專利名稱：Dna水平稻米可口性評價方法，和通過對半粒未去殼/未精碾稻米的分析來選擇可口稻米 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種DNA水平的評價稻米可口性和選擇可口稻米的方法。確切的說，本發明涉及一種用于篩選可口稻米的，DNA水平的評價稻米可口性的方法。它包括用適合的引物(STS引物)通過PCR擴增提取自稻植株，未去殼稻粒、未精碾稻米、精白米、米飯、米制糕點或者其研碎粉末地DNA，然后在擴增的DNA條帶中選擇與可口性評價密切相關的DNA條帶，將它用作可口性評價的DNA標記來篩選可口的稻米。這里所指的“可口的稻米”意思為口感好、品質高的稻米。
背景技術：
在包括日本的許多國家，稻、小麥和玉米被稱作是最重要的3大谷類，是世界上一半以上人口主要糧食的非常重要的組成部分。近來，對于作為糧食的稻米，不僅提高產量很重要，其質量，即米飯的可口性的提高也很重要。就稻米的全球狀況來看，軟質和芳香稻米，如印度和巴基斯坦的“Basmati370”、泰國的“Jasmine稻米”和日本的“Koshihikari”很受歡迎并且售價很高。
有兩種主要的方法可以評價稻米的可口性。其一是通過品嘗米飯來評價其食用品質的感官測試(感官測試)；另一是物理化學測試，通過分析稻米或米飯的化學成分并測量其物理性質，根據數據來估計稻米的可口性。這兩種方法各有優缺點。因此，目前評價稻米的可口性，使用兩種方法之一或兩者。
然而，這里感官測試和物理化學測試都需要至少測試50-500g稻米。因此，根據測試方法，不可能從小量，尤其是僅僅一粒稻米來估計某批或某個品種或品系稻米的可口性。
我們，即本發明的發明人迄今為止從事過多種關于稻米可口性評價的研究，并且將其結果公布于出版物，例如《Food Industry》第42卷，第17期，第55-61頁。可是，我們的現有各種技術也都是針對感官測試或物理化學測試，而這兩種測試都需要有測試一定數量的稻米，因而仍不能通過非破壞地測試很少量尤其是僅僅一個稻米粒來估計稻米的可口性。
到目前為止，我們研究過多種DNA水平的，通過RAPD方法或者使用STS引物的方法來區別稻米品種的技術。我們的研究發表于刊物如《the Journal of the Food Science and Technology in Japan》第46卷，第3期，第117-122頁，而且已經對此提交了專利申請(例如，日本專利公開文本第2001-95589號)。然而，我們的這些現有技術都是針對已注冊的稻米品種，使用區別品種的，而與可口性無關的DNA標記，用于區別稻米品種。總之，這些技術不屬于針對更廣范圍的稻米，包括世界上多個地區產出的未鑒定品種的稻米、正在培育的新品種稻米和其它市售的卻未經可口性評價的稻米的DNA水平可口性評價。
用稻苗和較大量的稻米作樣品，以RFLP(限制性片段長度多態性)為基礎的遺傳標記的研究已經用于尋找稻中抗植物病原菌和害蟲的基因。在以RFLP為基礎的方法中，用多種限制性內切酶處理樣品DNA，得到的DNA片段用于DNA多態性分析。然而這種操作不適用于本發明中使用很少量尤其是一粒稻米作樣品的非破壞性稻米可口性評價和可口稻米篩選。
因此，本領域相關技術迄今為止還不能以很少量尤其是一粒稻米作樣品并且通過使用DNA標記分析來評價稻米可口性。發明概述
本發明提供一種DNA水平的，以很少量尤其是半粒或一粒稻米作樣品的稻米可口性評價方法。這種方法可以在不破壞作為下一代稻植株發育起點的稻粒胚胎的前提下評價稻米可口性，并且篩選可口稻米。
我們，本發明的發明人為實現上述目的進行了刻苦的研究，并且發現，通過從各種稻米樣品中分別提取DNA，以適合的引物經PCR擴增這些DNA，然后在所得擴增的DNA條帶中選擇與可口性評價密切相關的DNA條帶，將其作為選擇可口稻米的可口性評價的DNA標記，可以從多種稻米樣品中篩選出可口稻米。在此發現的基礎上我們完成了本發明。
具體來說，該項發明為篩選可口稻米提供一種DNA水平的稻米可口性評價的方法。它包括在STS引物或隨機引物存在下通過PCR擴增從稻植物、未去殼稻粒、未精碾稻米、精白米、米飯、米制糕點或者其研碎粉末中提取的DNA，然后在所得擴增的DNA條帶中選擇與可口性評價密切相關的DNA條帶，并且將其用作可口性評價的DNA標記來篩選可口稻米。
在本發明DNA水平稻米可口性評價方法的一個實施方案中， 用于提取DNA的稻米樣品是半個不含胚胎的未去殼或未精碾稻米，用由PCR得到的DNA標記篩選出可口稻米之后，帶有胚胎的另一半可以萌發并且長成稻植株，因此可以選擇性培育這樣選出的可口稻米品種。
在本發明DNA水平稻米可口性評價方法的另一個實施方案中，PCR以RAPD或STS引物來實現，并且用與感官測試和/或物理化學測試的可口性評價密切正和/或負相關的DNA條帶作為選擇可口稻米的可口性評價DNA標記。
在本發明DNA水平稻米可口性評價方法的另外一個實施方案中，選擇性使用與感官測試和/或物理化學測試的可口性評價密切正和/或負相關的DNA標記，以樣品是否出現該條帶為基礎篩選可口稻米。
在本發明DNA水平稻米可口性評價方法的另外一個實施方案中，物理化學測試的稻米可口性評價通過測量己熟稻米的性質來實現。
在本發明DNA水平稻米可口性評價方法的另外一個實施方案中，PCR由10到30mer的制備自DNA序列SEQ ID Nos.1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81、82、85、和86的STS引物來實現。
在本發明DNA水平稻米可口性評價方法的另外一個實施方案中，在PCR中使用選自引物組A6，A7，B1，B7，B18，B43，E22，E30，F6，G4，G22，G28，J6，M2CG，M11，P3，P5，Q16，S13，T8，T16和WK9的一個或多個STS引物。
在本發明DNA水平稻米可口性評價方法的另外一個實施方案中，在PCR中使用選自引物組OPA6，OPB1，OPB18，OPE22，OPF6，OPG4，OPG28，OPM11，OPP3，OPP5，OPQ16和OPT16的一個或多個隨機引物。附圖簡述
圖1顯示電泳中觀察到的DNA條帶模式。其中，M表示標記；泳道1是“Koshihikari”；泳道2是“Hitomebore”；泳道3是“Hinohikari”；泳道4是“Akitakomachi”；泳道5是“Kirara 397”；泳道6是“Kinuhikari”；泳道7是“Hoshinoyume”；泳道8是“Haenuki”；泳道9是“Mutsuhomare”；泳道10是“Nipponbare”；泳道11是“Sasanishiki”；泳道12是“Tsugaruroman”；泳道13是“Hanaechizen”；泳道14是“Yumetsukushi”；泳道15是“Hatsushimo”；泳道16是“Asanohikaori”；泳道17是“Tsukinohikari”；泳道18是“Aichinokaori”；泳道19是“Matsuribare”；泳道20是“Akiho”。
圖2是展示1997年收獲的稻米的可口性實得值與預期值之間相關性的圖。
圖3是展示1998年收獲的稻米的可口性實得值與預期值之間相關性的圖。
圖4是展示1999年收獲的稻米的可口性實得值與預期值之間相關性的圖。
圖5是展示實施例2中稻米的可口性實得值與預期值之間相關性圖。
圖6是展示實施例2中分析的稻米的主要組成成分數據的圖。
圖7是展示實施例3中稻米的可口性實得值與預期值之間相關性的圖。
圖8是展示實施例4中稻米物理性質的實得值與預期值之間的相關性的圖。
圖9是展示實施例5中稻米物理性質的實得值與預期值之間的相關性的圖。
圖10是展示實施例6中稻米物理性質的實得值與預期值之間的相關性的圖。發明詳述
下文將詳細描述本發明。
在本發明中，稻米的可口性用于指示通過煮熟食用精白稻米做成的米飯的可口性。眾所周知，米飯的可口性在不同國家和不同地區差異很大，而且隨時間變化而變化，取決于用餐時的環境以及評味員是否饑餓等狀態。
然而，當許多評味員品嘗在同一先定條件下制得的米飯時，他們根據自己的喜好來評價。例如，大多數日本人喜好“軟質，粘性并且明亮的米飯”；相反，大多數印度人喜好“難以咀嚼的相對較硬且不粘的米飯”。
這里所指的稻米可口性包含了個人對米飯喜好的不同。因此，例如，可以指由日本谷類調查協會(the Japan Association of GrainInspection)每年在由前農林漁業部國家糧食研究所制定的感官測試方法基礎上進行并公布其結果的稻米可口性分級；由各個不同地區的農業試驗站的稻育種實驗室進行的可口性測試的結果；和下文所述的稻米可口性的物理化學檢查的結果。
本發明的稻米可口性的感官檢查如下4到50個(通常24個)評味沒品嘗米飯。這些評味沒將被測樣品與標準米飯的參考樣品作對比，在以下指標“整體評價”、“硬度”“、粘度”、“外觀”、“可口性”和“芳香”分別對被測樣品給出“不好”、“中等”或者“好”的評價。所有評味沒的數據都經過統計處理，通過與平均數據的顯著性水平差異或者通過二元配置和離散分析(two-way layout and dispersionanalysis)來評價被測試稻米的可口性。例如，上文所提到的日本谷類檢查協會的方法，和由全日本的國家和公共稻育種實驗室進行的可口性檢查方法都對應于感官檢查。
本發明的稻米的物理化學檢查用于從其數據估計稻米的可口性，具體如下分析稻米的化學成分，例如，測量它的蛋白含量或者淀粉含量。將稻米粒或米粉暴露于可見光來獲得它的近紅外光譜。檢測米粉的糊化性能。檢測米飯的性能。測量米飯的性質。通過多元變量分析如多重回歸分析或者神經網絡分析(neural entwork analysis)處理各測試結果和數據的解釋性變量，得出被測稻米的可口性的估計值。而這就是本發明根據其數據估計稻米可口性的稻米的物理化學檢查。
在本發明中，米飯的物理性質的測量如下據認為米飯的硬度和粘度同它的可口性有密切的關系。通過拉伸壓縮測量器如稠度測試儀、流變儀、流變記錄器(Rheolograph)或者Tensipresser，或者通過粘彈性測量儀，如Rheolographmicro來測量米飯的硬度和粘度。多種米飯樣品，例如，大約1-3粒或者更多而且甚至是米團可以用來測試它們的物理性質。
在本發明中，可以使用任何常規方法從稻植株、未去殼稻粒、未精碾稻米、精白米、米飯、米制糕點或者其研碎粉末中提取DNA，例如，使用十六烷基三甲基溴化銨(以下用CTAB方法指代)的方法，堿性SDS法，苯酚法，酶法或者苯甲基氯法。也可以用商業化的DNA提取試劑盒提取DNA。本發明優選使用下文實施例中所說的CTAB法或酶法。
具體例如，將一種CTAB溶液(0.1M Tris-鹽酸，2mM乙二銨四乙酸二鈉(EDTA)，1.4M NaCl(pH8.0))加入到樣品中并攪拌。將樣品放進溫育箱，并再次加入CTAB溶液，然后保溫一定時間來從樣品中抽取基因組DNA。
如果樣品來自米飯或者米制糕點，它的基因組DNA可以依據日本專利第3048149號中介紹的一種使用酶的方法來提取。具體地，如果樣品為粉末，將粉末溶解于緩沖溶液并且用抗熱淀粉酶處理，然后從中提取基因組基因。
如果樣品來自未去殼稻米或者未精碾稻米，其基因組DNA依照下述方法提取用刀將每一個要測試的未去殼或者未精碾稻米粒切成兩半，從不含胚(胚芽)的一半提取基因組DNA并且進行可口性評價。如下文所述，含有胚(胚芽)的另一半稻粒可以萌發并長成稻植株。就這樣，可以選擇性地培育可口稻米的植株。
如果愿意，還可以通過，例如氯仿/異戊醇處理、或異丙醇沉淀，或者苯酚/氯仿去蛋白法，或乙醇沉淀法等將這樣提取的DNA純化。純化操作優選使用氯仿/異戊醇處理。具體地，將氯仿/異戊醇(24/1)加入到DNA提取物中，混勻并離心；在其上清液中加入DNA沉淀劑(1％CTAB溶液，20mM Tris-鹽酸，10mM EDTA，pH8.0)來沉淀DNA；再次離心并將得到的DNA沉淀用1M的NaCl提取；并且用異丙醇和乙醇漂洗DNA提取物，然后離心收集后溶解在TE緩沖液中。如此操作可以得到純化的樣品DNA溶液。
接下來，將上述方法得到的基因組DNA作為模板，在隨機引物存在下進行PCR。這樣擴增得到基因組DNA中的堿基序列，用于區分品種并為下一步PCR所需的STS引物的設計提供依據。
本發明中的PCR是指用DNA聚合酶復制DNA的鏈式反應。PCR的一個循環包括3個步驟變性、退火和鏈延伸。變性步驟包括存在有多種基因片段(引物)時，以90到96℃之間的較高溫度，加熱模板DNA使雙鏈模板DNA分離成單個的單鏈；退火步驟是指在30到75℃使引物結合到DNA上；延伸步驟是指在70到75℃，有耐熱DNA聚合酶時，從結合引物的部分起延長DNA分子。本發明以重復20到50個這樣的PCR循環來擴增模板DNA大約1,000,000到10,000,000,000倍。
本發明的RAPD方法是檢測以隨機合成的8到50mer的隨機引物PCR擴增的DNA的多態性(形態的多樣變化)。
下面介紹本發明使用的隨機引物。在以稻米樣品提取的基因組DNA為模板DNA的PCR反應中，所用的隨機引物與已經變性的單鏈基因組DNA互補地結合構成一個雙鏈結構，然后這個雙鏈結構就作為模板DNA復制的起點。一般而言，這種隨機引物是一種8到50mer的核苷酸，并且是由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)隨機鍵合構成的合成引物。例如，它包括市售的10-mer的隨機引物(由Operon生產)和DNA低聚物組(12-mer)(由Wako PureChemical Industries生產)。具體而言，本發明使用一個或多個選自OPA6，OPB1，OPB18，OPE22，OPF6，OPG4，OPG28，OPM11，OPP3，OPP5，OPQ16和OPT16引物組的隨機引物，并檢查是否存在區別條帶。用“1”代表出現區別條帶，“0”代表不出現區別條帶，將PCR的數據數字化，并且這將是評估被測試稻米樣品可口性的解釋性變量。
以下介紹本發明所用的STS(序列標記位點)引物。它是一對用以擴增DNA中區別品種的堿基序列的引物。如上文所提，該STS引物是依據能夠產生品種區別條帶的堿基序列來設計的。而這種堿基序列是以RAPD方法PCR擴增基因組DNA來得到的。具體而言，將被測稻米樣品的基因組DNA作模板，用隨機引物做PCR，然后將DNA中產生品種區別條帶的部分測序。在這個堿基序列中，從該隨機引物的正反向端各選8到50個堿基殘基來構成一對引物。用這對引物對被測稻粒的模板DNA做PCR來區別品種。
這樣，STS引物特異性地選自有多個位點可以結合模板DNA的隨機引物。因此，在對模板DNA進行評價可口性的PCR中，這樣選出的STS引物選擇性地只與模板DNA上能夠產生品種區別條帶的堿基序列結合。
將由PCR擴增的DNA進行電泳。這是為了從擴增產物中檢測有關可口性評價的堿基序列的條帶。找到的堿基序列將作為設計所需STS引物的依據。
依據檢測到的有關可口性評價的堿基序列的條帶，按如下方法構成一對引物
從電泳膠上切下給出可口性評價DNA片段的條帶，提取并收集該DNA，并將其轉化到大腸桿菌(E.coli)，培養帶有該DNA片段的已轉化細胞。然后，通過小量制備的堿法從細胞中提取該質粒DNA。再以質粒DNA為模板，經PCR將其擴增，然后使用自動DNA測序儀對其進行測序。
在這些已測序DNA的基礎上，設計STS引物。在前面用隨機引物做的PCR反應中，稻米樣本DNA或模板DNA中包含與隨機引物結合的位點的序列應與該隨機引物的序列相同或互補(同源)。也即，被切出并提取自模板DNA的，用于高可口性評價的DNA堿基序列(這將作為設計STS引物的依據)，在其兩端應分別包含一個與隨機引物堿基序列相同或同源的序列部分。
相應地，從高可口性評價DNA堿基序列的正向和反向端，可以設計具有可用于確定可口性稻米的合適序列及合適長度的STS引物。
如上所述，本發明所用的STS引物是一對正反引物(引物對)，并且是先測序根據PCR所得區別條帶提取的DNA片段，然后構建其堿基序列，使之5’和3’端之間包含給出區別條帶的DNA序列。因此在PCR中，它只能擴增自己中間所包含的給出區分條帶的DNA序列。本發明所用的STS引物對優選具有相同或同源序列。
關于STS引物的大小(組成堿基的數量)，希望的是本發明所用為8到50個堿基，更優選15到30個堿基。如果其大小超過該范圍，就會因為引物不能很好地與模板DNA結合，并且結合后不能很好地解脫而對反應有所不利，而且DNA在PCR中不能產生區別條帶，所以對可口性評價無效。另一方面，如果其大小小于該范圍，也會因為引物可能非特異地與其他非所需DNA結合并且發生錯配而有所不利，結果不指示目的區別條帶的非所需條帶的表達頻率將增加，對可口性評價無效。畢竟，這些太小的引物對使用多種引物通過PCR方法快速簡單地進行可口性評價是無效的。
通過以上述方法實現的PCR實驗，我們，該項發明的發明人獲得了多種能夠有效區別稻品種的可口性評價條帶。下面的表1顯示一些稻米可口性評價條帶與可以依據這些條帶彼此區別的稻品種之間的相關性。
在本發明中，可口性評價的DNA條帶是指通過PCR擴增，在電泳中能夠產生足以從其他不同品種中區別出該稻米樣品可口性的模式的DNA條帶。
表1-1+PCR后電泳出現區別條帶-PCR后電泳不出現區別條帶
表1-2+PCR后電泳出現區別條帶-PCR后電泳不出現區別條帶
表1-3+PCR后電泳出現區別條帶-PCR后電泳不出現區別條帶
表1-4+PCR后電泳出現區別條帶-PCR后電泳不出現區別條帶
從這些條帶，可以得到多種STS引物。
(1)區別條帶A7(0.7kbp)
這個條帶由稻品種“Koshihikari”和“Akitakomachi”的擴增DNA獲得，但是卻特異性地不能從“Nipponbare”和“Asanohikari”中擴增而得。從這個條帶A7，設計了一對引物A7F30(SEQ ID No.5)和A7R30(SEQ ID No.6)
然后，從引物的3’端刪掉一定數量的堿基來得到本發明所用的STS引物A7F19(SEQ ID No.7)和A7R16(SEQ ID No.8)
(2)區別條帶B43(0.9kbp)
這個條帶由稻品種“Koshihikari”，“Hitomebore”和“Sananishiki”的擴增DNA獲得，但是卻不能從“Kirara397”和“Asanohikari”中擴增而得。從這個條帶B43，設計了一對引物B43F30(SEQ ID No.21)和B43R30(SEQ ID No.22)。
然后，從引物的3’端刪掉一定數量的堿基來得到本發明所用的STS引物B43F17(SEQ ID No.23)和B43R18(SEQ ID No.24)
(3)區別條帶E30(0.85kbp)
這個條帶由稻品種“Hitomebore”和“Mutsuhomare”的擴增DNA獲得，但是卻不能從“Koshihikari”和“Akitakomachi”中擴增而得。從這個條帶E30，設計了一對引物E30F30(SEQ ID No.29)和E30R30(SEQ ID No.30)。
然后，從引物中刪掉一定數量的堿基來得到本發明所用的STS引物E30F28(SEQ ID No.31)和E30R24(SEQ ID No.32)
(4)區別條帶J6(0.9kbp)
這個條帶由稻品種“Koshihikari”和“Kirara397”的擴增DNA獲得，但是卻不能從“Sananishiki”中擴增而得。從這個條帶J6，設計了一對引物J6F30(SEQ ID No.49)和J6R30(SEQ ID No.50)。
然后，從引物中刪掉一些堿基來得到本發明所用的STS引物J6F18(SEQ ID No.51)和J6R20(SEQ ID No.52)
(5)區別條帶M2CG(1.2kbp)
這個條帶表示在10mer隨機引物上增加了2個堿基，由稻品種“Hitomebore”和“Nipponbare”的擴增DNA獲得，但是卻不能從“Koshihikari”和“Kinuhikari”中擴增而得。從這個條帶M2CG，設計了一對引物M2CGF30(SEQ ID No.53)和M2CGR30(SEQ IDNo.54)。
然后，從引物中刪掉一些堿基來得到本發明所用的STS引物M2CGF16(SEQ ID No.55)和M2CGR15(SEQ ID No.56)
(6)區別條帶S13(1.8kbp)
這個條帶由稻品種“Kirara397”和“Hoshinoyume”的擴增DNA獲得，但是卻不能從“Nipponbare”和“Asanohikari”中擴增而得。從這個條帶S13，設計了一對引物S13F30(SEQ ID No.73)和S13R30(SEQ ID No.74)。
然后，從引物中刪掉一些堿基來得到本發明所用的STS引物S13F25(SEQ ID No.75)和S13R24(SEQ ID No.76)
從S13，可以設計出S13F40(SEQ ID No.89)和S13R40(SEQ IDNo.90)。然而，由這些引物去掉一些堿基所構成的S13F12(SEQ ID No.91)和S13R12(SEQ ID No.92)會非特異地與其他非所需DNA結合并且發生錯配，結果使不指示目的區別條帶的條帶表達頻率增加。總之，這些引物對用PCR進行稻米可口性評價無效。
(7)區別條帶WK9(1.6kbp)
這個條帶由稻品種“Hitomebore”和“Akitakomachi”的擴增DNA獲得，但是卻不能從“Koshihikari”和“Sasanishiki”中擴增而得。從這個條帶WK9，設計了一對引物WK9F30(SEQ ID No.85)和WK9R30(SEQ ID No.86)。
然后，從引物中刪掉一些堿基來得到本發明所用的STS引物WK9F20(SEQ ID No.87)和WK9R20(SEQ ID No.88)
為了得到本發明所用的STS引物，從上述特異設計的引物中刪掉一些堿基。簡而言之，擴增提取自某稻米樣品的DNA模板，并且依據擴增的DNA來設計一對引物。從這樣設計的引物對中刪掉不必要的堿基來得到每個長15到30堿基的所需STS引物。
可以以任何常規方式，用適合的限制性內切酶來實現堿基刪除。
具體來說，從引物對A6F30(SEQ ID No.1)和A6R30(SEQ ID No.2)；A7F30(SEQ ID No.5)和A7R30(SEQ ID No.6)；B1F30(SEQ ID No.9)和B1R30(SEQ ID No.10)；B7F30(SEQ ID No.13)和B7R30(SEQ ID No.14)；B18F30(SEQ ID No.17)和B18R30(SEQ ID No.18)；B43F30(SEQ IDNo.21)和F43R30(SEQ ID No.22)；E22F30(SEQ ID No.25)和E22R30(SEQ ID No.26)；E30F30(SEQ ID No.29)和E30R30(SEQ IDNo.30)；F6F30(SEQ ID No.33)和F6R30(SEQ ID No.34)；G4F30(SEQ IDNo.37)和G4R30(SEQ ID No.38)；G22F30(SEQ ID No.41)和G22R30(SEQ ID No.42)；G28F30(SEQ ID No.45)和G28R30(SEQ IDNo.46)；J6F30(SEQ ID No.49)和J6R30(SEQ ID No.50)；M2CGF30(SEQID No.53)和M2CGR30(SEQ ID No.54)；M11F30(SEQ ID No.57)和M11R30(SEQ ID No.58)；P3F30(SEQ ID No.61)和P3R30(SEQ IDNo.62)；P5F30(SEQ ID No.65)和P5R30(SEQ ID No.66)；Q16F30(SEQID No.69)和Q16R30(SEQ ID No.70)；S13F30(SEQ ID No.73)和S13R30(SEQ ID No.74)；T8F30(SEQ ID No.77)和T8R30(SEQ IDNo.78)；T16F30(SEQ ID No.81)和T16R30(SEQ ID No.82)；WK9F30(SEQ ID No.85)和WK9R30(SEQ ID No.86)，依照上述方法去掉不必要的堿基來獲得每個由15到30個堿基構成的STS引物。本發明從這組STS引物中選用了至少2對引物。
相應地，本發明所用的STS引物是至少2個或多個選自下述組中的寡核苷酸A6F21(SEQ ID No.3)和A6R22(SEQ ID No.4)；A7F19(SEQID No.7)和A7R16(SEQ ID No.8)；B1F25(SEQ ID No.11)和B1R20(SEQID No.12)；B7F22(SEQ ID No.15)和B7R17(SEQ ID No.16)；B18F15(SEQ ID N0.19)和B18R21(SEQ ID No.20)；B43F17(SEQ ID No.23)和B43R18(SEQ ID No.24)；E22F20(SEQ ID No.27)和E22R21(SEQ IDNo.28)；E30F28(SEQ ID No.31)和E30R24(SEQ ID No.32)；F6F25(SEQID No.35)和F6R22(SEQ ID No.36)；G4F18(SEQ ID N0.39)和G4R24(SEQ ID No.40)；G22F27(SEQ ID No.43)和G22R23(SEQ IDNo.44)；G28F17(SEQ ID No.47)和G28R28(SEQ ID No.48)；J6F18(SEQID No.51)和J6R20(SEQ ID No.52)；M2CGF16(SEQ ID No.55)和M2CGR15(SEQ ID No.56)；M11F20(SEQ ID No.59)和M11R20(SEQID No.60)；P3F20(SEQ ID No.63)和P3R15(SEQ ID No.64)；P5F20(SEQID No.67)和P5R25(SEQ ID No.68)；Q16F25(SEQ ID No.71)和Q16R20(SEQ ID No.72)；S13F25(SEQ ID No.75)和S13R24(SEQ ID No.76)；T8F22(SEQ ID No.79)和T8R25(SEQ ID No.80)；T16F24(SEQ ID No.83)和T16R26(SEQ ID No.84)；WK9F20(SEQ ID No.87)和WK9R20(SEQID No.88)
本發明所用STS引物不限于以上所述的那些。考慮其用于稻米可口性評價的能力和解鏈溫度(Tm)，可以設計任何其他額外的適合于本發明的STS引物，并可以用于本發明。
Tm對應于DNA的雙鏈彼此分開時的溫度。一般來說，所用引物的Tm或者其左右的溫度適合作為PCR反應的退火溫度。在本發明的方法中，對于聯合使用的STS引物，專門選用有相近Tm的STS引物，適當地確定方法中對DNA做PCR的退火溫度，使其在所用STS引物的Tm附近。因此，本發明的方法能夠以分開使用STS引物的操作，在一個或較少的PCR循環中得到所需要的區別條帶。
具體來說，期望本發明所用每個STS引物的Tm值與STS引物Tm的平均值的差不大于15℃(±15℃)，并且PCR反應的退火溫度也在這個范圍內。
PCR的退火溫度比所用STS引物的平均Tm值低15℃或更多將對反應有所不利，因為不應產生出區別條帶的品種在PCR中可能也會產生出這些帶來。另一方面，PCR的退火溫度比所用STS引物的平均Tm值高15℃或更多也將對反應有所不利，因為一些在PCR中應該出現的區分條帶可能不見了。
如果選擇合適，STS引物就能在PCR中選擇性地只與DNA中能夠產生可口性評價條帶的堿基序列位點結合。
本發明可以使用這樣的一種或多種不同類型的STS引物。
本發明中使用不同類型的STS引物是指在一個相同的區別品種的PCR反應中使用選擇的不同STS引物。本發明可以使用適當選擇的引物的組合(一套引物)并且在電泳結果中出現對應每個引物的區別條帶。本發明可以聯合使用一套不同的STS引物來區別稻品種。
所制備的所有STS引物不能夠無條件聯合使用。聯合使用STS引物，必須選擇合適的引物，而且以合適的比例來混合，要考慮到所要聯合使用的引物不會形成引物二聚體，而且出現的區別條帶相互不重疊。適當地組合多種STS引物，并使用這樣組合的STS引物可以不必對每一個引物都做PCR，而且可以在一個PCR反應中簡單準確地對多個稻品種進行一一區分。由此，本發明很大程度地節約了稻米品種鑒定勞力，時間和成本。
下面介紹本發明用于篩選可口稻米的DNA水平的稻米可口性評價方法。該方法包括，在STS引物存在下經PCR擴增提取自稻植物、未去殼稻粒、未精碾稻米、精白米、米飯、米制糕點或者其研碎粉末的DNA，從所得擴增的DNA條帶中選擇與可口性評價密切相關的DNA條帶，然后將其用作可口性評價的DNA標記來篩選可口稻米。
對依據這種方法進行的稻米可口性評價，如表1中通過PCR指示區別條帶存在與否的數據被數字化。具體地將其二進制化，“1”代表PCR后電泳中出現區別條帶；“0”代表條帶不出現。對于稻米可口性數字化，可以使用直接將稻米樣品的感官可口性檢查結果和物理化學檢查數據進行數字化的方法。另外的方法還有例如根據《稻米可口性分級》(Rice Palatability Ranking)(2001，由日本谷類調查協會發表)數字化所嘗稻米樣品可口性，特別A級是5分，A級為4分，A’級為3分，B級為2分，B’為1分。可以使用的方法還有根據《稻米品種百科全書2》(Encyclopedia of Rice Varieties 2)(1999，稻米數據庫發表)來數字化所嘗稻米樣品的可口性的方法，其中五星級為5分，四星級為4分，三星級3分，兩星級2分，一星級1分，這樣數字化后，這種方法得到的數據可以與上文稻米可口性分級的數據結合，然后每個被測試稻米品種的數據總和指示其可口性評價。
稻米樣品用STS引物或隨機引物做PCR后是否出現區別條帶的數據經過這樣數字化得到的分值成為解釋性變量(explanatory variables)；由任何可口性檢查，感官檢查或物理化學檢查所得的數據作為反應性變量(response variables)。這些變量通過多變量分析，如多重回歸分析等得出可口性評估等式。從這個可口性評估等式計算出每種被測稻米樣品的多重相關函數(multiple correlation function)。以此為基礎，被測稻米被判定為是否可口稻米。
可口性估算等式一般由多重回歸分析得到。此外，還可以通過任何其他多變量分析得到，例如，主成分分析，聚類分析，PLS分析或神經網絡分析(neural network analysis)。
例如，本發明對稻米可口性的多重回歸分析可以按如下進行構成下述等式的一個線性多重回歸模型。在此，y表示可口性評價的反應性變量；x1，x2，x3，....xp表示對應從1到數量p的引物是否出現區分條帶的解釋性變量；而x11，x21，x31，....xp1表示從1到數量p的個體對應反應變量y1，y2，y3，....yp的解釋性變量。
yi＝k+a1x1i+a2x2i+a3x3i+....+apxpi
當未知常數k和回歸系數a1，a2，a3，...ap被確定后，就可以求出對應于任何所得解釋性變量x1，x2，x3，....xp的反應性變量的估計值。
應該以最小化預測誤差(即預測值與實得值的差值)的平方和的方式來確定回歸系數a1，a2，a3，...ap。具體是，以最小化下列式子來寫出(p+1)維的聯立方程，就得到它們關于回歸系數a1，a2，a3，...ap的解。在回歸方程中代入回歸系數就得到常數k。
預測誤差
＝∑[yi-(k+a1x1i+a2x2i+a3x3i+....+apxpi)]2，其中i值在1到p之間。
接下來介紹本發明選擇可口稻米的方法。在選擇可口稻米的方法中，用不含胚(胚芽)的半粒未去殼或未精碾稻米樣品提取DNA。具體來說，將要測試的一粒未去殼或未精碾稻米用刀片切成兩半，從不含胚(胚芽)的一半提取基因組DNA。將這樣提取的DNA作為模板，用STS引物等多種引物進行PCR。
然后，通過電泳分析由PCR擴增得到的DNA的模式。通過這些操作，在被測試的未去殼或未精碾稻米樣品中篩選出那些含有較多可口稻米特異的區別DNA標記而含有較少非可口稻米特異的區別DNA標記的稻米樣品。
對于用于可口性評價的DNA標記，一般使用可口稻米品種特異的DNA條帶，或非可口稻米特異的DNA條帶，不過，也可以使用除此以外的其他任何條帶。
依上述方法用可口性評價DNA標記篩選出可口稻米之后，將剩下的含有胚(胚芽)的半粒未去殼或未精碾稻米萌發，使其長成稻植株，這樣選擇性地培育已選出的可口稻品種。
萌發含有胚(胚芽)的半粒未去殼或未精碾稻米，使之長成稻植株，并收獲下一代稻的種子。例如，這以下文所述方法實現用1％的次氯酸鈉溶液將含有胚(胚芽)的半粒稻米的表面消毒，然后將其放入具有例如如下組成的培養基中在30℃萌發。這些是萌發的半粒已選出的可口稻米。
培養基成分(1升，pH5.8)
瓊脂糖 8.000g
硫酸銨 0.463g
硝酸鉀 2.830g
氯化鈣 0.166g
硫酸鎂 0.185g
磷酸二氫鉀 0.400g
硫酸鐵 0.278g
EDTA二鈉0.373g
煙酸0.250mg
維生素B60.250mg
維生素B10.500mg
氨基乙酸 1.000mg
將發芽的半粒稻米轉移到人工氣候室，在那里于28℃以光照10小時，暗14小時的循環培養，使其長成綠色小苗。接著，將小苗移種到含有相同培養基的農用小盆中生長，然后移植到育苗混合肥料中，繼續在人工氣候室生長約2周。長好后，將苗轉移到填有盆栽混合肥料的瓦格納盆中，在人工氣候室培養約4個月，那時這些苗就開始抽穗了。繼續培養約40天直到稻穗成熟。然后，收割成熟的稻穗，打谷，去殼。
將去殼的稻粒精碾并磨成粉，然后以上面介紹的方式用CTAB法從中提取DNA。由這些DNA做模板，用STS引物等多種引物做PCR，然后電泳。以擴增的DNA在電泳中是否出現可口性評價的DNA條帶為基礎，寫出該樣品的可口性估算等式。根據該等式，判定該樣品是否為可口稻米。
未精碾稻米樣品可以在實驗室的稻米磨上精碾，并通過感官檢查或物理化學檢查來測試它的可口性。
除上述方法以外，用半粒未去殼或未精碾稻米培育并篩選可口稻米還可以依據下述方法進行。根據傳統方法，將被測稻米粒浸泡于40℃溫水，去雄，并用父系花粉授粉。栽培在花盆，授粉的稻粒產生F1種子，取一些作樣品。每個樣品稻粒，未經去殼或拋光的，切成一半含有胚(胚芽)，另一半不含胚。在研缽中研碎不含胚(胚芽)的半個稻粒，并用CTAB法提取DNA，作為PCR的模板。
使用多種引物如STS引物等對模板DNA做PCR，然后電泳分析擴增的DNA。將電泳中是否出現可口性評價DNA條帶數字化為“1”或“0”。簡單的說，就是將電泳數據二進制化為1表示PCR后電泳中出現區別條帶(+)；和0表示PCR后電泳中未出現區別條帶(-)。
根據上述《稻米可口性分級》(2001，由日本谷類調查協會發表)和《稻米品種百科全書2》(1999，稻米數據庫發表)的方法，以及由物理化學檢查或對上文所提稻米物理性質的測量的數字化數據，進行的可口性的數字化方法也應用于對稻米可口性評價。
這樣根據PCR中是否出現區分條帶來數字化的稻米樣品的數據是解釋性變量；由可口性檢查或物理化學檢查得到的數據是反應性變量。這些變量通過多變量分析如多重回歸分析來得出可口性評估等式。根據可口性評估等式，計算出每種被測稻米樣品的多重相關函數。以此來判定被測稻米是否為可口稻米。簡單來說，將PCR后電泳是否出現區分條帶的結果二進制化，然后代入可口性估算等式來算出估計的可口性數據。選擇可口性數據估計值較高的種子或者根據模板DNA判斷其米飯將具有適合的物理數據的種子為可口稻米。選擇根據模板DNA判斷其米飯將具有適合的物理數據的種子，例如，將粘度/硬度值較高的那些選給日本人，而硬度值較高的選給印度人。
根據上文所述方式，將如此選出的種子的含有胚(胚芽)的一半播種，發芽，移植并栽培，然后從栽培的植株上收獲成熟的種子。將這樣獲得的可口稻米的F2代以普通方式自花授粉建立品種，這樣就從半粒未去殼或未精碾稻米選擇并栽培出可口性稻。
根據本發明的方法，可以推測與稻米可口性密切相關的稻米植株，稻米種子，稻米和稻米加工產品的物理化學數據及米飯物理數據。這個可口性評價方法使用較少量的稻米，例如，僅一粒或半粒稻米就已足夠。因此，本發明能夠通過測試半個未去殼或未精碾稻米來推測稻米可口性，由此來篩選可口稻米，并且剩下的半粒仍可以發芽并長成稻植株。這樣長成的稻植株的種子仍可以經過本發明的處理方法篩選可口稻米。
而且，本發明的方法適用于世界上不同國家產出的多種稻米品種。實施例
參考下述實施例，進一步詳細介紹本發明。不過，這些實施例并不限制本發明的范圍。
實施例1(以感官檢查所得數據為反應性變量，對未知樣品應用PRC法米飯可口性估算等式)
1999年日本收獲的前20種最好品種的大米，“Koshihikari”，“Hitomebore”，“Hinohikari”，“Akitakomachi”，“Kirara 397”，“Kinuhikari”，“Hoshinoyume”，“Haenuki”，“Mutsuhomare”，“Nipponbare”，“Sasanishiki”，“Tsugaruroman”，“Hanaechizen”，“Yumetsukushi”，“Hatsushimo”，“Asanohikari”，“Tsukinohikari”，“Aichinokaori”，“Matsuribare”和“Akiho”全部未精碾，進行了測試。使用一個實驗室大米磨，(Yamamato Seisakusho’s RicepalVP31T)，這些大米磨成精白米產率為90％。
將每種精白米樣品的一個稻粒放到一個1.5ml的塑料管(Assist生產)，然后加入35μl去離子水。將管子在一個臺子上放置1小時，稻粒吸收里面的水。打開管子，將樣品稻米放入一個做米飯的電飯煲(東芝RC-183，外夾層加入75ml去離子水)，煮15分鐘，再燜15分鐘，來制得米飯樣品。
依下述方法提取每種樣品的DNA將每個米飯粒放在一個微型試管，加入300μl，100mM的Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0，含100mM的NaCl)，并在沉淀混合器(Contes)中搗碎。然后，加入5μl耐熱淀粉酶，α-淀粉酶(Sigma生產，790單位/mg固體，1mg/ml)，60℃反應1小時。接著，向其中加入5μl，Tritirachium album的蛋白酶K(Onko生產，20mg/ml)，于37℃反應2小時。
酶反應之后，向每個樣品中加入1ml冷卻至-20℃的乙醇，并于-20℃放置15分鐘。用微型離心機離心(15000 G，4℃，15分鐘，下述離心條件皆同此例)來分離出沉淀殘余物。用300μl TE(10mM Tris-鹽酸，pH8.0，1mM EDTA)溶解沉淀，再加入400μl苯酚。為抽提DNA，將其在旋轉攪拌器上攪拌30分鐘。
然后，離心(15000G，4℃，15分鐘)收集上清，并向上清液加入等體積PCI(苯酚/氯仿/異戊醇，25/24/1)。同抽提DNA一樣(將其在旋轉攪拌器上攪拌)處理30分鐘，之后離心(15000G，4℃，15分鐘)收集上清。向其中加入6ml，5M的NaCl和400μl冷卻的乙醇。然后離心，并用70％的乙醇清洗所得沉淀。將最后的沉淀溶解在40μl，10倍稀釋的TE中，制得DNA樣品溶液。
它的PCR反應按下述方法進行
依上述方法，從每種米飯樣品中提取的DNA模板經PCR反應擴增。PCR反應物組成混合0.2μl Taq多聚酶(Takara Bio Inc.生產，5u/μl)，2.5μl PCR緩沖液(12mM Tris-鹽酸，60mM KCl，pH8.3)，2.0μl MgCl2，1μl模板DNA(200ng/μl)和1μl dNTPs(100μM)。PCR所用STS引物為每種0.4μl的A6F21和A6R22(SEQ ID No.3和4)；每種0.5μl的A7F22和A7R17(SEQ ID No.15和16)，每種0.6μl的M11F20和M11R20(SEQ ID No.59和60)；每種0.5μl的S13F25和S13R24(SEQ ID No.75和76)；每種0.4μl的T16F24和T16R26(SEQ IDNo.83和84)；每種0.4μl的J6F18和J6R20(SEQ ID No.51和52)；每種0.4μl的WK9R20和WK9R20(SEQ ID No.87和88)，將這些引物同PCR反應物混合，并用無菌水補足體積至25μl。
反應器是PCR Thermal Cycler(熱循環儀)MP(Takara Bio Inc.生產)。在反應器中，模板DNA經歷35個PCR循環。每個PCR循環包括94℃變性1分鐘，62℃退火1分鐘和72℃鏈延伸2分鐘。
用Mupid II(Cosmobio生產)電泳擴增的DNA。DNA在2％的瓊脂糖凝膠中電泳40分鐘，溴化乙錠染色并由紫外光照射來顯出條帶模式。
根據《稻米可口性分級》(2001，由日本谷類調查協會發表)的方法將每種樣品的可口性數字化。具體而言，特別A級是5分，A級為4分，A’級為3分，B級為2分，B’為1分。將這樣數字化數據同根據《稻米品種百科全書2》(1999，稻米數據庫發表)，五星級為5分，四星級為4分，三星級3分，兩星級2分，一星級1分的方法得到的數字化數據結合。結合后，每種被測樣品的數據總和就指示它的可口性。表2和圖1展示每種樣品電泳的條帶模式和它的可口性評價數據。
而且，表2中每種樣品PCR擴增的DNA條帶模式中是否出現區別條帶的情況被二進制化。具體而言，出現DNA區別條帶(+)為“1”，而不出現的(-)為“0”。
進一步通過多重回歸分析處理所得數據。指示7組引物是否出現區別條帶的二進制化數據為解釋性變量，而可口性評價數據為反應性變量。由此得出下述可口性估算等式
可口性估計值
＝4.185+0.653×A6+1.068×A7+1.746×M11+1.42×S13-1.27×T16-0.355×WK9+1.81×J6 (1)
下述調查了可口性估算等式(1)對未鑒定樣品的適用性以上述相同的方法檢驗并測試1997年日本收獲的11個品種，1998年的11個品種和1999年的10個品種，并在它們之間分別比較對由感官檢查得到的可口性數值和由可口性估算等式(1)預言的可口性數值。圖2到圖4的圖示展示實得可口性數值和預言可口性數值的相關性。
如圖所示，由可口性估算等式(1)得到的多重相關函數，1997年的稻米樣品為0.85，1998年的為0.91，而1999年的為0.93，都很高。由此證實，可口性估算等式(1)適用于任何未曾用于完成該等式的未知樣品，而且與收獲時間的日期無關。表2-常見的稻米品種，其經感官檢驗評價的可口性數據，和由引物得到的區分條帶。+PCR后電泳中出現區別條帶-PCR后電泳中不出現區別條帶*未經感官測試
實施例2(以感官檢查所得數據作反應性變量，精白米基于PCR方法的可口性估算等式的實用性)
除以精白米粉為樣品做PCR以外，本實施例與實施例1相同。具體而言，將與實施例1中同樣的前20種最好品種的未精碾稻米樣品精碾并磨成稻米面粉樣品。用CTAB處理從每種6g米面粉樣品中提取基因組DNA。具體的，將6ml，70℃的2％的CTAB溶液(0.1M Tris-鹽酸，2mM EDTA，1.4M NaCl，pH8.0)加入樣品并攪拌，放入55℃培養箱，并再加入6ml相同的CTAB溶液(1％)。以此條件，抽提基因組DNA 30分鐘。
然后，向DNA抽提物中加入氯仿/異戊醇(24/1)，攪拌并離心。向離心所得上清加入DNA沉淀劑(1％CTAB溶液，20mMTris-鹽酸，10mM EDTA，pH8.0)，放置于4℃過夜以沉淀DNA。之后離心，得到DNA沉淀，再用1M的NaCl抽提。用異丙醇或乙醇清洗DNA提取物，再沉淀收集，然后溶解于200μl的TE緩沖液(10mM Tris-鹽酸，1mMEDTA，pH8.0)制得DNA樣品溶液。
用5種不同類型的STS引物B1，F6，G28，P5和T16，對提取自每種精白米樣品的模板DNA進行PCR反應。PCR反應物的制備混合0.2μl Taq多聚酶(Takara Bio Inc.生產，5u/μl)，2.5μl PCR緩沖液(12mM Tris-鹽酸，60mM KCl，pH8.3)，2.0μl MgCl2，1μl模板DNA(200ng/μl)和1μl dNTPs(100μM)。PCR的STS引物為每種0.2μl的B1F25(SEQ ID No.15)和B1R20和(SEQ ID No.16)，每種0.4μl的F6F25(SEQ ID No.35)和F6R22(SEQ ID No.36)；每種0.2μl的G28F17(SEQ ID No.47)和G28R28(SEQ ID No.48)；每種0.3μl的P5F20(SEQ ID No.67)和P5R25(SEQ ID No.68)；每種0.3μl的T16F24(SEQ ID No.83)和T16R26(SEQ ID No.84)。將這些引物同PCR反應物混合，并用無菌水補足體積至25μl。PCR條件同實施例1。
用Mupid II(Cosmobio生產)電泳擴增的DNA。DNA在2％的瓊脂糖凝膠中電泳40分鐘，溴化乙錠染色并由紫外光照射來顯出條帶模式。
另一方面，對稻米樣品進行感官檢查，數字化其可口性。感官檢查如下用水洗凈600g每種樣品的稻米。加入1.3倍重量的純水，浸泡1小時令其吸水。用電飯煲(東芝RC-183)煮熟。電飯煲自動斷電后，繼續放置，在里面燜15分鐘。蓋著蓋子，再放置1小時。然后打開，輕輕用米飯勺盛出到小杯中，讓評味員品嘗。
評味員有24人。稻米的感官測試詳細如下品種“Nipponbare”作為樣品可口性評價的參考，分值為0，其他樣品與參考樣品比較得到自己的綜合可口性評價。第一口的味道的確非常好的樣品給+3；第一口味道較好的，盡管不夠明確的給+2；第一口不明確，但是第二口感覺有點好的給+1；第一口味道的確不好的給-3；第一口有點不好，雖然不很明確，給-2；第一口不明確，但是第二口感覺有點不好的給-1。對于每種樣品，所有評味員所給分值的平均值為各樣品的可口性評價值。表3給出樣品在電泳中條帶模式的結果和感官可口性評價的結果。
另外，表3的每種樣品PCR擴增所得DNA條帶模式中是否出現區別條帶的情況被二進制化。具體的，出現區別條帶的(+)為“1”，不出現的為“0”。
進一步用多重回歸分析所得數據，指示5組引物是否出現區別條帶的二進制化數據為解釋性變量，而1998年收獲并在此測試的11個稻品種的可口性評價數據為反應性變量。這樣得到下面的可口性估算等式(2)。由可口性估算等式推出的被測樣品的多重相關函數為0.87。
可口性估計值
＝0.777-0.359×B1-0.288×F6+0.135×G28+0.519×P5-0.215×T16 (2)
對1999年收獲的12個稻米品種“Koshihikari”，“Hitomebore”，“Hinohikari”，“Sasanishiki”，“Hoshinoyume”，“Kirara 397”，“Mutsuhomare”，“Asanohikari”，“Hatsushimo”，“Kinuhikari”，“Nipponbare”和“Tsukinohikari”調查可口性估算等式對感官檢查數據的兼容性如下通過上述感官檢查方法得到這12個1999年的稻米品種的可口性數值，然后與由可口性估算等式(2)預測的數值相比較。圖5是顯示實得的可口性數值和預測的可口性數值的相關性。
由上述顯而易見，這12個1999年的稻米品種的多重相關函數為0.85。這證實了本發明基于PCR的可口性估算等式適用于下一年收獲的未知稻米品種。
另外，以數字化的PCR數據為變量，這些稻米樣品也做了主成分分析。圖6展示對應于日本1999年收獲的前20個最好的稻米品種的數值圖，分別由1指示“Koshihikari”，2指示“Hitomebore”，3為“Hinohikari”，4為“Akitakomachi”，5為“Kirara397”，6為“Kinuhikari”，7為“Hoshinoyume”，8為“Haenuki”，9為“Mutsuhomare”，10為“Nipponbare”，11為“Sasanishiki”，12為“Tsugaruroman”，13為“Hanaechizen”，14為“Yumetsukushi”，15為“Hatsushimo”，16為“Aichinokaori”，17為“Tsukinohikari”，18為“Aichinokaori”，19為“Matsuribare”和20為“Akiho”。
圖6指示被分析的單個稻米樣品。這說明本發明基于PCR的多變量分析適用于以感官檢查為基礎的稻米品種分類。
表3-感官檢驗數據和PCR數據+PCR電泳中出現區別條帶-PCR后電泳中不出現區別條帶*未經感官測試
實施例3(以感官檢查所得數據作反應性變量，米飯基于PCR方法的可口性估算等式的實用性)
按照實施例1中的方法，測試11個收獲于1997年和1998年的稻米品種，“Koshihikari”，“Hitomebore”，“Hinohikari”，“Sasannishiki”，“Hoshinoyume”，“Kirara 397”，“Mutsuhomare”，“Asanohikari”，“Hatsushimo”，“Kinuhikari”和“Nipponbare”的一共22個樣品。簡而言之，感官測試米飯，并從每種米飯樣品中提取DNA，作模板進行PCR。
PCR反應使用5種不同類型的STS引物，B1，F6，G28，M11，和P5。PCR反應物成分混合混合0.2μl Taq多聚酶(Takara Bio Inc.生產，5u/μl)，2.5μl PCR緩沖液(12mM Tris-鹽酸，60mM KCl，pH8.3)，2.0μl MgCl2，1μl模板DNA(200ng/μl)和1μl dNTPs(100μM)。PCR的STS引物為每種0.2μl的B1F25(SEQ ID No.15)和B1R20(SEQID No.16)，每種0.4μl的F6F25(SEQ ID No.35)和F6R22(SEQ IDNo.36)；每種0.2μl的G28F17(SEQ ID No.47)和G28R28(SEQ IDNo.48)；每種0.2μl的M11F20(SEQ ID No.59和M11R20(SEQ IDNo.60)；每種0.2μl的P5F20(SEQ ID No.67)和P5R25(SEQ ID No.68)，將這些同PCR反應物混合，并用無菌水補足體積至25μl。PCR條件同實施例1。
用Mupid II(Cosmobio生產)電泳擴增的DNA。DNA在2％的瓊脂糖凝膠中電泳40分鐘，溴化乙錠染色并由紫外光照射來顯出條帶模式。
另一方面，按照實施例2的方式，對稻米樣品進行感官檢查，并數字化其可口性。表4給出電泳得到的樣品條帶模式的結果和感官評價數據的結果。
另外，每種樣品PCR擴增所得DNA條帶模式中是否出現區別條帶的情況被二進制化。具體的，出現區別條帶的(+)為“1”，不出現的(-)為“0”。
進一步用多重回歸分析加工所得數據，指示5組引物是否出現區別條帶(1或0)的二元數據為解釋性變量，而1998年收獲的11個被測稻米品種的可口性評價數據為反應性變量。由此得到下面的可口性估算等式(3)。由可口性估算等式(3)推算出的被測樣品的多重相關函數為0.80。
可口性估算
＝0.745-0.501×B1-0.2181×F6+0.1273×G28-0.1454×M11+0.6×P5 (3)
對1997年收獲的未知稻米樣品應用可口性估算等式(3)，得到其相關性函數0.80(圖7)。這可以證實本發明的可口性估算等式可適用于不同年份產出的稻米樣品。
表4-感官檢驗數據和PCR數據
+PCR電泳中出現區別條帶
-PCR后電泳中不出現區別條帶
*未經感官測試
實施例4(以米飯的物理數據作反應性變量，米飯基于PCR方法的可口性估算等式的實用性)
根據作為稻米可口性基礎的米飯物理數據，來調查本發明稻米可口性評價和估計的實用性。
按照實施例2的方式測試1998年收獲的12個品種，“Koshihikari”，“Hitomebore”，“Hinohikari”，“Sasanishiki”，“Hoshinoyume”，“Kirara 397”，“Mutsuhomare”，“Asanohikari”，“Hatsushimo”，“Kinuhikari”，“Nipponbare”和“Tsukinohikari”和1999年收獲的10個品種，“Koshihikari”，“Hitomebore”，“Sasanishiki”，“Hoshinoyume”，“Mutsuhomare”，“Asanohikari”，“Hatsushimo”，“Kinuhikari”，“Nipponbare”和“Tsukinohikari”的稻米。簡而言之，從每種精白米面粉樣品中提取DNA，然后用多種STS引物做PCR并電泳，來看擴增DNA中是否出現區別條帶。
除以下所用5種不同類型的STS引物以外，PCR方法同實施例2。本例中所用引物為每種0.1μl的B43F17(SEQ ID No.23)和B43R18(SEQID No.24)，每種0.3μl的G22F27(SEQ ID No.43)和G22R23(SEQ IDNo.44)；每種0.3μl的P5F20(SEQ ID No.67)和P5R25(SEQ ID No.68)；每種0.2μl的G4F18(SEQ ID No.39)和G4R24(SEQ ID No.40)；每種0.2μl的M2CGF16(SEQ ID No.55)和M2CGR15(SEQ ID No.56)。
用Mupid II(Cosmobio生產)電泳擴增的DNA。DNA在2％的瓊脂糖凝膠中電泳40分鐘，溴化乙錠染色并由紫外光照射來顯出條帶模式。
按如下方法測量米飯的物理性質將1og每種米飯樣品放在一個小杯中，加入16ml純水，令其吸水1小時。將5個盛米的小杯放入一個電飯煲(東芝RC-183)，杯外加75ml純水來煮米。電飯煲自動斷電以后，繼續燜15分鐘。然后，在25℃放置2小時。
使用拉伸壓縮檢測器，Tensipresser，Myboy(Takemoto Electric生產)，對每種的20粒米飯做低壓縮測試，壓縮其厚度的25％來測量粘在測試器表面的米飯粒的量(L3)。結果在表5中給出。
另外，每種樣品PCR擴增所得DNA條帶模式中是否出現區別條帶的情況被二進制化。具體地，出現區別條帶的(+)為“1”，不出現的(-)為“0”。
進一步用多重回歸分析加工所得數據，以指示5組引物是否出現區別條帶(1或0)的二進制化數據為解釋性變量，而以測得的1998年的稻米樣品的物理數據為反應性變量。由此得到下面的物理數據估算等式(可口性估算等式)(4)。由此物理數據估算等式得出的稻米樣品的多重相關性函數為0.99。
可口性估計值
＝1.093-0.0858×B43-0.197×G4+0.253×G22+0.0391×M2CG+0.100×P5 (4)
表5-米飯的物理數據和PCR數據
+PCR電泳中出現區別條帶
-PCR后電泳中不出現區別條帶
物理數據在低壓縮測試中，粘于檢測器Tensipresser表面的米飯粒數量L3
(mm)
-未測
對1999年中的次農事年稻米樣品應用由多重回歸分析得到的等式4，得出未知樣品的多重相關性函數為0.88。這就證實了基于DNA分析的物理數據估算等式可實用于稻米可口性評價。
實施例5(以不同國家的米飯物理數據作反應性變量，構建米飯基于PCR方法的可口性估算等式)
根據不同國家的米飯物理數據，來調查本發明稻米可口性評價和估計的應用性。米飯物理數據是稻米可口性的基礎。
以實施例2的方法測試收獲于不同國家的15個稻米品種日本的“Koshihikari”，韓國的“Ilpum”，中國的“Fujihikari”，意大利的“Erio”，印度的“Basmati”和“Bangana”，越南的“Tamsoan”和“C70”，尼日利亞的“Oryza glaberrima(CG-14)”和“WAB 450106”，澳大利亞的“Amaroo”和“Pelde”，泰國的“Khao Dawk Mali”和美國的“Nishiki”和“Bengal”。簡而言之，從每種精白米面粉樣品中提取DNA，然后用多種STS引物做PCR并電泳，來看擴增DNA中是否出現區別條帶。
使用8種不同類型的STS引物每種0.4μl的A6F21和A6R22(SEQID No.3和4)；每種0.6μl的E30F28和E30R24(SEQ ID No.31和32)，每種0.4μl的F6F25和F6R22(SEQ ID No.35和36)，每種0.5μl的G4F18和G4R24(SEQ ID No.39和40)，每種0.5μl的J6F18和J6R20(SEQ ID N0.51和52)，每種0.5μl的M2CGF16和M2CGR15(SEQ ID No.55和56)，每種0.5μl的S13F25和S13R24(SEQID No.75和76)，每種0.4μl的WK9F20和WK9R20(SEQ ID No.87和88)。PCR條件同實施例2。
用Mupid II(Cosmobio生產)電泳擴增的DNA。DNA在2％的瓊脂糖凝膠中電泳40分鐘，溴化乙錠染色并由紫外光照射來顯出條帶模式。
按如下方法測量米飯的物理性質將10g每種米飯樣品放在一個小杯中，加入16ml純水，令其吸水1小時。將5個盛米的小杯放入一個電飯煲(東芝RC-183)，杯外加75ml純水來煮米。電飯煲自動斷電以后，繼續燜15分鐘。然后，在25℃放置2小時。
用拉伸壓縮檢查器，Texturometer(Zenkensha生產)，檢測每種稻米樣品的3粒米飯，測量其硬度(H1)。一次測試中，一共檢測一種稻米樣品的5個3粒一組的樣品。
另外，每種樣品PCR擴增所得DNA條帶模式中是否出現區別條帶的情況被二進制化。具體的，出現區別條帶的(+)為“1”，不出現的(-)為“0”。
進一步用多重回歸分析加工所得數據，以指示8組引物是否出現區別條帶(1或0)的二進制化數據為解釋性變量，而以測得的稻米樣品的物理數據(H1)為反應性變量。由此得到下面的物理數據估算等式(可口性估算等式)(5)。圖9中，將由物理檢查實際得到的物理數據，也即被測稻米樣品的實得物理數據同由物理數據估算等式(5)得出的該樣品的預測物理數據進行了比較。圖9顯示了被測稻米樣品物理數據實得值與其預測值之間的相關性。由該物理數據估算等式得出的被測稻米樣品的多重相關性函數為0.93。
Y＝2.246+0.632×WK9+0.514×E30-0.703×A6+1.011×M2CG-0.578×S13+0.386×J6-0.044×G4+0.38×F6(5)
表6-米飯的物理數據和PCR數據
+PCR電泳中出現區別條帶
-PCR后電泳中不出現區別條帶
物理數據由Texturometer測得的米飯硬度(H1，kgf)
這些結果證實本發明用以STS引物做PCR時是否出現區別條帶的數字化數據為解釋性變量的多變量分析，預測不同類型米飯的物理性質的方法適用于世界上多個國家產出的不同品種的稻米。
實施例6(以不同國家的米飯物理數據作反應性變量，構建基于PCR方法的可口性估算等式)
根據不同國家的米飯物理數據，來調查本發明稻米可口性評價和估計的應用性。米飯物理數據是稻米可口性的基礎。
以實施例2的方法測試收獲于不同國家的11個稻米品種日本的“Koshihikari”，中國的“Fujihikari”，意大利的“Erio”，“Ceremio”，“Thaibonnet”和“Alborio”，尼日利亞的“Oryza glaberrima(CG-14)”，“WAB961”，“WITA7”，“Cisdane”和“WAB450106”。簡而言之，從每種精白米粉樣品中提取并純化DNA，然后用多種STS引物做PCR并電泳，來看擴增DNA中是否出現區別條帶。
使用7種不同類型的STS引物每種0.4μl的A6F21和A6R22(SEQID No.3和4)；每種0.4μl的B1F25和B1R20(SEQ ID No.11和12)；每種0.6μl的E30F28和E30R24(SEQ ID No.31和32)，每種0.4μl的F6F25和F6R22(SEQ ID No.35和36)，每種0.5μl的J6F18和J6R20(SEQ ID No.51和52)，每種0.5μl的S13F25和S13R24(SEQ IDNo.75和76)，每種0.4μl的WK9F20和WK9R20(SEQ ID No.87和88)。
用Mupid II(Cosmobio生產)電泳擴增的DNA。DNA在2％的瓊脂糖凝膠中電泳40分鐘，溴化乙錠染色并由紫外光照射來顯出條帶模式。
將10g每種米飯樣品放在一個小杯中，加入16ml純水，令其吸水1小時。將5個盛米的小杯放入一個電飯煲(東芝RC-183)，杯外加75ml純水來煮米。電飯煲自動斷電以后，繼續燜15分鐘。然后，在25℃放置2小時。
使用拉伸壓縮檢測器，Tensipresser，Myboy(Takemoto Electric生產)，對每種的20粒米飯樣品做低壓縮測試，壓縮其厚度的25％來測量粘在測試器表面的米飯粒的量(L3)。結果在表5中給出。
另外，每種樣品PCR擴增所得DNA條帶模式中是否出現區別條帶的情況被二進制化。具體的，出現區別條帶的(+)為“1”，不出現的(-)為“0”。
進一步用多重回歸分析處理所得數據，以指示7組引物是否出現區別條帶(1或0)的二進制化數據為解釋性變量，而以測得的稻米樣品的物理數據(L3)為反應性變量。由此得到下面的物理數據估算等式(可口性估算等式)(6)。圖10中，將由物理檢查實際得到的物理數據，也即被測稻米樣品的實得物理數據同由物理數據估算等式(5)得出的該樣品的預測物理數據進行了比較。圖10顯示稻米樣品的實得物理數據與預測值的相關性。由此物理數據估算等式得出的稻米樣品的多重相關性函數為0.98。
y＝2.294-0.789×WK9-0.73×E30-0.82×A6-1.84×B1+1.66×S13-0.845×J6+2.68×F6 (6)
表7-米飯的物理數據和PCR數據
+PCR電泳中出現區別條帶
-PCR后電泳中不出現區別條帶
物理數據粘于Tensipresser的米量(L3，mm)
這些結果證實本發明用以STS引物做PCR時是否出現區別條帶的數字化數據為解釋性變量的多變量分析，預測不同類型米飯的物理性質的方法適用于世界上多個國家產出的不同品種的稻米。
實施例7(以RAPD方法評價精白米可口性)
取稻米樣品“Koshihikari”，“Hitomebore”，“Akitakomachi”，“Sasanishiki”，“Nipponbare”“Hinohikari”，“Kirara 397”，“Mutsuhomare”，“Kinuhikari”，“Asanohikari”，和“Haenuki”，以實施例1的方法，分別磨成精白米面粉。按照與實施例1相同的方式用CTAB法從6g每個稻米粉樣品中提取基因組DNA。
具體地，將6ml，70℃的2％的CTAB溶液(0.1M Tris-鹽酸，2mM EDTA，1.4M NaCl，pH8.0)加入樣品并攪拌，放入55℃培養箱，并再加入6ml相同的CTAB溶液(1％)。以此條件，抽提基因組DNA30分鐘。
然后，向DNA抽提物中加入氯仿/異戊醇(24/1)，攪拌并離心。向離心所得上清加入DNA沉淀劑(1％CTAB溶液，20mMTris-鹽酸，10mM EDTA，pH8.0)，放置于4℃過夜以沉淀DNA。之后，離心，得到DNA沉淀，再用1M的NaCl抽提。用異丙醇或乙醇清洗DNA提取物，再以普通方式收集沉淀。
然后溶解于200μl TE緩沖液(10mM Tris-鹽酸，1mM EDTA，pH8.0)制得DNA樣品溶液。
用這樣提取的DNA模板做以4種隨機引物OPB1，OPB18，OPM11和OPT16(都由Operon生產)做PCR。PCR反應物的配制混合0.2μlTaq多聚酶(Takara Bio Inc.生產，5u/μl)，2.5μl PCR緩沖液(12mMTris-鹽酸，60mM KCl，pH8.3)，2.0μl MgCl2，1μl模板DNA(200ng/μl)和1μl dNTPs(100μM)。再加每種0.2μl的隨機引物，混勻，并以無菌水補足體積至25.0μl。
反應器是PCR Thermal Cycler(熱循環儀)MP(Takara Bio Inc.生產)。在反應器中，模板DNA經歷35個PCR循環。每個PCR循環包括94℃變性1分鐘，36℃退火1分鐘和72℃鏈延伸2分鐘。
每種樣品PCR擴增所得DNA條帶模式中是否出現區別條帶的情況被二進制化。具體的，出現區別條帶的(+)為“1”，不出現的(-)為“0”。
進一步用多重回歸分析處理所得數據，以指示4種引物是否出現區別條帶(1或0)的二進制化數據為解釋性變量，而以感官檢查評價的可口性數據(表2)為反應性變量。由此得到下面的物理數據估算等式(可口性估算等式)(7)。由此物理數據估算等式得出的稻米樣品的多重相關性函數為0.89。
y＝5.71+1.04×OPB18-1.17×OPB1+2.29×OPM11+1.17×OPT16 (7)
實施例8(從半粒未精碾稻米中選擇可口稻米)
混合5粒可口稻米“Koshihikari”和5粒抗病非可口稻米“Tsukinohikari”，一共10粒。用刀將每粒米切成兩半，一半含有胚，另一半不含。
在研缽中將不含胚的一半米粒磨碎，并以與實施例2相同的方式，用CTAB法處理來提取DNA。不過在此，實驗的規模是實施例2中的1/500。將這樣得到的DNA作模板進行PCR反應。
PCR反應物的制備混合0.2μl Taq多聚酶(Takara Bio Inc.生產，5u/μl)，2.5μl PCR緩沖液(12mM Tris-鹽酸，60mM KCl，pH8.3)，2.0μl MgCl2，1μl模板DNA(200ng/μl)和1μl dNTPs(100Mm)。PCR所用STS引物為每種0.4μl的A6R21和A6R22(SEQ ID No.3和4)，每種0.5μl的A7F22和A7R17(SEQ ID No.15和16)，每種0.6μl的M11F20和M11R20(SEQ ID No.59和60)，每種0.5μl的S13F25和S13F24(SEQ ID No.75和76)，每種0.4μl的T16F24和T16R26(SEQ IDNo.83和84)，每種0.4μl的J6F18和J6R20(SEQ ID No.51和52)，每種0.4μl的WK9F20和WK9R20(SEQ ID No.87和88)。這些引物同PCR反應物混合，并用無菌水補足總體積至25.0μl。
反應器是PCR Thermal Cycler(熱循環儀)MP(Takara Bio Inc.生產)。在反應器中，模板DNA經歷35個PCR循環。每個PCR循環包括94℃變性1分鐘，62℃退火1分鐘和72℃鏈延伸2分鐘。
用Mupid II(Cosmobio生產)電泳擴增的DNA。DNA在2％的瓊脂糖凝膠中電泳40分鐘，溴化乙錠染色并由紫外光照射來顯出條帶模式。表8給出所得結果。
以同實施例1相同的方式，根據《稻米可口性分級》(2001，由日本谷類調查協會發表)的方法和《稻米品種百科全書2》(1999，稻米數據庫發表)的方法將每種樣品的可口性數字化。簡單的說，將這些方法得到的數字化數據加和，每種被測樣品的數據總和就指示它的可口性。而且，表8中每種樣品PCR擴增的DNA條帶模式中是否出現區別條帶的情況被二進制化，同實施例1。
以表8的數據為基礎，對被測樣品應用可口性估算等式(1)，算出每種樣品的可口性估算值。依據這些估算的可口性數值將樣品分為兩組，A組分值高而B組分值低。
如此分成兩組后，每組包含5粒含有胚(生殖細胞)的半粒稻米。用1％的次氯酸鈉溶液將樣品表面消毒，然后將其放入成分如下的培養基中，在30℃7天發芽。將發芽的半粒稻米轉移到人工氣候室，BiotronNC350(Nippon Medical Instruments Manufacturing生產)，在那里于28℃以光照10小時，暗14小時的循環培養，使其長成綠色小苗。
接著，將小苗移種到含有相同培養基的農用小盆中生長7天，然后移植到育苗混合肥料中，繼續在人工氣候室，TGH-6(Tabai Espec生產)生長約2周。這樣長好后，將苗轉移到填有盆栽混合肥料的瓦格納盆中，在人工氣候室培養約4個月，讓苗在那里抽穗。
培養基成分(1升，pH5.8)
瓊脂糖 8.000g
硫酸銨 0.463g
硝酸鉀 2.830g
氯化鈣 0.166g
硫酸鎂 0.185g
磷酸二氫鉀 0.400g
硫酸鐵0.278g
EDTA二鈉 0.373g
煙酸 0.250mg
維生素B6 0.250mg
維生素B1 0.500mg
氨基乙酸 1.000mg
這些稻植株在人工氣候室繼續培養約40天，稻穗成熟。然后，收割成熟的稻穗，打谷，去殼。精碾去殼稻米并將其磨成粉，由此以實施例2的方式用CTAB法提取DNA。以上述相同方式做PCR。
A組擴增的DNA出現和“Koshihikari”相同的區別條帶，而B組擴增的DNA出現與“Tsukinohikari”相同的區別條帶。煮熟后，被這樣鑒定為“Koshihikari”的稻米樣品味道好，而那些被鑒定為“Tsukinohikari”的味道不好。
上述方法證實本發明可以通過從未精碾稻米不含胚(胚芽)的半粒提取DNA，以STS引物對模板DNA做PCR來估計稻米的可口性，然后將剩下的半粒含有胚(胚芽)的稻米萌發來選擇可口稻米。
表8-以PCR鑒定“Koshihikari”和“Tsukinohikari”
表8-通過PCR鑒定“Kishihikari”和“Tsukinohikari”+PCR電泳中出現區別條帶-PCR后電泳中不出現區別條帶實施例9(通過半粒未精碾稻米的雜交育種和PCR選擇可口稻米)母本，可口稻米品種“Koshihikari”與父本，抗病、非可口稻米品種“Tsukinohikari”雜交。簡單來說，以常規方式通過溫水浸泡將“Koshihikari”的稻粒去雄，并且用“Tsukinohikari”授粉。這樣雜交后，播種稻粒，產出F1種子。不去殼，將F1種子播種在填有育苗肥的瓦格納盆中，在人工氣候室，TGH-6(Tabai Espec生產)中培養，通過自花授粉，產出F2種子。
將F2種子去殼。將得到的每種少量稻粒切成含有胚(胚芽)和不含胚(胚芽)的兩半。在研缽中將不含胚的一半米粒磨碎，并以與實施例2相同的方式，用CTAB法處理來提取DNA。不過在此，實驗的規模是實施例2中的1/500。將這樣得到的DNA用STS引物進行PCR反應來擴增模板DNA。PCR條件同實施例7。
將樣品經PCR得到的區別條帶模式代入實施例1的可口性估算等式(1)，算出樣品的可口性估算值。通過這樣分析，將樣品分成兩組，一組由可口性估算值最大為5的樣品構成，另一組由可口性估算值最小為8的樣品構成。對應這兩個組，將含有胚芽的半粒萌發并栽種，并使其抽穗，待稻穗成熟后收割，打谷，去殼，同實施例7。用實驗室稻米磨精碾去殼稻米，并用電飯煲(東芝RT-183)煮熟，之后，對米飯進行感官檢查，同實施例2。
感官檢查證實可口性估算值最高為5的一組不可口，而可口性估算值最低為8的一種是可口的。
上述方法證實本發明可以通過將每個未去殼或未精碾雜交稻種子顆粒一切兩半，從不含胚的半粒提取DNA，以STS引物對模板DNA做PCR來估計稻米的可口性，然后將剩下的半粒含有胚的稻米萌發來選擇可口稻米。
序列表<110>National Food Research Institute<120>DNA水平稻米可口性評價方法，和通過對半粒未去殼/未精碾稻米的分析來選擇可口稻米的方法<130>P131218K<160>92<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>1ccagctgaac gcctgtacta caagaattaa 30<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>2ccagctgtac gtcttcccca gcgccggcgg 30<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3ccagctgtac gcctgtacta c 21<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4ccagctgtac gtcttcccca gc 22<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>5tgcctcgcac cagaaatagt ataatcccaa 30<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>6tgcctcgcac catgaggtgt ggccgagtac 30<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>7tgcctcgcac cagaaatag 19<210>8<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>8tgcctcgcac catgag 16<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>9gtttcgctcc tacagtaatt aaggggctat 30<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>10gtttcgctcc catgcaatct gcaaaagttt 30<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>11gtttcgctcc tacagtaatt aaggg 25<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>12gtttcgctcc catgcaatct 20<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>13caggtgtggg ttacaaggat 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1.一種DNA水平的選擇可口稻米的稻米可口性評價方法，包括在STS引物或隨機引物存在下經PCR擴增提取自稻植物、未去殼稻粒、未精碾稻米、精白米、米飯、米制糕點或者其研碎末的DNA，然后從所得擴增的DNA條帶中選擇與可口性評價密切相關的DNA條帶，和將其用作可口性評價的DNA標記來選擇可口的稻米。
2.權利要求1的方法，其中從中提取DNA的稻米樣品是不含胚的半粒未去殼或未精碾稻米，并且用PCR反應所得DNA標記選出可口稻米之后，使另一半含有胚的稻米粒萌發并長成稻植株，由此選擇性的培育所選出的可口稻米品種。
3.權利要求1或2的方法，其中使用STS引物通過RAPD方法實施所述PCR，并使用與感官檢驗和/或物理化學檢驗中的可口性評價密切正和/或負相關的DNA條帶作為可口性評價的DNA標記來選擇可口稻米。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中選擇性地使用與感官檢驗和/或物理化學檢驗中的可口性評價密切正和/或負相關的DNA標記，以樣品中存在該標記與否為基礎來選擇可口稻米。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中通過測量米飯性質實現物理化學檢驗中的稻米可口性評價。
6.權利要求1-4中任一項的方法，其中用10到30mer的，制備自DNA序列SEQ ID No.1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81、82、85、和86的STS引物來實施PCR。
7.權利要求1-4中任一項的方法，其中在PCR中使用一個或多個選自下列引物組的STS引物A6，A7，B1，B7，B18，B43，E22，E30，F6，G4，G22，G28，J6，M2CG，M11，P3，P5，Q16，S13，T8，T16和WK9。
8.權利要求1或2的方法，其中在PCR中使用一個或多個選自下列引物組的隨機引物OPA6，OPB1，OPB18，OPE22，OPF6，OPG4，OPG28，OPM11，OPP3，OPP5，OPQ16和OPT16。
全文摘要
提供一種DNA水平的，以很少量，尤其是一粒或半粒稻米做樣品的稻米可口性評價方法。不破壞作為下一代稻植株發育起點的稻粒胚來評價稻米可口性并篩選可口稻米。該方法包括用STS引物或隨機引物PCR擴增提取自稻植株、未去殼稻米、未精碾稻米、精白米、米飯、米制糕點或者其研碎粉末的DNA，然后在擴增的DNA條帶中選擇與可口性評價密切相關的DNA條帶，將它用作可口性評價的DNA標記來篩選可口的稻米。
文檔編號C12N15/09GK1407117SQ0214166
公開日2003年4月2日 申請日期2002年9月10日 優先權日2001年9月10日
發明者大坪研一, 岡留博司, 中村澄子, 原口和朋, 與座宏一, 奧西智哉, 鈴木啟太郎 申請人:獨立行政法人食品綜合研究所, 生物系特定產業技術研究推進機構