一種大腸桿菌通用的高效可溶表達載體系統的制作方法

專利名稱：：一種大腸桿菌通用的高效可溶表達載體系統的制作方法
技術領域：
：本發明涉及基因工程領域，更具體地，涉及一種可在大腸桿菌中以可溶形式高效表達外源蛋白的新型通用載體；這種表達載體的構建方法；以及含有該種載體的宿主細胞。
背景技術：
：大腸桿菌作為外源蛋白的表達體系具有許多獨特的優點，比如，大腸桿菌遺傳背景清楚，細胞生長迅速，發酵周期短，易于篩選和操作，并且表達系統較為豐富。但是，一個不容忽視的問題就是，許多在大腸桿菌中表達的外源蛋白都以沒有活性的形式聚集，這種沒有活性的形式就是包涵體。從包涵體出發，必須經過一定條件的變性、再折疊復性，才能得到所需的活性蛋白產物。而這些過程所需要的條件往往需要針對不同的外源蛋白進行優化，同時，這一變性、復性過程比較繁雜，而且產量比較低。大腸桿菌蛋白的正確折疊是由內部和外部因素共同驅動完成的。越來越多的證據表明，在蛋白質的折疊過程中，至少有三個最主要的晚期事件，即二硫鍵的形成，脯氨酸的異構化和亞單位的組裝。這些過程直接決定了蛋白質最終的正確結構能否形成。在大腸桿菌中，這些過程都由蛋白質二硫鍵形成相關蛋白、脯氨酸順反異構酶和分子伴侶催化完成。為促進外源蛋白的可溶表達，人們采取過多種方式，如與葡萄球菌蛋白A(SPA)融合表達，與谷胱甘肽(GST)融合表達，與硫氧環蛋白(Thioredoxin)融合表達等。由于這些蛋白都不是大腸桿菌折疊途徑所需的，只能起到部分的促可溶作用，因而效果自然有限，對于許多蛋白，甚至根本沒有作用。將外源蛋白基因與適當的信號肽序列相連，這樣的表達產物有望通過信號肽的引導而分泌到大腸桿菌周質腔，并且在這里得到進一步的折疊，產物甚至可以分泌到胞外培養基中。然而，事實證明，有時信號肽不能有效引導蛋白分泌，有時蛋白分泌到周質腔中也形成無活性的包涵體。這說明，僅有信號肽還不足以使外源蛋白以可溶形式表達。大腸桿菌通用分子伴侶，如GroEL/ES，在大腸桿菌蛋白折疊過程中起著很重要的作用。GroEL/ES主要通過與蛋白肽鏈折疊過程中形成的中間體結合，從而抑制這些中間體經由暴露在表面的疏水氨基酸殘基而形成非特異性聚集體。但是僅僅具有分子伴侶功能的GroEL/ES，雖然在實際應用中對某些蛋白起到了促可溶效果，但對許多外源蛋白的測試，并未取得理想的結果。這是由于蛋白質的分泌和折疊都是相當復雜的過程，僅有信號肽或僅有分子伴侶都不足以使得外源蛋白正確折疊。折疊酶類和分子伴侶在這些過程中發揮著極為重要的作用。
發明內容發明概述本發明人在長期的科研實踐中，令人意外地發現采用既有折疊酶功能，又有分子伴侶功能的促折疊相關蛋白FkpA能有效解決了外源蛋白的可溶表達問題，并且對于本發明中使用的所有外源蛋白都取得了非常理想的促可溶效果。因此，在本發明的一個方面，提供一種用基因工程方法通過將促折疊相關蛋白FkpA引入到大腸桿菌表達載體上而構建的大腸桿菌通用的高效可溶表達載體。在本發明的另一個方面，提供一種含有用于構建大腸桿菌通用的高效可溶表達載體的宿主細胞。在本發明的另一個方面，提供了一種大腸桿菌通用的高效可溶表達載體pTFA和pTRFA。在本發明的另一個方面，提供了一種用于高效可溶表達抗膀胱癌單鏈抗體PG的表達載體pTFP1。在本發明的另一個方面，提供了一種用于高效可溶表達抗膀胱癌單鏈抗體PG和纖維素結合域(CBD)所構成的融合蛋白CBD-PG的表達載體pTBNP1F。在本發明的另一個方面，提供了一種含有通用的高效可溶表達載體pTFA或者pTRFA的宿主細胞，所述的宿主細胞優選地為大腸桿菌。在本發明的另一個方面，提供了一種含有pTFP1或者pTBNP1F載體的宿主細胞，所述的宿主細胞優選地為大腸桿菌。在本發明的另一個方面，提供了一種構建上述各種載體的方法，包括將促折疊相關蛋白FkpA引入到大腸桿菌表達載體上的步驟。在本發明的另一個方面，提供了一種以可溶形式高效表達外源蛋白的方法，其特征在于利用上述的通用的高效可溶表達載體。但是，在本說明書的上下文，尤其是“實施例”部分的公開內容的基礎上，本發明的其它方面和優點對本領域的普通技術人員來說是顯而易見的。圖1為本發明所構建的新型通用融合和共表達載體的示意圖(基于FkpA的融合表達載體pTFP1和共表達載體pTBNP1F的結構示意圖)。圖2為本發明所構建的新型通用融合表達載體的構建過程簡圖。圖3為本發明所構建的新型通用共表達載體的構建過程簡圖。圖4為利用本發明所構建的新型通用融合和共表達載體在大腸桿菌中以可溶形式表達的外源蛋白的SDS-PAGE圖(可溶表達的FkpA-PG和CBD-PG的SDS-PAGE圖)。圖5為利用本發明所構建的新型通用融合和共表達載體在大腸桿菌中以可溶形式表達的外源蛋白的活性分析結果(ELISA分析FkpA-PG及與FkpA共表達的CBD-PG的抗原結合活性)。發明詳述在本發明的上下文中，所使用的術語除非另外說明，一般具有本領域的普通技術人員通常理解的含義。特別地，下列術語具有如下的含義本文所述的“促折疊相關蛋白”是指任何與蛋白質的折疊和成熟過程相關聯的蛋白質，包括各種分子伴侶蛋白、蛋白質二硫鍵形成蛋白、蛋白質二硫鍵異構酶、蛋白質肽基脯氨酰順反異構酶等。本文所述的“融合表達”是指外源基因序列與促折疊相關蛋白基因序列形成一個單一的轉錄和翻譯單元，形成單一的融合大蛋白。本文所述的“共表達”是指外源基因序列與促折疊相關蛋白基因序列可以在同一個轉錄啟動子的控制下轉錄，但以不同的翻譯單元分別翻譯成促折疊相關蛋白和外源目的蛋白；外源基因序列與促折疊相關蛋白基因序列也可以在不同的轉錄啟動子的控制下分別轉錄，并且以不同的翻譯單元分別翻譯成促折疊相關蛋白和外源目的蛋白。本發明采用的促折疊相關蛋白FkpA同時具有脯氨酰順反異構酶活性和分子伴侶的活性。FkpA蛋白是大腸桿菌組成型表達的蛋白，其成熟體位于大腸桿菌周質腔中，主要在這一部位發揮作用。但當外源蛋白大量表達時，原本以基礎水平表達的FkpA的量顯然不能滿足如此眾多的外源蛋白的折疊要求。通過將FkpA的編碼基因克隆到以多拷貝形式存在于大腸桿菌中的質粒上，使得FkpA也能大量表達，從而有效緩解了促折疊相關蛋白的不足，這樣就能使大量的外源蛋白得到正確折疊。本發明的大腸桿菌通用高效可溶表達載體的構建是建立在大腸桿菌促折疊相關蛋白FkpA的基礎之上的，這種蛋白具有催化蛋白新生肽鏈折疊過程中的酶促反應的能力，并且同時具有分子伴侶的功能，這些能力都是外源蛋白在大腸桿菌中高效可溶表達所必需的。這種新型載體巧妙地將這種促折疊相關蛋白FkpA引入到大腸桿菌表達載體上，這種過量表達的促折疊相關蛋白就能有效地對高效表達的外源蛋白起到促進折疊的作用。這種載體具有以下特點1.大量表達的促折疊相關蛋白FkpA能有效促進與之相融合的外源蛋白的正確折疊，從而使外源蛋白以可溶的有活性的形式表達；2.對于分子量較大的外源蛋白，可采用與促折疊相關蛋白FkpA共表達的方式表達，這種表達方式下的外源蛋白仍然是可溶的活性蛋白。因此，可根據外源蛋白的不同，靈活選擇融合方式或者是共表達的方式來表達外源蛋白；3.以這種方式表達的蛋白都是有功能的活性蛋白，不需要步驟繁瑣而效率極低的變性和復性過程，只需要較為簡單的純化步驟就能得到大量的外源蛋白；4.這種表達載體以大腸桿菌為表達宿主，可大量發酵生產，生產工藝簡單，容易操作，成本低廉。在構建本發明所描述的高效可溶表達載體系統時，我們采用了兩種策略，即融合表達和共表達。融合表達是指促折疊相關蛋白FkpA和外源目的蛋白在DNA水平上形成一個單一的融合基因，經轉錄和翻譯后形成一個大的蛋白，用合適的蛋白酶處理，就能釋放出外源目的蛋白。共表達是將促折疊相關蛋白FkpA和外源目的蛋白在DNA水平上分別作為兩個獨立的基因，即各自都帶有終止密碼子，經轉錄和翻譯后就形成兩個不同的蛋白，即FkpA和外源目的蛋白。之所以采用兩種方式，是為了更好的適應不同大小的目的蛋白。一般情況下，融合表達的蛋白總產量往往大于共表達的蛋白產量，但對于分子量過大的目的蛋白，融合表達會導致產物分子量太大而影響翻譯效率和后續的純化步驟，這種情況下，適宜采用共表達的方法。本發明構建的通用高效可溶表達載體的兩種策略都取得了良好的結果，充分表明，這兩種方式都是可行的。為使外源目的蛋白能從融合蛋白中釋放出來，在FkpA和外源基因插入位點之間設計有蛋白酶Thrombin識別的位點。下面結合具體的實施例，并參照附圖進一步詳細地描述本發明。應理解，本說明書中的實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。實施例設計大小合適的特異性引物，以普通大腸桿菌菌株K12的基因組DNA為模板，采用聚合酶鏈反應(PCR)擴增出大腸桿菌促折疊相關蛋白FkpA的完整編碼序列，但不含有終止密碼子。將擴增產物回收、酶切并連接到載體質粒pTMF上，就得到了可用于融合表達的載體pTFA。用內切酶BglII和SacI從pTFA上切下含有FkpA的片段，并將其連接到含有抗膀胱癌單鏈抗體的載體上，構建得到了高效可溶表達抗膀胱癌單鏈抗體的融合表達載體pTFP1。為構建共表達載體，另外設計了一對FkpA的特異引物，其中上游引物帶有大腸桿菌翻譯識別序列-核糖體結合位點(RBS)，以利于外源目的蛋白和FkpA分別獨立翻譯成不同的蛋白。PCR擴增得到的編碼框上游帶有RBS的FkpA，經回收、酶切并連接到載體質粒pTMF上，就得到了可用于共表達的載體pTRFA。用內切酶BglII和NdeI從含有融合蛋白CBD-PG的載體上將該片段切下，并連入共表達載體pTRFA上，就得到了共表達CBD-PG的載體pTBNP1F。用構建好的質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)(購自美國Invitrogen公司)。從轉化平板上挑取單克隆菌落細胞接種到含有50μg/mL卡那霉素的LB培養基中，37℃振蕩培養至OD550為0.8，向培養物中加入終濃度為0.4mmol/L的IPTG(購自寶生物工程(大連)有限公司)，誘導培養4小時。離心收集菌體細胞，超聲破碎菌體，12000rpm離心10分鐘，上清及沉淀分別進行收集，并用于12％SDS-PAGE檢測。超聲處理后的上清可同時用于ELISA活性實驗。具體操作流程如下一、融合用表達載體pTFA的構建本載體是由質粒pTMF構建而成的。質粒pTMF是質粒pET28a(+)的衍生質粒，其與pET28a(+)的唯一區別就是多克隆位點不一樣。pTMF的構建過程如下人工合成包含所需酶切位點的雙鏈DNA片段5’CCATGGGTAAGCTTGTCGACGGTACCGAGCTCATGTACCCGCGCGGT3’GGTACCCATTCGAACAGCTGCCATGGCTCGAGTACATGGGCGCGCCANcoIHindIIISalIKpnISacIThrombinsiteAACCTCGAGCATATGGAATTCGGATCCG3’TTGGAGCTCGTATACCTTAAGCCTAGGCAGCT5’XhoINdeIEcoRIBamHIXhoI*用NcoI消化處理該片段并回收，同時，用NcoI和XhoI酶切質粒pET28a(+)，回收載體大片段，并將其與上述人工合成的多克隆位點片段連接，篩選得到的陽性質粒命名為pTMF。采用特異引物，從大腸桿菌基因組DNA中擴增出不帶終止密碼子的FkpA，然后將其插入到pTMF上NcoI和SacI位點之間，就得到了pTFA載體。1、特異引物的設計和合成從GenBank中查到了大腸桿菌K12菌株FkpA的核酸編碼序列，共有813個核苷酸堿基。然后從該編碼框出發，設計出分別和編碼框上、下游互補配對的兩條引物FNC和FSC，其中FNC為平末端，FSC含有內切酶SacI位點。引物序列如下FNC5’AAATCACTGTTTAAAGTAACG3’FSC5’GCGAGCTCTTTTTTAGCAGAATCTGCGG3’，下劃線表示SacI位點，旁邊的GC為保護堿基。2、PCR擴增FkpA基因首先將合成的引物(DNA干粉)溶在適量的雙蒸水(ddH2O)中，使DNA濃度為10pmol/L。擴增反應管組成如下模板(大腸桿菌K12基因組DNA)1μL(約100ng)引物FNC(上海生工生物技術合成)5μL引物FSC(上海生工生物技術合成)5μLdNTPs(購自寶生物工程(大連)有限公司)5μL(每種各2.0mmol/L)10×PCR反應buffer(購自上海博亞生物技術公司)5μLpfuDNA聚合酶(購自上海博亞生物技術公司)1μL(3u/μL)大腸桿菌K12為普通大腸桿菌菌株K12。10×PCR反應buffer組分如下100mMTris-HCl(pH8.3)，500mMKCl，15mMMgCl2。用ddH2O補足至總體積50μL，混勻，94℃預變性5分鐘，然后進行30輪PCR循環94℃變性1分鐘，54℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘。PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，利用華舜生物技術有限公司的小量膠回收試劑盒純化回收所需的全長FkpA。3、PCR擴增產物的限制性內切酶消化及消化后DNA的純化回收用SacI對回收的全長PCR產物進行消化處理，按以下說明進行取約1ugDNA產物，加入3μL10×bufferL(購自寶生物工程(大連)有限公司，組分如下100mMTris-HCl(pH7.5)，100mMMgCl2，10mMDithiothreitol)，1μL內切酶SacI(購自寶生物工程(大連)有限公司)，用ddH2O補足體積至30μL，37℃水浴酶解反應4小時。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測消化完全后，在長波長紫外燈下切膠回收所需的條帶，參照華舜生物技術有限公司產品華舜小量膠回收試劑盒說明，用柱回收和純化所需的酶切片段。4、載體質粒pTMF的提取采用堿法小量提取質粒，所用Top10菌株購自美國Invitrogen公司。具體步驟如下從Top10/pTMF平板上挑取單菌落，接種在5ml含卡那霉素(Km，普通醫用制品，華北制藥廠生產)50μg/mL的LB培養基(組分為10克胰蛋白胨，5克酵母提取物，10克NaCl，用NaOH溶液調節pH為7.0；固體LB培養基需加入終濃度為1.5-2.5％的瓊脂粉。使用前需進行滅菌處理)中，37℃培養過夜，12000rpm離心1分鐘收集菌體。菌體沉淀重懸于100μLSolutionI(50mmol/LGlucose，10mmol/LEDTA，25mmol/LTris-Cl，pH8.0)，充分混勻。加入200μL新配制的SolutionII(0.2mol/LNaOH，1％SDS)，蓋緊管蓋，快速顛倒4-5次，將離心管置于冰浴中放置3分鐘。加入150μL預冷的SolutionIII(3mol/LKAc，pH4.8)，混勻后于冰浴中放置5分鐘。然后于12000rpm，4℃離心10分鐘。將上清轉移至另一新鮮離心管中，加入2倍體積的預冷的無水乙醇，混勻后室溫放置10分鐘，然后于4℃，12000rpm離心20分鐘，就得到DNA沉淀。DNA沉淀用70％乙醇淋洗一遍，離心管開蓋放置在通風的地方，待DNA干燥后，將其溶于500μlddH2O中(含50μg/ml的RNaseA)，37℃消化RNA約半小時。加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，震蕩混勻，于室溫，12000rpm離心10分鐘。轉移水相至另一離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，震蕩混勻，室溫下，12000rpm離心10分鐘。轉移上清至另一離心管中，加入1/10體積的醋酸鈉(NaAc，3mol/l，pH5.2)并混勻，然后加入2倍體積的無水乙醇，4℃放置1小時以沉淀DNA。4℃下，12000rpm離心20分鐘，棄上清，DNA沉淀用70％乙醇淋洗一遍，干燥后沉淀溶于50μlddH2O備用。5、載體質粒pTMF的限制性內切酶消化及消化后DNA的純化回收先用NcoI對載體DNA進行消化，具體如下取約1μg質粒pTMF在30μl總反應體積中(3μl10×BufferK(購自寶生物工程(大連)有限公司，組分如下200mMTris-HCl(pH8.5)，100mMMgCl2，10mMDithiothreitol(DTT)，1000mMKCl)，2μlNcoI(購自寶生物工程(大連)有限公司)，用ddH2O補足體積至30μl)，37℃酶解反應4小時，按照華舜生物技術有限公司產品華舜小量膠回收試劑盒說明純化回收酶切后的DNA。用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段(購自寶生物工程(大連)有限公司)補平NcoI酶切后的兩端缺口，反應如下純化回收的DNA中加入10×Klenow片段buffer(購自寶生物工程(大連)有限公司，組分如下100mMTris-HCl(pH7.5)，70mMMgCl2，1mMDithiothreitol)5μl，dNTPs(購自寶生物工程(大連)有限公司，每種各2.0mmol/L)5μl，Klenow片段(購自寶生物工程(大連)有限公司，3u/μl)1μl，補足體積至50μl，37℃補平反應45分鐘。按照華舜生物技術有限公司產品華舜小量膠回收試劑盒說明純化回收補平后的DNA。然后用SacI對補平后的DNA進行酶切，具體反應如下取補平后的質粒pTMF在30μl反應體系中(3μl10×BufferL(組分及來源同上)，2μlSacI，用ddH2O補足體積至30μl)，37℃酶解反應4小時，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測消化完全后，在長波長紫外燈下切膠回收所需的條帶，回收方法參照華舜生物技術有限公司產品華舜小量膠回收試劑盒說明，用柱回收和純化所需的載體片段。6、載體片段pTMF與FkpA片段的連接取回收的雙酶切pTMF約40ng，雙酶切全長FkpA約20ng，加入2μl10×T4DNA連接酶緩沖液(購自寶生物工程(大連)有限公司，組分如下660mMTris-HCl(pH7.6)，66mMMgCl2，100mMDTT，1mMATP)，1μlT4DNA連接酶(購自寶生物工程(大連)有限公司)，加ddH2O至總體積20μl，混勻，16℃連接過夜(約16小時)。7、大腸桿菌感受態細胞的制備用氯化鈣法制備大腸桿菌的感受態細胞，方法如下從野生大腸桿菌菌株Top10平板上挑取單菌落，接種于3mlLB液體培養基中，37℃震蕩培養過夜。以1％的接種量轉接于40ml的LB液體培養基中，37℃震蕩培養至OD值為0.3-0.4時，將菌液置于冰浴中10分鐘，于4℃，4000rpm離心10分鐘，棄去上清，沉淀重懸于20ml預冷的0.1mol/LCaCl2中，冰浴放置30分鐘，4℃，4000rpm離心10分鐘，棄去上清，加入2ml預冷的0.1mol/LCaCl2(含20％甘油)重懸細胞，以每管200μl分裝備用。不及時使用的各管于-70℃保存。8、重組DNA的轉化，陽性克隆的篩選及測序鑒定10ul連接產物加入到200μl的感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴放置30分鐘，42℃水浴90秒，立即置于冰浴中2-5分鐘，然后加入800μl不加抗生素的液體LB培養基，輕輕混勻，37℃輕搖培養復蘇45-60分鐘。取200μl培養液涂布于LB(含50μg/mlKm)平板上，表面干燥后，37℃倒置培養過夜。挑取平板上生長的單菌落，采用堿法小量提取質粒DNA，用BglII和SacI雙酶切，能切下大約980bp的質粒，即初步確定為陽性克隆；同時，用FkpA特異的引物FNC和FSC進行PCR反應，進一步鑒定插入外源片段的質粒。將鑒定后的質粒送上海生工生物工程公司測序鑒定，鑒定后測序正確的陽性質粒命名為pTFA。二、共表達用載體pTRFA的構建共表達載體pTRFA是由質粒pTMF在NdeI和BamHI位點之間插入用特異引物擴增的帶RBS的FkpA基因而來的。擴增用的模板為已構建好的質粒pTFA，擴增用的上游引物帶有一段RBS識別序列。1、特異引物的設計和合成從GenBank中查到了大腸桿菌K12菌株FkpA的核酸編碼序列，共有813個核苷酸堿基。然后從該編碼框出發，設計出分別和編碼框上、下游互補配對的兩條引物RFND和FBM，其中RFND的5’帶有一個NdeI識別位點和一段RBS序列，FBM不含內切酶切點，為平末端引物。兩條引物序列如下RFND5’GAATGGCATATGATGAAATCACTGTTTAAAGTAAC3’下劃線表示NdeI識別位點，斜體部分即為RBS序列，旁邊的GAATGG為酶切保護堿基。FBM5’TTATTTTTTAGCAGAATCTG3’，該引物為平末端。2、PCR擴增帶RBS序列的FkpA基因(RFkpA)首先將合成的引物(DNA干粉)溶在適量的雙蒸水(ddH2O)中，使DNA濃度為10pmol/L。擴增反應管組成如下質粒DNA(pTFA)1μL(約20ng)RFND(上海生工生物技術公司合成)5μLFBM(上海生工生物技術公司合成)5μLdNTPs(購自寶生物工程(大連)有限公司)5μL(每種各2.0mmol/L)10×PCR反應buffer(購自上海博亞生物技術公司)5μLpfuDNA聚合酶(購自上海博亞生物技術公司)1μL(3u/μL)10×PCR反應buffer組分同上。用ddH2O補足至總體積50μL，混勻，94℃預變性5分鐘，然后進行30輪PCR循環94℃變性1分鐘，54℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘。PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，利用華舜生物技術有限公司的小量膠回收試劑盒純化回收所需的全長RFkpA。3、PCR擴增產物的限制性內切酶消化及消化后DNA的純化回收用NdeI對回收的全長PCR產物進行消化處理，按以下說明進行取約1ugDNA產物，加入3μL10×bufferH(購自寶生物工程(大連)有限公司，組分如下500mMTris-HCl(pH7.5)，100mMMgCl2，10mMDithiothreitol，1000mMNaCl)，1μL內切酶NdeI(來源同上)，用ddH2O補足體積至30μl，37℃水浴酶解反應4小時。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測消化完全后，在長波長紫外燈下切膠回收所需的條帶，參照華舜生物技術有限公司產品華舜小量膠回收試劑盒說明，用柱回收和純化所需的酶切片段。4、載體質粒pTMF的限制性內切酶消化及消化后DNA的純化回收先用BamHI對載體DNA進行消化，具體如下取約1μg質粒pTMF在30μl反應體系中(3μl10×BufferK(組分及來源同上)，3μl0.1％BSA(來源同內切酶)，2μlBamHI，用ddH2O補足體積至30μl)，37℃酶解反應4小時，按照華舜生物技術有限公司產品華舜小量膠回收試劑盒說明純化回收酶切后的DNA。用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段(來源同上)補平BamHI酶切后的兩端缺口，反應如下純化回收的DNA中加入10×Klenow片段buffer5μl，dNTPs(組分及來源同上，每種各2.0mmol/L)5μl，Klenow片段1μl(3u/μl)，補足體積至50μl，37℃補平反應45分鐘。按照華舜生物技術有限公司產品華舜小量膠回收試劑盒說明純化回收補平后的DNA。然后用NdeI(來源同上)對補平后的DNA進行酶切，具體反應如下取補平后的質粒pTMF在30μl反應體系中(3μl10×BufferH(組分及來源同上)，2μlNdeI，用ddH2O補足體積至30μl)，37℃酶解反應4小時，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測消化完全后，在長波長紫外燈下切膠回收所需的條帶，回收方法參照華舜生物技術有限公司產品華舜小量膠回收試劑盒說明，用柱回收和純化所需的載體片段。5、載體片段pTMF與RFkpA的連接取回收的雙酶切pTMF約40ng，酶切全長RFkpA約20ng，加入2μl10×T4DNA連接酶緩沖液，1μlT4DNA連接酶，加ddH2O至總體積20μl，混勻，16℃連接過夜。6、重組DNA的轉化，陽性克隆的篩選及測序鑒定10ul連接產物加入到200μl的大腸桿菌菌株Top10感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴放置30分鐘，42℃水浴90秒，立即置于冰浴中2-5分鐘，然后加入800μl不加抗生素的液體LB培養基，輕輕混勻，37℃輕搖培養復蘇45-60分鐘。取200μl培養液涂布于LB(含50μg/mlKm)平板上，表面干燥后，37℃倒置培養過夜。挑取平板上生長的單菌落，采用堿法小量提取質粒DNA，用BglII和EcoRI(兩種內切酶的來源同上)雙酶切，能切下大約800bp的質粒，即初步確定為陽性克隆；同時，用FkpA特異的引物RFND和FBM進行PCR反應，進一步鑒定插入外源片段的質粒。將鑒定后的質粒送上海生工生物工程公司測序鑒定，鑒定后測序正確的陽性質粒命名為pTRFA。三、融合表達抗膀胱癌單鏈抗體的載體pTFP1的構建融合表達載體pTFP1是由單獨表達抗膀胱癌單鏈抗體的載體pTP1在BglII和SacI之間插入同樣雙酶切pTFA得到的小片段(含有不帶終止密碼子的FkpA)構建而成的。載體pTP1為單獨表達C-末端帶c-myc標簽序列的抗膀胱癌單鏈抗體的載體，其構建過程簡要介紹如下。從分泌抗膀胱癌單克隆抗體的雜交瘤細胞株BDI-1(來自北京大學)提取基因組DNA，采用特異引物擴增得到抗膀胱癌單鏈抗體基因序列(參見文獻YuLZ等)。合成兩條特異引物用于擴增c-末端帶c-myc標簽序列的抗膀胱癌單鏈抗體基因序列PGH5’CCCTCGAGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTC3’，下劃線為XhoI識別位點；PGLC15’CCGAATTCTTATTTTAGTTCCAACTTTGTCCCCG3’，下劃線為EcoRI識別位點，斜體部分為c-myc標簽序列。按照與上文相同的擴增條件擴增得到C-末端帶c-myc標簽序列的抗膀胱癌單鏈抗體基因序列，其模板來自北京大學。擴增得到的抗膀胱癌單鏈抗體基因序列連入載體pTMF的XhoI-EcoRI位點之間，得到的陽性克隆質粒命名為pTP1。1、表達質粒pTP1和pTFA的提取和限制性內切酶消化用華舜小量質粒提取試劑盒提取質粒pTP1和pTFA(本發明構建，參見上文)，分別用BglII和SacI進行雙酶切處理，條件如下取約1ugDNA，加入1.5μL10×bufferK(組分及來源同上)，內切酶NdeI和SacI各1μL，用ddH2O補足體積至30μl，37℃水浴酶解反應4小時。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測消化完全后，在長波長紫外燈下切膠回收所需的條帶，即回收pTP1酶切后的大片段和pTFA酶切后的小片段，參照華舜生物技術有限公司產品華舜小量膠回收試劑盒說明，用柱回收和純化所需的酶切片段。2、DNA的連接反應，重組DNA的轉化和陽性克隆的篩選取回收的雙酶切pTP1約40ng，FkpA約20ng，加入2μl10×T4DNA連接酶緩沖液，1μlT4DNA連接酶，加ddH2O至總體積20μl，混勻，16℃連接過夜。10ul連接產物加入到200μl的感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴放置30分鐘，42℃水浴90秒，立即置于冰浴中2-5分鐘，然后加入800μl不加抗生素的液體LB培養基，輕輕混勻，37℃輕搖培養復蘇45-60分鐘。取200μl培養液涂布于LB(含50μg/mlKm)平板上，表面干燥后，37℃倒置培養過夜。挑取平板上生長的單菌落，采用堿法小量提取質粒DNA，用BglII和SacI雙酶切，能切下大約980bp的質粒，即初步確定為陽性克隆；同時，用FkpA特異的引物FNC和FBM進行PCR反應，進一步鑒定插入外源片段的質粒。將鑒定后的質粒送上海生工生物工程公司測序鑒定，鑒定后測序正確的陽性質粒命名為pTFP1(參見附圖1及附圖2)。四、共表達抗膀胱癌單鏈抗體-纖維素結合域(CBD)融合蛋白CBD-PG和FkpA蛋白的載體pTBNP1F的構建共表達載體pTBNP1F是由用BglII和NdeI雙酶切質粒pTBNP1得到的含有融合蛋白CBD-PG基因序列的片段插入到同樣雙酶切處理的質粒pTRFA上構建而成的。質粒pTBNP1的構建過程如下pTBN的構建提取Cellulomasfimi(糞纖維單胞菌，購自中國普通微生物菌種保藏中心)染色體DNA作為擴增纖維素結合域(CBD)的模板；從GeneBank查得Cellulomasfimi染色體上編碼纖維素結合域的基因序列，全長492個堿基，設計兩條特異引物，分別與該CBD序列上、下游互補，引物序列如下上游引物CBDNC5’TCCACCCGCAGAACCGCC3’(平末端)下游引物BD35’TAGAGCTCCGGCGTGGGGGTGGGGG3’，下劃線所示為內切酶SacI位點。按以下條件進行PCR擴增反應模板(Cellulomasfimi染色體DNA)1μL(約100ng)引物CBDNC(上海生工生物技術合成)5μL引物BD3(上海生工生物技術合成)5μLdNTPs(購自寶生物工程(大連)有限公司)5μL(每種各2.0mmol/L)10×PCR反應buffer(購自上海博亞生物技術公司)5μLpfuDNA聚合酶(購自上海博亞生物技術公司)1μL(3u/μL)10×PCR反應buffer組分同上文。用ddH2O補足至總體積50μL，混勻，94℃預變性5分鐘，然后進行30輪PCR循環94℃變性1分鐘，54℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘。PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，利用華舜生物技術有限公司的小量膠回收試劑盒純化回收所需的全長CBD。先用NcoI對載體pTMF進行消化，具體如下取約1μg質粒pTMF在30μl總反應體積中(3μl10×BufferK(來源及組分同上)，3μl10×BSA，2μlNcoI(來源同上)，用ddH2O補足體積至30μl)，37℃酶解反應4小時，按照華舜生物技術有限公司產品華舜小量膠回收試劑盒說明純化回收酶切后的DNA。用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段(來源同上)補平NcoI酶切后的兩端缺口，反應如下純化回收的DNA中加入10×Klenow片段buffer(來源及組分同上)5μl，dNTPs(來源及組分同上)5μl，Klenow片段(來源同上)1μl，補足體積至50μl，37℃補平反應45分鐘。按照華舜生物技術有限公司產品華舜小量膠回收試劑盒說明純化回收補平后的DNA。然后用SacI對補平后的載體DNA和回收的CBD進行酶切，具體反應如下取補平后的質粒pTMF或CBD在30μl反應體系中(3μl10×BufferL(組分及來源同上)，2μlSacI，用ddH2O補足體積至30μl)，37℃酶解反應4小時，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測消化完全后，在長波長紫外燈下切膠回收所需的條帶，回收方法參照華舜生物技術有限公司產品華舜小量膠回收試劑盒說明，用柱回收和純化所需的載體和CBD片段。按照與上文相同的方法進行載體與CBD片段的連接及轉化，篩選所得到的陽性克隆質粒命名為pTBN。pTBNP1的構建為方便克隆，采用特異引物擴增C-末端含c-myc識別序列標簽的抗膀胱癌單鏈抗體，并將其連入載體pTBN。擴增所用的引物為PGH(與上文相同)；PGLC25’CCCATATGTTAATTCAGATCCTCTTCTGAGATG3’，下劃線為NdeI識別位點。按照與上文擴增PG相同的條件擴增得到C-末端帶c-myc標簽序列的抗膀胱癌單鏈抗體基因序列，其模板為上文構建的載體pTP1。擴增得到的抗膀胱癌單鏈抗體基因序列連入載體pTBN的XhoI-NdeI位點之間，得到的陽性克隆質粒命名為pTBNP1。1、質粒pTRFA和pTBNP1DNA的提取以及限制性內切酶消化用華舜小量質粒提取試劑盒提取質粒pTRFA和pTBNP1，分別用BglII和NdeI進行雙酶切處理，條件如下取約1ugDNA，加入1.5μL10×bufferH(組分及來源同上)，內切酶BglI和INdeI各1μL，用ddH2O補足體積至30μl，37℃水浴酶解反應4小時。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測消化完全后，在長波長紫外燈下切膠回收所需的條帶，即回收pTRFA酶切后的大片段和pTBNP1酶切后的小片段，參照華舜生物技術有限公司產品華舜小量膠回收試劑盒說明，用柱回收和純化所需的酶切片段。2、DNA的連接、重組DNA的轉化和陽性克隆的篩選DNA的連接反應按以下進行取回收的雙酶切pTRFA約40ng，CBD-PG片段約20ng，加入2μl10×T4DNA連接酶緩沖液，1μlT4DNA連接酶，加ddH2O至總體積20μl，混勻，16℃連接過夜。10ul連接產物加入到200μl的感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴放置30分鐘，42℃水浴90秒，立即置于冰浴中2-5分鐘，然后加入800μl不加抗生素的液體LB培養基，輕輕混勻，37℃輕搖培養復蘇45-60分鐘。取200μl培養液涂布于LB(含50μg/mlKm)平板上，表面干燥后，37℃倒置培養過夜。挑取平板上生長的單菌落，采用堿法小量提取質粒DNA，用BglII和NdeI雙酶切，能切下大約1.3kb的質粒，即初步確定為陽性克隆。將鑒定后的質粒送上海生工生物工程公司測序鑒定，鑒定后測序正確的陽性質粒命名為pTBNP1F(參見附圖1及附圖3)。五、融合蛋白FkpA-PG的可溶表達以及CBD-PG與FkpA的可溶共表達構建好的質粒pTFP1、pTBNP1F和空載體pTMF分別轉化大腸桿菌表達宿主BL21(DE3)(購自美國Invitrogen公司)。從轉化平板上挑取單克隆菌落細胞接種到含有50μg/mL卡那霉素的LB培養基中，37℃振蕩培養至OD550為0.8，向培養物中加入終濃度為0.4mmol/L的IPTG(購自寶生物工程(大連)有限公司)，誘導培養4小時。取1mL培養液，12000rpm離心1分鐘收集菌體，去上清，菌體細胞重懸在500μlPBS(組分為8克NaCl，0.2克KCl，1.44克Na2HPO4和0.24克KH2PO4，用HCl調pH至7.4，定容至1升)中，超聲破碎菌體后，12000rpm離心10分鐘，收集上清，沉淀重懸在500μlPBS中。并用12％SDS-PAGE電泳分析蛋白的表達情況。SDS-PAGE電泳的相關步驟如下。聚丙烯酰胺凝膠的配制濃縮膠5％分離膠12％分離膠8％封口膠30％Acr/Bis(29∶1)(ml)0.56.04.00.531.5MTris-HCl(pH8.8)(ml)-3.83.8-1.0MTris-HCl(pH6.8)(ml)0.38--0.510％SDS(ml)0.030.150.150.0210％AP(ml)0.030.150.150.02TEMED(ml)0.0030.0060.0090.0012ddH2O(ml)2.14.96.90.93樣品的處理適量蛋白樣品(一般約30μl)與等體積的2×SDS凝膠電泳加樣緩沖液(100mmol/lTris-HClpH6.8，200mmol/lDTT，4％SDS，0.2％溴酚藍，20％甘油)混合，沸水浴加熱5分鐘，冷卻備上樣。電泳準備電泳緩沖液(25mmol/lTris-HCl，pH8.3，0.1％SDS)。取適量體積的樣品上樣，恒壓90-100V，待樣品進入分離膠，恒壓120-150V。染色及脫色采用考馬斯亮蘭R250染色(0.25g考馬斯亮蘭R250溶于100ml甲醇-水-冰乙酸溶液中(90ml甲醇∶水(1∶1，v/v)和10ml冰乙酸)，室溫染色4-12小時。用甲醇-水-冰乙酸溶液脫色，室溫脫色至具有明顯條帶，凝膠照相分析結果(參見附圖4)。六、ELISA分析FkpA-PG及與FkpA共表達的CBD-PG的抗原結合活性超聲波破碎法制備的膀胱癌細胞系BIU87(購自北京大學)的細胞膜抗原包被ElISA板4℃過夜，用含0.05％Tween20的PBS(即PBST)洗板三次，加200μl1％的BSA封閉2小時，分別用PBST和PBS各洗三次。含可溶FkpA-PG和可溶CBD-PG的超聲上清分別進行結合反應1小時，用PBST和PBS各洗三次。加入1∶1000稀釋的兔抗鼠c-myc抗體(9E10，美國SantaCruz公司產品)，室溫結合1小時，分別用PBST和PBS各洗三次。再加入1∶1000稀釋的HRP標記的羊抗鼠抗體IgG(北京華美公司產品)，室溫結合1小時，分別用PBST和PBS各洗三次。在底物顯色液(10mg/mlOPD，1％H2O2)中顯色后，96孔酶標儀測定OD490讀數(參見附圖5)。參考文獻DarbyNJ，MorinPE，TalboG等.通過非天然的二硫鍵中間體的牛胰腺蛋白酶抑制劑的再折疊(Refoldingofbovinepancreatictrypsininhibitorvianon-nativedisulphideintermediates).分子生物學雜志(JMolBiol)，1995，249463-77；AnfinsenCB.支配蛋白鏈折疊的原理(Principlesthatgovernthefoldingofproteinchain).科學(Science)，1973，181223-30；SaxenaVP，WetlauferDB.蛋白質中三維結構的形成(Formationofthree-dimensionalstructureinproteins).生物化學(Biochemistry)，1970，95015-22；GethingMJ，SambrookJ.細胞中蛋白質的折疊(Proteinfoldinginthecell).自然(Nature)，1992，35533-45；EllisRJ.分子伴侶避免擁擠(Molecularchaperonesavoidingthecrowd).當代生物學(CurrentBiology)，1997，7R531-R533；HolmgrenA.硫氧還蛋白和谷氧還蛋白系統(Thioredoxinandglutaredoxinsystems).生物的化學雜志(JBiolChem)，1989，26413963-66；LaVallieER，DiBlasioEA，KovacicS等.一種克服大腸桿菌胞質中包涵體形成的硫氧還蛋白基因融合表達系統(AthioredoxingenefusionexpressionsystemthatcircumventsinclusionbodyformationintheE.colicytoplasm).生物技術(Biotechnology(NY))，1993，11187-193；SmithDB，JohnsonKS.一步法從大腸桿菌純化與谷胱甘肽巰基轉移酶融合表達的多肽(Single-steppurificationofpolypeptidesexpressedinEscherichiacoliasfusionswithglutathioneS-transferase).基因(Gene)，1988，6731-40；RainaS，MissiakasD.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