專利名稱：一種提高凍存細胞復蘇率的細胞凍存液的制作方法
技術領域：
本發明涉及活體組織細胞培養技術，更具體涉及一種提高細胞復蘇率的細胞凍存液，廣泛適用于細胞生物學技術領域。
背景技術：
細胞凍存液是組織細胞凍存時必須的一種溶液。數十年來，大量國內外生物細胞學技術相關書籍，介紹常規凍存液配方均為細胞培養液70-80％、牛血清10-20％、二甲亞砜10％。普遍使用的細胞培養液有四種RPMI-1640、MEM、Eagle和TC-199細胞培養液均已市場商品化。凍存液的作用是將擬凍存的活性組織細胞懸浮于凍存液，供給細胞生命代謝所必須的營養物質，同時具有防止或減少冷凍冰晶對細胞的損傷作用。在長期的細胞生物學實驗中，廣泛地使用的是此常規配方的細胞凍存液，經過大量實際生物細胞學操作實驗、相關學術刊物報道認為在排除其它影響因素的情況下，復蘇率為40-70％。在細胞生物學實驗中，復蘇率是指在長期冷凍保存狀態下的細胞，經過復蘇過程，恢復其活性與生物學特性的細胞數量。
凍存細胞經復蘇后培養16-24小時，在普通光學顯微鏡下觀察當復蘇率小于40％時，見活細胞較少，細胞形態小而且不規則，生長繁殖速度緩慢，甚至不生長，5-7天全部死亡后；當復蘇率大于40％或小于60％時，顯示有部分成活細胞，細胞大小不均勻，生長繁殖速度慢，培養5-7天則能生長成單層細胞；當復蘇率大于70％時，顯示成活細胞較多，細胞形態正常，生長繁殖速度快，培養2-3大則能生長成單層細胞。
目前，采用細胞凍存液的凍存與復蘇效果配制常規配方的細胞凍存液比例如下RPMI-1640培養液 70毫升小牛血清 20毫升二甲亞砜 10毫升混合搖勻即成(一)細胞凍存1、培養生長成單層的綠猴腎細胞(Vero Cell)細胞一瓶→0.25％胰蛋白酶液，消化3分鐘→棄胰酶液→加入RPMI-1640培養液10毫升，吹打混勻細胞懸液→離心4000轉/10分鐘→棄上清→加入常規的凍存液2毫升/管，混勻，置入潔凈凍存小管；2、小管置-20℃，2小時→置-40℃，2小時→置-80℃，2小時→浸入液態氮中長期保存。
(二)細胞復蘇過程1、從液態氮中取出凍存的綠猴腎細胞(Vero)小管→置37℃水浴，3分鐘速溶→加入RPMI-1640培養液8毫升，離心4000轉/10分鐘→棄上清→加入10％小牛血清RPMI-1640培養液10毫升→靜置37℃培養，16小時-24小時；2、鏡下觀察復蘇后的細胞狀態，可見約60％的Vero細胞貼壁生長，細胞形態呈多邊形，大小不均勻，折光性差；3、培養48小時后，觀察細胞未生長成單層→更換10％小牛血清RPMI-1640培養液，繼續培養→37℃培養，80-96小時后，傳代培養；4、完成了細胞復蘇生長繁殖周期。
或細胞凍存液，MEM培養液；地鼠腎細胞(BHK-21)、人鼻咽癌組織細胞(Hep-2)、貓腎細胞(FK-81)、人肝癌細胞(7721)的凍存與復蘇效果實驗細胞凍存液比例如下MEM培養液 80毫升小牛血清10毫升二甲亞砜10毫升混合搖勻即成(一)細胞凍存1、取培養生長成單層的地鼠腎細胞(BHK-21)、人鼻咽癌組織細胞(Hep-2)、貓腎細胞(FK-81)、人肝癌細胞(7721)各一瓶→0.25％胰蛋白酶液，消化3分鐘→棄胰酶液→加入MEM培養液10毫升，吹打混勻細胞懸液→離心4000轉/10分鐘→棄上清→加入常規的凍存液2毫升/管，混勻，置入潔凈凍存小管；2、小管置-40℃，2小時→置-80℃，2小時→浸入液態氮中長期保存。
(二)細胞復蘇效果1、從液態氮中取出凍存的地鼠腎細胞(BHK-21)、人鼻咽癌組織細胞(Hep-2)、貓腎細胞(FK-81)、人肝癌細胞(7721)各一小管→37℃水浴中，3分鐘速溶→加入8毫升細胞培養液，離心4000轉/10分鐘→棄上清→加入10％小牛血清MEM培養液10毫升/瓶→靜置37℃，培養16小時-24小時2、光鏡下觀察復蘇后的細胞狀態，可見地鼠腎細胞(BHK-21)、人鼻咽癌組織細胞(Hep-2)、貓腎細胞(FK-81)、人肝癌細胞(7721)均為部分細胞貼壁生長，細胞形態不規則，大小不均勻，折光性差；3、復蘇效果顯示BHK-21細胞復蘇率約50％，Hep-2細胞復蘇率約60％，FK-81細胞復蘇率約50％，7721細胞復蘇率約55％。
4、培養48小時后，細胞未生長成單層→更換10％小牛血清MEM培養液，繼續培養→37℃培養，80-100小時后，傳代培養；5、完成了細胞復蘇生長繁殖周期。
在生物學技術飛速發展的當今，人們在細胞生物學及其相關學科的研究中，越來越多的運用組織細胞培養增殖技術，將有研究意義或有應用前景的活體組織細胞采用低溫度進行長期保存數年、數十年甚至數百年，一旦需要，可隨時對所保存的組織細胞進行復蘇，恢復其完整的形態結構與生物學特性，供生命科學研究實驗。活性組織細胞的凍存和復蘇過程，是直接影響人工培養組織細胞增殖是否成功和順利進行的一個關鍵技術。
綜上述，復蘇率的高或低，是直接影響細胞生長質量與增殖周期的重要因素。細胞凍存液則是在細胞凍存過程中起到保護和營養細胞的關鍵溶液，所以，細胞凍存液的配方與含量，對細胞復蘇率有重要和直接的影響作用。
發明內容
本發明目的在于提供了一種提高凍存細胞復蘇率的細胞凍存液，調整了“常規細胞凍存液”內的細胞培養液與牛血清的含量比例，配伍合理。提高了凍存細胞的復蘇率，保證了細胞的生長質量，縮短了細胞復蘇增殖的周期的作用。
為了達到其發明目的采用了以下技術措施，其特征是
細胞培養液 10-30％小牛血清60-80％二甲亞砜10％混合均勻即成注細胞培養液可任意選用一種RPMI-1640或MEM或Eagle或TC199本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果使用改進后的細胞凍存液，細胞復蘇率可達80-90％以上，較使用常規細胞凍存液的復蘇率有了顯著提高，保證了細胞生長質量和生物學特性，縮短了細胞復蘇的增殖周期。使復蘇后的組織培養細胞能及時、保質保量的提供生物學研究實驗。在組織細胞培養增殖技術中，應用改進后的細胞凍存液明顯了提高凍存細胞復蘇率、提高了工作效力。
具體實施例方式
實施例1采用改進含量配方后的細胞凍存液、非洲綠猴腎細胞(Vero)的凍存與復蘇效果細胞凍存液由以下重量配比的原料制成RPMI-1640培養液30毫升或25毫升或20毫升小牛血清 60毫升或65毫升或70毫升二甲亞砜 10毫升混合搖勻即成(一)細胞凍存過程1、取培養生長成單層的綠猴腎細胞(Vero)細胞一瓶→0.25％胰蛋白酶液，消化3分鐘→棄胰酶液→加入RPMI-1640培養液10毫升，吹打混勻細胞懸液→離心4000轉/10分鐘→棄上清→加入上述凍存液2毫升/管，混勻，置入潔凈凍存小管；2、小管置-20℃，2小時→置-40℃，2小時→置-80℃，2小時→浸入液態氮中長期保存。
(二)細胞復蘇過程與效果1、從液態氮中取出凍存的綠猴腎細胞(Vero)小管→置37℃水浴，3分鐘速溶→加入RPMI-1640培養液8毫升，離心4000轉/10分鐘→棄上清→加入10％小牛血清RPMI-1640培養液10毫升→靜置37℃培養，16小時-24小時；2、光鏡下觀察復蘇后的細胞狀態，可見約90％的Vero細胞大面積貼壁生長，細胞形態呈多邊形，大小均勻，折光性好；3、培養48小時后，細胞生長成單層，繼續傳代培養；4、完成了細胞復蘇生長繁殖周期。
實施例2采用改進配方后的細胞凍存液，地鼠腎細胞(BHK-21)、人鼻咽癌組織細胞(Hep-2)、貓腎細胞(FK-81)、人肝癌細胞(7721)的凍存與復蘇效果細胞凍存液由以下重量配比原料制成MEM培養液 10毫升或15毫升小牛血清 80毫升或75毫升二甲亞砜 10毫升混合搖勻即成(一)細胞凍存1、取培養生長成單層的地鼠腎細胞(BHK-21)、人鼻咽癌組織細胞(Hep-2)、貓腎細胞(FK-81)、人肝癌細胞(7721)各一瓶→0.25％胰蛋白酶液，消化3分鐘→棄胰酶液→加入MEM培養液10毫升，吹打混勻細胞懸液→離心4000轉/10分鐘→棄上清→加入上述凍存液2毫升/管，混勻，置入潔凈凍存小管；2、小管置-40℃，2小時→置-80℃，2小時→浸入液態氮中長期保存。
(二)細胞復蘇過程與效果1、從液態氮中取出凍存的地鼠腎細胞(BHK-21)、人鼻咽癌組織細胞(Hep-2)、貓腎細胞(FK-81)、人肝癌細胞(7721)各一小管→37℃水浴中，3分鐘速溶→加入8毫升細胞培養液，離心4000轉/10分鐘→棄上清→加入10％小牛血清MEM培養液10毫升/瓶→靜置37℃，培養16小時-24小時；2、光鏡下觀察復蘇后的細胞狀態，可見地鼠腎細胞(BHK-21)、人鼻咽癌組織細胞(Hep-2)、貓腎細胞(FK-81)、人肝癌細胞(7721)均見細胞大面積貼壁生長，細胞形態好，大小均勻，折光性好；3、復蘇效果顯示BHK-21細胞復蘇率約85％，Hep-2細胞復蘇率約95％，FK-81細胞復蘇率約93％，7721細胞復蘇率約90％；4、培養48小時后，細胞生長成單層，繼續傳代培養；5、完成了細胞復蘇生長繁殖周期。
權利要求
1.一種提高凍存細胞復蘇率的細胞凍存液，它由以下重量配比的原料制成細胞培養液10-30小牛血清 60-80二甲亞砜 10。
2.根據權利要求1所述的一種提高凍存細胞復蘇率的細胞凍存液，其特征是各原料的重量配比是細胞培養液15小牛血清 75二甲亞砜 10。
3.根據權利要求1所述的一種提高凍存細胞復蘇率的細胞凍存液，其特征是各原料的重量配比是細胞培養液20小牛血清 70二甲亞砜 10。
4.根據權利要求1所述的一種提高凍存細胞復蘇率的細胞凍存液，其特征是各原料的重量配比是細胞培養液25小牛血清 65二甲亞砜 10。
全文摘要
本發明公開了一種提高凍存細胞復蘇率的細胞凍存液，采用了細胞培養液、小牛血清和二甲亞砜，均按一定比例混配。本發明配伍合理，提高了凍存細胞的復蘇率，可達80－90％以上，保證了細胞生長質量，縮短了細胞復蘇的增殖周期。
文檔編號C12N5/00GK1412301SQ02147780
公開日2003年4月23日 申請日期2002年12月5日 優先權日2002年12月5日
發明者李天憲, 陳繩亮, 范兆軍, 張忠, 熊克娟 申請人:中國科學院武漢病毒研究所