專利名稱：：煙胺合成酶基因的用途和通過轉基因植物提高植物耐逆性的方法
技術領域：
：本發明涉及煙胺合成酶基因的用途和一種利用轉基因植物提高植物耐逆性(抗旱或耐鹽等)的方法。
背景技術：
：目前，干旱、鹽堿成為公認的全球化環境問題，據統計，全球干旱、半干旱地區約占土地總面積的36％，占耕地面積的43％，而土壤干旱又常常伴隨著鹽漬化。在我國鹽漬化土地占耕地面積的20％。造成缺水脅迫的環境因子，如干旱、高鹽和極端的溫度是嚴重影響栽培植物生長發育的非生物脅迫因素，并且是限制植物生產力的主要因子。為了應付日益膨脹的人口和日益惡化的環境，需要培育出更多耐受脅迫的作物。由于植物的脅迫耐性大多屬于數量性狀，用傳統育種技術和用標記物輔助進行篩選的方法來改良植物的脅迫耐性費時、費力、困難大。自從1984年首次獲得轉基因煙草以來，植物轉基因技術在植物改良方面日益得到廣泛的應用，已有200多種植物相繼轉化。運用基因工程技術，極大縮短育種年限，加快育種進程；更為重要的是基因轉化打破了物種間基因交流的界限，將不同來源的基因(包括不同植物、動物、微生物、真菌等)導入現存的優良植物品種中，獲得更理想性狀的品種。而通過基因工程方法直接導入外源抗性基因具有所需周期短，目的性強等優點。通過與傳統育種技術共同作用將大大加快植物優良性狀新品種的培育。但由于逆境脅迫響應在遺傳上和生理上表現出很強的復雜性，人們對逆境脅迫的耐受機制如逆境信息的感知、傳遞以及代謝途徑的變化等認識還遠遠不夠，限制了基因工程技術的應用。隨著分子生物學的發展，人們能夠從基因組成、表達調控及信號傳導等方面來認識植物逆境脅迫耐受性機理。并且已經克隆到來自微生物、植物等有機體的編碼生化代謝關鍵酶基因和在逆境脅迫信號傳導過程中起重要作用的基因，采用重組DNA和轉基因技術向作物中導入這些外源基因已成為提高植物耐脅迫性的新途徑。盡管植物本身具有防御逆境脅迫的能力，但是植物間對非生物脅迫的耐受性差別很大，特別是一些栽培植物，耐逆境脅迫能力較低。現在改良植物脅迫耐性更為迅速和有效的策略是轉移編碼生化途徑的關鍵酶或參與信號傳導途徑的一個或幾個基因。目前，應用于植物脅迫改良的外源目的基因包括編碼催化滲透調節產物合成的酶、膜修飾酶、活性氧解除酶、脅迫誘導蛋白等基因。鐵元素是影響植物生長發育的限制營養元素。鐵參與植物的光合作用、呼吸作用、生物固氮及DNA合成復制等許多重要的生物過程(Welch，1995)。缺乏鐵元素則會影響植物體內葉綠素和豆血紅素的生物合成，使得植物出現缺綠癥。pH極高的鹽堿土嚴重影響農業生產，其中，鐵在鹽堿土中的溶解性極低，更不易被植物吸收利用，因而生長在高pH土壤環境中的植物易發生嚴重的缺綠癥。研究發現植物對鐵元素的缺乏與體內煙胺(Nicotianamine，NA)含量的不足有很大關系。NA是Fe2+、Cu2+、Zn2+.Mn2+等離子在木質部和韌皮部運輸過程中形成穩定態所必需的螯合物，參與這些離子運輸。NA與Fe2+形成的復合物比與Fe3+形成的復合物更加穩定，這樣更能保持Fe2+的穩定。VonWiren(1999)還發現NA能保護細胞，防止氧化破壞。因此參與NA合成的煙胺合成酶基因(nicotianaminesynthase，NAS)的作用顯得十分重要。目前研究人員已從許多植物體內克隆出NAS基因，如大麥中克隆的NAS基因(accessionNo.AF136941，AF136942，AB011264，AB011266，AB011268，AB011269，AB019525，AB010086，AB011267)，水稻中克隆的NAS基因(accessionNo.BE607438，AB046401，AB023819，AB023818，AB021746)，大豆(accessionNo.BM892247)，玉米中的NAS基因(accessionNo.AB042551，BU493605)，擬南介中克隆的NAS基因(accessionNo.AB021936，AB021935，AB021934，BE845347AY072364，AY140031)，西紅柿中克隆的NAS基因(accessionNo.BG791292)等，并發現NAS基因的表達受缺鐵條件誘導(Higuchi，2001；Ling等，1999；Suzuki等，2001)。由于NAS表達受缺鐵條件誘導，且NAS的表達能有利于提高植物耐缺鐵環境，研究人員試圖將NAS基因導入植物體內，以期增加缺鐵環境中植物的抗性，提高植物的生長發育。目前還未見到轉NAS基因具有提高植物耐逆(耐干旱及鹽堿)的報道。我們以黑麥草為轉化受體，首次將NAS基因導入植物體，發現轉基因植物的耐逆能力尤其是耐旱及耐鹽性能具有較大提高。發明目的本發明的一個目的是提供一種煙胺合成酶(nicotianaminesynthase)基因的用途。本發明的另一個目的是提供一種提高植物耐逆性的方法。技術方案因而，本發明提供了一種煙胺合成酶基因在提高植物耐逆性中的用途。本發明提供了一種利用轉基因植物提高植物耐逆性的方法，包括以下步驟(a)構建一種DNA片段，使其包含一種由組成性或組織特異性或誘導表達啟動子控制的煙胺合成酶基因；(b)用所構建的DNA片段或含有上述DNA片段的質粒轉化植物細胞；(c)篩選出被轉化的植物細胞；(d)使被轉化的植物細胞再生出完整植株；在將轉化的植物細胞再生出完整植株后，可對轉基因植株的進行擴繁，并使轉基因植物的耐逆性(耐旱或耐鹽堿)的進一步改善和提高。所述的轉化植物的擴繁包括無性繁殖和種子繁殖或兩者之組合。所述的耐逆性提高包括抗旱或耐鹽、耐低溫、抗病蟲害等性能的改善和提高。在本發明的方法中，所述的組成性表達啟動子可以是CaMV35S，玉米Ubiquitin，水稻actinl啟動子等；所述的組織特異性表達啟動子可以是根特異性表達啟動子、葉片特異性表達啟動子或維管特異性表達啟動子。在本發明的方法中，所述的DNA片段指含有由組成性或組織特異性表達或誘導表達(ABA、干旱、鹽堿或化學誘導等)啟動子控制的煙胺合成酶基因的DNA分子；也可是人工合成的DNA片段。也可在包括在用于根瘤農桿菌或發根農桿菌轉化植物的雙元載體質粒如pBin19，pCambia，pBI101等和可在原核生物中繁殖的其他質粒如pUC，pBluescript，PCR載體質粒中。這些質粒以及使用這些質粒的構建方法可通過現有技術中已知的方法進行。所述的煙胺合成酶基因可以是來源于不同生物(包括植物或非植物)。可以是任何一種現有技術中已知的煙胺合成酶基因，例如如大麥中克隆的NAS基因(accessionNo.AF136941，AF136942，AB011264，AB011266，AB011268，AB011269，AB019525，AB010086，AB011267)，水稻中克降的NAS基因(accessionNo.BE607438，AB046401，AB023819，AB023818，AB021746)，大豆(accessionNo.BM892247)玉米中的NAS基因(accessionNo.AB042551，BU493605)、擬南介中克降的NAS基因(accessionNo.AB021936，AB021935，AB021934，BE845347AY072364，AY140031)，西紅柿中克隆的NAS基因(accessionNo.BG791292)等(Higuchi，2001；Ling等，1999；Suzuki等，2001)。在上述方法的步驟(a)中所構建的DNA片段還可以另外包括一種植物篩選標記基因。所述的植物篩選標記基因可以是抗生素篩選標記基因，如抗卡那霉素篩選標記基因新霉素磷酸轉移酶(NPTII)，抗潮霉素篩選標記基因潮霉素磷酸轉移酶(hpt)；或非抗生素篩選標記基因如木糖異構酶等。所述的控制煙胺合成酶基因(nicotianaminesynthase)的誘導系統可以是酒精可誘導系統(alc)，糖甾醇可誘導系統，四環素可誘導系統(tet)，乳糖可誘導系統(lac)，銅離子可誘導系統，及植物內源誘導系統如熱激(heatshock)，除草劑(safener)，損傷誘導系統等。本發明的方法中，所述的植物細胞指來源于如牧草、草坪草、楊樹、桉樹、水稻、小麥、玉米、油菜、棉花、大豆等所有植物的細胞、組織或植株。細胞或植物的轉化指通過原生質體-化學介導法(Ca2+，PEG)，基因槍介導法，農桿菌介導法，電激法，花粉管導入，微注射等任何一種方法或幾種方法的組合。本發明的方法中，所述的轉化細胞(或植物愈傷組織，植株)指利用上述轉化方法將煙胺合成酶基因導入并通過分子手段證明是陽性的植物。本發明的方法中，所述的轉化細胞(或植物愈傷組織，植株)的篩選指利用抗生素或其他篩選標記基因，如含新霉素磷酸轉移酶(NPTII)基因的細胞或愈傷組織可由卡那霉素或其替衍生代物如G418等進行篩選；含潮霉素磷酸轉移酶基因的細胞或愈傷組織可由潮霉素進行篩選等。在獲得抗性愈傷組織細胞后可采用Southern或PCR法，點雜交等分子檢測手段對其進行檢測，以確定其含有煙胺合成酶基因。本發明的方法中，使被轉化的植物細胞再生出完整植株主要指通過離體由包含有上述DNA元件的轉化細胞再生的植株，也包括非離體的其他營養繁殖方法再生的植株。附圖簡要說明圖1用于耐受脅迫轉化質粒的構建。CaMV35S啟動子控制下的煙胺合成酶基因(nicotianaminesynthase，NAS)質粒。卡那霉素抗性基因(NPTII)由NOS啟動子調控。LB-leftborder；RB-rightborder.圖2幾種黑麥草的組培再生試管苗。(a)、卓越；(b)、凱；(c)、百盛。圖3黑麥草遺傳轉化過程。依次為胚性愈傷組織的培養(a)、愈傷組織轉化后的抗性篩選(b)、分化出苗(c)、生根培養(d)、壯苗生長(e)等幾個關鍵過程。圖4轉NAS基因黑麥草植株的PCR鑒定。1.DNA分子量標準；2.陽性對照；3.陰性對照植株；4-9，為獨立擬轉基因植株。圖5轉基因黑麥草植株的Southern雜交檢測。對pBNA轉基因陽性植株基因組DNA、質粒pBNA及非轉化植株基因組DNA用EcoRI完全酶切，電泳轉膜，用NTPII基因片段做探針進行Southern雜交，在轉基因植株中出現特征帶。由于內切酶EcoRI在NTPII基因內沒有酶切位點，所以從Southern雜交結果中顯示的條帶數，初步確定了pBNA質粒在轉化植株基因組中的插入位點。圖6轉基因黑麥草植株的在溫室中的耐旱性鑒定。將檢測后的陽性轉基因黑麥草植株和對照植株移栽到溫室后，進行干旱脅迫處理；對照植株(A)經10天干旱脅迫即完全枯死，而轉基因植株在兩周后仍未死亡(B)。此外，轉基因抗性黑麥草植株葉綠素含量明顯高于對照植株，這可能與外源NASHOR1基因的導入有關，增加了黑麥草在干旱條件下鐵元素的吸收利用和運輸，加強植物生理生化作用，從而提高和改善了植物在不良環境條件下的生長狀態。圖7轉基因黑麥草植株的在北京地區的小面積田間鑒定。2002年將轉基因黑麥草植株和對照植株移栽到北京中國科學院遺傳與發育生物學研究所農場試驗田間后，整個夏季依自然灌溉，未輔以人工澆水灌溉；轉基因黑麥草植株(B)生長勢明顯優于對照植株(A)。實施例多年生黑麥草(L.perenneL.)是一種重要的禾本科牧草和草坪草，廣泛分布于溫帶地區。一般用作飼料牧草和草坪草。黑麥草具有建植速度快、抗病蟲害能力強、分蘗能力強等特性，能夠迅速覆蓋地面，為其它植物的生長提供良好的環境。實施例1抗逆性質粒pBNAS的構建根據大麥煙胺合成酶(NASHOR1)cDNA序列，合成一對針對大麥煙胺合成酶序列特異性引物N端5‘-GGATCCATGGATGCCCAGAACAAGGAG-3’C-端5‘-GGATCCCAACGATCAGAAGGCCACT-3’PCR反應條件依據高保真Taq酶擴增體系說明書進行。變性溫度為94℃，退火溫度為60℃，延伸溫度72℃，30個循環后，72℃保溫10min。PCR產物經博大科技公司的DNA快速純化回收試劑盒回收后，與T-Veeter在4℃連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，產生重組質粒pBUC，挑選白色菌落，經酶切鑒定后并測序。質粒pBNAS詳細的構建見圖1。質粒保存在大腸桿菌DH5α。含有CaMV35S啟動子調控的大麥NAS基因，大小為0.987Kb，為BamHI酶切。另外含有pNOS調控的NPTII基因，大小為795bp。實施例2黑麥草的組織培養系統的建立與植株再生黑麥草(LoliumperenneL.)品種凱，百盛，春潮(黑麥草X高羊茅)、卓越2000等種子(Clover公司)用于該實驗(圖2)。將成熟的種子用20％NaClO浸泡60分鐘，用無菌水沖洗3-4次，接種在誘導培養基上。待長出愈傷組織后轉至繼代培養基上培養。每3-4周繼代一次。當愈傷組織形成大量結構致密、顆粒狀、顯黃白色的胚性愈傷組織后，即可。將胚性愈傷組織轉至分化培養基上進行1-2個月的培養后，可長出1-2cm的幼苗，再將其轉移到生根培養基。待苗長大并長出根后經2-3天的溫室煉苗后移植到土中。愈傷組織的誘導和繼代培養在黑暗中進行，愈傷組織的分化和幼苗生根培養的培養條件為25-26℃，每日光照12h，光強2000lux。各培養基配方如下MS基本培養基MS大量元素+MS微量元素+MS有機成分+30g/L蔗糖+3-4g/LPhytegal，pH5.8NB基本培養基N6大量元素+B5微量元素+B5有機成分+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+3-4g/LPhytegalpH5.8CC基本培養基CC大量元素+CC微量元素+CC有機成分+30g/L蔗糖+3-4g/LPhytegal，pH5.8誘導及繼代培養基MS、NB和Cc基本培養基+2or5mg/L2，4-D+0.05mg/LBAP+2mg/LABA+1g/L水解酪蛋白預分化培養基MS、NB和CC基本培養基+2mg/LBAP+1mg/LNAA+2mg/LABA分化培養基MS、NB和CC基本培養基+mg/LBAP+1mg/LNAA+0.5-1mg/LTDZ壯苗培養基1/2MS無機鹽+B5有機+0.5-1mg/LNAA+1mg/LMET實施例3黑麥草的轉化與轉基因植物的獲得金粉DNA復合體的制備稱取60mg金粉(＝1.0um)放入1.5ml滅菌的離心管中，加入1ml無水乙醇，振蕩1min，10000rpm離心10秒，棄上清。重洗一次后，將金粉懸浮于1ml無菌水中，現用或-20℃保存。吸取50μl金粉懸浮液，20μl0.1M亞精胺，20μl2.5MCaCl2，5μgDNA，振蕩3分鐘，10000rpm離心20秒，棄上清，以無水乙醇漂洗兩次，加入60μl無水乙醇，重懸。受體材料的轟擊選用適當型號的壓力膜，與轟擊膜一起，在70％的酒精中浸泡0.5~2小時，取出晾干，取10μl制備好了的金粉-DNA復合體，用無水乙醇作適當稀釋后，無效產地涂布于轟擊膜上，晾干后進行轟擊，每皿轟擊兩次。受體材料的預處理選取生長狀態良好為轉化受體材料，轟擊前將其轉至含甘露醇(90g/L)的高滲培養基上培養12~24h，使用1100psi的壓力膜，以每槍使用500μg金粉吸附1μgpBNAS質粒DNA的用量、6cm的轟擊距離、每皿材料轟擊2槍。轟擊后繼續在高滲培養基上培養24h；再將其轉入不含篩選劑的繼代培養基中恢復培養一周左右，然后再進行篩選培養。轉化子的篩選和培養轉化后的愈傷組織先在較低選擇壓G41850mg/l的繼代培養基上篩選3-4周，再轉至較高選擇壓G41875mg/l的培養基上篩選3-4周；然后選取成活的抗性愈傷組織塊轉至上述選擇壓的預分化培養基上進行預分化培養，10天后至分化培養基上進行分化培養，每隔20天左右更換一次培養基待幼芽長出1-2cm后，將抗性苗移入生根培養基上進行生根培養。參照前人(Altpeter等，2000，Spangenberg等，1995；Wang等，1992；Wang，1997；Wu等，1997；Xiao等，1997；Ye等1997，2000；Zhong等，1993)在水稻、小麥、大麥、高羊茅、黑麥草等單子葉禾本科植物中采用的基因槍轉化方法，建立了禾本科草坪草黑麥草的基因槍轉化技術體系(圖3)。實施例4擬轉化植株分子鑒定按照Dellaporta等(1983)的方法提取擬轉化植株的基因組DNA，以NPTII基因編碼區特異的引物進行PCR擴增，篩選出轉基因植株(圖4)。為了進一步證實目的基因在轉化植株總基因組中的整合，按照Sambrook等(1989)的方法，用BamHI酶切pBNAS質粒DNA，回收帶有NPTII基因的795bp大小的DNA片段作為探針，對PCR檢測的陽性植株進行Southern雜交，結果如圖5所示轉基因植株的總DNA中有特征帶，而在未轉化的陰性植物中沒有出現任何帶，這表明外源基因已整合到植物基因組中。實施例5轉基因植株的干旱節水實驗將檢測后的陽性轉基因黑麥草植株和對照植株移栽到溫室后，進行干旱脅迫處理；兩周時間的干旱脅迫使得轉基因陽性植株與陰性對照植株之間生長狀態的差異極為明顯(圖6)。此外，轉基因抗性黑麥草植株葉綠素含量明顯高于對照植株，這可能與外源NAS基因的導入有關，增加了黑麥草在干旱條件下鐵元素的吸收利用和運輸，加強植物生理生化作用，從而提高和改善了植物在不良環境條件下的生長狀態。實施例6轉基因植株在田間小規模的干旱脅迫實驗轉基因黑麥草植株的在北京地區的小面積田間鑒定。2002年將轉基因黑麥草植株和對照植株移栽到北京中國科學院遺傳與發育生物學研究所農場試驗田間后，整個夏季未輔以人工澆水灌溉，僅依自然降雨灌溉；轉基因黑麥草植株(圖7B)生長勢明顯優于對照植株(圖7A)。參考文獻AltpeterF，XuJP，SalahuddinA，PosseltUK，SchubbertJ.RNA-mediatedvirusresistanceinfertiletransgenicperennialryegrassplants.Abstracts2ndInternationalsymposiummolecularbreedingofforagecrops，2000，p103AltpeterF，XuJP.Rapidproductionoftransgenicturfgrass(Fescuerubra)plants.J.PlantPhysiol.，2000，157441-448Cornejo，MJ，Luth，D，Blankenship，KM，Anderson，OD，andBlechl，AE.Activityofamaizeubiquitinpromoterintransgenicrice.PlantMol.Biol.1993，23，567-581.Dellaporta，SL，Wood，J，andHicks，JB，ArapidmethodforDNAextractionfromplanttissue.PlantMol.Biol.Rep.1983，1，19-21.HiguchiK.，TaniK.，NakanishiH.，YoshiwaraT.，etal.TheexpressionofabarleyHvNASlnicotianaminesynthasegenepromotor-gusfusiongeneintransgenictobaccoisinducedbyFe-deficiencyinroot.Biosci.Biotechnol.Biochem.，2001，651696-1697Ling，HQ，Koch，G，Bumlein，H，andGanalM，Map-basedcloningofchloronerva，ageneinvolvedinironuptakeofhigherplantsencodingnicotianaminesynthase，ProcNatlAcadSciUSA1999，96(12)7098-103。MassHMVander，JongERde，RuebS，HensgensLAM，KrensFA.Stabletransformationandlong-termexpressionofthegusAreportergeneincalluslinesofperennialryegrass.PlantMol.Bio.，1994，24401-405Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，andManiatis，T.MolecularCloningALaboratoryManual1989.NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress.SpangenbergG，WangZY，NagelJ，IglesiasVA，PortrykusI.Transgenictallfescueandredfescueplantsfrommicroprojectilebombardmentofembryogenicsuspensioncells.J.PlantPhysiol.，1995，145693-701SuzukiK，NakanishiH，NishizawaNK，MoriS.AnalysisofupstreamregionofnicotianaminesynthasegenefromArabidopsisthalianapresenceofputativeERE-likesequence.BiosciBiotechnolBiochem.2001，65(12)2794-7.VonWirenN.，KlairS.，BansalS.，BriatJ.F.，etal.NicotianaminechelatesbothFe3+andFe2+implieationformetaltransportinplants.PlantPhysiol.，1999，1191107-1114WangGR，etal，FertiletransgenicplantsfromdirectgenetransfertoprotoplastsofLoliumperenneandL.multiflorum.J.PlantPhysiol.，1997，151149-154WangXL.Genetransfertoryegrassesdown-regulationofmajorpollenallergensintransgenicplants.ProcXVIIIIntlGrasslandCongress，WinnipegandSaskaton1997，3WangZY，BindingH，PosseltUK.TransgenicplantsoftallFescueobtainedbydirectgenetransfertoprotoplasts.Bio/Tech.，1992，1069-73WelchR.M.Micronutrientnutritionofplants，Crit.Rev.PlantSci.，1995，14149-82WuXL，YeXD，WangZY，PotrykusI，SpangenbergG.Genetransfertoryegrassesdown-regulationofmajorpollenallergensintransgenicplants.Proc.XVIIIInt.GrasslandCongress，WinnipegandSaskatoon，1997，3XiaoL，HaSB.Efficientselectionandregenerationofcreepingbentgrasstransformantfollowingparticlebombardment，PlantCellReports，1997，16874-878YeX，WangZY，XuX，PotrykusI.TrahsgenicItalianryegrass(Loliummultiflorum)plantsfrommicroprojectilebombardmentofembryogenicsuspensioncells.PlantCellReports，1997，16379-384YeX，WangZY，ZhaoH，FreherM，NoesbergerJ，PotrykusI，SpangenbergG.AlteredfructanaccumulationintransgenicLoliummultiflorumplantsexpressingaBacillussubtilissacBgene.PlantCellReports，2000，inpressZhongH，BolyardMG，SrinivasanC，SticklenMB.Transgenicplantsturfgrass(Agrostispalustris)frommicroprojectilebombardmentofembryogeniccallus.PlantCellReports，1993，131-權利要求1.煙胺合成酶基因在提高植物耐逆性中的用途。2.一種利用轉基因植物提高植物耐逆性的方法，包括以下步驟(a)構建一種DNA片段，使其包含一種由組成性或組織特異性表達或誘導表達啟動子控制的煙胺合成酶基因；(b)用所構建的DNA片段或含有上述DNA片段的質粒轉化植物細胞；(c)篩選出被轉化的植物細胞；(d)使被轉化的植物細胞再生出完整植株。3.按照權利要求2所述的方法，其中，步驟(a)所構建的DNA片段中還包含一種植物篩選標記基因。4.按照權利要求2所述的方法，其中，所述的DNA片段含有用于根瘤農桿菌或發根農桿菌轉化植物的雙元載體質粒。5.按照權利要求4所述的方法，其中，所述的DNA片段含有pBin19，pCambia，或pBI101。6.按照權利要求2所述的方法，其中，所述的DNA片段含有可在原核生物中繁殖的質粒。7.按照權利要求6所述的方法，其中，所述的DNA片段含有pUC，pBluescript，或者PCR載體質粒。8.按照權利要求2所述的方法，其中，所述的植物細胞指來源于煙草、楊樹、桉樹、高粱、牧草、草坪草、馬鈴薯、水稻、小麥、玉米、油菜、棉花、或大豆等的細胞。9.按照權利要求2所述的方法，其中，轉化植物細胞指通過原生質體-化學介導法(Ca2+，PEG)，基因槍介導法，農桿菌介導法，電激法，花粉管導入，微注射或這些方法的組合來進行的。全文摘要本發明提供了煙胺合成酶基因的用途和一種利用轉基因植物提高植物耐逆性能的方法，包括(a)構建一種DNA片段，使其包含一種由組成性或組織特異性或誘導表達啟動子控制的煙胺合成酶基因；(b)用所構建的DNA片段或含有上述DNA片段的質粒轉化植物細胞；(c)篩選出被轉化的植物細胞；(d)使被轉化的植物細胞再生出完整植株。該方法可大大提高轉基因植物耐受脅迫的能力。文檔編號C12N15/82GK1493691SQ0215032公開日2004年5月5日申請日期2002年11月1日優先權日2002年11月1日發明者儲成才,張振霞,史代范,包雷申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所