專利名稱：姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法
技術領域：
本發明屬生物工程技術領域。具體涉及一種姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法。
姬松茸的主要活性成份是姬松茸多糖，多糖組份中以葡萄糖為主，以具有β-(1→6)側鏈的β-(1→3)葡聚糖為主要結構。研究結果表明，姬松茸多糖主要通過激活機體免疫系統，增強巨噬細胞的吞噬作用，刺激干擾素的形成，激活機體內自然殺傷細胞，促進免疫球蛋白、白細胞介素的生成，提高淋巴細胞的轉化率等而發揮其抗腫瘤作用，在基因水平上有較強的抗化學誘變作用，可用于慢性乙型肝炎及惡性腫瘤放化療后乏力，白細胞減少，免疫功能降低的綜合治療。
本發明提供了一種姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法。該方法包括下列步驟(1)姬松茸的育種與特征用組織分離法獲得姬松茸純菌株AB103，將其接種在PDA或麥芽汁固定斜面培養基上，于25～28℃恒溫培養7～10天后，置于4℃左右的冰箱中保存備用。采用紫外誘變法對菌絲細胞進行誘變，紫外照射距離為20～30cm，照射時間為5～15秒。初篩誘變株在固體培養基上的菌絲體生長能力，復篩誘變株在液體培養基中菌絲體生長量和多糖肽產量，獲得優質菌株AB103-51。該菌株分類命名為巴西蘑菇(姬松茸)Agaricus blazei，該菌株已于2002年7月16日保存于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心的編號為CGMCCNo.07722001325B。并于2002年7月16日檢測結果為存活。
固體培養用40～50％的稻草(或木屑、棉子殼)、1％的蔗糖或葡萄糖、10～20的麩皮或米糠、1％的石膏或碳酸鈣，加水拌勻，含水量60％，PH自然，瓶裝，在1.5kg/m2的壓力下滅菌1小時，冷卻后，在無菌操作下搖瓶種子接種于固體培養基內，培養溫度22～26℃，20～30天菌絲體布滿全瓶。原基萌發后，降低栽培溫度22～25℃，保持適當濕度、光照和通風，30～40天后，子實體成熟；(2)菌株的發酵工藝流程本發明采用通氣發酵法生產姬松茸菌絲體，發酵培養基成本低廉，發酵周期短。發酵工藝流程如下斜面菌種或茄瓶菌種→搖瓶種子→50-100L3種子罐(一級)→500-1000L3種子罐(二級)→5000-10噸發酵罐。
搖瓶種子的裝量75～150ml/250ml或150～150ml/250ml培養基，往復式搖床振蕩速度80～150次/分，或旋轉式搖床振蕩速度100～200轉/分，培養溫度24～28℃。培養時間2～3天。種子罐和發酵罐投料量50～70％，接種量8～10％，攪拌速度100～200rpm，通氣量1∶0.5～1∶1v/vmin，發酵培養時間4～7天。隨著發酵培養時間延長，培養基由混濁逐漸變清。發酵液中還原糖、氨態氮、PH都逐漸降低，菌絲體生物量不斷增加，至第5～6天時多糖肽產量達最高時終止發酵。(3)姬松茸多糖肽的提取本發明所述姬松茸AB103-51的多糖肽提取工藝是姬松茸發酵液用沙芯漏斗抽濾，分離發酵液和菌絲體，工廠可用板框機分離發酵液與菌絲體。將濕菌絲體加10～20倍水浸泡過夜，用90～100℃水浴回流提取2～5小時，過濾，將濾液濃縮后加2～5％倍的95％乙醇0～4℃沉淀8～10小時，干燥得姬松茸多糖肽。
本發明所述經組織分離法得到的AB103菌種，子實體肉質，多數單個，個別叢生。菌蓋半球形至平展，直徑3～10cm，淺褐色至棕褐色，菌蓋表面有纖維狀鱗片，邊緣有菌幕碎片。菌柄近圓柱形生于菌蓋中央，初期為實心，中后期疏松至空心。菌環易脫落。擔孢子淺紅色至棕褐色，光滑，短橢圓形。菌絲分枝，有橫隔，無鎖狀聯合。物理誘變所得的菌株AB103-51在固體木屑麩皮培養基上培養，其子實體形態與天然實體相同。
本發明所述姬松茸菌株AB103-51的培養性狀是①接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，溫度24～28℃，生長旺盛，菌絲體純白色、絨狀，接種十天菌落直徑達15-20mm。②接種在木屑培養基上，其培養特征如上所述。③在搖瓶振蕩培養時，用往復式搖床，振蕩速度80～150次/分，或旋轉式搖床，振蕩速度100～200轉/分，形成菌株，當菌大量形成時，發酵液由混濁變清，粘度逐漸增加，散發濃郁果香味。④在發酵培養基中，培養5～6天時，菌絲體生長和多糖肽產量達到最高，可終止發酵。
姬松茸菌絲體多糖肽的特征是①多糖肽，多糖含量為20～40％，蛋白質含量為15～30％。②灰色至灰褐色粉末。③主要成份都是β-葡聚糖。④紅外吸光譜峰位是883～892cm-1。
上述工藝過程使用的培養基成分和各種溶劑均無毒性，發酵生產的姬松茸菌絲體和姬松茸多糖肽，經國家規定的急性毒性試驗和慢性毒性試驗證明，本發明的產中品均無毒性。長期使用本產品不僅不會產生任何毒副作用，反而能增加機體的免疫功能。
從上述發明方法所獲得的姬松茸菌絲體和多糖肽能明顯促進腹腔巨噬細胞的吞噬功能，能抵抗由環磷酰胺引起的白血球下降和食欲減退；能提高荷瘤機體的免疫球蛋白、補體和血清溶血素的含量；能抑制腫瘤細胞的生長。可用于臨床抗腫瘤，減輕腫瘤病人化療和放療所引起的副作用，如惡心嘔吐、食欲不振、白細胞降低等癥狀，提高生存質量。并可作為亞健康人士提高機體免疫功能的保健品。
本方法發酵周期短，生產成本低，產品菌絲體和多糖肽安全無毒。從姬松茸菌絲體中提取的多糖肽具有調節機體免疫功能，抑制腫瘤細胞生長，對化療和放療的腫瘤病人的惡心嘔吐、食欲不振、白細胞降低等癥狀有明顯改善作用，是一種新型的生物免疫調節劑。
PDA配方如下馬鈴薯 200g葡萄糖 20g瓊脂20g水 1000ml鈴薯去皮，切塊，加水煮沸20～30分鐘后，4層紗布過濾，取汁。
將斜面菌種接種在裝有100ml液體培養基的500ml三角瓶中，振蕩培養。采用往復式搖床(振蕩速度80～150次/分)或旋轉式搖床(振蕩速度100～200轉/分)，振蕩培養度24～28℃。培養第二天出現小菌球，鏡檢菌絲生長繁茂、多分枝、具橫隔、五色、透明、具鎖狀聯合，發酵至第5～7天發酵液粘稠，此時菌絲體生長量最大，多糖肽產量最高，可終止發酵。
發酵培養基配方如下淀粉 3％麩皮 0.3％蔗糖 1％酵母粉0.2％硫酸鎂0.05％磷酸二氫鉀0.1％發酵液經離心后，得姬松茸菌絲體，加水10倍后，用細胞搗碎機打碎細胞，然后加90℃熱水回流提取3～5小時，將提取液再經真空薄膜濃縮，取1份濃縮加3份95％乙醇，在0～4℃條件下醇析8小時。經真空干燥或冷凍干燥后即可獲得褐色粉末狀的姬松茸多糖肽。取多糖肽加水(1∶100重量比)溶解后，用葡萄糖凝膠(Sdphadex-G75)進行層析分離，用紫外吸收法和酚硫酸測定層析液的多糖和多肽，樣品在收集試管中出現多糖和多肽，證明是姬松茸多糖肽。
綜合PDA配方如下馬鈴薯 200g蔗糖 20g麩皮 100gKH2PO43gMgSO47H2O 1.5g瓊脂 20g水 1000ml馬鈴薯去皮，切塊，加水煮沸20～30分鐘后，4層紗布過濾，取汁。麩皮加水煮沸20～30分鐘后，4層紗布過濾，取汁。
將斜面菌種接種在裝有100ml種子培養基的500ml三角瓶中，振蕩培養。采用復式搖床(振蕩速度80～150次/分)或旋轉式搖床(振蕩速度100～200轉/分)，振蕩培養溫度24～28℃。二天后以壓差法移種入50～100L種子罐內，罐裝量70％(v/v)，接種量10％(v/v)，通氣培養2天后移入500～1000L發酵罐。發酵罐裝量70％(v/v)，接種量10％(v/v)，罐溫24～30℃，通氣量1∶1(v/v)機械攪拌速度100～200rpm。發酵至第5～7天發酵液粘稠，此時菌絲體生長量最大，多糖肽產量最高，可終止發酵。
種子培養基配方如下玉米粉 3％淀粉 2％磷酸二氫鉀 0.1％硫酸鎂 0.05％發酵培養基配方如下淀粉 3％麩皮 0.3％蔗糖 1％酵母粉 0.2％硫酸鎂 0.05％磷酸二氫鉀 0.1％發酵液經板框壓濾后，得姬松茸菌絲體，加水10倍后，用細胞搗碎機打碎細胞，然后加95℃熱水回流提取4小時，將提取液真空薄膜濃縮，加水3倍體積的95％乙醇，低溫醇析。醇析物用無水丙酮和無水乙醚分別洗滌3次，于50℃下烘干，獲得褐色粉末狀的姬松茸多糖肽。取多糖肽加水(1∶100重量比)溶解后，用兩塊硅膠薄析進行TLC層析，分別用茚三酮和茴香醛顯色，兩塊板顯示的Rf值一致，證明所提取的樣品為姬松茸多糖肽。
權利要求
1.一種姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)姬松茸的育種與特征用組織分離法獲得姬松茸純菌株AB103，將其接種在PDA或麥芽汁固定斜面培養基上，于25～28℃恒溫培養7～10天后，置于4℃左右的冰箱中保存備用，采用紫外誘變法對菌絲細胞進行誘變，紫外照射距離為20～30cm，照射時間為5～15秒，初篩誘變株在固體培養基上的菌絲體生長能力，復篩誘變株在液體培養基中菌絲體生長量和多糖肽產量，獲得優質菌株AB103-51；固體培養用40～50％的稻草或木屑、棉子殼，1％的蔗糖或葡萄糖，10～20％麩皮或米糠，1％的石膏或碳酸鈣，加水拌勻，含水量60％，PH自然，瓶裝，在1.5kg/m2的壓力下滅菌1小時同，冷卻后，在無菌操作下搖瓶種子接種于固體培養基內，培養溫度22～26℃，20～30天菌絲體布滿全瓶，原基萌發后，降低栽培溫度22～25℃，保持適當溫度、光照和通風，30～40天后，子實體成熟；(2)菌株的發酵工藝流程本發明采用通氣發酵法生產姬松茸菌絲體，發酵培養基成本低廉，發酵周期短，發酵工藝流程如下斜面菌種或茄瓶菌種→搖瓶種子→50-100L3種子罐，一級→500-1000L3種子罐，二級→5000-10噸發酵罐，搖瓶種子的裝量75～150ml/250ml或150～150ml/250ml培養基，往復式搖床振蕩速度80～150次/分，或旋轉式搖床振蕩速度100～200轉/分，培養溫度100～200rpm，通氣量1∶0.5～1∶1v/v min，發酵培養時間4～7天，隨著發酵培養時間延長，培養基由混濁逐漸變清，發酵液中還原糖、氨態氮、PH都逐漸降低，菌絲體生物量不斷增加，至第5～6天時多糖肽產量；(3)姬松茸多糖肽的提取本發明所述姬松茸AB103-51的多糖肽提取工藝是姬松茸發酵液用沙芯漏斗抽濾，分離發酵液和菌絲體，工廠可用板框機分離發酵液與菌絲體，將濕菌絲體加10～20倍水浸泡過夜，用90～100℃水浴回流提取2～5小時，過濾，將濾液濃縮后加2～5％倍的95％乙醇0～4℃沉淀8～10小時，干燥得姬松茸多糖肽。
2.根據權利要求1所述的一種姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法，其特征在于其中所述的優質菌株AB 103-51的分類命名為巴西蘑菇Agaricus blazei，保藏編號為CGMCC No.07722001325B。
3.根據權利要求1所述的一種姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法，其特征在于其中所述的優質菌株AB103-51的發酵工藝，其種子培養基的特征是100ml的培養基玉米粉1～3g、淀粉1～2g、硫酸鎂0.05～0.1g、磷酸二氫鉀0.1～0.2g。
4.根據權利要求1所述的一種姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法，其特征在于其中所述的優質菌株AB103-51的發酵工藝，其發酵培養基的特征是100ml的培養基的配比是淀粉1～3g、麩皮0.1～0.6g、葡萄糖或蔗糖0.5～1g、酵母粉0.1～0.5g、硫酸鎂0.05～0.2g、磷酸二氫鉀0.1～0.3g。
5.根據權利要求1所述的一種姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法，其特征在于其中所述的發酵工藝的特征是發酵罐培養可添加泡敵或豆油適量。
6.根據權利要求1所述的一種姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法，其特征在于其中所述的發酵工藝的特征是培養基中可添加玉米漿，添加量為0.1～1％。
7.根據權利要求1所述的一種姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法，其特征在于其中所述的發酵工藝的特征是搖瓶種的發酵條件250ml搖瓶裝量75～150ml培養基，500ml搖瓶裝量150～250ml培養基，采用往復式搖床，振蕩速度80～150次/分，或旋轉式搖床，振蕩速度度100～200轉/分，培養溫度24～28℃，培養時間2～3天。
8.根據權利要求1所述的一種姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法，其特征在于其中所述的發酵工藝的特征是發酵條件接種量8～10％，攪拌速度100～200rpm，通氣量1∶0.5～1∶1v/v min，發酵溫度為24～28℃，罐壓0.3～0.5kg/cm2，發酵培養時間2～3天。
9.根據權利要求1所述的一種姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法，其特征在于其中所述的發酵工藝的特征是發酵條件接種量8～10％，攪拌速度100～200rpm，通氣量1∶0.5～1∶1v/v min，發酵溫度為24～28℃，罐壓0.3～0.5kg/cm2，發酵培養時間4～7天。
10.根據權利要求1所述的一種姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法，其特征在于其中一種姬松茸G菌株AB103-51的固體培養用稻草或木屑、棉子殼、蔗糖或葡萄糖，麩皮或米糠、石膏或碳酸鈣所組成的培養基。
11.根據權利要求1所述的一種姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法，其特征在于其中所述的培養工藝的特征是培養基的百分含量是稻草或木屑、棉子殼40～50％，蔗糖或葡萄糖1％，麩皮或米糠10～20％，石膏或碳酸鈣1％。
12.根據權利要求1所述的一種姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法，其特征在于其中所述的姬松茸培養物過濾得AB103-51的菌絲體，菌絲細胞破碎后，溫菌絲體加10-20倍水，在90～100℃熱水中回流提取2～5小時，得菌絲體提取液。
13.根據權利要求1所述的一種姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法，其特征在于其中所述的菌絲體提取液濃縮后加2～5倍的95％乙醇，在0～4℃沉淀8～10小時，層析物干燥得灰褐色的姬松茸多糖肽。
全文摘要
本發明屬生物工程技術領域。具體涉及一種姬松茸的發酵工藝及其多糖肽的生產方法。本發明的方法是將組織分離的姬松茸AB103菌株純化后，采用物理法對其菌絲體進行誘變，經初篩和復篩后，獲得液體發酵菌絲體生物量多、多糖肽產量高的優質菌株AB103－51。用天然玉米粉、麩皮、淀粉、酵母粉、玉米漿、硫酸鎂、磷酸二氫鉀等作為培養基，進行從斜面菌種，到搖瓶種子，一級種子、二級種子，到發酵培養的發酵工藝流程，獲得含菌絲體及多糖肽較高的姬松茸發酵液。從AB103－51的菌絲體中，用熱水提取，乙醇沉淀等方法，獲得一種具有生物免疫調節劑作用的姬松茸多糖肽。
文檔編號C12N1/14GK1398978SQ0213651
公開日2003年2月26日 申請日期2002年8月16日 優先權日2002年8月16日
發明者錢秀萍, 藍德剛, 王強 申請人:維京仲華(上海)生物醫藥科技有限公司