多重基因表達分析方法應用于傳統中國醫藥辨證的制作方法

專利名稱：多重基因表達分析方法應用于傳統中國醫藥辨證的制作方法
技術領域：
傳統中國醫藥在中國已有數千年歷史，其累積無數前人對抗各類疾病之經驗，應用于病理、診斷、治療及預防疾病等。雖然經由許多案例證實其療效，然而大部分傳統中國醫藥的基本原理卻仍未能藉由現代科技語言予以闡述。
本發明關于利用測量多重基因表達程度來決定傳統中國醫藥定義之生理狀態。
另一方面，本發明揭示之軟件系用以指示一種處理器，接受包含傳統中國醫藥定義生理狀態評分和多重基因表達程度之信息，并且推導出一個表示基因加權表達程度組合相關評分的公式(例如經由多項回歸分析)。本發明之軟件可用以決定傳統中國醫藥定義之生理狀態中有哪些基因對應表達及這些基因的表達程度。
并且，本發明揭示之軟件系用以指示一種處理器，接受包含多重基因表達程度之信息和依據前段敘述推導出的公式所決定之基因加權表達程度組合。本發明之軟件應用于決定傳統中國醫藥根據一組既定基因的表達程度來定義生理狀態。
同時，本發明之范圍為一種決定傳統中國醫藥定義生理狀態之方法。其包含量化多重基因表達和以基因加權表達程度組合表示傳統中國醫藥定義生理狀態的不同組合。基因表達程度的量化與決定傳統中國醫藥定義相關生理狀態，可依上述方法實行之。
本發明提供一新穎的方法，其可使相關人員在決定傳統中國醫藥定義生理狀態時，無需進行傳統中國醫藥的診斷程序，并且有利于評估傳統中國醫藥之功效及幫助傳統中國醫藥對病人之診治。本發明之具體實施詳列于下列相關敘述中。本發明之其它特異性，具體性和優越性亦將詳細揭示于發明敘述及專利申請范圍中。
依據傳統中國醫藥理論，疾病的發生乃由于一種或多種生理狀態的失衡。因此，正確地確認此生理上之失衡是治療疾病的關鍵。傳統中國醫藥利用望、聞、問、切「四診」方法來決定生理狀態。
望診涉及對病人的神、色、形、態以及分泌物、排泄的異常變化，進行有目的的觀察，以測知內臟功能變化，從而獲得有關疾病狀況的一種診法。聞診涉及聽聲音和嗅氣味兩個方面，是通過聽覺和嗅覺，了解由病人發出的各種異常聲音和氣味，以診察病情。問診則涉及詢問病情，病人痛苦的癥狀，家庭史及過去病狀等。切診涉及脈診和按診兩部分內容，脈診是按脈搏；按診是在病人身軀上一定的部位進行觸、摸、按壓，以了解疾病的內在變化或體表反應，從而獲得疾病資料的一種診斷方法。
本發明基于基因表達程度與傳統中國醫藥定義生理狀態相關性之發現，提出一種如上所述，決定傳統中國醫藥定義生理狀態之方法。
明確地說，本發明之方法包括量化多重基因表達程度以及經由組合基因加權表達程度于數學公式計算后所得之評分。此評分即傳統中國醫藥定義生理狀態之明確陳述，例如寒/熱的程度。
首先依據生理狀態選擇相關的基因群。例如，選擇與免疫和發炎反應具高度相關性的基因來判斷氣喘的相關生理狀態(見實施例)。依據本發明所提供的方法，即可判斷基因與該生理狀態的相關性(詳述如下)。有些基因可能與該生理狀態無關，則這些基因便被從這個基因群中剔除。其它被認為與該生理狀態相關的基因則被加入此基因群做進一步分析。
各基因表達之量化可由該基因之信使核醣核酸分子或蛋白質分子之數量來表示。信使核醣核酸分子或蛋白質分子之定量方法已廣為人知。通常，待測物來自于活體組織(如組織或細胞樣本)或體液(如血液或尿液)。一個基因可用單個或多個檢測組件(例如，一個或多個生物探針)檢測其表達量。對應任一基因之檢測組件在基質(如薄膜，微離心管，多孔盤，玻璃或硅芯片等)上可能聚集在一處或分隔開來。檢測組件也可能是固著于基質上或可移動(例如，在溶液中)。檢測信使核醣核酸分子之方法包括DNA印跡或RNA印跡法(Southern or Northern Blot)、多聚酶鏈式反應法(PCR)、和微陣列載玻片(microarray slides)等。檢測組件則包含核酸引子或探針(Nucleic Acid Primers or Probes)，可參考文獻包括Schena等(1995)Science 270467-470；Eisen andBrown(1999)Methods Enzymol.303179-205；Blohm and Guiseppi-Elie(2001)Curr.Opinion in Biotechnol.1241-47；Mullis(1987)美國專利No.4,683,202；Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88189-193；Guatelli等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA871874-1878；Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA861173-1177；Lizardi等(1988)BioTechnology 61197等。亦有許多方法可以檢測特定蛋白質的含量。通常，這些方法都包括使用針對某特定蛋白質設計之偵測組件(如抗體)與待測樣本直接接觸，藉由與偵測組件結合之蛋白質數量來判定樣本中之蛋白質含量。目前常見的檢測方法包括酶聯免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，免疫沉淀法(immunoprecipitation)，免疫螢光法(immunofluorescence)，酶免疫測定法(enzyme immunoassay，EIA)，放射免疫測定法(radioimmunoassay，RIA)，蛋白質印跡法(Westernbloting)，蛋白質芯片分析(protein chip analysis)。可參考文獻包括Harlow and Lane(1988)Antibodies.Alaboratory manual.ColdSpring Harbor Laboratory；Celis等(1994)Determination of antibodyspecificity by Western blotting and immunoprecipitation.In CellBiology.A Laboratory Handbook.Celis，J.E.(ed.)，Academic Press，New York，第2卷，305-313頁；Porstmann and Kiessig(1992)J.Immunol.Methods 1505-21；Dwenger(1984)J.Clin.Biochem.22883；MacBeath and Schreiber(2000)Science 2891760等。
分析基因表達與傳統中國醫藥定義生理狀態診斷的關聯性，參與測試的一組人同時接受中醫師看診及基因表達的分析。針對每一位被診斷的對象，中醫師以傳統方法判定其生理狀態，并將此生理狀態以分數表加以量化，而受測個人之多重基因表達則以生物微數組芯片或上述其它方法測定之。生理狀態分數表的結果與各基因表達量之間的關系以數學方法或直接借助統計回歸分析軟件來分析，以找出具明顯相關的各類基因，從而建立以此多基因為變項之數學公式(詳見以下實施例)。所得之數學公式可根據需求作進一步改善，以加強統計學上之關聯性(correlation)與顯著性(significance)。例如，在測試中加入更多基因或增加受測的人數。依此所導出之數學公式可在臨床上做為判別傳統中國醫藥定義生理狀況之工具。只要將檢體之基因表達數據輸入公式，即可得到傳統中國醫藥生理狀況分析的評分。如以下實施例所示，以氣喘病人為研究對象的結果，可導出含31個基因表達為變項的數學公式來描述傳統中國醫藥中之寒/熱生理狀態。實施例中之公式，在統計學上，具有87％的相關正確性。
下述實施例目的在于舉證本發明之可行性，而非局限本發明之應用與實施范圍。包括基因的種類、數目、基因表達的分析、傳統中國醫藥對于各種生理狀態的分析與描述、不同疾病的應用，皆可運用本發明所揭示之程序與觀念加以變化及擴充。
不同年齡、性別的氣喘病人于就醫時，同時接受一位中醫師及一位醫護人員(或西醫)看診。每位病人的寒/熱及虛/實生理狀態由中醫師診斷后，再根據下表各項要求紀錄下來。表一氣喘熱癥評分表姓名 病歷號 年齡

表二氣喘虛癥評分表姓名 病歷號年齡

每位病人于初診時，由醫護人員抽血三至五毫升，作為微數組芯片基因表達分析之樣本。樣品收集處理過程如下A.樣品收集使用EDTA(乙二胺四醋酸，紫頭管)采血3~5毫升B.樣品處理●分離白血球
1. 15毫升離心管內加入5毫升菲可帕克(Ficoll-Paque，PharmaciaBiotech)。
2.再將15毫升全血緩慢沿著管壁加入此離心管中。
3.以每分鐘25000轉轉速(rpm)離心20分鐘。
4.取出血清(黃色，第一層)置入1.5毫升微離心管中，置于-20℃中保存；取出血塊黃層(Buffy coat；白色，混濁，位離心液第二層)加入2個全新2毫升微離心管后，以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗一次，再以15000rpm轉速離心10分鐘。
5.丟棄離心后之液體，以PBS再沖洗一次，并充分混合后以15000rpm轉速離心10分鐘。
6.丟棄離心后之液體(盡量將液體倒干，可倒扣于擦手紙上約1分鐘)，再以300微升PBS重新懸浮離心沉淀物后，加入約5倍此體積之核糖核酸粹取液，溫和地重復翻轉加蓋之微離心管5至6次；標明病人姓名、日期和編號后置于-20℃保存。
●純化總量核糖核酸1.將上述最后步驟中保存之核糖核酸待粹取液在4℃溫度下以4000g轉速離心10分鐘，分離出淋巴球。
2.加入1毫升TRIZOL試劑(Life Technologies)，劇烈混合震蕩使細胞溶解。
3.置于冰上反應5分鐘后快速離心。
4.舍棄上清液后加入0.2毫升三氯甲烷(CHCl3)，劇烈震蕩混合1分鐘。
5.置于冰上反應2分鐘。
6.于4℃，以14000g轉速離心15分鐘。
7.將上清液(約0.6毫升)轉置于一全新1.5毫升微離心管中。
8.加入0.5毫升異丙醇并混合均勻。
9.于-20℃反應20分鐘。
10.于4℃，以14000g轉速離心15分鐘。
11.丟棄上清液。
12.以75％乙醇潤濕離心沉淀后之核糖核酸小粒。
13.于4℃，以14000g轉速離心15分鐘。
14.丟棄上清液后將核糖核酸離心沉淀小粒真空干燥。
15.以20微升不含核糖核酸酶之水重新懸浮核糖核酸離心沉淀小粒。
16.以光譜儀測量核糖核酸總濃度。
●Cy5標示和純化(Cy5為一螢光染劑)1.準備足夠2倍量之反轉錄標示混合物，并將此溶液存于-20℃.2倍量之反轉錄標示混合物組成如下5倍量之反轉錄緩沖液120微升DTT(5mM) 60微升去氧腺嘌呤三磷酸(dATP)(100mM) 3微升去氧胞嘧啶三磷酸dCTP(100mM)3微升去氧鳥嘌呤三磷酸dGTP(100mM)3微升去氧胸嘧啶三磷酸dTTP(100mM)0.6微升去核酸酶水(nuclease-free water)110.4微升總體積 300.0微升2.將2微升，0.1微克/微升之oligo-dT(12-18-mer；LifeTechnologies)及8微升之總和核糖核酸混合(若核糖核酸最初濃度大于0.3微克/微升，則將其稀釋至0.3微克/微升；若核糖核酸濃度介于0.15-0.3微克/微升之間，則將其稀釋至0.5微克/微升)。
3.將此混合液置于70℃反應10分鐘后急速置于冰上2-3分鐘。
4.于暗室中加入下列試劑并混合均勻2倍量之反轉錄緩沖液 16微升Cy5-去氧胸嘧啶三磷酸(Cy5-dUTP)(1mM) 3微升SuperScript II(200 U/μL) 2微升RNAsin 1微升5.將此混合液置于42℃反應2小時。
6.加入1.5微升，20mM之乙二胺四醋酸(EDTA)以制止反轉錄反應。
7.加入1.5微升，500mM氫氧化鈉(NaOH)并加熱至72℃，10分鐘以使核糖核酸降解。
8.加入1.5微升，500mM鹽酸(HCl)以中和此混合液。
9.以ProbeQuant G-50微柱(Micro Column；Amersham PharmaciaBiotech)過濾未結合之螢光標示核苷酸。
10.真空抽干純化之混合物并以10微升人類COT-1 DNA及1微升，20微克/微升poly-A核糖核酸重新懸浮離心后之沉淀小粒。
11.將此Cy5標示之樣本貯存于-80℃。
微陣列載玻片(microarray slides)如下制備。
微陣列載玻片(microarray slides)依據下列標準程序制備。本實施例自69個與免疫及發炎高度相關的基因中選擇93個互補去氧核糖核酸探針(cDNA probes；詳見下列表三)。有些互補去氧核糖核酸探針則由某基因序列之不同部位選取(例如ACHE)。取得之數據則分別分析之(詳見下列敘述)。另外，選擇一表達程度維持一定的管家基因(housekeepinggene)GAPDH做為陽性控制組，其它基因表達程度以此作校正。再以2種植物基因，RbCL和ATBS之探針做為陰性控制組。
互補去氧核糖核酸克隆(cDNA clones)購自Incyte Genomics Inc.(St.Louis，MO，USA)。所有探針以一次重復、8×12數組排列方式點于生物芯片上。
表三反向轉錄去氧核糖核酸基因探針排列方式 微陣列載玻片前雜交1.在42℃條件下，將芯片置于廣口瓶浸泡于5倍檸檬酸鈉溶液(SSC，3M NaCl，300mM sodium citrate)，0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS，sodiumdocecyl sulfate)及1％牛血清蛋白中反應45分鐘。
2.以2次蒸餾水沖洗芯片。
3.以壓縮空氣吹干芯片。雜交樣本之制備(Cy5標示之互補去氧核糖核酸)1.在每一個樣本上加入11微升之2倍濃度雜交緩沖液(50％甲銑胺，10倍濃度檸檬酸鈉溶液，0.2％十二烷基硫酸鈉)。
2.將樣本加熱至95℃，3分鐘。
3.離心2分鐘以使樣本冷卻。雜交
1.將雜交反應培養箱預熱至42℃。
2.依序以100％乙醇及2次蒸餾水清洗蓋玻片。
3.以壓縮空氣吹干蓋玻片。
4.將待測樣本加入互補去氧核糖核酸探針標點區，小心蓋上蓋玻片，務使無空氣殘留。
5.加入5微升5倍濃度檸檬酸鈉溶液至雜交反應槽以確定反應期間反應槽之濕度。
6.將雜交反應槽小心地置于反應培養箱，以溫度42℃過夜反應。雜交后清洗1.拆解各反應槽并將芯片取出。
2.將芯片置于芯片架后浸入42℃之清洗液(1)中(1倍濃度檸檬酸鈉溶液，0.1％十二烷基硫酸鈉)。輕輕晃動芯片架直到蓋玻片自動滑落。
3.將芯片轉移到新芯片架上后浸入42℃之清洗液(1)中(1倍濃度檸檬酸鈉溶液，0.1％十二烷基硫酸鈉)5分鐘。
4.在室溫下將芯片轉移到清洗液(2)中(1倍濃度檸檬酸鈉溶液，0.1％十二烷基硫酸鈉)，并輕輕晃動12分鐘。
5.在室溫下將芯片轉移至清洗液(3)中(0.1倍濃度檸檬酸鈉溶液)，并輕輕晃動1分鐘；重復此步驟4次。
6.以流動之2次蒸餾水沖洗5秒鐘。
7.以100％乙醇沖洗。
8.以壓縮空氣吹干芯片。
9.掃描芯片。決定基因之表達程度雜交后之芯片以GenePix 4000B Reader(Axon Instruments，Inc.)掃描，測量每一點訊號強度。將訊號強度利用GenePix Pro 3.0(AxonInstruments，Inc.)軟件轉換為強度值。每一基因表達強度依GADPH基因表達強度訊號校正，以獲得一基因表達指數基因表達指數＝(基因表達強度-背景強度)÷(GAPDH表達強度-背景強度)基因表達數據之統計分析利用Statistica軟件(Statsoft Company，OK，USA)分析基因表達數據與「寒/熱」和「虛/實」生理狀態評分之間的關系。表四基因表達程度與「寒/熱」生理狀態之相關

表五基因表達程度與「虛/實」生理狀態之相關

0.01＜p＜0.05為顯著。
0.001＜p＜0.01為高顯著。
p＜0.001為非常顯著。
p＞0.05為統計上不顯著。
0.05＜p＜0.1為傾向統計上顯著，將實時加注。
利用Statitica軟件的前述逐項功能，將基因表達指數(獨立變項)和「寒/熱」與「虛/實」生理狀態評分(因變項)之相關性以多向回歸分析予以公式化。特別是，利用這個軟件將此93個獨立變項做部分F-檢定(partial F-test)，然后選取一個最高的F值(例如與因變項最顯著相關者)做為第一個獨立變項。然后利用此軟件公式中的第一個獨立變項，計算出第二個具備最高F值的獨立變項。隨后，第二個獨立變項便被包含在公式之中。依此類推，此軟件便可進行下一步的計算。計算的循環持續直到F值低于1.4，總體F值高于標準值為止。如此建立了一個可用以表示基因表達指數與「寒/熱」生理狀態評分相關性的公式(見下文)。利用這個公式，可以預測病人的「寒/熱」生理狀態達到近87％的準確度。
「寒/熱」生理狀態評分＝9.266-4.297X1+14.195X2-63.813X3-14.625X4+0.669X5-18.968X6+35.786X7-28.364X8-0.622X9-7.628X10+16.972X11-3.161X12+20.004X13-5.297X14+4.794X15-41.230X16+27.656X17+0.587X18-0.353X19-5.617X20+0.965X21+26.581X22-34.130X23+13.134X24-15.014X25-13.268X26+34.639X27-45.892X28+57.490X29+12.426X30+1.104X31X1-X31為STAT1，TBXA2R_1，CDH3，Interleukin 5 Receptor_1，Interleukin 15_3，PRKG1，Metallothionein_1，STAT4_1，Interleukin13，ICAM1，Adenylate Cyclasel_3，Interleukin 6，STAT2，Interferon1，GBP1，C_FOS，Colony stimulating，Metallothionein_3，TBXA2R_2，Interleukin 15_1，Interleukin 4，Interleukin 15_4，Interleukin 18Receptor，ETS1_1，ETS1_2，TBXA2R_3，CCR3，SLAM，MIG，ADRB2，andSelectin L，之基因表達指數。
p值＝7.48E-10
R2＝0.874整體樣本總平方值(total SS)＝616.72，Reg SS＝471.00，Res SS＝145.72整體F＝6.26同樣地，也可以建立一個如下，可用以表示基因表達指數與「虛/實」生理狀態評分相關性的公式「虛/實」評分＝2.707-2.685X32+0.948X33+10.660X34-6.126X25-0.159X35-56.577X36+29.078X37+10.106X38-52.797X39-72.409X40+16.141X41-33.123X42-11.597X43+0.283X44+30.648X45+1.511X46-25.911X6+6.110X5+9.539X10-4.320X14+48.717X47-38X48+31.497X49+1.553X50+0.936X51-28.684X26+30.478X2-62.133X52+53.074X29+24.880X3-6.084X12+5.534X53-0.697X21+30.439X54-10.031X55X32-X55為CCR7，LAMR1，CD_31，CD_2，Terminal transferase，HOXA1_2，ITGA6，MUC1，CD_26，Adenylate cyclase1_1，Interleukin 18，STAT6，CD_69，MUC2_4，GBP2，CCR5，ACHE_1，Adenylate cyclase1_2，SCYA17，CXCR3，MUC2_1，PDPK，Interleukin 12 Receptor beta2_2，andMetallothionein_2，之基因表達指數。
p值＝3.47E-08R2＝0.873整體樣本總平方值(total SS)＝453.68，Reg SS＝345.41，Res SS＝108.27整體F＝5.10p值表示統計結果的顯著程度，并未顯示在不同α值上進行重復的顯著性分析。p＜0.005代表非常顯著。
R2代表一個評分變異的比例，以X變項表示，并且所有的數據點都落在回歸線上。
整體樣本總平方值(total SS)為單一樣本數與樣本數平均值之間誤差的平方總和。總平方值回歸(Reg SS)為回歸組成之總平方值。總平方值余數(Res SS)為余數組成之總平方值。適合度的條件為總平方值回歸與總平方值余數之比例。較高的比例值(例如大于0.7)表示較高適合度；反之較小的比例值表示較低的適合度。
整體F值代表公式中的F值。
本發明所揭露之所有特征包含其它任何組合。本發明所揭露的每一項特征皆可由其它具有相同、相當或類似功能的特征所取代。因此，除非特別聲明，本發明在此所揭露的每一項特征僅為一系列相當或類似特征之通用例證。
依據以上描述，熟悉此技藝者皆可輕易了解本發明之基本特征，并且在不超出其精神及涵蓋范圍狀況下，依不同的應用與條件針對本發明做不同的修改。所以，其它可因此而具體實施之狀況亦包含在本發明的權利要求范圍之中。
權利要求
1.一種基質，包含用以決定多重基因表達的檢測組件，其特征在于此多重基因加權表達程度的組合，是表示傳統中國醫藥定義的生理狀態。
2.如權利要求1所述的基質，其特征在于該檢測組件為核酸。
3.如權利要求1所述的基質，其特征在于該檢測組件為勝肽。
4.如權利要求3所述的基質，其特征在于該勝肽為抗體。
5.如權利要求3所述的基質，其特征在于該勝肽為配位子。
6.如權利要求1所述的基質，其特征在于該生理狀態為「寒/熱」。
7.如權利要求1所述的基質，其特征在于該生理狀態為「虛/實」。
8.如權利要求1所述的基質，其特征在于該多重基因加權表達程度的組合是一種加權表達程度的總合。
9.如權利要求8所述的基質，其特征在于該多重基因加權表達程度的組合表達的生理狀態為「寒/熱」。
10.如權利要求8所述的基質，其特征在于該多重基因加權表達程度的組合表達的生理狀態為「虛/實」。
11.一種軟件，其是用以指示一個處理器，執行包含接受多重基因表達程度信息及決定多重基因加權表達程度組合的步驟，其特征在于該多重基因加權表達程度的組合是表示傳統中國醫藥定義的生理狀態。
12.一種軟件，其特征在于它是用以指示一個處理器，執行包含接受傳統中國醫藥定義生理狀態的評分和多重基因表達程度信息的步驟，以及由該生理評分與這些基因加權表達程度組合所推演出的公式。
13.如權利要求12所述的軟件，其特征在于該公式由多項回歸分析所推演。
14.一種決定傳統中國醫藥診斷各種生理狀態的方法，其特征在于它是由量化多重基因表達程度所組成，此種多重基因加權表達程度的組合是表示傳統中國醫藥定義的生理狀態。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于該基因表達程度是為核酸變化的量化。
16.如權利要求14所述的方法，其特征在于該基因表達程度是為勝肽化的量化。
17.如權利要求16所述的方法，其特征在于該勝肽為抗體。
18.如權利要求16所述的方法，其特征在于該勝肽為配位子。
19.如權利要求14所述的方法，其特征在于該生理狀態為「寒/熱」。
20.如權利要求14所述的方法，其特征在于該生理狀態為「虛/實」。
21.如權利要求14所述的方法，其特征在于該多重基因加權表達程度的組合是一種加權表達程度的總合。
22.如權利要求21所述的方法，其特征在于該生理狀態為「寒/熱」。
23.如權利要求21所述的方法，其特征在于該生理狀態為「虛/實」。
全文摘要
本發明提供一種基質，其包含用以決定多重基因表達程度的檢測組件，此多重基因加權表達程度的組合，是表示傳統中國醫藥定義的生理狀態。本發明同時揭示此多重基因表達程度應用于傳統中國醫藥定義生理狀態的相關方法與軟件。
文檔編號C12Q1/68GK1456681SQ0214182
公開日2003年11月19日 申請日期2002年8月21日 優先權日2002年5月6日
發明者蕭敻, 黃馪珽, 許清祥 申請人:晶宇生物科技實業股份有限公司, 景岳生物科技股份有限公司