專利名稱：低自由能表面微處理控制細胞空間定位及應用的制作方法
技術領域：
本發明為匯集表面化學、生物材料學、微制作技術、等離子體化學等交叉學科領域的技術發明。具體地說，通過在疏水的低自由能表面上進行表面化學的修飾，形成親水的且具有高表面自由能的表面化學微觀模式，從而控制細胞在基質表面上的空間分布、形狀和大小，在生物醫學工程領域如組織工程、細胞的生物傳感器、生物芯片和生物微機電系統(BioMEMs)中有廣泛的應用前景。
背景技術：
細胞在基質表面上的粘附和生長強烈依賴于基質表面的化學性質，包括表面自由能和親/疏水性等。所以，通過基質表面化學性質的模式化修飾，可以控制細胞在基質表面上的空間分布。此外，通過基質表面模式形狀和大小的控制，借以控制細胞的形狀和大小，這是本發明的主要技術特征。然而，目前文獻中還沒見到有相同技術特征的報道，所能見到的具有相同效果的技術，僅有哈佛大學化學系Whitesides教授實驗室發展的金表面烷硫醇鹽自組裝單層技術。其原理是，通過對烷硫醇鹽自組裝單層末端功能基團的修飾，利用寡聚乙二醇基團抑制蛋白質吸附的特性，結合微制作技術，制作抑制蛋白質吸附的背景表面，并在其上引入支持蛋白質吸附的帶有其他末端功能基團如甲基的烷硫醇鹽自組裝單層小島，從而達到控制蛋白質吸附層空間分布的效果，并進而控制細胞空間分布和細胞形狀及大小的目的。
上述兩種技術，其基本原理明顯不同。烷硫醇鹽自組裝單層技術主要利用寡聚乙二醇基團抑制蛋白質吸附的特性，該特性的機理目前尚不明晰，據信與表面基團寡聚乙二醇的高密度組裝引起的空間位阻有關。本發明的技術方案則是利用某些材料表面自由能很低這一表面化學特性，結合利用微制作技術和等離子體表面修飾技術，在低表面自由能材料表面上引入高表面自由能區域，從而達到控制細胞在表面上的空間分布以及其形狀和大小的目的。
發明內容
本發明的目的在于提供一種通過在疏水的低自由能基質表面進行表面化學修飾，形成親水的且具有高表面自由能的表面化學微觀模式，以控制細胞在基質表面上的空間分布、形狀和大小的方法。本發明的另外一個目的在于將上述的方法在生物醫學工程領域、細胞生物傳感器、生物芯片和生物微電機系統中應用。
本發明通過實驗證實，強疏水性的低自由能表面上，細胞通常難以粘附。所以，可以選擇許多強疏水性低自由能材料如聚四氟乙烯、聚二甲基硅氧烷，它們都適用于本發明述的作為基質進行表面化學修飾的材料，其中，優選聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)作為低表面自由能材料的代表之一，利用表面化學、生物材料學、微制作技術、等離子體化學等學科的技術和方法，在其低自由能，不利于細胞粘附的表面上，離心涂布光刻膠，在光刻膠上復有掩模，顯影除去暴光光刻膠后，暴露出裸露的PDMS表面。通過高表面自由能圖式的引入，等離子體處理對裸露的PDMS表面進行表面修飾，形成親水高自由能表面。再除去未暴光光刻膠，使被掩模遮掩的PDMS表面再現，結果在PDMS表面形成了控制細胞粘附空間定位、細胞形狀和大小的目的區域。為達到本發明目的所采取的技術步驟如圖1所示。
圖1、疏水低自由能聚二甲基硅氧烷(PDMS)表面上引入親水高自由能區域技術流程圖2、聚二甲基硅氧烷(PDMS)經等離子體處理后表面自由能的變化，表面自由能系通過測量水和二碘甲烷的接觸角計算得出。表面自由能于處理時間正相關。
圖3、聚二甲基硅氧烷經氧等離子體處理后表面微觀親水性的變化。圖案的顯示系以水蒸氣在表面上凝結后揮發形成。等離子體處理使得裸露聚二甲基硅氧烷(PDMS)表面變為親水。水滴揮發較慢，而周圍的背景區域既未經處理區域，由于表面的疏水性，水滴很快蒸發。左圖中圓直徑50微米，右圖中正方形邊長45微米。
圖4、細胞粘附空間定位的實現。細胞粘附的空間定位。左側為經等離子體處理的PDMS表面，右側為同一PDMS表面但是曝光時為光刻膠掩蓋，接種細胞后，細胞只在經等離子體處理區域即左側粘附生長，而右側PDMS表面上細胞不能粘附。
圖5、細胞形狀和大小的控制。圖中細胞呈現規則的排列，顯示為圓形陣列或長方形陣列。圓直徑為50微米，長方形邊長為30×70微米。雖然很多圓形上有2個細胞，但是可以通過圓直徑的減小，使得其面積僅足以鋪展一個細胞。
具體實施例方式
為了更好地理解本發明，但并非限制本發明，通過以下實施例進一步予以說明。
2、等離子體表面修飾等離子體具有很高的能量和反應活性，可與裸露PDMS表面反應，結果表現為親水性的高自由能區域。等離子體強度和作用時間可自行選擇，修飾結果與這兩個參數均相關。
3、細胞粘附的空間定位部分區域等離子體處理的PDMS采用75％或無水乙醇浸泡消毒，按照常規培養技術接種牛關節軟骨細胞并進行培養。
4、細胞形狀和大小的控制通過制作具有和細胞尺度相似的掩模圖形，按照上述流程，即可控制細胞的形狀和大小。
權利要求
1.一種通過在基質表面進行化學修飾，以控制細胞在基質表面上的空間分布形狀和大小的方法，該方法的特征是采用一種表面具有疏水性低自由能的材料，在其表面離心涂布光刻膠；在光刻膠上覆蓋掩模，暴光，顯影除去暴光光刻膠；暴露出裸露的基質表面，通過高表面自由能圖式的引入，對裸露面進行表面修飾，形成親水高自由能表面；再除去被掩模遮掩未暴光光刻膠，結果表面形成了控制細胞粘附空間區域定位、細胞形狀和大小的一種方法。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的一種表面具有疏水性低自由能的材料有聚四氟乙烯、聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述的高表面自由能圖式的引入，對裸露面進行表面修飾是指凡具有很高能量和反應活性，與裸露基質表面反用形成親水的高自由能區域，高表面自由能圖式引入的能源包括等離子體、離子束、準分子激光、電子束和X光，可以任選用其中之一，對裸露面進行表面修飾。
4.根據權利要求1所述的方法在生物醫學工程領域、細胞生物傳感器、生物芯片和生物微電機系統中的應用。
全文摘要
本發明為匯集表面化學、生物材料學、微制作技術、等離子體化學等交叉學科領域的技術發明。具體地說，通過在疏水的低自由能表面上進行表面化學的修飾，形成親水的且具有高表面自由能的表面化學微觀模式，從而控制細胞在基質表面上的空間分布、形狀和大小，在生物醫學工程領域如組織工程、細胞的生物傳感器、生物芯片和生物微機電系統(BioMEMs)中有廣泛的應用前景。
文檔編號C12M3/00GK1490401SQ02147589
公開日2004年4月21日 申請日期2002年10月17日 優先權日2002年10月17日
發明者陶祖萊, 張毅奕, 高宇欣, 胡淵 申請人:中國科學院力學研究所