新型人骨髓基質細胞來源的1型磷酸酶抑制因子，其編碼序列及用途的制作方法

專利名稱：新型人骨髓基質細胞來源的1型磷酸酶抑制因子，其編碼序列及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和醫學領域，具體地說，本發明涉及新的人骨髓基質細胞來源的1型磷酸酶抑制因子IPP2，及其多核苷酸編碼序列。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。IPP2是一種與抗凋亡和記憶有關的細胞內可溶性蛋白，具有抵抗凋亡和維持記憶的功能。
背景技術：
磷酸化修飾是機體代謝和信號通路中最主要的，也是最快捷的調節方式。而這種方式是通過激酶和磷酸酶的完美協調來實現的，1型蛋白磷酸酶(PP-1)是一類非常重要的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，通過去磷酸化蛋白調節細胞周期、基因表達、蛋白合成、糖脂代謝，及記憶形成等生理功能。它由催化亞基和調節亞基組成，后者決定磷酸酶的底物特異性，活性以及亞細胞定位。1型磷酸酶抑制因子(IPP-1，inhibitor of protein phosphatase 1，)是第一個發現調節1型蛋白磷酸酶活性的內源性分子，IPP-1能夠抑制PP1對pCREB(cAMP反應元件結合蛋白)的脫磷酸，維持高水平的pCREB，而CREB的活化即磷酸化是許多細胞，特別是神經元存活和長時間記憶形成的必要條件。眾所周知，學習和記憶等高級生理活動都涉及到突觸LTP(長時間增強)的產生，PP1促進LTD(長時間的抑制)，而IPP-1通過抑制PP1促進LTP(長時間增強)的產生。RpcAMP(PKA的抑制劑)抑制HFS(high frequency stimulation)引起的突觸后神經元的LTP的產生，而磷酸化IPP-1能夠逆轉這種情況，可見，外界刺激通過PKA磷酸化IPP-1，進而抑制磷酸酶活性，導致一些信號通路蛋白和轉錄因子磷酸化程度的改變，引起細胞一系列的生理功能的改變。
鑒于與磷酸化有關的因子具有重要的生理功能，因此，本領域迫切需要開發新與與磷酸化有關的因子。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的入骨髓基質細胞來源的1型磷酸酶抑制因子IPP2蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發明的第一方面，提供新穎的分離出的IPP2多肽，該多肽是人源的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制巨噬細胞RAW 264.7凋亡功能的由(a)衍生的多肽。
在本發明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人IPP2的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中235-582位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1637位的序列。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了制備具有人IPP2蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達人IPP2蛋白的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有人IPP2蛋白活性的多肽。
在本發明的第五方面，提供了與上述的人IPP2多肽特異性結合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續的15-1637個核苷酸。
在本發明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗人IPP2多肽活性的化合物，以及抑制人IPP2多肽的表達的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人IPP2多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在IPP2蛋白的方法，它包括將樣品與IPP2蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在IPP2蛋白。
在本發明的第八方面，提供了一種檢測與人IPP2多肽異常表達相關的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發明的第九方面，提供了本發明多肽和編碼序列的用途。例如本發明多肽可被用于篩選促進人IPP2多肽活性的激動劑，或者篩選抑制人IPP2多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發明的人IPP2蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明的人IPP2多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體。這些藥物組合物可治療腫瘤、炎癥、神經系統和心血管病等病癥。
本發明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了本發明的人IPP2 RT-PCR表達分析結果，提示IPP2表達于某些腫瘤細胞。
圖2是本發明的人IPP2 Northern印跡雜交所顯示的分布。結果提示IPP2是一種具特定組織分布的分子。
圖3顯示了人IPP2抑制LPS誘導RAW 264.7的ERK活化。
圖4顯示了人IPP2抑制NO引起的RAW 264.7的凋亡。
圖5顯示了人IPP2維持NIH 3T3和PC-12細胞的磷酸化。
具體實施例方式
本發明人利用cDNA文庫大規模測序和EST同源比較的方法，從正常人骨髓基質細胞中分離到一種新型全長基因，全長為1637bp，含348bp編碼區，編碼116個氨基酸，與其他分子的同源性比較提示可能屬于1型磷酸酶的抑制亞基IPP-1家族。尤其在N端功能區與人IPP-1高度同源，因此將該新基因命名為IPP2。
RT-PCR顯示該分子在一些造血系腫瘤如Daudi、MOLT-4、Raji、THP-1、K562、HT-29、Hela、A549、NAM、TF-1、2162、Hut以及Hela、A549、HT29實體瘤中存在不同程度的表達。Northern印跡顯示IPP2mRNA在正常人的心臟、肝臟、骨骼肌、睪丸特異性表達，其中心肌和骨骼肌中有三個轉錄本。通過體外激酶分析證實該分子能夠抑制PP-1酶活性，且IC50與人IPP-1蛋白相似。同時發現IPP2分子能夠抑制LPS引起的ERK活化，并能抑制NO誘導RAW264.7凋亡。而IPP2瞬時轉染NIH 3T3和PC-12細胞，能夠維持8-Br-cAMP/IBMX引起的高水平的CREB磷酸化程度。而CREB的磷酸化能夠使抗凋亡蛋白Bcl-2表達上升。我們推測IPP2通過抑制PP1，維持一些信號蛋白和轉錄因子的活化，使一些存活蛋白表達上調。進而抵抗外界因素引起的細胞凋亡總之，IPP2作為一種新型的磷酸酶抑制因子，通過抑制磷酸酶，維持某些重要的信號通路中介分子或轉錄因子的磷酸化，傳遞和放大某些信號，在抗細胞凋亡、記憶形成、信號轉導等方面有著重要的作用，因此該分子在機體免疫功能的調節、抗腫瘤、抗病毒感染、神經退行性病變治療等多個領域中具有重要的開發和應用價值。
在本發明中，術語“IPP2蛋白”、“IPP2多肽”或“骨髓基質細胞來源的1型磷酸酶抑制因子IPP2”可互換使用，都指具有人骨髓基質細胞來源的1型磷酸酶抑制因子IPP2氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的IPP2蛋白或多肽”是指IPP2多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化IPP2蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括人IPP2蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的天然人IPP2蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發明中，術語“人IPP2多肽”指具有人IPP2蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與人IPP2蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人IPP2蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人IPP2 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人IPP2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人IPP2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了人IPP2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人IPP2多肽序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。
發明還提供人IPP2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人IPP2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，“人IPP2蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。
表1


本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼IPP2蛋白的多聚核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的人IPP2核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被優選用于獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，并可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或IPP2蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的IPP2多肽。一般來說有以下步驟
(1).用本發明的編碼人IPP2多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，人IPP2多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J BioChem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含人IPP2編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞； CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在復制起始點晚期一側的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的人IPP2蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療IPP2蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進或對抗IPP2蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人IPP2蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激人IPP2蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發明還包括對人IPP2 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人IPP2基因產物或片段。較佳地，指那些能與人IPP2基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制人IPP2蛋白的分子，也包括那些并不影響人IPP2蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人IPP2基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人IPP2基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人IPP2蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6∶511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hvbridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷人IPP2蛋白功能的抗體以及不影響人IPP2蛋白功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人IPP2基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人IPP2基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗人IPP2蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人IPP2蛋白。此外，與人IPP2蛋白結合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內可跟蹤其位置和分布。這種放射性標記的抗體可作為一種非創傷性診斷方法用于腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉移。
本發明中的抗體可用于治療或預防與人IPP2蛋白相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷人IPP2蛋白的產生或活性。
抗體也可用于設計成針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如人IPP2蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人IPP2蛋白陽性的細胞(例如淋巴結細胞等)。
多克隆抗體的生產可用人IPP2蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發明蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與IPP2蛋白發生相互作用的物質，如配體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
本發明的多肽或其激動劑或拮抗劑可直接用于疾病治療，例如，用于腫瘤、炎癥，神經系統和心血管病方面的治療。在使用時，還可同時使用其他治療劑，如IFN-α、IFN-β、TNF-α、TNF-β等。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明IPP2多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的IPP2蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。
人IPP2蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術可用于治療由于IPP2蛋白的無表達或異常/無活性的IPP2蛋白的表達所致的細胞增殖、發育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的IPP2蛋白，以抑制內源性的IPP2蛋白活性。來源于病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將IPP2基因轉移至細胞內。構建攜帶IPP2基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組人IPP2基因可包裝到脂質體中，然后再轉移至細胞內。
抑制人IPP2mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發明的范圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
能與人IPP2蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對人IPP2蛋白分子進行標記。
本發明還涉及定量和定位檢測人IPP2蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人IPP2蛋白水平，可以用作解釋人IPP2蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷IPP2蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在IPP2蛋白的方法是利用IPP2蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與IPP2蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在IPP2蛋白。
IPP2蛋白的多聚核苷酸可用于IPP2蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，IPP2蛋白的多聚核苷酸可用于檢測IPP2蛋白的表達與否或在疾病狀態下IPP2蛋白的異常表達。如IPP2DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷IPP2蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用IPP2蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測IPP2蛋白的轉錄產物。
檢測IPP2基因的突變也可用于診斷IPP2蛋白相關的疾病。IPP2蛋白突變的形式包括與正常野生型IPP2 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發明的序列對染色體鑒定也是有價值的。簡而言之，根據本發明IPP2蛋白的cDNA制備PCR引物(優選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應于引物的人基因的雜合細胞會產生擴增的片段。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數據相關聯。這些數據可見于例如，V.Mckusick，MendelianInheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary聯機獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業已定位到染色體區域上的疾病之間的關系。
在本發明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本發明的多核苷酸是從人骨髓基質細胞cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1637個堿基，其開放讀框位于235-582位，編碼全長為116個氨基酸的人IPP2蛋白(SEQ ID NO2)。該IPP2蛋白與1型磷酸酶抑制因子同源，有44％的一致性。Northern印跡雜交顯示其具有與OKL38不同的組織分布特征，在肝臟、心臟、睪丸及骨骼肌等組織中優勢表達。RT-PCR分析表明IPP2在一些造血系腫瘤如Daudi、MOLT-4、Raji、THP-1、K562、HT-29、Hela、A549、NAM、TF-1、2162、Hut以及Hela、A549、HT29實體瘤不同程度的表達。已進行的研究提示，IPP2具有與IPP2相似的抑制磷酸酶的功能，推測其為一新型磷酸酶抑制因子。現有的結果表明，IPP2與抗細胞凋亡和記憶有關，因此，IPP2蛋白或其相關的拮抗劑、激動劑等可為治療腫瘤等疾病提供新的免疫診斷和靶向治療途徑，因而具有巨大的應用前景。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人IPP2 cDNA的克隆用Trizol試劑(Life Technologies公司)提取人骨髓基質細胞總RNA。然后，從總RNA中分離poly(A)mRNA。將poly(A)mRNA經逆轉錄形成cDNA后，用SuperScriptII克隆試劑盒(Life Technologies)將cDNA片段定向插入到載體的多克隆位點上，轉化DH5α細菌形成cDNA質粒文庫。用雙脫氧法測定隨機挑選克隆的5’末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數據庫進行比較，結果發現有一個cDNA克隆的DNA序列為新的全長cDNA。通過合成一系列引物對新克隆所含的DNA序列進行雙向測定。計算機分析表明，克隆所含的全長cDNA是一個新的cDNA序列(如SEQ ID NO1所示)，編碼一個新的蛋白質(如SEQ ID NO2所示)。此蛋白質被命名為人骨髓基質細胞來源的1型磷酸酶抑制因子IPP2，其編碼基因命名為人骨髓基質細胞來源的1型磷酸酶抑制因子IPP2基因。
序列SEQ ID NO1全長為1637bp，包括234bp的5’端非編碼區和1052bp的3’端非編碼區，編碼含116個氨基酸的多肽。理論上計算未糖基化的成熟分子的分子量約為13kD。
BLAST分析表明其與已知基因不同，與人1型磷酸酶抑制因子，一致性達64％，，屬于1型磷酸酶抑制因子。
實施例2用RT-PCR方法進行人IPP2的細胞表達分析用Trizol試劑提取處于對數生長期Hela等各種細胞系的總RNA，取5μg細胞總RNA與1μg Oligo-dT12-18混合，進行反轉錄。反轉錄體系為20μl，反應結束后加80μl ddH2O進行稀釋。PCR擴增所用的引物如下有義引物5’TTGCCGTGCCTGTATTCCA(SEQ ID NO3)，反義引物5’GAATCGGAGGTGGTGTTTGT(SEQ ID NO4)，同時以β-actin作為陽性對照。PCR反應體積為50μl，其中含反轉錄模板10μl、0.5mM引物、0.2mM dNTP和1U rTaq DNA聚合酶(Takara)，擴增參數為95℃15秒、57℃30秒、72℃30秒，28個循環后72℃延伸10分鐘。PCR產物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳初步確認。DNA序列分析結果表明該PCR產物的編碼DNA序列與SEQ ID NO1所示的412-882完全相同。
RT-PCR結果(圖1)表明，IPP2在一些造血系腫瘤如Daudi、MOLT-4、Raji、THP-1、K562、HT-29、Hela、A549、NAM、TF-1、2162、Hut以及Hela、A549、HT29實體瘤中存在不同程度的表達實施例3人IPP2的Northern印跡分析按如下常規方法進行Northern印跡待檢濾膜置于10ml經68℃預熱的雜交液，在雜交爐(Bellco)中于68℃預雜交30分鐘；將標記好的cDNA探針于95～100℃變性2～5分鐘，置冰上迅速冷卻后加入雜交液(cDNA探針終濃度為2～10ng/ml或1～2×106cpm/ml)，充分混勻，于68℃雜交2小時。雜交結束后，濾膜用2×SSC、0.05％SDS室溫淋洗數次，繼振蕩沖洗30～40分鐘，其間更換洗液數次。隨后用0.1×SSC、0.1％SDS于50℃振蕩沖洗20～40分鐘。最后濾膜用塑料保鮮膜包裹，于-70℃曝光X線膠片24～48小時。
Northern印跡雜交結果(圖2)顯示在肝臟、睪丸、骨骼肌、心臟及脾臟等正常組織中有不同程度的表達(2.0kb)，這表明IPP2蛋白是一種特定表達的蛋白。
實施例4人IPP2原核重組表達在該實施例中，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物，以抽提的HeLa細胞的總mRNA為模板通過RT-PCR，或者實施例1中的全長質粒DNA為模板進行擴增，獲得人IPP2 DNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5’端寡核苷酸引物序列為5’-GTGGATCCGAGCCCAACAGTCCCAAAA-3’(SEQ ID NO5)該引物含有BamH I限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是人IPP2的從第二個氨基酸開始的部分編碼序列；3’端引物序列為5’-ATGAATTCGTAAGTAATGGTCCCGCTG-3’(SEQ ID NO6)該引物含有EcoR I限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和人IPP2的部分編碼序列。
將獲得的PCR產物純化后經BamH I/EcoR I酶切再與質粒pGEM-3ZF按常規方法重組并轉化至感受態大腸桿菌BL21，挑取陽性克隆鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。將正確序列的人IPP2 cDNA EcoR I酶切片段克隆至表達載體pGEX-2T(Pharmacia)，形成載體pGEX-2T-IPP2，然后轉化大腸桿菌BL21。陽性克隆用BamH I/EcoR I酶切鑒定，產物行0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析。經測序證實，已插入了所設計的IPP2編碼序列。
挑表達IPP2的陽性BL21克隆接種于100ml 2×YTA培養基中，37℃300rpm振蕩培養12-15hr，1∶10稀釋于預熱的2×YTA培養基繼續振蕩培養1.5hr，加100mM IPTG至0.1mM后30℃誘導2-6hr，5,000g 4℃離心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7 mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重懸，超聲(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％輕搖30min，然后12,000g 4℃離心10min，上清用0.8μm濾膜過濾后，過1ml50％谷胱甘肽Sepharose 4B層析柱，1×PBS充分洗滌后，加入500ul谷胱甘肽洗脫緩沖液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH8.0)室溫靜置30分鐘后收集洗脫液，重復洗脫2-3次，得到GST-IPP2融合蛋白，分子量約39Kda，與預測值相符。
實施例5抗人IPP2抗體的產生將實施例4中獲得的重組蛋白人IPP2用來免疫動物以產生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉淀人IPP2基因翻譯產物的能力加以評估。結果發現，抗體可特異性地與本發明蛋白發生結合。
實施例6人IPP2真核重組表達載體及突變體的構建1.表達野生型IPP2在該實施例中，以抽提的HeLa細胞的總mRNA為模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物，通過RT-PCR，獲得人IPP2 DNA作為插入片段。
5’端寡核苷酸引物序列為5’-CAGAATTCATGGAGCCCAACAGTCCCA-3’(SEQ IDNO7)。該引物含有EcoRI限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是人IPP2的翻譯起始子和部分編碼序列；3’端引物序列為5’-TCAAGCTTGAATGGTCCCGCTGCTCC-3’(SEQ ID NO8)。該引物含有Hind III限制性內切酶的酶切位點和人IPP2的部分編碼序列。
將獲得的PCR產物純化后經EcoR I/Hind III酶切再與質粒pcDNA3.1/Myc-His(-)B按常規方法重組并轉化至感受態大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)，形成野生型真核表達載體pcDNA 3.1-IPP2載體(WT)。經測序證實，已插入了所設計的IPP2編碼序列。
2.表達40位蘇氨酸突變為賴氨酸的IPP2以及40位蘇氨酸突變為天冬氨酸的IPP2以pcDNA 3.1-IPP2載體(WT)質粒DNA為模板，采用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進行PCR點突變，構建40位蘇氨酸突變為賴氨酸的表達載體CA。
PCR反應中使用的5’端寡核苷酸引物序列為5’-AGAAGACCTGCACCAGCATC-3’(SEQ ID NO9)。該引物中將蘇氨酸的密碼子ACA變為賴氨酸的密碼子GCA；3’端引物序列為5’-GATGCTGGTGCAGGTCTTCT-3’(SEQ ID NO10)。
以pcDNA 3.1-IPP2載體(WT)質粒DNA為模板，40位蘇氨酸表達載體CD的構建采用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進行PCR點突變，構建40位蘇氨酸突變為天冬氨酸表達載體CD。
PCR反應中使用的5’端寡核苷酸引物序列為5’-AAGAAGACCTGATCCAGCATCAC-3’(SEQ ID NO11)。該引物中將蘇氨酸的密碼子ACA變為天冬氨酸的密碼子GAT；3’端引物序列為5’-GTGATGCTGGATCAGGTCTTCTT-3’(SEQ ID NO12)。
PCR反應體積為50μl，其中含質粒DNA模板1μl、0.5mM引物、0.2mM dNTP和1U Pyrobest DNA聚合酶(Takara)，擴增參數為95℃15秒、58℃30秒、72℃30秒，20個循環后72℃延伸10分鐘。PCR產物行0.8％瓊脂糖凝膠電泳初步確認。將獲得的PCR產物純化后經T4多核苷酸激酶加磷酸處理，自身平端連接并轉化至感受態大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。將正確序列的克隆形成載體CA或CD。經測序證實，所設計的突變位點已經發生突變。
實施例7人IPP2抑制NO誘導RAW 264.7細胞凋亡活性的檢測將實施例6中的IPP2表達載體WT和CD質粒DNA和pNGFP質粒以LipofectAMINE試劑(Life Technologies公司)共轉染RAW 264.7細胞，以pcDNA3.1質粒載體作為無關對照。轉染后48小時加入NO產生劑1mM SNP作用24進行PI/GFP雙染色，用流式細胞儀進行檢測。
檢測結果(圖3)顯示，野生型(WT)和活化型(CD)IPP2能抑制LPS誘導的RAW 264.7的ERK活化。
實施例8IPP2抑制LPS對ERK、MEK1/2活化的Western檢測將實施例6中的IPP2表達載體WT、CA和CD質粒DNA以LipofectAMINE試劑轉染RAW 264.7細胞，以pcDNA3.1質粒載體作為無關對照。轉染后48小時加入1ug/L的LPS刺激10分鐘，收集細胞(5×106細胞/樣品)，用PBS洗一遍后，用T-PER組織蛋白提取試劑(PIERCE)提取全蛋白用于其它檢測，具體操作按試劑盒說明進行。之后用BCA法測定蛋白濃度，調節至一致后，樣品每20μl與4μl 6倍上樣緩沖液(100mmol/L Tris-HCL，200mmol/L DTT，4％SDS，0.2％溴酚藍，20％甘油，PH6.8)混勻，于100℃水浴煮沸5分鐘后，行12％SDS-PAGE電泳，隨后以100V恒定電壓于4℃把聚丙烯酰胺中的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，麗春紅染色并標記方向，標出Marker所在位置。室溫阻斷4小時(10％脫脂奶粉的TBST溶液)，將兔源ERK、MEK1/2多抗按1∶1000稀釋于脫脂奶粉溶液中，與硝酸纖維素薄膜于室溫反應2小時后，用TBST(0.05％Tween20的TBS溶液)洗滌3次，每次10分鐘。然后加以辣根過氧化物酶標記的相應二抗(1∶2000稀釋)，室溫孵育60分鐘，TBST洗三次，每次10分鐘，將Western印跡熒光檢測試劑中的A液和B液以等體積混和，室溫孵育1分鐘后，甩干，壓膜，曝光，顯影。
結果(圖4)顯示，野生型(WT)和活化型(CD)IPP2抑制LPS對ERK、MEK1/2的活化，而陰性對照和失活型(CA)不能抑制LPS對ERK、MEK1/2的活化作用。
實施例9IPP2維持NIH 3T3和PC-12細胞CREB的磷酸化將實施例6中的IPP2表達載體WT、CA和CD質粒DNA以LipofectAMINE試劑轉染NIH 3T3和PC-12細胞，以pcDNA3.1質粒載體作為無關對照。轉染后48小時，血清饑餓36小時，加0.5mM的IBMX/8 Br-cAMP刺激，0小時、1小時、5小時收集細胞，檢測步驟同施例8。
結果(圖5)顯示，IBMX/8 Br-cAMP刺激1小時后，CREB磷酸化上升。5小時后，陰性對照組和失活組(CA)的CREB磷酸化下降到基礎水平，而陽性對照(IPP1)和野生型IPP2、活化型(CD)能維持CREB磷酸化水平。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>浙江大學免疫學研究所<120>新型人骨髓基質細胞來源的1型磷酸酶抑制因子，其編碼序列及用途<130>024956<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1637<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(235)..(582)<223><220><221>misc_feature<222>(1432)..(1432)<223>n＝a，t，c，g<400>1agaggatcca agggattggt gggggaacag gcaagccagg catcaccgtg gatgttgaag 60aagggggtta ctcaaacctc ggcatcttca cttgctcgat ctggaattac agctatttat120tacgaagcac tctgtgtggc ttagtggagt gtgtctgagg aaacacatcc cggacaccac180ttagggttag tctttctgag ctcttcacat ctctgactaa ttatcatcat tacc atg 237Met1gag ccc aac agt ccc aaa aag ata cag ttt gcc gtg cct gta ttc cag 285Glu Pro Asn Ser Pro Lys Lys Ile Gln Phe Ala Val Pro Val Phe Gln5 10 15agt cag att gca cct gaa gca gca gag cag ctg ggc ttt tgt cgt tca 333Ser Gln Ile Ala Pro Glu Ala Ala Glu Gln Leu Gly Phe Cys Arg Ser20 25 30cag atc agg aaa aga aga cct aca cca gca tca ctt gtg att ctc aat 381Gln Ile Arg Lys Arg Arg Pro Thr Pro Ala Ser Leu Val Ile Leu Asn35 40 45gag cat aac ccc cca gaa ata gat gac aag agg ggg ccc aac aca caa 429Glu His Asn Pro Pro Glu Ile Asp Asp Lys Arg Gly Pro Asn Thr Gln50 55 60 65ggg gaa tta cag aat gca tcc cct aag caa agg aag cag agt gtg tac 477Gly Glu Leu Gln Asn Ala Ser Pro Lys Gln Arg Lys Gln Ser Val Tyr70 75 80aca cca ccc acc ata aaa ggg gtt aag cat ctg aaa ggc cag aat gaa 525Thr Pro Pro Thr Ile Lys Gly Val Lys His Leu Lys Gly Gln Asn Glu85 90 95tca gca ttc cct gaa gaa gaa gaa ggc acc aat gaa aga gag gag cag 573Ser Ala Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Thr Asn Glu Arg Glu Glu Gln100 105 110cgg gac cat taattactgg tgcaaaatga gttgataaca accagaagtt 622Arg Asp His115gacttgttag tgctgtgctt ctactcgagc ttggaaaaat cccaacacaa aacaaacacc682acctccgatt ccatcatgat gccacgttgc tttctactgg attacctcct gaagcacttt742agatatttta tacataagta ttgacatgtt tttcagaagc tgtttcttca cttattgctt802ttttctaata atttttatta caccatttgc caagtccttc cctttggttt tagtttattc862ctctctacaa ctaaaaaagg gatcttgagt ttaggtacat tttaagtgat tcatttttag922tttttctaat tctggaatct gagccttctc ttacaacagg gagtctttca aaaacatttt982tttgtttctt tttcaaattc cactgtgttt atttattgcc ttgtttcttt ttcaaattcc 1042attggtcttg atttaattta gttccacaga ttttactgat agtctactac ctgccaacta 1102ctgaattatg cagcagactt ataaaaataa aaaggctatt ttattgttat tgccatcctg 1162ctagtaaaga tttattcaat tatttataat taattaagtg gcttcaccta tatttctgtt 1222aataatcaca ttaattatgt atgacaggta ggatttatgt tatagataag aaaactagag 1282tccaaagaaa ataagtgtcc ccaaatgaac caataatcca acaaacgctt ccactaacta 1342gcttctgacc tgtttgagtt gtgatagatt ttagaataaa aaagcctatc ctccttagga 1402gccatagact tttattcttt cttatactgn cttatatatt gacttagagc taaacttcct 1462ccaattcaga cataaagcat aggcagatac ttttgctaat gaggctaagc tgggaagaaa 1522accctgagtt ctactttaat tcttgggcat tgacttcaaa ctaagatgac ttataagaaa 1582taaaagaagt aaatttgaaa ctttaataaa aaaagtacat ggttcattta aaaaa1637<210>2<211>116<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Glu Pro Asn Ser Pro Lys Lys Ile Gln Phe Ala Val Pro Val Phe1 5 10 15Gln Ser Gln Ile Ala Pro Glu Ala Ala Glu Gln Leu Gly Phe Cys Arg20 25 30Ser Gln Ile Arg Lys Arg Arg Pro Thr Pro Ala Ser Leu Val Ile Leu35 40 45Asn Glu His Asn Pro Pro Glu Ile Asp Asp Lys Arg Gly Pro Asn Thr50 55 60Gln Gly Glu Leu Gln Asn Ala Ser Pro Lys Gln Arg Lys Gln Ser Val65 70 75 80Tyr Thr Pro Pro Thr Ile Lys Gly Val Lys His Leu Lys Gly Gln Asn85 90 95Glu Ser Ala Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Thr Asn Glu Arg Glu Glu100 105 110Gln Arg Asp His115<210>3<211>19<212>DNA<213>引物<400>3ttgccgtgcc tgtattcca 19<210>4<211>20<212>DNA<213>引物<400>4gaatcggagg tggtgtttgt20<210>5<211>27<212>DNA<213>引物<400>5gtggatccga gcccaacagt cccaaaa27<210>6<211>27<212>DNA<213>引物<400>6atgaattcgt aagtaatggt cccgctg27<210>7<211>27<212>DNA<213>引物<400>7cagaattcat ggagcccaac agtccca27<210>8<211>26<212>DNA<213>引物<400>8tcaagcttga atggtcccgc tgctcc 26<210>9<211>20<212>DNA<213>引物<400>9agaagacctg caccagcatc20<210>10<211>20<212>DNA<213>引物<400>10gatgctggtg caggtcttct20<210>11<211>23<212>DNA<213>引物<400>11aagaagacct gatccagcat cac23<210>12<211>23<212>DNA<213>引物<400>12gtgatgctgg atcaggtctt ctt2權利要求
1.一種分離的人磷酸酶抑制因子IPP2多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制巨噬細胞RAW 264.7凋亡功能的由(a)衍生的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列域有至少70％相同性(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中235-582位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1637位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，含有權利要求6所述的載體。
8.一種具有人磷酸酶抑制因子IPP2多肽活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達人磷酸酶抑制因子IPP2多肽的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有人磷酸酶抑制因子IPP2多肽活性的多肽。
9.一種能與權利要求1所述的人磷酸酶抑制因子IPP2多肽特異性結合的抗體。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權利要求1所述的多肽以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明涉及了一種骨髓基質細胞來源的1型磷酸酶抑制因子(protein phosphatase 1 inhibitor－2，IPP2)。本發明提供編碼此蛋白分子的多核苷酸和經重組技術產生這種蛋白分子的方法。本發明還公開了骨髓基質細胞來源的1型磷酸酶抑制因子及其多核苷酸編碼序列的用途。本發明證實了IPP2的高表達能抑制巨噬細胞RAW 264.7凋亡。本發明還公開了抗此蛋白分子用于疾病的診斷及治療的策略，特別是可用于惡性腫瘤的診斷和治療。
文檔編號C12N15/12GK1475501SQ0213652
公開日2004年2月18日 申請日期2002年8月16日 優先權日2002年8月16日
發明者王曉健, 李楠, 曹雪濤 申請人:浙江大學免疫學研究所