糖核苷酸類及復合糖類的制備方法

專利名稱：糖核苷酸類及復合糖類的制備方法
技術領域：
本發明涉及在細菌和病毒等的感染防御，心血管疾病和免疫治療等中有用的復合糖類的制備方法以及作為該復合糖類重要的合成底物的糖核苷酸的制備方法。
背景技術：
已知的糖核苷酸的制備方法有1)化學合成法[糖的化學和生物化學進展.，28，307(1973)，日本化學聯合會通報，46，3275(1973)，有機化學雜志.，57，146(1992)，糖類研究.，242，69(1993)；2)利用酶的制備方法[組織化學雜志.，55，1834(1990)，有機化學雜志.，57，152(1992)，美國化學聯合會雜志.，110，7159(1988)，特表平7-508413，特表平7-500248，WO96/27670]；3)利用酵母等微生物菌體的方法(特公昭45-2073，特公昭46-40756，特公昭47-1837，特公昭47-26703，特公昭49-8278，特開平2-268692)；4)從耐鹽性酵母等微生物回收的方法(特開平)。
對1)的方法來說，需要昂貴的核苷-5’-一磷酸(下文簡稱為NMP)的嗎啉酸(morpholidate)衍生物，糖磷酸等；對2)的方法來說需要昂貴的核苷-5’-二磷酸(下文簡稱為NDP)，核苷-5’-三磷酸(下文簡稱為NTP)，磷酸烯醇式丙酮酸，糖磷酸，丙酮酸激酶等原料；對3)的方法來說，需要對菌體的干燥處理。在4)的方法中有上述任一項方法中的核苷酸，糖磷酸原料昂貴，大規模生產困難等問題，因此，至今尚未建立糖核苷酸的大規模工業制備方法。
復合糖類的制備方法已知有1)化學合成法[酶學方法.，247，193(1994)；Ang.Chem.Int.Ed.Engl.，21，155(1982)；糖類研究.，211，cl(1991)]；2)使用水解酶的方法[分析生物化學.，202，215(1992)；生物技術動態.，6，256(1988)]；3)使用糖基轉移酶的方法(特開平7-79792，特表平7-500248，特公平5-82200，WO94/25614，特表平9-503905，美國專利5,583,042)。
在1)的方法中為了進行立體選擇的合成，必須導入保護基；2)的方法中收率和選擇性都不足夠；3)的方法需要NDP，NTP，磷酸烯醇式丙酮酸，糖磷酸或糖核苷酸等高價原料，還需要丙酮酸激酶等多種酶，使用上述的任一個方法都不能建立復合糖類的廉價的工業制備方法。而且，尚未知到利用廉價的核苷酸前體物質，糖，復合糖類前體物質直接進行復合糖類工業生產的方法。
據報道，可以通過添加乳清酸在棒桿菌屬的微生物中生產UMP[氨基酸，核酸，23，107(1991)]。另外，還知到用乳清酸作為原料生成胞苷二磷酸膽堿的方法(特開平5-276974)。
發明公開本發明的目的在于提供在細菌和病毒等的感染防御，心血管疾病和免疫治療等中有用的復合糖類的廉價且高效的制備方法以及作為該復合糖類重要的合成底物的糖核苷酸的廉價且高效的制備方法。
本發明人對利用微生物，以核苷酸作為前體物質生產復合糖類和糖核苷酸進行了廣泛研究，結果是可以高效地以核苷酸的前體物質和糖類作為原料的糖核苷酸的生產效率得到提高；與糖核苷酸相關的基因的表達得到增強，其生產性得以提高；而且發現可以利用能產生該糖核苷酸的微生物和能從糖核苷酸以及復合糖類前體物質產生復合糖類的微生物或動物細胞或昆蟲細胞，以核苷酸的前體物質和復合糖類的前體物質作為原料，從而高效的生產復合糖類；從而完成了本發明。
本發明提供了復合糖類的制備方法，其特征在于以下述物質作為酶源a)能從核苷酸前體物質產生NTP的微生物的培養液或該培養液的處理物，b)能從糖和NTP產生糖核苷酸的微生物的培養液或該培養液的處理物，以及c)能從糖核苷酸和復合糖類的前體物質產生復合糖類的微生物，動物細胞或昆蟲細胞的培養液或該培養液的處理物，使這些酶源，核苷酸前體物質，糖和復合糖類前體物質存在于水溶性介質中，使復合糖類在水溶性介質中生成和積累并從該水溶性介質中回收復合糖類；本發明提供了糖核苷酸的制備方法，其特征在于以下述物質作為酶源a)能從核苷酸前體物質產生NTP的微生物的培養液或該培養液的處理物，b)能從糖和NTP產生糖核苷酸的微生物的培養液或該培養液的處理物，使這些酶源，核苷酸前體物質，糖存在于水溶性介質中，使糖核苷醇在水溶性介質中生成和積累并從該水溶性介質中回收糖核苷酸；以及復合糖類的制備方法，其特征在于以能從糖核苷酸和復合糖類前體產生復合糖類的微生物、動物細胞和昆蟲細胞的培養液或該培養液的處理物作為酶源，使該酶源、復合糖類前體物質以及在上述的糖核苷酸的制備方法中得到的糖核苷酸存在于水溶性介質中，使復合糖類在水溶性介質中生成并積累；并從該水溶性介質中回收回收糖類。另外還提供了N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸的制備方法，其特征在于以有強的半乳糖激酶的微生物的培養液或該培養液的處理物作為酶源；使該酶源和N-乙酰基葡糖胺存在于水溶性介質中，使N-乙酰基葡糖胺-1磷酸在水溶性中產生和積累，并從該水溶性介質中回收該N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸。
附圖簡述

圖1示表達質粒pPA31和pPAC31的構建工序。
圖2示galU，ppa基因表達質粒pNT12和pNT32的構建工序。
圖3示galT，galK基因的表達質粒pNT25的構建工序。
圖4示在產氨棒桿菌中表達galT和galK基因的質粒pTK7的構建工序。
圖5示glmU，ppa基因的表達質粒pNT14的構建工序。
圖6示pgm基因的表達質粒pNT24的構建工序。
圖7示glmM基因的表達質粒pNT44的構建工序。
圖8示glk基因的表達質粒pNT46的構建工序。
圖9示pfkB基因的表達質粒pNT47的構建工序。
圖10示galK基因的表達質粒pNT54的構建工序。
圖11示manB、manC基因的表達質粒pNK7的構建工序。
圖12示pgm、pfkB基因的表達質粒pNT55的構建工序。
圖13示gmd，wcaG基因的表達質粒pNK8的構建工序。
圖14示neuA基因的表達質粒pTA14的構建工序。
圖15示lgtC基因的表達質粒pGT3的構建工序。
圖16示lgtB基因的表達質粒pNT60的構建工序。
表1-(1)和表1-(2)示在本發明中所用的縮寫及其說明。
表1-(1)

表1-(2)

根據本發明提供了新的糖核苷酸的制備方法和利用該糖核苷酸的制備方法的新的復合糖類的制備方法，其特征在于1)不需要NTP和糖磷酸等昂貴的原料，只需要乳清酸等廉價的核苷酸前體物質和糖類作為原料，2)在將NMP或NDP轉化為NTP時，不再需要添加磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸激酶等昂貴的物質，而且3)不需要酶的分離步驟。
對在本發明的方法中制備的糖核苷酸，可以例舉出，有在核苷-5’-二磷酸殘基的末端磷酸基團和糖殘基的還原基團之間以酯鍵結合的通式的化合物，還有核苷酸殘基是胞苷-5’-一磷酸類，糖殘基是多元醇的情況也包含在本發明的糖核苷酸中。
對在本發明的方法中所制備的復合糖類來說，可以例舉出與糖類結合的單糖，寡糖，與載體連接的單糖和寡糖，蛋白質，肽，脂類，糖蛋白質，糖脂類，糖肽或甾類化合物的化合物。
下面將詳細地描述本發明。
1)對于在本發明中所用的能從核苷酸前體物質產生NTP的微生物來說，可以使用任一種能從核苷酸前體物質產生NTP的微生物，例如，埃希氏菌屬或棒桿菌屬的微生物。
埃希氏菌屬的微生物可以例舉出大腸埃希氏菌等。
棒桿菌屬的微生物可以例舉出產氨棒桿菌等。
2)對在本發明中所用的能從糖和NTP產生糖核苷酸的微生物來說，可以使用任一種有產生目的糖核苷酸活性的生物，例如，優選使用涉及2)-①UDP-Glc的生產的以下述式1所示的其中(1)到(4)的酶活性強的微生物。
具體地說，可以例舉出埃希氏菌屬的微生物或棒桿菌屬的微生物，優選的具體的例子有大腸埃希氏菌或產氨棒桿菌。
另外，可以使用其中選自(1)，(2)，(3)和(4)中至少之一的酶已由基因重組技術增強的轉化株。該轉化株的具體例子有來自大腸埃希氏菌的代有含galU和ppa基因的重組DNA(pNT12)的大腸埃希氏菌KY8415(FERMBP-408)株。

(式1)
(1)己糖激酶(EC 2.7.1.1)或葡糖激酶(EC 2.7.1.2)(2)磷酸葡糖變位酶(EC 2.7.5.1)(3)葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基轉移酶(EC 2.7.7.9)(4)(無機的)焦磷酸酶(EC 3.6.1.1)在2)-②UDP-Gal的生產中，優選使用在下面通式2中所式的(5)和(6)的酶活性強的微生物，或者優選使用通式1中所示(1)到(4)的酶活性強的微生物。
具體地說，可以例舉出埃希氏菌屬的微生物或棒桿菌屬的微生物，優選的具體的例子有大腸埃希氏菌和產氨棒桿菌。
另外，可以使用其中酶活性由基因工程技術增強了的轉化株，其中酶有選自(5)和(6)的至少一種酶，或者選自(5)和(6)至少一種酶和選自(1)到(4)的至少一種酶。該轉化株的具體實例有來自大腸埃希氏菌的帶有含galT和galK基因的重組DNA(pNT25)的大腸埃希氏菌NM522株以及來自大腸埃希氏菌的帶有含有galT和galK基因的重組DNA的轉化株產氨棒桿菌ATCC21170。

(式2)(5)半乳糖激酶(EC 2.7.1.6)(6)半乳糖-1-磷酸尿苷酰基轉移酶(EC 2.7.7.12)在2)-③UDP-Gal的生產中，優選使用在下面通式3中所式的(7)到(12)和通式1中所示(4)的酶活性強的微生物，或者優選使用通式3中所示(13)和(10)的酶活性強的微生物。
具體地說，可以例舉出埃希氏菌屬的微生物或棒桿菌屬的微生物，優選的具體的例子有大腸埃希氏菌或產氨棒桿菌。
另外，可以使用其中選自(4)，(7)，(8)，(9)，(10)和(13)中至少之一的酶已由基因重組技術增強的轉化株。該轉化株的具體例子有來自大腸埃希氏菌的代有含glmM基因的重組DNA(pNT44)的大腸埃希氏菌NM522株，有來自大腸埃希氏菌的代有含glmU和ppa基因的重組DNA(pNT14)的大腸埃希氏菌KY8415株，有來自大腸埃希氏菌的代有含glk基因的重組DNA(pNT46)的大腸埃希氏菌NM522株，有來自大腸埃希氏菌的代有含galK基因的重組DNA(pNT54)的大腸埃希氏菌NM522株。
盡管對于(8)的磷酸葡糖胺變位酶活性的表達和增強來說，必須添加Glc-1，6-P2[生物化學雜志.，271，32(1996)]，但可以不添加Glc-1，6-P2而通過使用其中(11)和(12)的酶活性已由基因重組技術增強的轉化株而從G-6-P和F-6-P提供Glc-1，6-P2。
該轉化株的具體例子有來自大腸埃希氏菌的代有含pgm基因的重組DNA(pNT24)的大腸埃希氏菌NM522株，有來自大腸埃希氏菌的代有含pfkB基因的重組DNA(pNT47)的大腸埃希氏菌NM522株，有來自大腸埃希氏菌的代有含pgm和pfkB基因的重組DNA(pNT55)的大腸埃希氏菌NM522株。
利用(11)和(12)的酶活性從G-6-P和F-6-P提供Glc-1，6-P2從而使(8)的磷酸葡糖胺變位酶的表達活性增強的方法是本發明首次公開的。
利用(13)的半乳糖激酶(EC 2.7.1.6)從GlcNAc制備GlcNAa-1，6-P2的方法是本發明首次公開的。可用該方法制備GlcNAc-1-P。即，可用半乳糖激酶強的微生物，例如帶有含編碼galK的基因的DNA片段和載體的重組DNA的微生物的培養液或該培養液的處理物作為酶源，使該酶源和GlcNAc存在于水溶性介質中，使GlcNAc-1-P在水溶性介質中生成和積累并從水溶性介質中回收GlcNAc-1-P。
在水溶性介質中回收GlcNAc-1-P，可以使用活性炭和離子交換樹脂等常用的的方法。

(式3)(7)己糖激酶(EC 2.7.1.1)或葡糖激酶(EC 2.7.1.2)(8)磷酸葡糖胺變位酶(9)葡糖胺-1-磷酸乙酰基變位酶(10)N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸尿苷酰基轉移酶(EC 2.7.7.23)
(11)磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.11)(12)磷酸葡糖變位酶(EC 2.7.5.1)(13)半乳糖激酶(EC 2.7.1.6)在2)-④UDP-GalNAc的生產中，優選使用在下面通式3中所示的(7)到(12)和通式4所示的(14)以及通式1中所示的(4)的酶活性強的微生物，或者優選使用通式3中所示(13)和(10)，或者通式4中所示的(14)的酶活性強的微生物。
具體地說，可以例舉出埃希氏菌屬的微生物和棒桿菌屬的微生物，優選的具體的例子有大腸埃希氏菌或產氨棒桿菌。
另外，可以使用其中選自(7)到(14)和(4)中至少之一的酶已由基因重組技術增強的轉化株。

(式4)(14)UDP-GlcNAc 4-差向異構酶(EC 5.1.3.7)在2)-⑤UDP-GlcUA的生產中，優選使用在下面通式1中所式的(1)到(4)和通式5所示的(15)的酶活性強的微生物。
具體地說，可以例舉出埃希氏菌屬的微生物或棒桿菌屬的微生物，優選的具體的例子有大腸埃希氏菌或產氨棒桿菌。
另外，可以使用其中選自(1)，(2)，(3)，(4)和(15)中至少之一的酶活性已由基因重組技術增強的轉化株。

(式5)(15)UDP-Glc脫氫酶(EC 1.1.1.22)在2)-⑥GDP-Man的生產中，優選使用在下面通式6中所示的(16)到(18)和通式3所示的(11)和(12)的酶活性強的微生物。
具體地說，可以例舉出埃希氏菌屬的微生物或棒桿菌屬的微生物，優選的具體的例子有大腸埃希氏菌或產氨棒桿菌。
另外，可以使用其中選自(16)，(17)和(18)的酶活性已由基因重組技術增強的轉化株。該轉化株的具體例子有來自大腸埃希氏菌的代有含ManB和ManC基因的重組DNA(pNK7)的大腸埃希氏菌NM522株，有來自大腸埃希氏菌的代有含glk基因的重組DNA(pNT46)的大腸埃希氏菌NM522株菌。
盡管對于(17)的磷酸甘露糖變位酶活性的表達和增強來說，必須添加Glc-1，6-P2，但可以不添加Glc-1，6-P2而通過使用其中(11)和(12)的酶活性已由基因重組技術增強的轉化株而從G-6-P和F-6-P提供Glc-1，6-P2。該轉化株的具體例子有來自大腸埃希氏菌的代有含pgm基因的重組DNA(pNT24)的大腸埃希氏菌NM522株，有來自大腸埃希氏菌的代有含pfkB基因的重組DNA(pNT47)的大腸埃希氏菌NM522株，有來自大腸埃希氏菌的代有含pgm和pfkB基因的重組DNA(pNT55)的大腸埃希氏菌NM522株等。
利用(11)和(12)的酶活性從G-6-P和F-6-P提供Glc-1，6-P2從而使(17)的磷酸甘露糖變位酶的表達活性增強的方法是本發明首次公開的。

(式6)(16)己糖激酶(EC 2.7.1.1.)或葡糖激酶(EC 2.7.1.2)(17)磷酸甘露糖變位酶(EC 2.7.5.7)(18)甘露糖-1-磷酸鳥苷酰基轉移酶(EC 2.7.7.13)在2)-⑦GDP-Fuc的生產中，優選使用在下面通式7中所示的(19)和(20)和通式6所示的(16)到(18)以及通式3中所示的(11)和(12)的酶活性強的微生物。
具體地說，可以例舉出埃希氏菌屬的微生物或棒桿菌屬的微生物，優選的具體的例子有大腸埃希氏菌或產氨棒桿菌。
另外，可以使用其中選自(16)，(17)，(18)，(19)和(20)中至少之一的酶活性已由基因重組技術增強的轉化株。該轉化株的具體例子有來自大腸埃希氏菌的代有含ManB和ManC基因的重組DNA(pNK7)的大腸埃希氏菌NM522株，自大腸埃希氏菌的代有含gmd和wcaG基因的重組DNA(pNK8)的大腸埃希氏菌NM522株，有來自大腸埃希氏菌的代有含glk基因的重組DNA(pNT46)的大腸埃希氏菌NM522株等。
盡管對于(17)的磷酸甘露糖變位酶活性的表達和增強來說，必須添加Glc-1，6-P2，但可以不添加Glc-1，6-P2而通過使用其中(11)和(12)的酶活性已由基因重組技術增強的轉化株而從G-6-P和F-6-P提供Glc-1，6-P2。
該轉化株的具體例子有來自大腸埃希氏菌的代有含pgm基因的重組DNA(pNT24)的大腸埃希氏菌NM522株，有來自大腸埃希氏菌的代有含pfkB基因的重組DNA(pNT47)的大腸埃希氏菌NM522株，有來自大腸埃希氏菌的代有含pgm和pfkB基因的重組DNA(pNT55)的大腸埃希氏菌NM522株等。

(式7)(19)GDP-Man-4，6-脫水酶(EC 4.2.1.47)(20)GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖差向異構酶/還原酶在2)-⑧CMP-NeuNAc的生產中，優選使用在下面通式8中所示的(21)，(22)或(23)，(24)和(25)的酶活性強的微生物。
具體地說，可以例舉出埃希氏菌屬的微生物或棒桿菌屬的微生物，優選的具體的例子有大腸埃希氏菌或產氨棒桿另外，可以使用其中選自(21)，(22)，(23)，(24)和(25)中至少之一的酶活性已由基因重組技術增強的轉化株。該轉化株的具體例子有來自大腸埃希氏菌的代有含nanA基因的重組DNA(pNAL1)的大腸埃希氏菌C600株[應用和環境微生物學.，51，562，(1986)]，來自大腸埃希氏菌的代有含neuA基因的重組DNA(pTA14)的大腸埃希氏菌NM522株等。

(式8)(21)GlcNAc 2-差向異構酶(EC 5.1.3.8)(22)NeuAc醛縮酶(EC 4.1.3.3)(23)NeuAc合成酶(EC 4.1.3.19)(24)CMP-NeuAc合成酶(EC 2.7.7.43)(25)CTP合成酶(EC 6.3.4.2)當微生物通式具有1)的微生物的性質和2)的微生物的性質時，可以利用該微生物，從核苷酸的前體物質和糖產生糖核苷酸。
當微生物同時具有1)所述的微生物的性質和2)-①中所述的微生物的性質時，即可利用該微生物，從乳清酸等UTP的前體物質和葡萄糖生產UDP-Glc；當微生物同時具有1)所述的微生物的性質和2)-②中所述的微生物的性質時，即可利用該微生物，從乳清酸等UTP的前體物質和半乳糖生產UDP-Gal；當微生物同時具有1)所述的微生物的性質和2)-③中所述的微生物的性質時，即可利用該微生物，從乳清酸等UTP的前體物質和葡糖胺和N-乙酰葡糖胺生產UDP-GlcNAc；當微生物同時具有1)所述的微生物的性質和2)-④中所述的微生物的性質時，即可利用該微生物，從乳清酸等UTP的前體物質和葡糖胺和N-乙酰葡糖胺生產UDP-GalNAc；當微生物同時具有1)所述的微生物的性質和2)-⑤中所述的微生物的性質時，即可利用該微生物，從乳清酸等UTP的前體物質和葡萄糖生產UDP-GlcUA；當微生物同時具有1)所述的微生物的性質和2)-⑥中所述的微生物的性質時，即可利用該微生物，從GMP等GTP的前體物質和甘露糖生產GDP-Man；當微生物同時具有1)所述的微生物的性質和2)-⑦中所述的微生物的性質時，即可利用該微生物，從GMP等GTP的前體物質和甘露糖生產GDP-Fuc；當微生物同時具有1)所述的微生物的性質和2)-⑧中所述的微生物的性質時，即可利用該微生物，從乳清酸等CTP的前體物質和N-乙酰葡糖胺以及N-乙酰甘露糖胺生產CMP-NeuAc。
這些微生物的具體例子有來自大腸埃希氏菌的能表達galT和galK基因的產氨棒桿菌。
與上述菌株情況不一樣的情況是，當一個菌株僅具有生產糖核苷醇所需的部分活性時，可通過對具有各自活性的微生物的任意組合來生產糖核苷醇。
1)中所述的性質不必要僅由一種微生物所具有，可以利用構成1)的性質的兩種以上的微生物。具體地說，有能表達來自大腸埃希氏菌的pyrG基因的大腸埃希氏菌和產氨棒桿菌的組合(特開平5-276974)。
同樣地，2)中的性質也沒有必要僅有一種微生物所具有，其性質可以由兩種以上的微生物所具有。通過對這些微生物群體的任意組合，可以產生各種目的糖核苷酸。
例如，當微生物同時具有1)所述的微生物的性質和2)-①中所述的微生物的性質時，即可利用該微生物，可從乳清酸等UTP的前體物質和葡萄糖生產UDP-Glc；當微生物同時具有1)所述的微生物的性質和2)-②中所述的微生物的性質時，即可利用該微生物，從乳清酸等UTP的前體物質和半乳糖生產UDP-Gal；當微生物同時具有1)所述的微生物的性質和2)-③中所述的微生物的性質時，即可利用該微生物，從乳清酸等UTP的前體物質和葡糖胺或N-乙酰葡糖胺生產UDP-GlcNAc；當微生物同時具有1)所述的微生物的性質和2)-④中所述的微生物的性質時，即可利用該微生物，從乳清酸等UTP的前體物質和葡糖胺和N-乙酰葡糖胺生產UDP-GalNAc；當微生物同時具有1)所述的微生物的性質和2)-⑤中所述的微生物的性質時，即可利用該微生物，從乳清酸等UTP的前體物質和葡萄糖生產UDP-GlcUA；當微生物同時具有1)所述的微生物的性質和2)-⑥中所述的微生物的性質時，即可利用該微生物，從GMP等GTP的前體物質和甘露糖生產GDP-Man；當微生物同時具有1)所述的微生物的性質和2)-⑦中所述的微生物的性質時，即可利用該微生物，從GMP等GTP的前體物質和甘露糖生產GDP-Fuc；當微生物同時具有1)所述的微生物的性質和2)-⑧中所述的微生物的性質時，即可利用該微生物，從乳清酸等CTP的前體物質和N-乙酰葡糖胺或N-乙酰甘露糖胺生產CMP-NeuAc。
如上所述，在糖核苷酸的制備中，可以利用基因重組微生物，該制備方法涉及表2中所示的基因，這些基因克隆自大腸埃希氏菌，其堿基序列已被測定。
表2


涉及基因重組的各種方法可按已知的方法[如J.Sambrook等編分子克隆，操作指南，第二版，冷泉港實驗室(1989)]進行操作，從帶有含基因的質粒的大腸埃希氏菌分離純化質粒DNA；質粒DNA的限制性酶切；切斷后的DNA片段的分離純化；用酶連接DNA片段；用重組DNA轉化大腸埃希氏菌等。另外，可用Perkin-Elmer-Cetus公司生產的熱循環儀進行聚合酶鏈反應(下文稱為PCR)。
為了在宿主中表達與糖核苷酸相關的基因，以限制性酶類或PCR獲得適當長度的含該基因的DNA片段，將含該基因的DNA片段導入表達載體的啟動子的下游，接著將插入了上述DNA的表達載體導入合適的宿主中即可。
對宿主微生物來說，只要其可以表達目的基因即可。例如，可以例舉出埃希氏菌屬，沙雷氏菌屬，棒桿菌屬，短桿菌屬，假單孢菌屬，芽孢桿菌屬的微生物，以及糖酵母屬和假絲酵母屬的酵母。
對所使用的載體來說，只要其可在上述宿主中自主復制或能整合到染色體中，并在與糖制備相關的基因轉錄的位置含有啟動子即可。
當用上述的微生物作為宿主時，與糖核苷酸制備相關基因的表達載體應該可以在微生物宿主中自主復制并優選包含啟動子，核糖體結合序列，與糖核苷酸制備相關的基因，轉錄終止序列。最好還含有啟動子調控基因。
對表達載體來說，有例如，pBTrp2，pBTac2，pBTac1(均由BoehringerMannheim公司生產)，pKYP10(特開昭58-110600)，pKYP200[農業生物化學.，48，669(1984)]，pLSA1[農業生物化學.，53，277(1989)]，pGEL1[美國國家科學院院刊，824306(1985)]，pBluescript II SK+(STRATAGENE社制)，pTrS30[大腸埃希氏菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)調制]和pTrS32[大腸埃希氏菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)調制]，pUC19[基因，33，103(1985)]，pSTV28(寶酒造社制)，pPA1(特開昭63-233798)，pCG11(特公平6-91827)等。
對啟動子來說，只要其可以在上述的宿主中表達即可。例如，來自大腸埃希氏菌和噬菌體的trp啟動子，lac啟動子，PL啟動子，PR啟動子。另外，人工設計和修飾的啟動子如含有兩個直線排列的trp啟動子的trp串列啟動子，tac啟動子等。
對核糖體結合序列來說，只要其可在宿主中表達即可，優選使用將核糖體結合序列與起始密碼子之間調節為合適的距離的質粒(例如，6-18個堿基)。
盡管對與糖核苷酸表達相關的基因的表達來說，轉錄終止序列并不總是必須的，但優選在結構基因的下游配置轉盧終止序列。
對宿主來說，只要其能表達重組DNA并能利用于糖核苷酸的生成即可。具體地有大腸埃希氏菌XL1-Blue，大腸埃希氏菌XL2-Blue，大腸埃希氏菌DH1，大腸埃希氏菌MC1000，大腸埃希氏菌KY3276，大腸埃希氏菌W1485，大腸埃希氏菌JM109，大腸埃希氏菌HB101，大腸埃希氏菌No.49，大腸埃希氏菌W3110，大腸埃希氏菌NY49，大腸埃希氏菌KY8415，大腸埃希氏菌NM522，枯草芽孢桿菌，短芽孢桿菌，淀粉液化芽孢桿菌，未成熟短桿菌(Brevibacteriumimmariophilum)ATCC14068，解糖短桿菌ATCC14066，黃色短桿菌ATCC14067，乳發酵短桿菌ATCC13869，產氨棒桿菌ATCC21170，谷氨酸棒桿菌ATCC13032，嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870，嗜氨微桿菌ATCC15354，惡臭假單孢菌，粘質沙雷氏菌等。
在用酵母作宿主時，表達載體有例如YEp13(ATCC37115)，YEp24(ATCC37051)，Ycp50(ATCC37419)等。
對啟動子來說，只要其能在酵母宿主中表達即可。例如，己糖激酶等糖酵解途徑基因的啟動子，gal 1啟動子，gal 10啟動子，熱休克蛋白啟動子，MFα1啟動子，CUP1啟動子。
對宿主來說，只要其是能表達重組DNA并可利用于糖核苷酸的酵母即可。具體地有啤酒糖酵母，產朊假絲酵母，近平滑假絲酵母，克魯斯氏假絲酵母，易變假絲酵母，解脂假絲酵母，涎沫假絲酵母，季也蒙式假絲酵母，白色假絲酵母，土生假絲酵母，粉狀畢赤酵母，奧默列氏畢赤酵母，白色球擬酵母，球面球擬酵母，Torulopsis xylinus，無名球擬酵母，易變球擬酵母，類球形德巴利氏酵母，Debaryomycescantarellii，球形德巴利氏酵母，漢遜氏德巴利氏酵母，日本德巴利氏酵母，Zygosaccharomyces rouxii，拜列氏結合酵母，乳克魯維氏酵母，馬克斯克克魯維氏酵母，異常漢遜氏酵母，杰丁漢遜氏酵母，藍母啤可酒香酵母，異酒香酵母，粟酒裂殖糖酵母，茁芽絲孢酵母和河岸許望氏酵母。
對本發明所用的微生物的培養來說，可以用常規的方法進行培養。對培養該微生物用的培養基來說，只要其含有可被該微生物同化的炭源，氮源和無機鹽類并可以有效地培養該微生物。
炭源的例子有可被各種微生物同化的，如糖類葡萄糖，果糖，蔗糖，乳糖，麥芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，蜂蜜，淀粉，淀粉水解物等。有機酸丙酮酸，乳酸，檸檬酸，富馬酸等。各種氨基酸如谷氨酸，甲硫氨酸，賴氨酸等。以及醇如乙醇，丙醇，甘油等。另外天然有機源有稻糠，木薯，蔗渣，玉米漿等。
氮源的例子有各種無機和有機銨鹽氨，氯化銨，硫酸銨，碳酸銨，乙酸銨，磷酸銨等；氨基酸如谷氨酸，谷氨酰胺，甲硫氨酸等；胨，NZ胺，玉米漿，肉回收物，酵母回收物，麥芽回收物，酪蛋白水解物，大豆粉，魚粉或其水解物等。
無機鹽類有例如磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，磷酸鎂，硫酸鎂，氯化鎂，氯化鈉，氯化鈣，硫酸亞鐵，硫酸錳，硫酸銅，硫酸鋅，碳酸鈣等。如果需要，還可以加入維生素類，氨基酸類，核酸類等。
培養在振蕩培養或通氣攪拌培養等需氧條件下進行。優選培養溫度為15-45℃，培養時間通常為5-96小時。在培養時pH保持3.0-9.0。調整pH時，可以使用無機或有機酸，堿溶液，尿素，碳酸鈣，氨等。另外，在需要時可以向培養基中加入氨芐青霉素或四環素等抗生素。
在培養用含誘導性表達載體轉化的微生物時，可以向培養基中加入誘導劑。例如在培養用含lac啟動子的表達載體轉化的微生物時，可以向培養基中添加異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)；在培養用含trp啟動子的表達載體轉化的微生物時添加吲哆乙酸(IAA)。
在本發明的糖核苷酸的制備中，在使用兩種以上的微生物時，可以將微生物分別培養或者在同一個培養容器中同時接種，混合培養后，將該培養液用于糖核苷酸的制備。另外，可以在各微生物的培養中或培養后的殘存的微生物中接種其他的微生物，培養后，以培養也用于糖核苷酸的制備。另外，可以對具有1)的性質和2)的性質的微生物分別進行培養，并將培養液用于糖核苷酸的制備。
可以將該培養中得到的培養液和各培養液的各種處理物用作酶源，在水溶性介質中生成糖核苷酸。
培養液的處理物有培養液的濃縮物，培養液的干燥物，培養物離心分離得到的培養上清，該培養上清的濃縮物，從培養上清得到的酶樣品，從培養液離心分離得到的細胞(含菌體)，該細胞的干燥物，該細胞的冷凍干燥物，該細胞的表面活性劑處理物，該細胞的超聲波處理物，該細胞的機械磨碎處理物，該細胞的溶劑處理物，該細胞的酶處理物，該細胞的蛋白質分級分離物，該細胞的固定化物或者從該細胞抽提得到的酶樣品等。
糖核苷酸生成中所用的酶源的量為，濕菌體1-500g/l，優選5-300g/l。另外，在利用兩種以上的微生物在水溶性介質中進行反應時，水溶性介質中總的濕菌體的量為2-500g/l，優選5-400g/l。
糖核苷酸的生成中所用的水溶性介質有水，磷酸鹽，碳酸鹽，醋酸鹽，硼酸鹽，檸檬酸鹽，Tris等的緩沖液，甲醇，乙醇等醇類，乙酸乙酯等酯類，丙酮等酮類，乙酰胺等酰胺類等。作為酶源的微生物的培養液也可以以水溶性介質的形式使用。
在糖核苷酸的生成中所用的核苷酸的前體物質有乳清酸，尿嘧啶，尿嘧啶，乳清苷，胞嘧啶，胞苷，腺嘌呤，腺苷，鳥嘌呤，鳥苷，次黃嘌呤，肌苷，黃嘌呤，黃苷，肌苷-5’-一磷酸，黃苷-5’-一磷酸，鳥苷-5’-一磷酸，尿苷-5’-一磷酸，胞苷-5’-一磷酸等。優選乳清酸和鳥苷-5’-一磷酸。對該前體物質來說，可以使用其純品和含該前體物質的的培養液和該培養液中的前體物質的粗制品，只要其雜質不抑制反應即可。核苷酸前體物質的使用濃度為0.1-1.0M，優選為0.01-0.3M。
糖核苷酸生成中所用的糖有葡萄糖，果糖，半乳糖，葡糖胺，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰半乳糖胺，甘露糖，巖藻糖，N-乙酰甘露糖胺，乙酰神經氨酸等及其衍生物。糖，可以是純品或者是含糖的物質，只要其中的雜質不影響反應即可。糖，可以在反應時一并加入，或分步加入或連續加入，濃度為0.1mM-2.0M。
在糖核苷酸生成中，必要時可以加入對ATP再生時必須的能量供體，輔酶，磷酸根離子，鎂離子，肌醇六磷酸等螯合劑，表面活性劑和有機溶劑。
能量供體有葡萄糖，果糖，蔗糖，乳糖，麥芽糖，甘露醇，山梨糖醇等糖類，丙酮酸，乳酸，乙酸，等有機酸，甘氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，谷氨酸等氨基酸類，蜂蜜，淀粉水解物等，濃度為1.0mM-2.0mM。
磷酸根離子的例子有正磷酸和多磷酸如焦磷酸，三聚磷酸，四聚磷酸，四聚偏磷酸等。多聚偏磷酸和無機磷酸鹽如磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉等多聚偏磷酸，濃度為1.0mM-1.0M。
鎂離子的例子有如硫酸鎂，硝酸鎂，氯化鎂等無機鎂鹽，檸檬酸鎂等有機鎂鹽等，濃度為1-100mM。
可增強糖核苷酸產生的表面活性劑的例子有聚氧乙烯十八烷基酰胺等非離子型表面活性劑(如日本油脂社的Nymeen S-215)，十六烷基三甲基溴化銨，烷基二甲基芐基氯化銨等陰離子表面活性劑(例如日本油脂社的Cation F2-40E)，月桂酰基肌氨酸鹽等陽離子表面活性劑和烷基二甲基胺等叔胺類(如日本油脂社的Tertiary Amine FB，其可單獨或兩個或兩個以上的混合物。表面活性劑的濃度通常為0.1-50g/l。
有機溶劑的例子有二甲苯，甲苯，脂肪醇，丙酮，乙酸乙酯，等，使用濃度通常為0.1-50ml/l。
糖核苷酸反應可在水溶性介質中進行，pH為5-10，優選6-9，溫度為20-50℃，時間2-96小時。
可用該方法生成糖核苷酸，例如尿苷二磷酸化合物，鳥苷二磷酸化合物和胞苷一磷酸化合物。具體地有選自UDP-Glc，UDP-Gal，UDP-GlcNAc，UDP-GalNAc，UDP-GlcUA，GDP-Man，GDP-Fuc，CMP-NeuAc等及其衍生物。
水溶性介質中生成的糖核苷酸的定量可按已知的方法進行，例如以分析生物化學216，188(1994)中記載的高效液相色譜(下文稱為HPLC)對UDP-Glc和UDP-Gal進行分離定量。另外，可用下面的HPLC條件對UDP-GlcNAc，GDP-Man，GDP-Fuc，CMP-NeuAc進行分離定量。
洗脫液0.1M KH2PO4(用H3PO4調pH為3.2)流速1ml/min柱子Partisil-10SAX(Whatman)檢測UV 262nm定量根據與標準吸光度進行比較而計算出來。
可用常規的活性炭和離子交換樹脂法對反應液中生成的糖核苷酸進行回收。例如UDP-Gal UDP-Glc按組織化學雜志.，57，152(1992)的方法，UDP-GlcNAc按組織化學雜志.，57，146(1992)的方法進行。
能在本發明復合糖類制備中使用的微生物或動物細胞或昆蟲細胞，只要其是可以從糖核苷酸和復合糖類前體物質產生復合糖類的微生物或動物細胞或昆蟲細胞即可。這些微生物、動物細胞或昆蟲細胞的實例包括那些具有以下酶活性的種類例如有葡糖酰基轉移酶，半乳糖酰基轉移酶，N-乙酰葡糖胺轉移酶，N-乙酰半乳糖胺轉移酶，葡糖醛酸基轉移酶，甘露糖基轉移酶，唾液酸基，巖藻糖基轉移酶等。
另外，以重組DNA技術修飾的微生物，動物細胞，昆蟲細胞也可以同樣的方式用于糖核苷酸的制備。此類微生物，動物細胞，昆蟲細胞的例子有表達來自人黑素瘤細胞系SK-Mel-28的神經酰胺葡糖酰基轉移酶基因的大腸埃希氏菌(美國國家科學院院刊.，93，4638(1996))，產生β1，3-半乳糖基轉移酶的人黑素瘤細胞系WM266-4(ATCC CRL 1676)，含來自人黑素瘤細胞系WM266-4的β1，3-半乳糖基轉移酶基因的重組細胞系如namalwa細胞系KJM-1等(特開平6-181759)；表達來自人Hela細胞的β1，4-半乳糖基轉移酶基因的大腸埃希氏菌(EMBOJ.，9，3171(1990))或啤酒糖酵母(生物化學與生物物理研究通訊.，201，160(1994))；表達大鼠β1，6-N-乙酰葡糖胺基轉移酶基因的COS-7細胞(ATCC CRL 1651)(生物化學雜志.，268，15381(1993))；表達人N-乙酰葡糖胺基轉移酶基因的sf9細胞系(生物化學雜志.，118，568(1995))；表達人葡糖醛酸基轉移酶基因的大腸埃希氏菌(生物化學與生物物理研究通訊.，196，473(1993))；表達人α1，3-巖藻糖基轉移酶基因的namalwa細胞系(生物化學雜志.，269，14730(1994))；表達人α1，3/1，4-巖藻糖基轉移酶基因的COS-1細胞系(遺傳和發育.，4，1288(1990))；表達人α1，2-巖藻糖基轉移酶基因的COS-1細胞系(美國國家科學院院刊.，87，6674(1990))；表達雞α2，6-唾液酸基轉移酶基因的COS-7細胞系(歐洲生物化學雜志.，219，375(1994))；表達來自人α2，8-唾液酸轉移酶的COS細胞系(美國國家科學院院刊.，91，7592(1994))；表達來自奈瑟氏球菌的β1，3-N-乙酰葡糖胺基轉移酶，β1，4-半乳糖基轉移酶，β1，3-N-乙酰半乳糖胺基轉移酶或α1，4-半乳糖基轉移酶的大腸埃希氏菌(WO 96/10086)；表達來自奈瑟氏球菌的表達α2，3-唾液酸基轉移酶的大腸埃希氏菌(生物化學雜志.，271，28271(1996))；表達來自幽門螺桿菌的α1，3-巖藻糖基轉移酶的大腸埃希氏菌(生物化學雜志.，272，21349(1997))；表達來自酵母的表達α1，2-甘露糖基轉移酶的大腸埃希氏菌(有機化學雜志.，58，3985(1993))。
當微生物被用于產生本發明的復合糖類時，可將該微生物培養在上述用于從糖核苷酸前體和糖產生糖核苷酸的微生物的相同的培養基中。
當用動物細胞產生復合糖類時，該動物細胞的培養基一般使用RPMI1640或Eagle氏MEM培養基，或向該培養基中添加了胎牛血清的培養基。培養通常在5％CO2的存在下進行。通常培養溫度20-40℃，培養時間3-14天。必要時，可以添加抗生素。
當用昆蟲細胞制備本發明的復合糖類時，該昆蟲細胞的培養液按已知的方法進行(生物化學雜志.，268，12609(1993))。
可將該培養中得到的微生物或動物細胞或昆蟲細胞的培養液以及該培養液的各種處理物作為酶源，在水溶性介質中生成復合糖類。培養液的處理物有培養液的濃縮物，培養液的干燥物，培養物離心分離得到的培養上清，該培養上清的濃縮物，從培養上清得到的酶樣品，從培養液離心分離得到的細胞(含菌體)，該細胞的干燥物，該細胞的冷凍干燥物，該細胞的表面活性劑處理物，該細胞的超聲波處理物，該細胞的機械磨碎處理物，該細胞的溶劑處理物，該細胞的酶處理物，該細胞的蛋白質分級分離物，該細胞的固定化物或者從該細胞抽提得到的酶樣品等。
如果以37℃1分鐘生成1μmol復合糖類的酶量為1活性單位的話，在復合糖類生成中所用的酶源的量為0.1mU/l-10000U/l，優選濃度為1mU/l-1000U/l。
復合糖類的生成中所用的水溶性介質有水，磷酸鹽，碳酸鹽，醋酸鹽，硼酸鹽，檸檬酸鹽，Tris等的緩沖液，甲醇，乙醇等醇類，乙酸乙酯等酯類，丙酮等酮類，乙酰胺等酰胺類等。作為酶源的微生物，動物細胞或昆蟲細胞的培養液也可以以水溶性介質的形式使用。
如果需要，可以加入肌醇六磷酸等螯合劑，氯化錳等無機鹽，2-巰基乙醇等。
作為在復合糖類形成中使用的糖核苷酸，可以使用在上述糖核苷酸生成中生成的溶液或從該溶液中純化而來的糖核苷酸，濃度為0.01mM-2.0M。
另外，可將用上述的方法制備的糖核苷酸應用于復合糖類形成反應中。
對用于復合糖類形成的復合糖類前體來說，只要其可被用作糖基轉移酶的底物即可。例如，單糖類，寡糖類，與載體等連接的單糖類或寡糖類，蛋白類，肽類，脂類，糖蛋白類，糖脂類，糖肽類，甾類化合物等。
具體的例子有葡萄糖，半乳糖，甘露糖，唾液酸，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰半乳糖胺，乳糖，N-乙酰乳糖胺，乳-N-二糖，GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，GlcNAcβ1-4Galβ1-4Glc，球狀三糖(globotriose)，Galα1-4Galβ1-4GlcNAc，2’-巖藻糖基乳糖，3-巖藻糖基乳糖，3’-唾液酸基乳糖，6’-唾液酸基乳糖，3’-唾液酸基-N-乙酰基乳糖胺，6’-唾液酸基-N-乙酰基乳糖胺，唾液酸基-N-二糖，Lewis X，Lewisa，乳-N-四糖，乳-N-新四糖，乳二巖藻四糖，3’-唾液酸基-3-巖藻糖基乳糖，唾液酸基-Lewis X，唾液酸基-Lewis a，乳-N-巖藻五糖I，乳-N-巖藻五糖II，乳-N-巖藻五糖III，乳-N-巖藻五糖V，LS-四糖a，LS-四糖b，LS-四糖c，(α2，3)唾液酸基乳-N-新四糖及其衍生物，絲氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺及含這些氨基酸的肽類，神經酰胺及其衍生物等。復合糖類前體的使用濃度為0.01mM-2.0M。
本發明復合糖類的例子有含有至少一種選自如下的糖的復合糖類葡萄糖，半乳糖，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰半乳糖胺，葡糖醛酸，甘露糖，巖藻糖，唾液酸，乳糖，N-乙酰乳糖胺，乳-N-二糖，GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，GlcNAcβ1-4Galβ1-4Glc，球狀三糖(globotriose)，Galα1-4Galβ1-4GlcNAc，2’-巖藻糖基乳糖，3-巖藻糖基乳糖，3’-唾液酸基乳糖，6’-唾液酸基乳糖，3’-唾液酸基-N-乙酰基乳糖胺，6’-唾液酸基-N-乙酰基乳糖胺，唾液酸基-N-二糖，Lewis X，Lewis a，乳-N-四糖，乳-N-新四糖，乳二巖藻四糖，3’-唾液酸基-3-巖藻糖基乳糖，唾液酸基-Lewis X，唾液酸基-Lewisa，乳-N-巖藻五糖I，乳-N-巖藻五糖II，乳-N-巖藻五糖III，乳-N-巖藻五糖V，LS-四糖a，LS-四糖b，LS-四糖c，(α2，3)唾液酸基乳-N-新四糖，乳-N-二巖藻己糖I，乳-N-二巖藻己糖II，乳-N-己糖，乳-N-新己糖，二唾液酸基乳-N-四糖及其衍生物，及含上述復合糖類的復合糖類以及含上述復糖類的復合糖類。具體地，其包括有選自如下的糖鍵的糖的復合糖類Galβ1-3Glc、Galβ1-4Glc、Galβ1-3GlcNAc、Galβ1-4GlcNAc、Galβ1-3Gal、Galβ1-4Gal、Galβ1-3GalNAc、Galβ1-4GalNAc、Galα1-3Glc、Galα1-4Glc、Galα1-3GlcNAc，Galα1-4GlcNAc、Galα1-3Gal、Galα1-4Gal、Galα1-3GalNAc、Galα1-4GalNAc、GlcNAcβ1-3Gal、GlcNAcβ1-4Gal、GlcNAcβ1-6Gal、GlcNAcβ1-3Glc、GlcNAcβ1-4Glc、GlcNAcβ1-3GlcNAc、GlcNAcβ1-4GlcNAc、GlcNAcβ1-6GalNAc、GlcNAcβ1-2Man、GlcNAcβ1-4Man、GlcNAcβl-6Man、GalNAcβ1-3Gal、GalNAcβ1-4Gal、GalNAcβ1-4GlcNAc、GalNAcα1-3GalNAc、Manβ1-4GlcNAc、Manα1-6Man，Manα1-3Man，Manα1-2Man，GlcUAβ1-4GlcN、GlcUAβ1-3Gal、GlcUAβ1-3GlcNAc、GlcUAβ1-3GalNAc、NeuAcα2-3Gal、NeuAcα2-6Gal、NeuAcα2-3GlcNAc、NeuAc2-6GlcNAc、NeuAcα2-3GalNAc、NeuAcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、Fucα1-3Glc、Fucα1-4Glc、Fucα1-3GlcNAc、Fucα1-4GlcNAc、Fucα1-2Gal和Fucα1-6GlcNAc
另外，該復合糖類中所含的糖的個數為10個或以下，6個或以下。
具體的復合糖類的制備方法為(1)將能表達奈瑟氏球菌來源的β1，4-糖基轉移酶(WO 96/10086)的微生物的培養液，能從UTP的前體物質產生UTP的微生物的培養液，以及能從糖和UTP產生UDP-Gal的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從乳清酸，半乳糖和葡萄糖產生乳糖。
(2)將能表達奈瑟氏球菌來源的β1，4-糖基轉移酶(WO 96/10086)的微生物的培養液，能從UTP的前體物質產生UTP的微生物的培養液，以及能從糖和UTP產生UDP-Gal的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從乳清酸，半乳糖和N-乙酰葡糖胺產生N-乙酰乳糖胺。
(3)將能表達奈瑟氏球菌來源的α2，3-唾液酸基轉移酶(生物化學雜志.，271，28271(1996))的微生物的培養液，能從CTP的前體物質產生CTP的微生物的培養液，以及能從糖和CTP產生CMP-NeuAc的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從乳清酸，N-乙酰甘露糖胺，丙酮酸和乳糖產生3’-唾液酸基乳糖。
(4)將能表達奈瑟氏球菌來源的α2，3-唾液酸基轉移酶(生物化學雜志.，271，28271(1996))的微生物的培養液，能從CTP的前體物質產生CTP的微生物的培養液，以及能從糖和CTP產生CMP-NeuAc的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從乳清酸，N-乙酰甘露糖胺，丙酮酸和N-乙酰葡糖胺產生3’-唾液酸基-N-乙酰乳糖胺。
(5)將能表達小雞來源的α2，6-唾液酸基轉移酶(歐洲生物化學雜志.，219，375(1994))的COS-7細胞系的培養液，能從CTP的前體物質產生CTP的微生物的培養液，以及能從糖和CTP產生CMP-NeuAc的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從乳清酸，N-乙酰甘露糖胺，丙酮酸和N-乙酰乳糖胺產生6’-唾液酸基-N-乙酰乳糖胺。
(6)將能表達奈瑟氏球菌來源的β1，3-N-乙酰基葡糖胺基轉移酶(WO 96/10086)的微生物的培養液，能從UTP的前體物質產生UTP的微生物的培養液，以及能從糖和UTP產生UDP-GlcNAc的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從乳清酸，N-乙酰葡糖胺和乳糖產生GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc。
(7)將能產生β1，3-半乳糖基轉移酶(ATCC CRL 1676)的人黑素瘤細胞系WM266-4的培養液或能表達來源于人黑素瘤細胞系WM266-4的β1，3-半乳糖基轉移酶基因的namalwa細胞系KJM-1轉化體的培養液(特開平6-181759)，能從UTP的前體物質產生UTP的微生物的培養液，以及能從糖和UTP產生UDP-Gal的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從乳清酸，半乳糖和GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc產生乳-N-四糖。
(8)將能表達來源于人Hela細胞系的β1，4-半乳糖基轉移酶大腸埃希氏菌(EMBO J.，9，3171(1990))或啤酒糖酵母(生物化學和生物物理研究通訊.，201，160(1994))的培養液，能從UTP的前體物質產生UTP的微生物的培養液，以及能從糖和UTP產生UDP-Gal的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從乳清酸，半乳糖和GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc產生乳-N-新四糖。
(9)將能表達來源于奈瑟氏球菌的β1，4-半乳糖基轉移酶(WO96/10086)的微生物的培養液，能從UTP的前體物質產生UTP的微生物的培養液，以及能從糖和UTP產生UDP-Gal的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從乳清酸，半乳糖和GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc產生乳-N-新四糖。
(10)將能表達來源于奈瑟氏球菌的β1，4-半乳糖基轉移酶(WO96/10086)的微生物的培養液，能從UTP的前體物質產生UTP的微生物的培養液，能從糖和UTP產生UDP-GlcNAc的微生物的培養液以及能從糖和UTP產生UDP-Gal的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從乳清酸，N-乙酰葡糖胺，半乳糖和乳糖產生乳-N-新四糖。
(11)將能表達奈瑟氏球菌來源的α2，3-唾液酸基轉移酶(生物化學雜志.，271，28271(1996))的微生物的培養液，能從CTP的前體物質產生CTP的微生物的培養液，以及能從糖和CTP產生CMP-NeuAc的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從乳清酸，N-乙酰甘露糖胺，丙酮酸和乳-N-新四糖產生(α2，3)唾液酸基乳-N-新四糖。
(12)將能表達人來源的α1，3-巖藻糖基轉移酶(生物化學雜志.，269，14730(1994))的namalwa細胞系的培養液，能從GTP的前體物質產生GTP的微生物的培養液，以及能從糖和GTP產生GDP-Fuc的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從GMP，甘露糖，乳-N-新四糖產生乳-N-巖藻五糖III。
(13)將能表達幽門螺桿菌來源的α1，3-巖藻糖基轉移酶(生物化學雜志.，272，21349和21357(1997))微生物的培養液，能從GTP的前體物質產生GTP的微生物的培養液，以及能從糖和GTP產生GDP-Fuc的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從GMP，甘露糖，乳-N-新四糖產生乳-N-巖藻五糖III。
(14)將能表達來源于奈瑟氏球菌的α1，4-半乳糖基轉移酶(WO96/10086)的微生物的培養液，能從UTP的前體物質產生UTP的微生物的培養液，以及能從糖和UTP產生UDP-Gal的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從乳清酸，半乳糖和乳糖產生球狀三糖。
(15)將能表達來源于奈瑟氏球菌的β1，4-半乳糖基轉移酶(WO96/10086)的微生物的培養液，能表達來源于奈瑟氏球菌的α1，4-半乳糖基轉移酶(WO 96/10086)的微生物的培養液，能從UTP的前體物質產生UTP的微生物的培養液，以及能從糖和UTP產生UDP-Gal的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從乳清酸，半乳糖和葡萄糖產生球狀三糖。
(16)將能表達奈瑟氏球菌來源的α1，4-半乳糖基轉移酶(WO96/10086)的微生物的培養液，能從UTP的前體物質產生UTP的微生物的培養液，以及能從糖和UTP產生UDP-Gal的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從乳清酸，半乳糖，N-乙酰乳糖胺產生Galα1-4Galβ1-4GlcNAc。
(17)將能表達人來源的β1，3-半乳糖基轉移酶(特開平6-181759)的動物細胞系的培養液，能從UTP的前體物質產生UTP的微生物的培養液，以及能從糖和UTP產生UDP-Gal的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從乳清酸，半乳糖和N-乙酰葡糖胺產生乳-N-二糖。
(18)將能表達奈瑟氏球菌來源的α2，3-唾液酸基轉移酶(生物化學雜志.，271，28271(1996))的微生物的培養液，能從CTP的前體物質產生CTP的微生物的培養液，以及能從糖和CTP產生CMP-NeuAc的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從乳清酸，N-乙酰甘露糖胺，丙酮酸和乳-N-二糖產生唾液酸基乳-N-二糖。
(19)將能表達人來源的α1，3-巖藻糖基轉移酶(生物化學雜志.，269，14730(1994))的動物細胞系的培養液，能從GTP的前體物質產生GTP的微生物的培養液，以及能從糖和GTP產生GDP-Fuc的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從GMP，甘露糖和3’-唾液酸基-N-乙酰乳糖胺產生唾液酸基-Lewis X。
(20)將人α1，3/1，4-巖藻糖基轉移酶(糖類研究.，190，1，(1989))，能從GTP的前體物質產生GTP的微生物的培養液，以及能從糖和GTP產生GDP-Fuc的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，進行酶反應，可從GMP，甘露糖和唾液酸基乳-N-二糖產生唾液酸基-Lewis a。
(21)將能表達酵母來源的α1，2-甘露糖基轉移酶(有機化學雜志.，58，3985，(1993))，能從GTP的前體物質產生GTP的微生物的培養液，以及能從糖和GTP產生GDP-Man的微生物的培養液或這些培養物的處理物作為酶源，可從GMP和甘露糖通過酶反應產生Manα1-2Man。
復合糖類的制備方法不受上述例子的限制，可在本發明的糖基轉移酶的范圍內結合本文所述的糖核苷酸的制備方法并在該酶的底物特異性范圍內，以核苷酸前體物質，糖和復合糖類前體物質作為原料工業化生產這樣的糖鏈。
能用本發明的制備方法制備的復合糖類有，例如(1)與病原性微生物和病毒感染相關的復合糖類，例如，作為病原性微生物和病毒的受體進行識別的復合糖類；(2)作為病原性微生物和病毒產生的毒素的受體進行識別的復合糖類；(3)在生物體內與細胞粘著，異物識別以及各種淋巴因子的結合相關的復合糖類，例如以化學上可結合的方式含有如下一個或多個糖的復合糖類葡萄糖，半乳糖，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰半乳糖胺，葡糖醛酸，甘露糖，N-乙酰甘露糖胺，果糖和唾液酸等。其具體的例子有(1)包含在人和動物乳汁中并參與抗微生物感染保護的復合糖類，例如，乳-N-四糖，乳-N-新四糖等復合糖類；
(2)識別，下述微生物的受體的復合糖類，例如大腸埃希氏菌，顆粒丙酸桿菌，結核分枝桿菌，粘膜炎莫拉氏菌，白色假絲酵母，腐生葡萄球菌，肺炎鏈球菌，無乳鏈球菌，銅綠假單孢菌，內氏放線菌，淋病奈瑟氏球菌，幽門螺桿菌，流感嗜血菌等。
(3)病毒如流感病毒，冠形病毒，仙臺病毒，新城疫病毒，呼腸弧病毒，輪狀病毒，艾滋病病毒(HIV)等的受體復合糖類；(4)原生動物如，隱子芥屬(Cryptosporidium)，錐體蟲屬等；(5)與毒素有親和性的受體復合糖類，毒素有例如霍亂毒素，大腸埃希氏菌熱不穩定毒素，肉毒桿菌毒素，梭菌δ毒素，梭菌A毒素，志賀菌毒素，Vero細胞毒素，志賀樣毒素，副溶血弧菌熱穩定毒素，破傷風毒素等。
(6)癌癥相關復合糖類，如神經節苷脂類(例如GD3，GM3等)，紅細胞糖苷脂，糖脂類等。
(7)與白細胞向炎癥區粘附及其功能修飾相關的復合糖類，例如唾液酸基-Lewis X糖鏈等。
(8)與自身免疫病如類風濕性關節炎，IgA腎小球腎炎等相關的復合糖類。
(9)與識別異物和癌細胞相關的被各種凝集素樣的物質所識別的復合糖類。
可根據已知的方法對在水溶性介質中生成的復合糖類進行定量(美國國家科學院院刊.，85，3289(1988)，分析生物化學.，174，459(1988))。
可根據常規的如活性炭，離子交換樹脂等方法對在反應液中生成的復合糖類進行回收，例如可根據組織化學雜志.，47，5416(1982)中所述的方法回收N-乙酰乳糖胺。
下面將用實施例說明本發明，但不限制本發明。
以下為本發明的實施例。
實施發明的最佳方式實施例1.galU，ppa表達重組質粒的構建下面對galU，ppa表達重組質粒pNT12的構建方法進行描述(圖1，圖2)。
1)含PL啟動子的表達載體的構建用下述的方法構建含PL啟動子的表達載體pPA31和pPAC31(圖1)。
將帶有含色氨酸啟動子的質粒pTrS30的大腸埃希氏菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)和帶有含PL啟動子的pPA1質粒(特開昭63-233798)以及含PL啟動子和cI857阻遏物的質粒pPAC1(FERM BP-6054)的大腸桿菌細胞分別接種在LB培養基[10g/l細菌培養用蛋白胨(Difco產)，5g/l酵母回收物(Difco產)，NaCl 5g/l，pH 7.2]并30℃培養18小時。
可用已知的方法，從該培養得到的菌體中分離純化出pTrS30，pPA1，pPAC1質粒的DNA。
用限制性酶PstI和ClaI切割純化后的pTrS30 DNA 0.2μg，之后用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene CleanII(Bio 101社制)試劑盒回收3.4kb的片段。將0.5μg純化的pPA1 DNA用限制性酶PstI和ClaI切割后，用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收1.0kb的DNA片段。
將該3.4kb和1.0kb DNA片段用連接反應試劑盒(TAKARA ligationkit寶酒社造)，于16℃進行16小時的連接反應。根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml青霉素的LB瓊脂培養基中，37℃培養過夜。
根據上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到含PL啟動子的表達載體pPA31。經限制性酶消化以確認該質粒的結構(圖1)。
用限制性酶PstI和ClaI切割純化后的pPA31 DNA 0.2μg，之后用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene CleanII(Bio 101社制)試劑盒回收3.4kb的片段。將0.5μg純化的pPAC1 DNA用限制性酶PstI和ClaI切割后，用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收2.3kb的DNA片段。
將該3.4kb和2.3kb DNA片段用連接反應試劑盒(TAKARA ligationkit寶酒社造)，于16℃進行16小時的連接反應。根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml青霉素的LB瓊脂培養基中，37℃培養過夜。
根據上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到含受cI857阻遏物影響的PL啟動子的表達載體pPAC31。經限制性酶消化以確認該質粒的結構(圖1)。
2)galU表達質粒的構建用已知的方法分離純化大腸埃希氏菌W3110的染色體DNA[例如，當今分子生物學方法，John Wielyand Sons Inc.(1994)]。
用Appiled Biosystems公司的380A DNA合成儀合成序列號1中所示的有義鏈DNA引物和序列號2中所示的反義鏈引物。
以該合成DNA作為引物，W3110株的染色體DNA作為模板進行PCR反應。在40μl的反應液中含有W3110染色體DNA 0.04μg，引物各0.5μM，TAKARA Ex Taq(寶酒造)1.0U，10×ExTaq緩沖液(寶酒社造)4μl，dNTP各200μM，于94℃1分鐘，42℃2分鐘，72℃3分鐘30個循環進行PCR反應。
將1/10量的反應液上瓊脂糖凝膠電泳以確證目的片段的擴增，剩下的反應液加入等量(1vol/1vol)的用TE[10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mMEDTA]飽和的苯酚/氯仿，并混合。將該混合液離心分離后，在得到的上成液中加入2倍量的冷乙醇進行混合，-80℃放置30分鐘。將該放置液離心分離得到DNA沉淀。將該沉淀用70％冷乙醇洗滌，真空干燥得到沉淀。下文，將加入TE飽和的苯酚/氯仿，用乙醇洗滌沉淀得到DNA沉淀的操作稱為乙醇沉淀法。
將該DNA用20μl TE溶解。將5μl該溶解液用DNA限制性酶HindIII和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene Clean II試劑盒回收0.9kb的DNA片段。將實施例1-1)中得到的pPA31 DNA 0.2μg用限制性酶HindIII和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收4.2kb的DNA片段。
將該0.9kb和4.2kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。
根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌KY8415株，將該轉化體涂布在含50μg/ml青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
根據上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到表達galU的質粒pNT9。經限制性酶消化以確認該質粒的結構(圖2)。
3)同時表達galU，ppa的質粒的構建合成了序列號3所示的有義鏈引物和序列號4所示的反義引物，以該合成的DNA為引物W3110株的染色體DNA為模板，按上述的相同條件進行PCR。
PCR反應后，用乙醇沉淀法得到DNA沉淀。
將該DNA用20μl TE溶解。將5μl該溶解液用DNA限制性酶BamHI和SalI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene CleanII試劑盒回收1.0kb的DNA片段。將實施例1-2)中得到的pNT9 DNA 0.2μg用限制性酶BamHI和SalI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收4.9kb的DNA片段。
將該1.0kb和4.9kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。
根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌KY8415株，將該轉化體涂布在含50μg/ml青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
根據上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到同時表達galU，ppa的質粒pNT12。經限制性酶消化以確認該質粒的結構(圖2)。
將該pNT12 DNA 0.5μg用限制性酶EcoRI和SalI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene Clean II試劑盒回收2.2kb的DNA片段。令一方面，將pSTV28 DNA(寶酒社造)0.2μg用限制性酶EcoRI和SalI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收3.0kb的DNA片段。
將該2.2kb和3.0kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含10μg/ml氨霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
根據上述已知的方法從培養的轉化體菌落中回收質粒，得到同時表達galU，ppa的質粒pNT32。經限制性酶消化以確認該質粒的結構(圖2)。
實施例2.UDP-Glc的生產將實施例1得到的大腸埃希氏菌KY8415/pNT12株接種到在1L帶檔板的錐形瓶中的125ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養基，30℃220rpm的條件下培養17小時。將該培養液125ml接種到存在于5L培養容器中的2.5L的液體培養基(pH無需調整)中，其中該液體培養基含有葡萄糖10g/l，細菌培養用蛋白胨(Difco)12g/l，酵母回收物(Difco)24g/l，KH2PO42.3g/l(另外滅菌)，K2HPO412.5g/l(另外滅菌)，氨芐青霉素50μg/ml；在600rpm，通氣量2.5L/分的條件下于30℃培養4小時，接著在40℃培養3小時。
在該培養中，使用28％的氨水使培養液的pH維持在7.0。另外，必要時可在培養中加入葡萄糖。將該培養液離心分離得到濕菌體。必要時，可將這些濕菌體保存于-20℃并在使用前解凍。
將產氨棒桿菌ATCC 21170株接種在存在于300ml體積的帶擋板的錐形瓶的20ml液體培養基中，于28℃220rpm的條件下培養24小時，其中該液體培養基含有葡萄糖50g/l，蛋白胨(日本制藥)10g/l，酵母回收物(Oriental Yeast產)10g/l，尿素5g/l，(NH4)2SO45g/l，KH2PO41g/l，K2HPO43g/l，MgSO4.7H2O 1g/l，CaCl2.2H2O 0.1g/l，FeSO4.7H2O 10mg/l，ZnSO4.7H2O 10mg/l，MnSO4.4-6H2O 20mg/l，L-半胱氨酸20mg/l，D-泛酸鈣10mg/l，維生素B15mg/l，煙酸5mg/l生物素30μg/l(10N NaOH調pH為7.2)。
將20ml該培養液接種到含250ml的上述相同液體培養基的2L帶擋板的錐形瓶中，28℃220rpm的條件下，培養24小時。
將該種培養液250ml接種到含2.25L液體培養基的5L的培養容器中，于32℃600rpm，通氣量2.5L/min的條件下培養24小時；其中液體培養基由如下物質組成葡萄糖150g/l，肉回收物(極東制藥)5g/l，KH2PO410g/l，K2HPO410g/l，MgSO4.7H2O 10g/l，CaCl2.2H2O 0.1g/l，FeSO4.7H2O 20mg/l，ZnSO4.7H2O 10mg/l，MnSO4.4-6H2O 20mg/l(另外滅菌)，β-丙氨酸15mg/l(另外滅菌)，L-半胱氨酸20mg/l，生物素100μg/l，尿素2g/l，維生素B1 5mg/l(另外滅菌)(10N NaOH調pH為7.2)。在培養中，使用28％的氨水使pH維持在6.8。
將該培養液離心分離得到濕菌體。該濕菌體必要時可保存在-20℃，在使用前解凍。
將由大腸埃希氏菌KY8415/pNT12濕菌體40g/l，產氨棒桿菌ATCC21170株150g/l，葡萄糖100g/l，KH2PO420g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，乳清酸(鉀鹽)21.2g/l，Nymeen S-2154g/l，二甲苯10ml/l組成的反應液30ml接種到200ml的燒杯中，在磁性攪拌子的攪拌下(900rpm)于32℃反應21小時。
在反應中用4N NaOH使pH維持在7.2，必要時加入葡萄糖和KH2PO4。
通過該反應，在反應液中生成了43.9g/l的UDP-Glc(2Na鹽)。
實施例3.表達galT，galk的重組質粒的構建下面描述表達galT，galk的重組質粒pNT25的構建方法(圖3)。
合成了序列號5的有義鏈DNA引物，序列號6的反義鏈DNA引物；以該合成的DNA作為引物，W3110株的染色體DNA作為模板，用上述的相同條件進行PCR。
PCR結束后，用乙醇沉淀法獲得DNA沉淀。該DNA沉淀用20μl TE溶解。將該溶解液5μl用DNA限制性酶Hind III和HincII切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene CleanII試劑盒回收2.3kb的片段。將pluescriptIISK+DNA 0.2μg用限制性酶HindIII和EcoRV切斷后，瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收3.0kb的片段。
將該2.3kb和3.0kb的片段用連接反應試劑盒在16℃進行16小時連接反應。
根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml的LB瓊脂培養基上，于30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到含galT，galK基因的質粒pNT19。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖3)。
將該pNT19 DNA 0.5μg用限制性酶ClaI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene Clean II試劑盒回收2.2kb的DNA片段。實施例1-1)中得到的pPAC31 DNA 0.2μg用限制性酶ClaI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收5.5kb的DNA片段。
將該2.3kb和5.5kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。
根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到同時表達galT，galK基因的質粒pNT25。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖3)。
實施例4.UDP-Gal的生產1)galT，galK，galU，ppa表達株的構建用常規方法以實施例1-3)中得到的pNT32 DNA轉化大腸埃希氏菌NM522/pNT25株，將得到的轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素和10μg/ml氯霉素的LB瓊脂培養基上，于30℃培養過夜。選擇生長的轉化體，得到galT，galK，galU，ppa表達株大腸埃希氏菌NM522/pNT25/pNT32。
2)UDP-Gal的構建用與實施例2同樣的方法培養在實施例4-1)中得到大腸埃希氏菌NM522/pNT25/pNT32株，將得到的培養物離心分離得到濕菌體。另外，以與實施例2相同的方法培養產氨棒桿菌ATCC 21170株，將得到的培養物離心分離得到濕菌體。必要時可將該濕菌體保存在-20℃，在使用前解凍。
將由大腸埃希氏菌KY8415/pNT25/pNT32濕菌體50g/l，產氨棒桿菌ATCC21170株150g/l，葡萄糖80g/l，半乳糖20g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，乳清酸(鉀鹽)21.2g/l，NymeenS-215 4g/l，二甲苯10ml/l組成的反應液2L接種到5L的培養容器中，在600rpm攪拌下，1L/min通氣于32℃反應26小時。
在反應中用4N NaOH使pH維持在7.2，必要時加入葡萄糖和KH2PO4。
通過該反應，在反應液中生成了47.4g/l的UDP-Gal(2Na鹽)。實施例5.能在產氨棒桿菌中表達galT，galK的重組質粒的構建下面描述能在產氨棒桿菌中表達來源于大腸埃希氏菌的galT，galK的重組質粒pTK7的構建(圖4)。
1)pCG116的構建能在產氨棒桿菌中復制的質粒pCG116的構建如下將質粒pCG11(特公平6-91827)用DNA限制性酶PstI和StuI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene Clean II試劑盒回收6.5kb的片段。
另一方面，將質粒pUC19 DNA 1.0μg用限制性酶EcoRI切斷后，用DNA末端平滑化試劑盒(寶酒造社制)。用PstI切割末端平滑化的DNA，瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用MERmaid(Bio101)s試劑盒回收43bp的片段。
將該6.5kb和43bp的片段用連接反應試劑盒在16℃進行16小時連接反應。
根據電穿孔的方法[FEMS微生物學快報.，65，299(1989)]用該連接反應液轉化產氨棒桿菌ATCC21170株，將該轉化體涂布在含100μg/ml壯觀霉素的LB瓊脂培養基上，于30℃培養2天。
用上述已知的方法[細菌學雜志.，159，306(1984)]從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到質粒pCG116。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖4)。
2)galT，galK表達質粒pTK7的構建將實施例3得到的galT，galK表達質粒pNT25 DNA 1.0μg用限制性酶XhoI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用GeneClean II試劑盒回收3.5kb的DNA片段。
另一方面，實施例5-1)中得到的pCG116 DNA 0.5μg用限制性酶SalI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收6.5kb的DNA片段。
將該3.5kb和6.5kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。
根據電穿孔的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌ATCC21170株，將該轉化體涂布在含100μg/ml壯觀霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養2天。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到同時表達galT，galK基因的質粒pTK7。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖4)。
實施例6.UDP-Gal的生產用與實施例2同樣的方法將在實施例5中得到的產氨棒桿菌ATCC21170/pTK7株于32℃培養20小時后，再于40℃培養4小時，將得到的培養物離心分離得到濕菌體。必要時可將該濕菌體保存在-20℃，在使用前解凍。
將由產氨棒桿菌ATCC21170/pTK7株濕菌體150g/l，葡萄糖40g/l，半乳糖20g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，乳清酸(鉀鹽)10.6g/l，Nymeen S-215 4g/l，二甲苯10ml/l組成的反應液30ml置于到200ml的燒杯中，在磁性攪拌子的攪拌下(900rpm)攪拌下，于32℃反應22小時。
在反應中用4N NaOH使pH維持在7.2，必要時加入果糖，半乳糖和KH2PO4。
通過該反應，在反應液中生成了7.2g/l的UDP-Gal(2Na鹽)。
實施例7.glmU，ppa，pgm，glmM，glk，pfkB的表達質粒的構建1)glmU，ppa表達質粒的構建合成了序列號7的有義鏈DNA引物，序列號8的反義鏈DNA引物；以該合成的DNA作為引物，W3110株的染色體DNA作為模板，用上述的相同條件進行PCR。
PCR結束后，用乙醇沉淀法獲得DNA沉淀。該DNA沉淀用20μl TE溶解。將該溶解液5μl用DNA限制性酶Hind III和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene CleanII試劑盒回收1.4kb的片段。將實施例1-1)得到pPA31 DNA 0.5μg用限制性酶HindIII和BamHI切斷后，瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收4.2kb的片段。
將該1.4kb和4.2kb的片段用連接反應試劑盒在16℃進行16小時連接反應。
根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌KY8415株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基上，于30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長出的轉化體菌落中回收質粒，得到含glmU基因的質粒pNT10。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖5)。
將實施例1-3)得到的pNT12 DNA 0.5μg用限制性酶BamHI和SalI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收1.0kb的DNA片段。將上述的pNT10 DNA 0.2μg用限制性酶BamHI和SalI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收5.3kb的DNA片段。
將該1.0kb和5.3kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。
根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌KY8415株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到同時表達glmU，ppa基因的質粒pNT14。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖5)。
2)pgm表達質粒的構建合成了序列號9的有義鏈DNA引物，序列號10的反義鏈DNA引物；以該合成的DNA作為引物，W3110株的染色體DNA作為模板，用上述的相同條件進行PCR。
PCR結束后，用乙醇沉淀法獲得DNA沉淀。該DNA沉淀用20μl TE溶解。將該溶解液5μl用DNA限制性酶ClaI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene Clean II試劑盒回收1.8kb的片段。將實施例1-1)中得到的pPAC31 DNA 0.2μg用限制性酶ClaI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收5.5kb的DNA片段。
將該1.8kb和5.5kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。
根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到表達pgm的質粒pNT24。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖6)。
3)glmM的表達質粒的構建合成了序列號11的有義鏈DNA引物，序列號12的反義鏈DNA引物；以該合成的DNA作為引物，大腸埃希氏菌W3110株的染色體DNA作為模板，用上述的相同條件進行PCR。
PCR結束后，用乙醇沉淀法獲得DNA沉淀。該DNA沉淀用20μl TE溶解。將該溶解液5μl用DNA限制性酶ClaI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene CleanII試劑盒回收1.6kb的片段。將實施例1-1)中得到的pPAC31 DNA 0.2μg用限制性酶ClaI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收5.5kb的DNA片段。
將該1.6kb和5.5kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。
根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到表達glmM的質粒pNT44。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖7)。
4)glk表達質粒的構建合成了序列號13的有義鏈DNA引物，序列號14的反義鏈DNA引物；以該合成的DNA作為引物，大腸埃希氏菌W3110株的染色體DNA作為模板，用上述的相同條件進行PCR。
PCR結束后，用乙醇沉淀法獲得DNA沉淀。該DNA沉淀用20μl TE溶解。將該溶解液5μl用DNA限制性酶HindIII和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene Clean II試劑盒回收0.5kb的片段。
將實施例1-1)中得到的pPAC31 DNA 0.2μg用限制性酶HindIII和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收4.2kb的DNA片段。
將該0.5kb和4.2kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到表達glk的質粒pNT45。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖8)。
用上述同樣的條件進行PCR，將得到的溶解液5μl用DNA限制性酶HindIII切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收0.5kb的片段。將上述方法中得到的pNT45 DNA 0.2μg用限制性酶HindIII切斷后，用堿性磷酸酶進行脫磷酸化處理，然后上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收4.7kb的DNA片段。
將該0.5kb和4.7kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。
根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到表達glk的質粒pNT46。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖8)。
5)pfkB的表達質粒的構建合成了序列號15的有義鏈DNA引物，序列號16的反義鏈DNA引物；以該合成的DNA作為引物，W3110株的染色體DNA作為模板，用上述的相同條件進行PCR。
PCR結束后，用乙醇沉淀法獲得DNA沉淀。該DNA沉淀用20μl TE溶解。將該溶解液5μl用DNA限制性酶HindIII和EcoRV切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene CleanII試劑盒回收1.3kb的片段。將pBluescriptII SK+DNA 0.2μg用限制性酶HindIII和EcoRV切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收3.0kb的DNA片段。
將該1.3kb和3.0kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。
根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到含pfkB基因的質粒pNT43。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖9)。
將該pNT43 DNA 0.5μg用限制性酶ClaI和SacI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收1.3kb的片段。
將實施例1-1)中得到的pPAC31 DNA 0.2μg用限制性酶ClaI和SacI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收5.7kb的DNA片段。
將該1.3kb和5.7kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。
根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到表達pfkB的質粒pNT47。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖9)。
實施例8.UDP-GlcNAc的生產用與實施例2相同的方法培養在實施例7中得到的大腸埃希氏菌KY8415/pNT14，NM522/pNT24，NM522/pNT44，NM522/pNT47株，將得到的各培養物離心分離得到濕菌體。必要時可將濕菌體保存于-20℃，并于使用前解凍。
將由大腸埃希氏菌NM522/pNT24濕菌體6g/l，NM522/pNT47濕菌體6g/l，100mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)，6mM MgCl2.6H2O，10mM葡萄糖-6-磷酸，2.5mM果糖-6-磷酸，2.5mM ATP，Nymeen S-2154g/l組成的0.1ml反應液加入到1.5ml的試管中，37℃反應1小時。將反應液在65℃處理5分鐘后，添加菌體和底物如大腸埃希氏菌KY8415/pNT14濕菌體0.3g/l，NM522/pNT44濕菌體6g/l，5mM葡糖胺-6-磷酸，5mM乙酰輔酶A，5mM UTP，于37℃再反應30分鐘；在反應液中生成了2.5mM(1.6g/l)的UDP-GlcNAc(2Na鹽)。而在不添加大腸埃希氏菌NM522/pNT24株濕菌體或NM522/pNT47株濕菌體時，UDP-GlcNAc的生成量分別為0.08mM和0.16mM。
這些結果表明通過將pgm表達株和pfkB表達株組合起來，就可以提供對glmM的活性表達必需的Glc-1，6-P2。
實施例9.UDP-GlcNAc的生產用與實施例2相同的方法培養在實施例7中得到的大腸埃希氏菌KY8415/pNT14，NM522/pNT24，NM522/pNT44，NM522/pNT46，NM522/pNT47株，將得到的各培養物離心分離得到濕菌體。另外，可用同實施例2相同的方法培養產氨棒桿菌ATCC21170株，并離心分離得到的培養物以得到濕菌體。必要時可將濕菌體保存于-20℃，并于使用前解凍。
將由大腸埃希氏菌KY8415/pNT14株，NM522/pNT24，NM522/pNT44，NM522/pNT47株，NM522/pNT46株的濕菌體各10g/l，產氨棒桿菌ATCC21170株150g/l，果糖50g/l，葡糖胺鹽酸鹽80g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，乳清酸(鉀鹽)10g/l，NymeenS-215 4g/l，二甲苯10ml/l組成的30ml反應液加入到200ml的燒杯中，將該反應液在磁性攪拌子的攪拌下(900rpm)于32℃反應10小時。
在反應中用4N NaOH維持pH在7.2，必要時加入果糖，KH2PO4。
通過該反應，在反應液中生產了6.2g/l的UDP-GlcNAc(2Na鹽)。
實施例10.galK表達質粒的構建將實施例3-1)中得到的pNT25 DNA 0.5μg用限制性酶ClaI和EcoRV切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene CleanII試劑盒回收6.7kb的DNA片段。所回收的DNA片段用DNA末端平滑化試劑盒使其末端平滑后，用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。
根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到表達galK的質粒pNT54。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖10)。
實施例11.UDP-GlcNAc的生產用與實施例2同樣的方法將在實施例10中得到的大腸埃希氏菌NM522/pNT54株，將得到的培養物離心分離得到濕菌體。另外，用與實施例2同樣的方法培養產氨棒桿菌ATCC21170株，將得到的培養物離心分離，得到濕菌體。必要時可將該濕菌體保存在-20℃，在使用前解凍。
將由大腸埃希氏菌NM522/pNT54株濕菌體50g/l，產氨棒桿菌ATCC21170株濕菌體150g/l，果糖40g/l，N-乙酰葡糖胺67g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，乳清酸(鉀鹽)10g/l，Nymeen S-215 4g/l，二甲苯10ml/l組成的反應液30ml接種到200ml的燒杯中，在磁性攪拌子的攪拌下(900rpm)攪拌下，于32℃反應27小時。
在反應中用4N NaOH使pH維持在7.2，必要時加入葡萄糖和KH2PO4。
通過該反應，在反應液中生成了17.1g/l的UDP-GlcNAc(2Na鹽)。
實施例12.UDP-GlcNAc與UDP-Gal的同時生產用與實施例2同樣的方法培養在實施例3中得到的大腸埃希氏菌NM522/pNT25株，將得到的培養物離心分離得到濕菌體。另外，用與實施例2同樣的方法培養產氨棒桿菌ATCC21170株，將得到的培養物離心分離，得到濕菌體。必要時可將該濕菌體保存在-20℃，在使用前解凍。
將由大腸埃希氏菌NM522/pNT25株濕菌體25g/l，產氨棒桿菌ATCC21170株濕菌體150g/l，果糖60g/l，N-乙酰葡糖胺50g/l，半乳糖40g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，乳清酸(鉀鹽)10g/l，Nymeen S-215 4g/l，二甲苯10ml/l組成的反應液30ml接種到200ml的燒杯中，在磁性攪拌子的攪拌下(900rpm)攪拌下，于32℃反應24小時。
在反應中用4N NaOH使pH維持在7.2，必要時加入KH2PO4。
通過該反應，在反應液中生成了11.4g/l的UDP-GlcNAc(2Na鹽)和18g/l UDP-Gal(2Na鹽)。
實施例13.manB，manC，pgm，pfkB表達質粒的構建1)manB，manC表達質粒的構建合成了序列號17的有義鏈DNA引物，序列號18的反義鏈DNA引物；以該合成的DNA作為引物，大腸埃希氏菌W3110株的染色體DNA作為模板，用上述的相同條件進行PCR。
PCR結束后，用乙醇沉淀法獲得DNA沉淀。該DNA沉淀用20μlTE溶解。將該溶解液5μl用DNA限制性酶HindIII和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene CleanII試劑盒回收3.0kb的片段。將pBluescriptII SK+DNA 0.2μg用限制性酶HindIII和BamHI切斷后，瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收3.0kb的片段。
將該兩個3.0kb的片段用連接反應試劑盒在16℃進行16小時連接反應。根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基上，于30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到含manB和manC的質粒pNK6。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖11)。
將該pNK6 DNA 0.5μg用限制性酶ClaI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收3.0kb的DNA片段。將在實施例1-1)中得到的pPAC31 DNA 0.2μg用限制性酶ClaI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收5.5kb的DNA片段。
將該3.0kb和5.5kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到同時表達manB和manC的質粒pNK7。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖11)。
2)同時表達pgm，pfkB質粒的構建將實施例7中得到的pNT24的DNA 0.5μg用DNA限制性酶XhoI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene Clean II試劑盒回收3.0kb的片段。另一方面將pSTV28 DNA(寶酒造社制)0.2μg用限制性酶SalI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收3.0kb的DNA片段。
將該兩個3.0kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含10μg/ml氯霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到表達pgm基因的質粒pNT53。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖12)。
合成了序列號19的有義鏈DNA引物，以該有義鏈DNA的引物和序列號16的反義鏈DNA引物作為引物，實施例7中得到的質粒pNT47作為模板，用上述的相同條件進行PCR。
PCR結束后，用乙醇沉淀法獲得DNA沉淀。該DNA沉淀用20μl TE溶解。將該溶解液5μl用DNA限制性酶EcoRV和BglII切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收1.3kb的片段。將pNT53 DNA 0.2μg用限制性酶SmalI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收6.0kb的DNA片段。
將該1.3kb和6.0kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含10μg/ml氯霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到表達pgm和pfkB的質粒pNT55。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖12)。
實施例14.GDP-Man的生產1)manB，manC，pgm，pfkB的表達株的制備根據常規方法用在實施例13-2)中得到的pNT55轉化大腸埃希氏菌NM522/pNK7，將該轉化體涂布在含50μg/ml和10μg/ml氯霉素的LB培養基，于30℃培養過夜。從所選擇的生長的轉化體中得到表達manB，manC，pgm，pfkB的表達株大腸埃希氏菌NM522/pNK7/pNT55株。
2)GDP-Man的生產用與實施例2同樣的方法分別培養在上述1)中得到的大腸埃希氏菌NM522/pNK7/pNT55和實施例7中得到的大腸埃希氏菌NM522/pNT46株，將得到的培養物離心分離得到濕菌體。另外，用與實施例2同樣的方法培養產氨棒桿菌ATCC21170株，將得到的培養物離心分離，得到濕菌體。必要時可將該濕菌體保存在-20℃，在使用前解凍。
將由大腸埃希氏菌NM522/pNK7/pNT55株濕菌體25g/l，產氨棒桿菌ATCC21170株濕菌體150g/l，果糖60g/l，甘露糖50g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，GMP(2Na，7H2O鹽)60g/l，NymeenS-215 4g/l，二甲苯10ml/l組成的反應液30ml接種到200ml的燒杯中，在磁性攪拌子的攪拌下(900rpm)攪拌下，于32℃反應24小時。
在反應中用4N NaOH使pH維持在7.2，必要時加入KH2PO4。
通過該反應，在反應液中生成了14.6g/l的UDP-Man(2Na，1H2O鹽)。
實施例15.gmd，wcaG表達質粒的構建合成了序列號20的有義鏈DNA引物，序列號21的反義鏈DNA引物；以該合成的DNA作為引物，大腸埃希氏菌W3110株的染色體DNA作為模板，用上述的相同條件進行PCR。
PCR結束后，用乙醇沉淀法獲得DNA沉淀。該DNA沉淀用20μl TE溶解。將該溶解液5μl用DNA限制性酶HindIII和XhoI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene Clean II試劑盒回收2.3kb的片段。
將實施例1-1)中得到的pPA31 DNA 0.2μg用限制性酶HindIII和SalI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收3.9kb的DNA片段。
將該2.3kb和3.9kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。
根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到表達gmd，wcaG的質粒pNK8。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖13)。
實施例16.GDP-Fuc的生產用與實施例2同樣的方法將在實施例14中得到的大腸埃希氏菌NM522/pNK7/pNT55，在實施例15中得到的NM522/pNK8株和實施例7中得到的NM522/pNT46株，將得到的各培養物離心分離得到濕菌體。另外，用與實施例2同樣的方法培養產氨棒桿菌ATCC21170株，將得到的培養物離心分離，得到濕菌體。必要時可將該濕菌體保存在-20℃，在使用前解凍。
將由大腸埃希氏菌NM522/pNK7/pNT55株濕菌體25g/l，大腸埃希氏菌NM522/pNK8 25g/l，大腸埃希氏菌NM522/pNT46 25g/l，產氨棒桿菌ATCC21170株濕菌體150g/l，果糖40g/l，甘露糖60g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，GMP(2Na，7H2O鹽)60g/l，NymeenS-215 4g/l，二甲苯10ml/l組成的反應液30ml接種到200ml的燒杯中，在磁性攪拌子的攪拌下(900rpm)攪拌下，于32℃反應24小時。
在反應中用4N NaOH使pH維持在7.2，必要時加入KH2PO4。
通過該反應，在反應液中生成了1.0g/l的UDP-Fuc(2.5Na，1H2O鹽)。
實施例17.neuA表達質粒的構建用同實施例1同樣的方法制備大腸埃希氏菌K235株(ATCC 13027)。
合成了序列號22的有義鏈DNA引物，序列號23的反義鏈DNA引物；以該合成的DNA作為引物，大腸埃希氏菌K235株(ATCC13027)的染色體DNA作為模板，用上述的相同條件進行PCR。
PCR結束后，用乙醇沉淀法獲得DNA沉淀。該DNA沉淀用20μl TE溶解。將該溶解液5μl用DNA限制性酶EcoRI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene CleanII試劑盒回收1.3kb的片段。將pBluescript IISK+DNA 0.2μg用限制性酶EcoRI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收3.0kb的DNA片段。
將該1.3kb和3.0kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。
根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到表達neuA的質粒pTA12。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖14)。
將pTA12 DNA 0.5μg用限制性酶ClaI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收1.3kb的DNA片段。將實施例1-1)中得到pPAC31 DNA 0.2μg用限制性酶ClaI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收5.5kb的DNA片段。
將該1.3kb和5.5kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。
根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到表達neuA的質粒pTA14。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖14)。
實施例18.CMP-NeuAc的生產用與實施例2同樣的方法將在實施例17中得到的大腸埃希氏菌NM522/pTA14C600/pNAL1株[應用和環境微生物學.，51，562(1986)]和JF646/pMW5株[生物化學雜志.，261，5568(1986)]，將得到的各培養物離心分離得到濕菌體。另外，用與實施例2同樣的方法培養產氨棒桿菌ATCC21170株，將得到的培養物離心分離，得到濕菌體。必要時可將該濕菌體保存在-20℃，在使用前解凍。
將由大腸埃希氏菌NM522/pTA14株濕菌體50g/l，大腸埃希氏菌C600/pNAL1濕菌體15g/l，大腸埃希氏菌JF646/pMW5株濕菌體25g/l，產氨棒桿菌ATCC21170株濕菌體150g/l，乳清酸(鉀鹽)10g/l，丙酮酸(鈉鹽)20g/l，果糖40g/l，N-乙酰甘露糖胺10g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，Nymeen S-215 4g/l，二甲苯10ml/l組成的反應液30ml接種到200ml的燒杯中，在磁性攪拌子的攪拌下(900rpm)攪拌下，于32℃反應24小時。
在反應中用4N NaOH使pH維持在7.2，必要時加入KH2PO4。
通過該反應，在反應液中生成了2.7g/l的CMP-NeuAc(Na鹽)。
實施例19.乳-N-四糖的生產1)β1，3-半乳糖基轉移酶的制備將用含編碼蛋白質A的IgG的結合區和β1，3-半乳糖基轉移酶的融合蛋白的基因的質粒pAMoERSAW1(特開平6-181759)轉化的namalwaKJM-1的細胞株，以5×104細胞/ml的濃度懸浮在含0.5mg/mlG418(Gibco)的30ml RPMI 640。ITPSGF培養基中，于37℃在CO2培養箱中培養8天。
將該培養液離心得到去除了細胞的上清。必要時，可將該上清保存在-80℃，并在使用前解凍。
向已形成了蛋白質A的IgG結合區與β1，3-半乳糖基轉移酶的融合蛋白的上清中加入疊氮化鈉至終濃度為0.1％并加入已根據生產商的說明預處理過的IgG Sepharose(Pharmacia)50μl；4℃緩慢攪拌過夜。
攪拌后，通過離心分離回收結合了IgG Sepharose的β1，3-半乳糖基轉移酶，用1ml的RPMI 640。ITPSGF培養基洗滌3次，將該IgGSepharose用作β1，3-半乳糖基轉移酶的酶源。
2)乳-N-四糖的生產根據已知的方法[農業生物化學.，54，2169(1990)]用2-氨基吡啶對乳-N-新四糖(Oxford Glycosystems)進行熒光標記并與0.1Uβ-半乳糖苷酶(生化學工業社制)混合，然后在37℃反應16小時以去除非還原端的半乳糖。
將該反應液在100℃加熱5分鐘，使β-半乳糖苷酶失活。
將在該反應液中得到的GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc作為復合糖類的前體物質。
將有該復合糖類前體物質0.5mM，上述步驟1)中得到的IgGSepharose結合的β1，3-半乳糖基轉移酶0.5U，含實施例4得到的UDP-Gal的反應液6μl(5mM)，100mM Tris-HCl(pH 7.9)，10mMMnCl2，2mM 2-巰基乙醇組成的反應液36μl，于32℃反應65小時。
反應結束后，用下述條件的HPLC對該反應液中積累的生物物質進行定量。
柱子TSKgel ODS-80TM柱(4.6mm×30cm，TOSOH社制)液相0.02M醋酸氨緩沖液(pH4.0)溫度50℃流速1ml/min檢出熒光檢測器(激發波長320hm，發射波長400nm)通過將標記產物的洗脫時間與氨基吡啶標記乳-N-四糖的洗脫時間進行比較而對產物進行鑒定。
通過該反應，生產了0.17mM(0.12g/l)乳-N-四糖。
實施例20.乳-N-新四糖的生產用與實施例19相同的方法，從乳-N-新四糖制備GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc并用作復合糖類的前體物質。
將有該復合糖類前體物質0.5mM，1，4-半乳糖基轉移酶(Sigma)0.5U，含實施例4得到的UDP-Gal的反應液6μl(5mM)，100mMTris-HCl(pH 7.9)，10mM MnCl2，2mM 2-巰基乙醇組成的反應液36μl，于32℃反應65小時。
反應結束后，用與實施例19-2)相同的條件的HPLC對該反應液中積累的生物物質進行定量。另外，通過將標記產物的洗脫時間與氨基吡啶標記乳-N-新四糖的洗脫時間進行比較而對產物進行鑒定。
通過該反應，生產了0.15mM(0.11g/l)的乳-N-新四糖。
實施例21.乳-N-巖藻五糖III的生產以與實施例19-1)同樣的方式，IgG Sepharose連接的α1，3-巖藻糖基轉移酶的制備來源于用質粒pAMoA-FT6轉化的namalwa細胞系KJM-1(生物化學雜志.，269，14730(1994))并被用作α1，3-巖藻糖基轉移酶的酶源，其中該質粒含有編碼蛋白質A IgG結合區與α1，3-巖藻糖基轉移酶的融合蛋白的基因。
在由0.25mM乳-N-四糖(Oxford Glycosystems)，1.0U IgGSepharose連接的α1，3-巖藻糖基轉移酶，6μl含實施例16的GDP-Fuc(0.25mM)的反應液，100mM Tris-HCl(pH 7.9)，10mM MnCl2組成的50μl反應液于37℃放置24小時。
反應結束后，以Dionex產的糖分析儀(DX-50)對反應液中所積累的產物量進行測定。通過將產物的洗脫時間與乳-N-巖藻五糖III(OxfordGlycosystems)的洗脫時間進行比較而對產物進行鑒定。
實施例22.α1，4-半乳糖基轉移酶(lgtC)表達質粒的構建以與實施例1相同的方法制備淋病奈瑟氏球菌(ATCC 33084)的染色體DNA。
合成了序列號24的有義鏈DNA引物，序列號25的反義鏈DNA引物；以該合成的DNA作為引物，淋病奈瑟氏球菌(ATCC 33084)的染色體DNA作為模板，用上述的相同條件進行PCR。
PCR結束后，用乙醇沉淀法獲得DNA沉淀。該DNA沉淀用20μl TE溶解。將該溶解液5μl用DNA限制性酶HindIII和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene Clean II試劑盒回收1.0kb的片段。將實施例1-1)中得到的pPA31 DNA 0.2μg用限制性酶HindIII和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收4.2kb的DNA片段。
將該1.0kb和4.2kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。
根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到表達lgtC的質粒pGT3。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖15)。
實施例23.球狀三糖的生產用與實施例2同樣的方法將在實施例4中得到的大腸埃希氏菌NM522/pNT25/pNT32株，和在實施例22得到的大腸埃希氏菌NM522/pGT3進行培養，將得到的各培養物離心分離得到濕菌體。另外，用與實施例2同樣的方法培養產氨棒桿菌ATCC21170株，將得到的培養物離心分離，得到濕菌體。必要時可將該濕菌體保存在-20℃，在使用前解凍。
將由大腸埃希氏菌NM522/pNT25/pNT32株濕菌體50g/l，大腸埃希氏菌NM522/pGT3濕菌體150g/l，產氨棒桿菌ATCC21170株濕菌體150g/l，果糖100g/l，半乳糖100g/l，乳糖100g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，乳清酸(鉀鹽)10g/l，NymeenS-215 4g/l，二甲苯10ml/l組成的反應液30ml接種到200ml的燒杯中，在磁性攪拌子的攪拌下(900rpm)攪拌下，于32℃反應26小時。
在反應中用4N NaOH使pH維持在7.2，必要時加入半乳糖，乳糖，果糖和KH2PO4。
通過該反應，在反應液中生成了188g/l的球狀三糖。
將該反應液離心去除菌體，得到10ml上清，將上清用活性炭方法進行純化，得到1.5g球狀三糖的白色粉末。
實施例24.Galα1-4Galβ1-4GlcNAc的生產用與實施例2同樣的方法將在實施例4中得到的大腸埃希氏菌NM522/pNT25/pNT32株，和在實施例22得到的大腸埃希氏菌NM522/pGT3進行培養，將得到的各培養物離心分離得到濕菌體。另外，用與實施例2同樣的方法培養產氨棒桿菌ATCC21170株，將得到的培養物離心分離，得到濕菌體。必要時可將該濕菌體保存在-20℃，在使用前解凍。
將由大腸埃希氏菌NM522/pNT25/pNT32株濕菌體50g/l，大腸埃希氏菌NM522/pGT3濕菌體50g/l，產氨棒桿菌ATCC21170株濕菌體150g/l，果糖50g/l，半乳糖50g/l，N-乙酰乳糖胺96g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，乳清酸(鉀鹽)10g/l，NymeenS-215 4g/l，二甲苯10ml/l組成的反應液30ml接種到200ml的燒杯中，在磁性攪拌子的攪拌下(900rpm)攪拌下，于32℃反應23小時。
在反應中用4N NaOH使pH維持在7.2，必要時加入半乳糖，果糖和KH2PO4。
通過該反應，在反應液中生成了10g/l Galα1-4Galβ1-4GlcNAc。
將該反應液離心去除菌體，得到30ml上清，將上清用活性炭方法進行純化，得到0.2g Galα1-4Galβ1-4GlcNAc的白色粉末。
實施例25.β1，4-半乳糖基轉移酶(lgt B)表達質粒的構建合成了序列號26的有義鏈DNA引物，序列號27的反義鏈DNA引物；以該合成的DNA作為引物，淋病奈瑟氏球菌(ATCC 33084)的染色體DNA作為模板，用上述的相同條件進行PCR。
PCR結束后，用乙醇沉淀法獲得DNA沉淀。該DNA沉淀用20μl TE溶解。將該溶解液5μl用DNA限制性酶HindIII和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，用Gene Clean II試劑盒回收0.8kb的片段。將pBluescriptII SK+DNA 0.2μg用限制性酶HindIII和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收3.0kb的DNA片段。
將該0.8kb和3.0kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到表達lgtB的質粒pNT60P。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖16)。
pNT60P DNA 0.5μg用限制性酶ClaI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，分離得到0.8kb的片段。將實施例1-1)中得到的pPA31 DNA 0.2μg用限制性酶ClaI和BamHI切斷后，上瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，同樣地回收5.5kb的DNA片段。
將該0.8kb和5.5kb DNA片段用連接反應試劑盒，于16℃進行16小時的連接反應。根據上述已知的方法用該連接反應液轉化大腸埃希氏菌NM522株，將該轉化體涂布在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基中，30℃培養過夜。
用上述已知的方法從生長的轉化體菌落中回收質粒，得到表達lgtB的質粒pNT60。用限制性酶消化以確證該質粒的結構(圖16)。
實施例26.N-乙酰乳糖胺的生產用與實施例2同樣的方法將在實施例25中得到的大腸埃希氏菌NM522/pNT60株，和在實施例3得到的大腸埃希氏菌NM522/pNT25進行培養，將得到的各培養物離心分離得到濕菌體。另外，用與實施例2同樣的方法培養產氨棒桿菌ATCC21170株，將得到的培養物離心分離，得到濕菌體。必要時可將該濕菌體保存在-20℃，在使用前解凍。
將由大腸埃希氏菌NM522/pNT25株濕菌體50g/l，大腸埃希氏菌NM522/pNT60濕菌體50g/l，產氨棒桿菌ATCC21170株濕菌體150g/l，乳清酸(鉀鹽)10g/l，果糖100g/l，N-乙酰葡糖胺100g/l，半乳糖100g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，Nymeen S-2154g/l，二甲苯10ml/l組成的反應液30ml接種到200ml的燒杯中，在磁性攪拌子的攪拌下(900rpm)攪拌下，于32℃反應34小時。
在反應中用4N NaOH使pH維持在7.2，必要時加入半乳糖，果糖和KH2PO4。
通過該反應，在反應液中生成了114g/l N-乙酰乳糖胺。
實施例27.乳糖的生產用與實施例2同樣的方法將在實施例25中得到的大腸埃希氏菌NM522/pNT60株，和在實施例3得到的大腸埃希氏菌NM522/pNT25進行培養，將得到的各培養物離心分離得到濕菌體。另外，用與實施例2同樣的方法培養產氨棒桿菌ATCC21170株，將得到的培養物離心分離，得到濕菌體。必要時可將該濕菌體保存在-20℃，在使用前解凍。
將由大腸埃希氏菌NM522/pNT25株濕菌體50g/l，大腸埃希氏菌NM522/pNT60濕菌體50g/l，產氨棒桿菌ATCC21170株濕菌體150g/l，乳清酸(鉀鹽)10g/l，葡萄糖115g/l，半乳糖115g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，Nymeen S-215 4g/l，二甲苯10ml/l組成的反應液30ml接種到200ml的燒杯中，在磁性攪拌子的攪拌下(900rpm)攪拌下，于32℃反應15小時。
在反應中用4N NaOH使pH維持在7.2，必要時加入KH2PO4。
通過該反應，在反應液中生成了49g/l乳糖。
實施例28.球狀三糖的生產用與實施例2同樣的方法將在實施例25中得到的大腸埃希氏菌NM522/pNT60株，和在實施例3得到的大腸埃希氏菌NM522/pNT25和在實施例22得到的大腸埃希氏菌NM522/pGT3進行培養，將得到的各培養物離心分離得到濕菌體。另外，用與實施例2同樣的方法培養產氨棒桿菌ATCC21170株，將得到的培養物離心分離，得到濕菌體。必要時可將該濕菌體保存在-20℃，在使用前解凍。
將由大腸埃希氏菌NM522/pNT25株濕菌體50g/l，大腸埃希氏菌NM522/pNT60濕菌體50g/l，大腸埃希氏菌NM522/pGT3 50g/l，產氨棒桿菌ATCC21170株濕菌體150g/l，乳清酸(鉀鹽)10g/l，葡萄糖115g/l，半乳糖115g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，Nymeen S-215 4g/l，二甲苯10ml/l組成的反應液30ml接種到200ml的燒杯中，在磁性攪拌子的攪拌下(900rpm)攪拌下，于32℃反應13小時。
在反應中用4N NaOH使pH維持在7.2，必要時加入KH2PO4。
通過該反應，在反應液中生成了5g/l球狀三糖。
在工業上應用的可能性通過本發明，可以大規模的高效地以核苷酸的前體物質和糖為原料制備糖核苷酸，以及以糖核苷酸和復合糖類前體物質制備復合糖類。
序列表序列號1序列長度31序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列GGAGAAAGCT TATGGCTGCC ATTAATACGA A 31序列號2序列長度30序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列AACACGGATC CGGATGTTAC TTCTTAATGC30序列號3序列長度28序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列ATGGAGGATC CTGCTCTGTA TACCGTCT 28序列號4序列長度20序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列TGCTGGTCGA CCTGCGCTTG 20
序列號5序列長度31序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列AAGGAAAGCT TATGACGCAA TTTAATCCCG T 31序列號6序列長度20序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列GCAAAGTTAA CAGTCGGTAC20序列號7序列長度31序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列TCAGGAAGCT TATGTTGAAT AATGCTATGA G 31序列號8序列長度27序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列TCTCCGGATC CCATGTGACC GGGTTAG27
序列號9序列長度28序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列TCTAAATCGA TGCAGACAAA GGACAAAG28序列號10序列長度27序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列TTGCAGGATC CTCGTAGGCC TGATAAG 27序列號11序列長度20序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列TGATATCCGC TCCCTTTCCG 20序列號12序列長度26序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列ACAGCGGATC CGATGTGTTC GCTGAG 26
序列號13序列長度29序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列ACAGCAAGCT TTTGACTTTA GCGGAGCAG 29序列號14序列長度29序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列GAGTTGGATC CCGATATAAA AGGAAGGAT 29序列號15序列長度25序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列TTTTTAAGCT TCATTTATCA AGAGT 28序列號16序列長度31序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列TTTTTGATAT CCCCAATGCT GGGGGTTTTT G 31
序列號17序列長度31序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列CGTCAAAGCT TAAATGATAT TCGGGGATAA T31序列號18序列長度25序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列AGGGAGGATC CGACATTACG CGTTC 25序列號19序列長度33序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列CCGCAAGATC TCGTAAAAAG GGTATCGATA AGC 33序列號20序列長度27序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列TTGGGAAGCT TCCGGCAAAT GTGGTTT 27
序列號21序列長度25序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列ATAAACTCGA GAGAGACAAG CGGAG 25序列號22序列長度27序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列TATTATCGAT GAATTAATAA TTCATAG27序列號23序列長度25序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列CTCTGGATCC AGTTACGTAT AATAT 25序列號24序列長度30序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列CGGCAAGCTT ATTGTGCCTT TCCAATAAAA 30
序列號25序列長度28序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列ACTTGGATCC CCGTCAATAA ATCTTGCG 28序列號26序列長度30序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列GGTAAAGCTT ATGCAAAACC ACGTTATCAG 30序列號27序列長度29序列類型核酸拓撲學單鏈序列種類其它核酸，合成的DNA配列AAACGGATCC TTATTGGAAA GGCACAATA 29
權利要求
1.一種復合糖類的制備方法，其特征在于以a)能從核苷酸的前體物質產生核苷-5’-三磷酸(下文簡稱NTP)的微生物的培養液或該培養液的處理物，和b)能從糖和NTP產生糖核苷酸的微生物的培養液或該培養液的處理物，和c)能從糖核苷酸和復合糖類前體產生復合糖類的微生物，動物細胞或昆蟲細胞的培養液或該培養液的處理物作為酶源；使這些酶源，核苷酸的前體物質以及糖和復合糖類的前體物質存在于水溶性介質中，在該水溶性介質中生成并積累復合糖類；以及從該水溶性介質中回收復合糖類。
2.權利要求1所述的制備方法，其特征在于其中培養液的處理物是培養液的濃縮物，培養液的干燥物，培養物離心分離得到的培養上清，該培養上清的濃縮物，從培養上清得到的酶樣品，從培養液離心分離得到的細胞，該細胞的干燥物，該細胞的冷凍干燥物，該細胞的表面活性劑處理物，該細胞的超聲波處理物，該細胞的機械磨碎處理物，該細胞的溶劑處理物，該細胞的酶處理物，該細胞的蛋白質分級分離物，該細胞的固定化物或者從該細胞回收得到的酶樣品等。
3.權利要求1所述的制備方法，其中核苷酸的前體物質為乳清酸，尿嘧啶，乳清苷，尿苷，胞嘧啶，胞苷，腺嘌呤，腺苷，鳥嘌呤，鳥苷，次黃嘌呤，肌苷，黃嘌呤，黃苷，肌苷-5’-一磷酸，黃苷-5’-一磷酸，鳥苷-5’-一磷酸，尿苷-5’-一磷酸，胞苷-5’-一磷酸等。
4.權利要求1所述的制備方法，其中糖核苷酸是尿苷二磷酸化合物，鳥苷二磷酸化合物或胞苷一磷酸化合物。
5.權利要求4的制備方法，其中尿苷二磷酸化合物，鳥苷二磷酸化合物或胞苷一磷酸化合物是選自如下的化合物及其衍生物的化合物尿苷二磷酸葡萄糖，尿苷二磷酸半乳糖，尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺，尿苷二磷酸-N-乙酰半乳糖胺，尿苷二磷酸葡糖醛酸，鳥苷二磷酸甘露糖，鳥苷二磷酸巖藻糖，胞苷一磷酸-N-乙酰神經氨酸。
6.權利要求1的制備方法，其中糖選自葡萄糖，果糖，半乳糖，葡糖胺，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰半乳糖胺，甘露糖，巖藻糖，N-乙酰甘露糖胺，N-乙酰神經氨酸及其衍生物。
7.權利要求1的制備方法，其中復合糖類為含有選自如下的1個或1個以上的糖的復合糖類或含有該復合糖類的復合糖類葡萄糖，半乳糖，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰半乳糖胺，葡糖醛酸，甘露糖，N-乙酰甘露糖胺，巖藻糖，唾液酸，乳糖，N-乙酰乳糖胺，乳-N-二糖，GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，GlcNAcβ1-4Galβ1-4Glc，球狀三糖(globotriose)，Galα1-4Galβ1-4GlcNAc，2’-巖藻糖基乳糖，3-巖藻糖基乳糖，3’-唾液酸基乳糖，6’-唾液酸基乳糖，3’-唾液酸基-N-乙酰基乳糖胺，6’-唾液酸基-N-乙酰基乳糖胺，唾液酸基-N-二糖，Lewis X，Lewis a，乳-N-四糖，乳-N-新四糖，乳二巖藻四糖，3’-唾液酸基-3-巖藻糖基乳糖，唾液酸基-Lewis X，唾液酸基-Lewis a，乳-N-巖藻五糖I，乳-N-巖藻五糖II，乳-N-巖藻五糖III，乳-N-巖藻五糖V，LS-四糖a，LS-四糖b，LS-四糖c，3’-唾液酸基乳-N-新四糖，乳-N-二巖藻己糖I，乳-N-二巖藻己糖II，乳-N-己糖，乳-N-新己糖，二唾液酸基乳-N-四糖及其衍生物。
8.權利要求1的制備方法，其中復合糖類是含選自如下的糖鍵的復合糖類或含該復合糖類的復合糖類Galβ 1-3 Glc、Galβ 1-4 Glc、Galβ1-3 Glc NAc、Galβ 1-4 Glc NAc、Galβ 1-3 Gal、Galβ1-4 Gal、Galβ 1-3 Gal NAc、Galβ 1-4 Gal NAc、Galα1-3 Glc、Galα 1-4 Glc、Galα 1-3 Glc NAc，Galα 1-4 Glc NAc、Galα 1-3 Gal、Galα 1-4 Gal、Galα 1-3 Gal NAc、Galα 1-4 Gal NAc、Glc NAcβ 1-3 Gal、Glc NAcβ1-4 Gal、Glc NAcβ 1-6 Gal、Glc NAcβ 1-3 Glc、Glc NAcβ 1-4 Glc、Glc NAcβ1-3 Glc NAc、Glc NAcβ1-4Glc NAc、Glc NAcβ 1-6 Gal NAc、Glc NAcβ 1-2 Man、Glc NAcβ 1-4 Man、Glc NAcβ 1-6 Man、Gal NAcβ 1-3 Gal、Gal NAcβ 1-4 Gal、Gal NAcβ 1-4 Glc NAc、Gal NAcα1-3 Gal NAc、Manβ 1-4 Glc NAc、Manα 1-6 Man.Manα1-3 Man，Manα 1-2 Man，Glc UAβ 1-4 Glc N、Glc UAβ 1-3 Gal、Glc UAβ 1-3 Glc NAc、Glc UAβ 1-3 Gal NAc、Neu Acα 2-3 Gal、Neu Acα 2-6 Gal、Neu Acα 2-3 Glc NAc、Neu Acα 2-6 Glc NAc、Neu Acα 2-3 Gal NAc、Neu Acα 2-6 Gal NAc、Neu Acα 2-8 Neu Ac、Fucα 1-3 Glc、Fucα 1-4 Glc、Fucα 1-3 Glc NAc、Fucα 1-4 Glc NAc、Fucα 1-2 Gal和Fucα 1-6 Gl-c NAc。
9.權利要求7或8的制備方法，其中復合糖類含10個以下的糖。
10.權利要求7或8的制備方法，其中復合糖類含6個以下的糖。
11.權利要求1的制備方法，其中復合糖類的前體物質為單糖，寡糖，蛋白質，肽，脂類，糖蛋白質，糖脂類，糖肽和甾類化合物。
12.權利要求11的制備方法，其中復合糖類前體物質為選自如下的復合糖類前體物質，或含該復合糖類前體物質的復合糖類前體物質葡萄糖，半乳糖，甘露糖，唾液酸，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰半乳糖胺，乳糖，N-乙酰乳糖胺，乳-N-二糖，GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，GlcNAcβ1-4Galβ1-4Glc，球狀三糖(globotriose)，Galα1-4Galβ1-4GlcNAc，2’-巖藻糖基乳糖，3-巖藻糖基乳糖，3’-唾液酸基乳糖，6’-唾液酸基乳糖，3’-唾液酸基-N-乙酰基乳糖胺，6’-唾液酸基-N-乙酰基乳糖胺，唾液酸基-N-二糖，Lewis X，Lewis a，乳-N-四糖，乳-N-新四糖，乳二巖藻四糖，3’-唾液酸基-3-巖藻糖基乳糖，唾液酸基-Lewis X，唾液酸基-Lewis a，乳-N-巖藻五糖I，乳-N-巖藻五糖II，乳-N-巖藻五糖III，乳-N-巖藻五糖V，LS-四糖a，LS-四糖b，LS-四糖c，3’-唾液酸基乳-N-新四糖及其衍生物，絲氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺及含這些氨基酸的肽及其衍生物，以及神經酰胺及其衍生物。
13.權利要求1的制備方法，其特征在于能從核苷酸前體物質產生NTP的微生物是選自棒桿菌屬的微生物。
14.權利要求13的制備方法，其特征在于棒桿菌屬的微生物是產氨棒桿菌。
15.權利要求1的方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的能力是由一種以上的微生物實現的。
16.權利要求15的制備方法，其特征在于微生物是選自埃希氏菌屬和棒桿菌屬的至少一種微生物。
17.權利要求16的方法，其中埃希氏菌屬的微生物是大腸埃希氏菌。
18.權利要求16的制備方法，其中棒桿菌屬的微生物是產氨棒桿菌。
19.權利要求1的方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的微生物是具有至少一種高活性的選自如下的酶的微生物葡糖激酶(下文簡稱glk)，磷酸葡糖變位酶(下文簡稱pgm)，葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基轉移酶(下文簡稱galU)和焦磷酸酶(下文簡稱ppa)。
20.權利要求19的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的能力是由至少一種含有重組DNA的微生物實現的，其中重組DNA包含一種載體和一種含有至少一種選自如下的基因的DNA片段編碼glk的基因，編碼pgm的基因，編碼galU的基因和編碼ppa的基因。
21.權利要求20的制備方法，其特征在于編碼glk的基因，編碼pgm的基因，編碼galU的基因和編碼ppa的基因是來源于大腸埃希氏菌的基因。
22.權利要求19的制備方法，其中糖核苷酸是尿苷二磷酸葡萄糖。
23.權利要求19的制備方法，其中微生物是尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶活性強的微生物，糖核苷酸是尿苷二磷酸葡萄糖。
24.權利要求1的制備方法，其中能從糖和NTP產生糖核苷酸的微生物是半乳糖激酶(下文簡稱galK)的微生物。
25.權利要求24的制備方法，其特征在于由權利要求24的galK活性強的微生物以N-乙酰葡糖胺為底物而提供N-乙酰葡糖胺-1-磷酸。
26.權利要求24的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的能力是由至少一種含有重組DNA的微生物實現的，其中重組DNA帶有含編碼galK基因的DNA片段和一種載體。
27.權利要求26的制備方法，其特征在于編碼galK的基因來源于大腸埃希氏菌。
28.權利要求24的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的微生物是半乳糖-1-磷酸尿苷酰基轉移酶(下文簡稱galT)活性強的微生物。
29.權利要求28的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的能力是由至少一種含有重組DNA的微生物實現的，其中該重組DNA帶有含編碼galT基因的DNA片段和一種載體。
30.權利要求29的制備方法，其特征在于編碼galT的基因來源于大腸埃希氏菌。
31.權利要求28的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的微生物是是具有至少一種高活性的選自如下的酶的微生物葡糖激酶(下文簡稱glk)，磷酸葡糖變位酶(下文簡稱pgm)，葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基轉移酶(下文簡稱galU)和焦磷酸酶(下文簡稱ppa)。
32.權利要求31的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的能力是由至少一種含有重組DNA的微生物實現的，其中重組DNA包含一種載體和一種含有至少一種選自如下的基因的DNA片段編碼glk的基因，編碼pgm的基因，編碼galU的基因和編碼ppa的基因。
33.權利要求32的制備方法，其特征在于編碼glk的基因，編碼pgm的基因，編碼galU的基因和編碼ppa的基因是來源于大腸埃希氏菌的基因。
34.權利要求28或31的制備方法，其中糖核苷酸是尿苷二磷酸半乳糖。
35.權利要求24的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的微生物是N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰基轉移酶(下文簡稱glmU)活性強的微生物。
36.權利要求35的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的能力是由至少一種含有重組DNA的微生物實現的，其中該重組DNA帶有含編碼glmU基因的DNA片段和一種載體。
37.權利要求36的制備方法，其特征在于編碼glmU的基因來源于大腸埃希氏菌。
38.權利要求1的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的微生物是磷酸葡糖變位酶(下文簡稱pgm)和磷酸果糖激酶(下文簡稱pfkB)活性強的微生物。
39.權利要求38的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的能力是由至少一種含有重組DNA的微生物實現的，其中該重組DNA帶有含選自編碼pgm基因和pfkB基因的至少一種的DNA片段和一種載體。
40.權利要求38的制備方法，其特征在于編碼pgm的基因，編碼pfkB的基因來源于大腸埃希氏菌。
41.權利要求38的制備方法，其特征在于葡萄糖-1，6-二磷酸是由權利要求38的pgm和pfkB活性強的微生物葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸為底物而提供的。
42.權利要求41的制備方法，其特征在于磷酸葡糖胺變位酶或磷酸甘露糖變位酶的活性被權利要求41提供的葡萄糖-1，6-二磷酸所增強。
43.權利要求38的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的微生物是具有至少一種高活性的選自如下的酶的微生物葡糖胺-1-磷酸乙酰轉移酶，N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸尿苷酰基轉移酶(下文簡稱glmU)，和焦磷酸酶(下文簡稱ppa)，磷酸葡糖胺變位酶(下文簡稱glM)和葡糖激酶(下文簡稱glk)。
44.權利要求43的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的能力是由至少一種含有重組DNA的微生物實現的，其中該微生物帶有含選自編碼glmU的基因，編碼ppa的基因，編碼glmM的基因和編碼glk的基因中至少一種的DNA片段和一種載體。
45.權利要求44的制備方法，其特征在于編碼glmU的基因，編碼ppa的基因，編碼glmM的基因和編碼glk的基因來源于大腸埃希氏菌。
46.權利要求24，35，38或43的制備方法，其中糖核苷酸是尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺。
47.權利要求24，35，38或43的制備方法，其中微生物是UDP-GlcNAc4-差向異構酶活性強的微生物，糖核苷酸是尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺。
48.權利要求38的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生核苷酸的微生物是其中選自如下的至少一種酶的活性強的微生物磷酸甘露糖變位酶(下文簡稱manB)，甘露糖-1-磷酸鳥苷酰基轉移酶(下文簡稱manC)，葡糖激酶(下文簡稱glk)。
49.權利要求48的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的能力是由至少一種含有重組DNA的微生物實現的，其中該重組DNA帶有含選自編碼manB的基因，編碼manC的基因和編碼glk的基因的至少一種的DNA片段和一種載體。
50.權利要求49的制備方法，其特征在于編碼manB的基因，編碼manC的基因和編碼glk的基因是來源于大腸埃希氏菌的基因。
51.權利要求38或48的制備方法，其中糖核苷酸是鳥苷二磷酸甘露糖。
52.權利要求38的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生核苷酸的微生物是其中選自如下的至少一種酶的活性強的微生物磷酸甘露糖變位酶(下文簡稱manB)，甘露糖-1-磷酸鳥苷酰基轉移酶(下文簡稱manC)，葡糖激酶(下文簡稱glk)，GDP-4，6-甘露糖脫水酶(下文簡稱gmd)，GDP-4-酮基-6-脫氧甘露糖差向異構酶/還原酶(下文簡稱wcaG)。
53.權利要求52的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的能力是由至少一種含有重組DNA的微生物實現的，其中該重組DNA帶有含選自編碼manB的基因，編碼manC的基因，編碼glk的基因，編碼gmd的基因和編碼wcaG的基因中的至少一種的DNA片段和一種載體。
54.權利要求53的制備方法，其特征在于編碼manB的基因，編碼manC的基因，編碼glk的基因，編碼gmd的基因和編碼wcaG的基因是來源于大腸埃希氏菌的基因。
55.權利要求38或52的制備方法，其中糖核苷酸是鳥苷二磷酸巖藻糖。
56.權利要求1的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的微生物是其中選自如下的至少一種酶的活性強的微生物GlcNAc2-差向異構酶，CMP-NeuAc合成酶(下文簡稱neuA)，NeuAc醛縮酶(下文簡稱nanA)，NeuAc合成酶(下文簡稱neuB)，CTP合成酶(下文簡稱pyrG)。
57.權利要求56的制備方法，其特征在于能從糖和NTP產生糖核苷酸的能力是由至少一種含有重組DNA的微生物實現的，其中該重組DNA帶有含選自編碼GlcNAc2-差向異構酶的基因，編碼neuA的基因，編碼nanA的基因，編碼neuB的基因，編碼pyrG的基因的基因中的至少一種的DNA片段和一種載體。
58.權利要求57的制備方法，其特征在于編碼neuA的基因，編碼nanA的基因，編碼neuB的基因，編碼pyrG的基因是來源于大腸埃希氏菌的基因。
59.權利要求56的制備方法，其中糖核苷酸是胞苷一磷酸-N-乙酰基神經氨酸。
60.權利要求1的制備方法，其特征在于能從糖核苷酸和復合糖類前體物質產生復合糖類的微生物是大腸埃希氏菌，啤酒糖酵母或產氨棒桿菌。
61.權利要求60的制備方法，其特征在于微生物是含有重組DNA的至少一種微生物，其中該重組DNA帶有含選自編碼葡糖基轉移酶，半乳糖基轉移酶，N-乙酰葡糖胺基轉移酶，N-乙酰半乳糖胺基轉移酶，葡糖醛酸基轉移酶，甘露糖基轉移酶，唾液酸基轉移酶和巖藻糖基轉移酶基因的轉移酶基因中的至少一種的DNA片段和一種載體。
62.權利要求61的制備方法，其特征在于編碼選自如下的酶的基因是來源于微生物的基因編碼葡糖基轉移酶，半乳糖基轉移酶，N-乙酰葡糖胺基轉移酶，N-乙酰半乳糖胺基轉移酶，葡糖醛酸基轉移酶，甘露糖基轉移酶，唾液酸基轉移酶和巖藻糖基轉移酶基因。
63.權利要求1的制備方法，其中動物細胞是COS-7細胞或namalwa KJM-1細胞；昆蟲細胞是sf9細胞。
64.權利要求1的制備方法，其特征在于動物細胞或昆蟲細胞是含有重組DNA的動物細胞或昆蟲細胞，其中含有選自編碼葡糖基轉移酶，半乳糖基轉移酶，N-乙酰葡糖胺基轉移酶，N-乙酰半乳糖胺基轉移酶，葡糖醛酸基轉移酶，甘露糖基轉移酶，唾液酸基轉移酶和巖藻糖基轉移酶基因的轉移酶基因中的至少一種的DNA片段和一種載體。
65.權利要求64的制備方法，其特征在于編碼選自如下的轉移酶的基因是來源于動物細胞的基因編碼葡糖基轉移酶，半乳糖基轉移酶，N-乙酰葡糖胺基轉移酶，N-乙酰半乳糖胺基轉移酶，葡糖醛酸基轉移酶，甘露糖基轉移酶，唾液酸基轉移酶和巖藻糖基轉移酶基因。
66.一種N-乙酰葡糖胺-1-磷酸的制備方法，其特征在于以權利要求24的galK活性強的微生物的培養液或該培養液的處理物作為酶源，使該酶源和N-乙酰葡糖胺存在于水溶性介質中，使在水溶性介質中生成并積累N-乙酰葡糖胺-1-磷酸，并從該水溶性介質中回收N-乙酰葡糖胺-1-磷酸。
67.權利要求66的制備方法，其中該微生物是帶有含編碼galK的基因DNA片段的重組DNA的微生物。
68.權利要求67的制備方法，其中編碼galK的基因是來源于大腸埃希氏菌的編碼半乳糖激酶的基因。
69.權利要求66的制備方法，其特征在于培養液的處理物是培養液的濃縮物，培養液的干燥物，培養物離心分離得到的培養上清，該培養上清的濃縮物，從培養上清得到的酶制品，從培養液離心分離得到的細胞，該細胞的干燥物，該細胞的冷凍干燥物，該細胞的表面活性劑處理物，該細胞的超聲波處理物，該細胞的機械磨碎處理物，該細胞的溶劑處理物，該細胞的酶處理物，該細胞的蛋白質分級分離物，該細胞的固定化物或者從該細胞抽提得到的酶樣品等。
全文摘要
一種利用下述酶源制備糖核苷酸類的方法a)一種任選地處理過的能從核苷酸前體產生NTP的微生物的培養物，和b)一種任選地處理過的能從糖和NTP產生糖核苷酸的微生物的培養物；一種利用下述酶源產生復合糖類的方法上述的培養物a)和b)，和c)一種任選地處理過的能從糖核苷酸和復合糖前體產生復合糖的微生物，動物細胞或昆蟲細胞的培養物；一種利用下述酶源產生復合糖類的方法一種任選地處理過的能從糖核苷酸和復合糖前體產生復合糖的微生物，動物細胞或昆蟲細胞的培養物；一種利用下述酶源產生N－乙酰基葡糖胺－1－磷酸的方法一種任選地處理過的能從具有潛在的半乳糖激酶活性的微生物的培養物。
文檔編號C12P19/30GK1550554SQ02141259
公開日2004年12月1日 申請日期1997年9月12日 優先權日1996年9月17日
發明者小泉聰司, 佐佐木克敏, 遠藤徹夫, 田畑和彥, 克敏, 夫, 彥 申請人:協和發酵工業株式會社