其中該振蕩速率于開始時被設定在約40rpm下，隨后升高至約150rpm。
在第二組實驗中，將一樟芝培養物分成三份，并于整個培養期間分別培養在被控制于三個不同區段內的pH值下。經比較后，發現于pH4.5至5.4下所進行之培養可致使藥理活性的早期產生。優選地，樟芝培養物的pH值是在整個培養期間內被調整為pH4.6至5.3且優選為pH4.7至5.2之范圍內。
藉由前述關于振蕩及pH值等有用參數，依據本發明之樟芝培養法可成功地被擴大規模至160升之體積，并同時維持由該真菌所衍生出之希望藥理活性。
依據本發明之方法，一可供各種產業用途之具藥理活性濾出物能以一經濟、有效率且省時之方式從樟芝獲得。
本發明亦涉及建立一種可操作的純化方法，藉此，可獲得數種被增富有具藥理活性物質的新組合物，以供各種醫藥用途。依據本發明，該純化方法是藉由將一樟芝之粗制濾出物選擇性地加以分離來進行，以獲得一含有分子量不超過約10kDa、優選為不超過約3kDa且更優選為不超過約1kDa之真菌分子的分離部分。該分離方法可藉由以分子量為基礎來分離分子(即分子篩)的任何常規方法來進行，該種方法的例子包括凝膠過濾法、密度梯度純化法、超過濾法、超高速離心法以及其他類似的常規方法。
依據本發明，含有分子量不超過約1kDa之分子的分離部分是以極性為基礎而被進一步部分分離，以獲得一水不混溶相，并從之獲得具藥理活性之分離部分。該水不混溶相可為一不溶性固相或一不與水混溶之有機相。在本發明之一優選實施方案中，令該≤1kDa分離部分通過一含有有效量之吸附劑的固定相，該吸附劑能選擇性地吸附疏水性真菌分子。隨后，將該固定相予以洗脫，以獲得一具有希望藥理活性之分離部分。簡言之，該固定相從該≤1kDa分離部分中選擇性地獲取并濃縮據信含有希望之具藥理活性物質的疏水性溶質，以使得位于流經液(flow through)內的不具活性物質能被移除。適于含納于固定相中之吸附劑可為帶有適于從一流動相中捕集疏水性物質之官能團的任何吸附劑。該種吸附劑之例子為AmberliteR XAD-4(Sigma)與其等效物。該部分分離可藉由任何習用方式來運作，諸如將該≤1kDa分離部分與一批料之吸附劑共同培育，抑或是令該≤1kDa分離部分流經一填充有吸附劑的層析柱，只要具藥理活性物質被留置于吸附劑表面之含量是令人滿意的。用以從固定相中洗脫出被結合物質的適當洗脫劑(eluent)是為本領域所熟悉的，因而可被本領域技術人員所容易地選定。優選地，該洗脫劑為一具有低于水之極性的有機溶劑，且更優選為具有一低于甲醇之極性的有機溶劑。最佳之洗脫劑包括乙酸乙酯及乙醇。
可令展現出希望藥理活性之洗脫物(eluate)接受以其他物理、化學或生物特性為基礎的額外純化程序。在本發明之一優選實施方案中，洗脫物以疏水性程度為基礎被進一步分離，更優選為該分離是實施于一諸如LichrosorbR RP-18柱(Merck)及其等效物中。所得之數個分離部分被發現具有藥理活性。
前述發現強烈地暗示著，樟芝之藥理活性主要源自于具有分子量不超過1kDa之疏水性化合物。此發現恰與先前的一個假說相反，在該假說中，具有一為500至2,000kDa之平均分子量的多糖被認定為蕈類所擁有之抗腫瘤活性的主要來源(Mizuno，et.al.，Anttitumor-activesubstances from mushrooms.Food Rev.Intl.11(1)23-61)。雖然樟芝經報導為富含有諸如三萜、類黃酮(flavinoids)、類固醇、倍半萜內酯(sesquiterpene lactones)以及苯基與二苯基化合物等低分子量物質(Chang，supra；Chemg，et al.，Triterpenoids from Antrodia cinnamomea.Pytochem.41(1)263-267(1996)；Chiang，et al.，A sesquiterpene lactone，phenyl and biphenyl compounds from Antrodia cinnamomea.Pytochem.39(1)613-616(1995)；以及Yang，et.al.，Steroids and Triterpenoids ofAntrodia cinnamomea a fungus parasitic on Cinnamomum Micranthum.Pytochem.41(5)1389-1392(1996))，但是，沒有任何經報導之教示內容資以將此等物質與該真菌之藥理活性相聯系。
依據本發明之純化方法提供數種組合物，其中活性物質被濃縮且不具活性之物質被進一步移除。該等組合物顯然對于人類或動物個體具有增進之藥理有效性，因而適供用于諸如制造藥學組合物或營養補充品等各種產業用途。是以，本發明亦涉及利用所述新組合物作為在需要接受治療之人類或動物個體中治療疾病(特別是癌癥或腫瘤疾病)的藥物，抑或是作為一種被配制成諸如食品、飲料及/或動物飼料等形式之營養補充品。
下列實例僅供用于例示本發明，而非意欲限制本發明之范圍。
實施例1樟芝液體培養物之制備樟芝分離株CCRC 930032之原始培養物是被維持在-80℃下，從該原始培養物移出少量真菌，置入馬鈴薯右旋糖瓊脂平盤培養基(PDA，購自于Difco)上。待真菌恢復活力后，將培養物移至馬鈴薯右旋糖瓊脂斜面培養基。將斜面培養基培育在25℃下，并每二個月進行繼代培養一次。該等斜面培養基是供用作為操作用培養物(working cultures)。為制備菌絲體接種源，將源自于PDA斜面培養基之培養物接種于PDA平板上，并在28℃下培育15至20天。
菌絲體接種源之制備將真菌予以培養，直至觀察到菌絲群落具有一為15至30毫米之直徑為止。在一光學顯微鏡下檢驗樟芝的菌絲體特征，以確保其未被污染。將整個菌絲體切成小塊，隨后在無菌狀態下，于均質機(Osterizer)中，利用50ml之無菌水將菌絲體予以均質化，歷時30秒。菌絲體懸浮液之分量可供用作為浸沒式搖瓶培養的接種源。在500ml之厄氏錐瓶(Erlenmeyer flasks)內中預先置入一合成培養基(2％果糖、0.5％(w/v)之酵母膏(DIFCO)、0.1％(w/v)之KH2PO4(Merck)以及0.05％(w/v)之MgSO4·7H2O(Merck))，再將該接種源以1∶9之體積比加入該合成培基內。在30℃下，將該浸沒培養物予以培育5天，并施以恒定振蕩(在一得自于Hotech之旋轉式振蕩機上以50rpm之速率進行振蕩)。所得之培養物用作為后續大規模培養的接種源。
實施例2振蕩速率對于真菌濾出物之藥理活性的影響在5升發酵槽(B.Braun)內中預先置入2.7升合成培養基(2％果糖、0.5％(w/v)之酵母膏(DIFCO)、0.1％(w/v)之KH2PO4(Merck)以及0.05％(w/v)之MgSO4·7H2O(Merck))，再將實施例1中所制得之樟芝CCRC 930032接種源以1∶9之體積比加入該合成培養基中。在30℃以及0.6升/分鐘通氣速率下培育該培養物。培養物振蕩速率于開始時被設定在約200rpm下，經培育74小時后，再升高至約500rpm。在接種菌絲體后的第48、113、170、217及259小時，從培養物取樣獲得數個樣品，隨后令該等樣品通過一由過濾漏斗、錐瓶與抽氣裝置所構成的簡易過濾器裝置，以移除大部分之不溶性物質。以氨水(NH4OH)將所獲得之濾出物的pH值調整至7，并進行濕熱滅菌。將所得樣品保存于4℃下，以供后續MTT比色分析之用。
利用未經接種之培養基來作為MTT分析之負對照組。
選定Hep G2腫瘤細胞來進行MTT比色分析。進行分析之前，將細胞維持在補充有10％小牛血清(Hyclone)之α-MEM培養基(GIBCO BRL)，以作為原始培養物。該腫瘤細胞株是利用胰蛋白酶-EDTA(GIBCO BRL)使細胞由細胞培養錐瓶上脫離，而每周被繼代一或二次。獲取腫瘤細胞，經計數后，再以3,000個細胞/孔之濃度接種在一個96-孔微滴定板中。將各孔中之細胞培養基總體積補充至180μl，并于37℃下，在一充有5％CO2之培育箱中予以培育至隔日。
將三組各20μl分量之樣品加入培養孔內，并在前述培育條件下將培養物予以培育72小時。隨后，將20μl以5mg/ml之濃度預先制備在PBS溶液(GIBCO BRL)中之MTT(Merck)原液添加至各孔內。
在37℃下，于CO2培育箱中另行培育4小時后，移除各孔中之上清液，并添加100μl之100％DMSO(二甲亞砜，可得自于Sigma)，以溶解MTT-甲產物。以一機械式平板混合器充分混合后，利用ELISA閱讀器(MRX，Dynex)來測量540nm下之吸光值。因此，受測濾出物的腫瘤細胞相對存活率可藉由將各個實驗組樣品之吸光值除以對應未經接種對照組之吸光值而得出。
比較例1重復實施例2，除了該真菌培養物是于整個培養期間被培育在一為約500rpm之恒定速率下以外。
經實施例2與比較例1所得之濾出物處理后的腫瘤細胞相對存活率，在表1及

圖1中加以比較。
表1

在表1中，針對在指定時間點取樣的濾出物對于Hep G2腫瘤細胞的抑制效應進行比較。對于在菌絲體接種后的第170小時所取得的濾出物而言，可見歷經200rpm至500rpm之兩階段振蕩的樟芝CCRC930032能于MTT分析中獲得16％之相對存活率，此數值遠較在500rpm之恒定速率下所培養的培養物更為有效，因為后者僅觀察到35％之較高相對存活率。在后續的時間點(即第217與259小時)，實施例2與比較例1的抗腫瘤活性會漸趨靠近，此暗示著由初始低速振蕩與后續階段的高速振蕩所構成之組合，將可致使培養物中之具藥理活性物質的早期生成。
利用AGS、HeLa及MCF-7等腫瘤細胞株進行相應實驗，可在MTT分析中觀察到一致性的結果(結果未示出)。
實施例3pH值對于真菌濾出物之藥理活性的效應制備三個具有分別為約4.5(試驗A)、5.0(試驗B)及5.5(試驗C)之初始pH值的合成培養基批料(1.5％果糖、0.5％(w/v)之酵母膏(DIFCO)、0.1％(w/v)之KH2PO4(Merck)以及0.05％(w/v)之MgSO4·7H2O(Merck))，并將實施例1所制得之接種源以1∶9之體積比加入該等合成培養基中。將所得培養物依實施例2所述方法進行培養，但是在預定時間點監控各個培養物之pH值，并藉由添加NaOH溶液謹慎地將之調整至初始pH值附近(表2)。培養程序持續336小時。添加NaOH溶液的時機是依選定之pH值而定。例如，試驗B與試驗C是分別從第192與168小時起添加NaOH溶液，以將pH值維持于約4.9至5.1與約5.4至5.6，而試驗A則遲至第240小時才加入NaOH溶液。
表2

在接種菌絲體后的第96、144、192、240、288及336小時，從培養物取樣獲得數個樣品，隨后令該等樣品通過一由過濾漏斗、錐瓶與抽氣裝置所構成的簡易過濾器裝置，以移除大部分之不溶性物質。以氨水(NH4OH)將所獲得之濾出物的pH值調整至7，并進行濕熱滅菌。將所得樣品保存于4℃下，以供后續MTT比色分析之用。依實施例2所示，令所得樣品接受MTT比色分析。利用未經接種之培養基來作為MTT分析之陰性對照組。
表3

如表3所示，在指定時間點所取樣之樟芝濾出物針對其對于HepG2腫瘤細胞之抑制效應來進行比較。對于在接種菌絲體后的第192小時所取得之濾出物而言，可見試驗A與試驗B中培養的樟芝CCRC930032會獲得較試驗C所觀察到的更低的相對存活率。此種在抗腫瘤效應上之差異會在第240小時達到最高，而于后續的時間點逐漸降低，此暗示著在pH4.5至5.4下、優選為pH4.6至5.3下且更優選為在pH4.7至5.2下在所進行之培養，將可致使培養物中之具藥理活性物質的早期生成。
利用AGS、HeLa及MCF-7等腫瘤細胞株進行相應實驗，可在MTT分析中觀察到一致的結果(結果未示出)。
實施例4樟芝在250升發酵槽中之擴大規模培養在一具250升發酵槽(Bio-Top)內中預先置入160升之合成培養基(1.5％果糖、0.5％(w/v)之酵母膏(DIFCO)、0.1％(w/v)之KH2PO4(Merck)以及0.05％(w/v)之MgSO4·7H2O(Merck))，再將實施例1中所制得之樟芝CCRC 930032接種源以1∶9之體積比加入該合成培養基中。在30℃以及0.6升/分鐘之通氣速率下培育該培養物。培養物之振蕩速率于開始時被設定在約40rpm下，培育70小時后，再升高至約150rpm。培養物之pH值于整個培養期間均被調整在pH4.9至5.1的范圍內。
在接種菌絲體后的第96、144、168、186.5、244及284小時，從培養物取樣獲得數個樣品，隨后藉由一常規方法進行過濾，以移除大部分之不溶性物質。以氨水將所獲得之濾出物的pH值調整至7，并進行濕熱滅菌。令所得樣品接受MTT比色分析，其中HeLa、AGS、Hep G2及MCF-7細胞是在1,000、3,000、3,000及3,000個細胞/孔之初始濃度下進行測試。利用未經接種之培養基來作為MTT分析之負對照組。結果示于表4與圖4中。
表4

表4與圖4顯示出，經由將振蕩速率及pH值設定于實施例2及3中所述之優選范圍內，可將依據本發明之樟芝培養法成功地擴大規模至160升之體積。
實施例5在合成培養基中制備樟芝培養物之濾出物將被培養在PDA平板培養基上之樟芝CCRC 930032的整個菌絲體切成小塊，隨后在無菌狀態下，于一均質機(Osterizer)中，利用50ml之無菌水將菌絲體予以均質化，歷時30秒，以便獲得一菌絲懸浮液。在1升厄氏錐瓶內中預先置入200ml之合成培養基(2％果糖、0.5％(w/v)之酵母膏(DIFCO)、0.1％(w/v)之KH2PO4(Merck)以及0.05％(w/v)之MgSO4·7H2O(Merck))，再添加20ml之菌絲懸浮液。在30℃下，將該沈浸培養物予以培育14天，并施以恒定振蕩(在一具可得自于Hotech之旋轉式振蕩機上以75rpm之速率進行振蕩)。培育結束后，令真菌培養物通過一由過濾漏斗、錐瓶與抽氣裝置所構成的簡易過濾器裝置。所得粗制濾出物供后續分析之用。
實施例6源自于樟芝濾出物之活性分離部分的制備與分析依據制造商所提供的指南，藉由低速離心，令實施例5所得之粗制濾出物(F0)通過一個CertriprepR Concentrator 10(一種購自于Amicon的商用微型柱，其具有10kDa的分子量截留值)。初次流經液被稱作為分離部分F1。隨后以去離子再次充填柱并再次離心，以收集二次流經液F2。獲取仍留置于柱內之真菌分子，并命名為F3。
藉由一具有3kDa之分子量截留值的CertriprepR Concentrator 3微型柱(Amicon)，依前述方法將F1進行部分分離，以便獲得初次流經液(F4)、二次流經液(F5)以及仍留置于該柱內的分離部分(F6)。此純化流程示出于圖5中。
將所得之分離部分進行MTT比色分析，以評估抑制腫瘤細胞生長的能力。在此例中，HeLa細胞以1500個細胞/孔之初始濃度進行測試，而MRC-5、AGS、Hep G2及MCF-7細胞則具有3,000個細胞/孔的初始載入量。圖6中清楚地顯示出，F1與F4此二者所展現出之抗腫瘤活性相當于粗制濾出物(F0)所展現出的活性。此結果暗示著，濾出物中所存有的大部分(若非為全部)藥理活性物質具有低分子量，特別是具有不超過約3kDa的分子量。
另外，經由一系列膜組，將實施例5所得之粗制濾出物(F0)予以部分分離，以獲得一含有分子量不超過1kDa之真菌分子的分離部分(F7)。抗腫瘤活性與F7共存于相同分離部分(圖7中之最左圖)此一事實指出，具藥理活性物質的表觀分子量可能降至不超過約1kDa。
前述MTT分析中，于經濾出物處理之MRC-5細胞(正常肺纖維細胞)中會觀察到降低的存活率，此指出真菌濾出物以及其活性分離部分可能會對于正常細胞展現出抑制效應。然而，當接種諸如高達10,000個細胞/孔的MRC-5細胞時，該抑制效應會大幅降低。經比較，真菌濾出物以及其活性分離部分的有效性極不易被增量之腫瘤細胞所影響(數據未示出)。經此一活體外之觀察可推測，當投藥至活體內時，依據本發明之組合物對于正常細胞較為無害，但會給予腫瘤嚴厲的打擊。
實施例7樟芝濾出物在AmberliteR XAD-4樹脂上的分離將實施例6所得之濾出物F7與一批次之AmberliteR XAD-4(Sigma)共同培育，并施予溫和振蕩。培育結束后，藉由離心來沉淀樹脂粒。分別獲取含有未結合物質之上清液以及樹脂粒。隨后，依序以相同體積之去離子水、甲醇及乙酸乙酯來洗脫樹脂粒，并分別收集源自于三個洗脫流程的洗脫物。于低壓下，將甲醇洗脫物與乙酸乙酯洗脫物蒸發至干燥，再溶入少量乙醇中。將適量無菌水加入所得乙醇溶液中，以使得后續MTT比色分析中之乙醇最終濃度被調整至不超過0.5％。MTT比色分析是依實施例6所述方法來進行，并利用未經接種之培養基或0.5％乙醇水溶液作為陰性對照組。結果示于圖7。
圖7顯示出，乙酸乙酯洗脫物對于所有五種細胞均具有優越的抗腫瘤活性，而水及甲醇洗脫物則不會對該等細胞展現出顯著的效應。上清液中可觀察到殘余的抗腫瘤活性，推測此是導因于疏水性物質未被樹脂所完全吸附。此等結果暗示著，濾出物中所存有的藥理活性主要源自于分子量不超過約1kDa的疏水性物質。
實施例8樟芝濾出物在Lichrosorb RP 18柱中的分離在一個LichrosorbR RP-18管柱(Hibar預充填柱RT250-25；7μm；購自于Merck)中進一步分離實施例7所得之乙酸乙酯洗脫物。利用乙腈/水所構成之洗脫劑，以200分鐘期間從40％至100％的乙腈百分率以及5.7毫升/分鐘的流速下進行梯度洗脫。測量254nm處之吸光值，并將之繪示于圖8中。將體積各為12-ml之分離部分予以收集，并如表5所示組合成數個分離部分。
表5

依實施例7所述，于低壓下，將該等分離部分蒸發至干燥并制備成操作溶液。MTT比色分析是依實施例6所述方法來進行。結果示于圖9至11。
如圖9至11所顯示，分離部分G、K及L對于AGS細胞展現出顯著的抑制效應，而相鄰分離部分G與H則將Hep G2細胞的存活率壓抑至一低于50％的位準。MCF-7細胞廣泛地被分離部分B、E、F、G、H、K、L及R所抑制。
然而，乙酸乙酯洗脫物中對于HeLa細胞的抑制活性，幾乎在利用逆相分配層析進行純化期間消失殆盡，此指出樟芝濾出物中之某些藥理活性可能來自于許多分子的協同作用，而此一協同作用相當容易受到劇烈純化程序的影響。
雖然本發明已被描述于前述之特定實施例中，惟應明了，對于本領域熟熟練技術人員而言，許多的修改與變化是至為顯明，而可在不偏離本發明之精神與權利要求書范圍下完成。
權利要求
1.一種用以制造具有藥理活性之樟芝(Antrodia camphorata)培養物的方法，其包含(a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適于該分離株生長的培養基中，以獲得第一培養物；(b)令從步驟(a)培養而得之第一培養物接受被設定在第一預定速率下的第一振蕩階段，歷時一段可令被接種之分離株進一步生長的時間，以獲得一增殖有菌絲體的第二培養物；以及(c)令得自于步驟(b)之第二培養物接受被設定在不同于第一預定速率之第二預定速率下的第二振蕩階段，令該分離株處于生理壓力下。
2.如權利要求1之方法，其中該第二預定速率高于該第一預定速率。
3.如權利要求1之方法，其中步驟(a)所得之第一培養物以及步驟(b)所得之第二培養物是藉由將pH值調整至4.5至5.4之范圍內，而被培養于步驟(b)以及(c)中。
4.如權利要求3之方法，其中步驟(a)所得之第一培養物以及步驟(b)所得之第二培養物是藉由將pH值調整至4.6至5.3之范圍內，而被培養于步驟(b)以及(c)中。
5.如權利要求4之方法，其中步驟(a)所得之第一培養物以及步驟(b)所得之第二培養物是藉由將pH值調整至4.7至5.2之范圍內，而被培養于步驟(b)以及(c)中。
6.如權利要求1之方法，其中該培養基是選自于由馬鈴薯右旋糖培養液與含有果糖作為主要碳源的合成培養基所構成之組中。
7.如權利要求6項之方法，其中該培養基為一含有果糖作為主要碳源的合成培養基。
8.如權利要求1之方法，其中該分離株是選自于由CCRC 930032(ATCC PTA-1233)、CCRC 35396、35398、35716、36401與36795所構成之組中。
9.一種用以制造具有藥理活性之樟芝培養物的方法，其包含(a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適于該分離株生長的培養基中；以及(b)將得自于步驟(a)之培養物予以培養，藉由在整個步驟(b)期間將培養物之pH值調整至4.5至5.4的范圍內。
10.如權利要求9之方法，其中步驟(a)所得之培養物是藉由在整個步驟(b)中將pH值調整至4.6至5.3之范圍內而被培養。
11.如權利要求10之方法，其中步驟(a)所得之培養物是藉由在整個步驟(b)中將pH值調整至4.7至5.2之范圍內而被培養。
12.如權利要求9之方法，其中該培養基是選自于由馬鈴薯右旋糖培養液與含有果糖作為主要碳源的合成培養基所構成之組中。
13.如權利要求12之方法，其中該培養基為一含有果糖作為主要碳源的合成培養基。
14.如權利要求9之方法，其中步驟(b)是藉由在一預定速率下進行振蕩來實施。
15.如權利要求9之方法，其中該分離株是選自于由CCRC 930032(ATCC PTA-1233)、CCRC 35396、35398、35716、36401與36795所構成之組中。
16.一種用以從樟芝培養物獲得一具有藥理活性之組合物的方法，其包含(a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適于該分離株生長的培養基中；(b)將步驟(a)所得之培養物予以培養；(c)從該培養物中移除大部分的不溶性物質，從而獲取一具有藥理活性的溶液；以及(d)將步驟(c)所得之溶液予以處理，以獲得一含有分子量不超過約10kDa之真菌分子的藥理活性組合物。
17.如權利要求16之方法，其中步驟(d)所獲得之組合物含有分子量不超過約3kDa之真菌分子。
18.如權利要求16之方法，其中步驟(d)所獲得之組合物含有分子量不超過約1kDa之真菌分子。
19.一種用以從樟芝培養物獲得一具有藥理活性之組合物的方法，其包含(a)將一樟芝分離株的菌絲體接種源接種在一適于該分離株生長的培養基中；(b)將步驟(a)所得之培養物予以培養；(c)從該培養物中移除大部分的不溶性物質，從而獲取一具有藥理活性的溶液；(d)將步驟(c)所得之溶液予以處理，以獲得一含有分子量不超過約1kDa之真菌分子的分離部分；以及(e)令步驟(d)所得之分離部分通過一水不混溶相，并從該水不混溶相獲得該具藥理活性的組合物。
20.如權利要求19之方法，其中步驟(e)中之水不混溶相為一含有效量之吸附劑的固定相，該吸附劑能選擇性地吸附疏水性真菌分子，以及將該固定相予以洗脫，以獲得具有藥理活性的分離部分。
21.如權利要求20之方法，其中該固定相包含AmberliteR XAD-4樹脂作為吸附劑。
22.如權利要求20之方法，其中該固定相是被一洗脫劑所洗脫，該洗脫劑為一具有低于水之極性的有機溶劑。
23.如權利要求22之方法，其中該洗脫劑為一具有低于甲醇之極性的有機溶劑。
24.如權利要求23之方法，其中該洗脫劑是選自于由乙酸乙酯及乙醇所構成之組中。
25.如權利要求19之方法，其更包含將步驟(e)所得之組合物進行逆相分配層析，以獲得具藥理活性之分離部分。
26.如權利要求1之方法，其中該藥理活性為一針對腫瘤或癌細胞的抑制活性。
27.如權利要求9之方法，其中該藥理活性為一針對腫瘤或癌細胞的抑制活性。
28.如權利要求16之方法，其中該藥理活性為一針對腫瘤或癌細胞的抑制活性。
29.如權利要求19之方法，其中該藥理活性為一針對腫瘤或癌細胞的抑制活性。
30.如權利要求25之方法，其中該藥理活性為一針對腫瘤或癌細胞的抑制活性。
31.一種經由權利要求1、9、16、19及25項中任一之方法所獲得的產物。
32.一種藥學組合物，其包含一經由權利要求1、9、16、19及25項中任一之方法所獲得的產物。
33.如權利要求32之藥學組合物，其是用以治療癌癥或腫瘤疾病。
全文摘要
本發明涉及建立一種適于從一樟芝(Antrodiacamphorata)培養物中大規模地制造出具藥理活性之濾出物的培養條件，具體地，該培養條件是藉由令培養期間的振蕩速率及/或pH值最佳化來建立。本發明亦涉及一種經由一系列部分分離過程而從一樟芝培養物中獲得具藥理活性之組合物的方法。本發明亦涉及利用前述組合物來制備藥學組合物。
文檔編號C12R1/645GK1448501SQ0215484
公開日2003年10月15日 申請日期2002年12月2日 優先權日2002年3月29日
發明者吳美嬌, 黃仁彰, 林錫杰, 王伯徹 申請人:食品工業發展研究所