一個煙草強核基質結合序列及其分離鑒定方法與應用的制作方法

            文檔序號:396319閱讀:355來源:國知局
            專利名稱:一個煙草強核基質結合序列及其分離鑒定方法與應用的制作方法
            技術領域
            本發明涉及一個煙草強核基質結合序列(MAR)及其分離鑒定方法與應用,屬于細胞生物學和真核基因表達調控領域。具體涉及一個煙草強MAR序列及其分離鑒定的方法與應用,該MAR序列可以應用于植物表達載體的構建,提高外源基因在轉基因植株中的穩定、高效表達水平。
            本發明煙草強核基質結合序列是通過如下方法分離的利用聚合酶鏈式反應(PCR)方法從煙草基因組中分離出具有MAR序列特征的DNA片段,克隆于pGEM T Easy載體(Promega公司)(見

            圖1)。以超聲波處理的大腸桿菌基因組DNA作競爭性抑制劑與核基質進行體外結合實驗,鑒定MAR序列與核基質的特異性結合能力,篩選出結合能力較強的MAR序列插入pBI121 gus基因表達盒兩側構建含MAR序列表達載體。以不含MAR序列的pBI121為對照,轉化煙草,通過檢測轉基因煙草GUS表達活性來確定MAR序列對外源基因表達活性的影響,從而篩選出能顯著增強外源基因的MAR序列。
            本發明利用上述方法分離到一強MAR序列,該片段長1001堿基對,AT含量為62.8%,具有MAR序列中常見的T box(TTWTWTTWTT)1個、解旋序列(AATATATTT或AATATT)3個、拓撲異構酶II結合位點(GTNWAYATTNATNNR)1個。該MAR序列在體外與核基質有較強的結合能力,將該MAR序列順向插入pBI121gus基因表達盒兩側,構建成植物表達載體pBI121TM2MARII(見圖2)。通過凍融法轉化農桿菌LBA4404,用葉盤法轉化煙草,在含有羧芐和卡那霉素的Ms培養基上篩選抗性植株,然后將其移到生根培養基上生根,最后移栽到基質中在溫室中長大。取轉基因煙草底部第五片葉片150mg進行GUS酶活檢測,檢測表明該MAR序列能使gus基因表達比對照增強5倍。高于國外文獻報道的強MAR序列的增強效果(2倍)。因此我們分離的強MAR序列是一個能顯著增強外源基因在轉基因植株中穩定表達的MAR序列,可以作為一個強的增強子元件用于植物高效表達載體的構建。該MAR序列具有SEQ ID NO.1所示的序列序列表(1)SEQ ID NO.1的信息(a)序列特征*長度1001堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈型*拓撲結構線性*A/T百分含量62.8%*A box(AATAAAYAAA)數目0個*T box(TTWTWTTWTT)數目1個*解旋序列(AATATATTT或AATATT)數目2個*拓撲異構酶II結合位點(GTNWAYATTNATNNR)數目1個(b)分子類型DNA(c)假設否
            (d)反義否(e)最初來源煙草NC89(Nicotiana tabacum L.cv NC89)(f)序列描述SEQ ID N0.1TCGATTAAAAATCCCAATTATTGCGAGTGAAAGCTGCTCAATATTGCTTAATAGAAGAAA 60ATTTGTATCGAAATGTTCATGGGACCCTTAGCACGGTGCCTTGGTCTATCACAAACTGAA 120TATGTGATGCAAGAAGTACATAAAGAACATTGTTGCAATCACGTTGGAGGAAGGTCATTT 180TAAAGACGCTAAAAGGGGCGGTATTATTTGCAAAAAATAGAAGACAAAGCGAAAATTTTT 240ATTAGAAGGTGTGATAAATGTCAACGGGGTGCAAACAATATGCATCAACCAGCAGTGTTT 300CTTCATTCAATCATAGCACCGTGGCCGTTTATGAAGTGGGTTATGTATTGTAGGTCCTCT 360ACCTAAAGCACCAGGAAAGGAACGACTTTTATTAATCTTAACTGATTATTTTTCTATGTG 420GGTAGAAGCATGTGCCTTTAAATAGATCGAGAGAAAGAGGTTGTTGATATTATTTGGAGG 480AACATAATATGTCGATTTTGTGTCCCAAGAAAAATAGTACGCGATAATGGGCCACAATTC 540GTAGGTTCAAAAGTTACCGATTTTCTCAAAATCTGGGAAATTAAACAAATTATTTCGGCG 600CACTGCCATCCCATAGCTAATGGGAAACCATAATCGACAAATACAATTATTGTCAACAAT 660ATAAAGAAACGGTTAGAATCATCAAAAGGCAGGTTCCCTGAAGTACTACTTGGGCTAGTA 720TGGGATTACAGGACAACGACGAAGATAAGCACAAGAGAAACACCATTCTCACTTATTTAT 780GGTACTGAGGCCTTAATTTCGGTGGAAATAGGAGAGCCAAGAACAAGATACGTACATACA 840AATGAAGTAACAAATGAGAAAGAACTTTTAACAAATTTAGATTTGACAAAGGAGATAAGG 900GAAGCAACTTTGATACAGATGGCGGCACAAAAGTAGAGGATTGAGCAATATTACAACAGA 960AAGGCGAACCTTCGATATTTCAAGATTGGGAACTTCTTCCT 1001本發明的煙草強核基質結合序列適用于構建高效植物表達載體用于轉基因。煙草強核基質結合序列及其產生的pBI121TM2MARII的應用,將該MAR序列構建到某個表達載體結構基因表達盒兩側時,可以構建高效表達載體,用于轉基因研究和應用,pBI121TM2MARII可以直接用做植物表達載體。
            本發明的優點在于從煙草中分離的新的強MAR序列,能顯著增強外源基因在轉基因植物中高效表達,將該MAR序列構建到植物表達載體pBI121兩側后能使gus基因在轉基因植物中的表達水平提高5倍。由于MAR序列是靠結合到常染色質區增強啟動子活性從而提高基因表達的,可以隨細胞分裂繁殖而分配到子代中去,不易丟失,在子代中仍能使外源基因保持較高表達活性。同時由于MAR序列在植物中作用無種屬特異性,因此,該MAR序列特別適用于構建高效植物表達載體,用于轉基因研究和產業化,提高植物基因工程產品的產量。
            uidA是β-葡糖苷酸酶(簡稱GUS)T NOS是終止序列圖3是植物表達載體pBI121TM2MARII的圖譜RB、LB是T DNA右邊界序列、左邊界序列Ori是質粒復制起始位點GUS是β-葡糖苷酸酶CaMV35S是花椰菜花葉病毒基因的啟動子TM2MAR是煙草強MAR序列圖4是轉基因煙草的GUS酶活測定4(a)示不含MAR的pBI121載體轉化群體,圖4(b)示含MARs的pBI1121TM2MARII載體轉化群體,圖4(c)示pBI121、pBI1121TM2MARII和未轉基因植株對照CK的平均GUS活性,單位nmol MU/mg·蛋白/min(五)具體發明實施方式實施例1一個煙草強MAR序列的克隆a.PCR反應 聚合酶鏈式反應(PCR)的試劑與條件PCR反應的模板DNA為煙草基因組DNA。煙草(Nicotiana tabacum L.cv NC89)種于溫室,其葉片用于基因組DNA的提取,煙草基因組DNA的提取采用CTAB法首先將下列試劑混在一起10×Taq DNA聚合酶緩沖液5微升模板DNA(100納克/微升) 1微升正向引物(100納摩爾/升) 1微升反向引物(100納摩爾/升) 1微升脫氧核苷酸混合物(dNTPs,100納摩爾/升) 1微升Taq DNA聚合酶(5單位/微升) 0.5微升滅菌重蒸水 30.5微升總體積 50微升PCR反應的條件為首先94℃變性5分鐘,然后進入下列循環94℃ 40秒,46℃ 50秒,72℃ 90秒,共進行30個循環,最后72℃延伸10分鐘。
            b.pGEMpMAR克隆的構建 利用膠回收試劑盒(上海Sangon產品),純化PCR產物,操作步驟按產品說明書進行。取純化后的產物4μl,連接至pGEM-T Easy載體(Promega產品),構建成pGEMpMAR克隆(見圖1)。
            c.序列測定與同源檢索 用載體引物T7和SP6進行序列測定,序列測定由上海生工公司完成。將所得的序列在基因銀行中(GenBank)的序列比較,序列檢索表明該序列尚未在基因銀行注冊,為新的MAR序列,具有SEQ ID NO.1所示的特征(1)SEQ ID NO.1的信息(a)序列特征*長度1001堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈型*拓撲結構線性*A/T百分含量62.8%*A box(AATAAAYAAA)數目0個*T box(TTWTWTTWTT)數目1個*解旋序列(AATATATTT或AATATT)數目2個*拓撲異構酶II結合位點(GTNWAYATTNATNNR)數目1個(b)分子類型DNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源煙草NC89(Nicotiana tabacum L.cv NC89)(f)序列描述SEQ ID NO.1TCGATTAAAAATCCCAATTATTGCGAGTGAAAGCTGCTCAATATTGCTTAATAGAAGAAA 60ATTTGTATCGAAATGTTCATGGGACCCTTAGCACGGTGCCTTGGTCTATCACAAACTGAA 120TATGTGATGCAAGAAGTACATAAAGAACATTGTTGCAATCACGTTGGAGGAAGGTCATTT 180TAAAGACGCTAAAAGGGGCGGTATTATTTGCAAAAAATAGAAGACAAAGCGAAAATTTTT 240ATTAGAAGGTGTGATAAATGTCAACGGGGTGCAAACAATATGCATCAACCAGCAGTGTTT 300CTTCATTCAATCATAGCACCGTGGCCGTTTATGAAGTGGGTTATGTATTGTAGGTCCTCT 360ACCTAAAGCACCAGGAAAGGAACGACTTTTATTAATCTTAACTGATTATTTTTCTATGTG 420GGTAGAAGCATGTGCCTTTAAATAGATCGAGAGAAAGAGGTTGTTGATATTATTTGGAGG 480AACATAATATGTCGATTTTGTGTCCCAAGAAAAATAGTACGCGATAATGGGCCACAATTC 540GTAGGTTCAAAAGTTACCGATTTTCTCAAAATCTGGGAAATTAAACAAATTATTTCGGCG 600CACTGCCATCCCATAGCTAATGGGAAACCATAATCGACAAATACAATTATTGTCAACAAT 660ATAAAGAAACGGTTAGAATCATCAAAAGGCAGGTTCCCTGAAGTACTACTTGGGCTAGTA 720TGGGATTACAGGACAACGACGAAGATAAGCACAAGAGAAACACCATTCTCACTTATTTAT 780GGTACTGAGGCCTTAATTTCGGTGGAAATAGGAGAGCCAAGAACAAGATACGTACATACA 840AATGAAGTAACAAATGAGAAAGAACTTTTAACAAATTTAGATTTGACAAAGGAGATAAGG 900GAAGCAACTTTGATACAGATGGCGGCACAAAAGTAGAGGATTGAGCAATATTACAACAGA 960AAGGCGAACCTTCGATATTTCAAGATTGGGAACTTCTTCCT1001
            實施例2MAR序列與核基質的體外結合實驗a.懸浮培養 利用水稻種子在Ms改良培養基(酵母粉0.3%,2,4-D 2mg/L,6 BA 0.5mg/L)上誘導愈傷組織。挑取疏松易碎的愈傷組織繼代于AA(2,4-D 1mg/L)液體培養基,26℃,110rpm,每9天繼代一次。
            b.細胞核的提取 取10ml培養至第7天的懸浮細胞(細胞體積),在20ml含2%纖維素酶RS、1%離析酶和0.2%果膠酶Y 23的酶解液中處理,用全玻璃勻漿器勻漿,直至研至單一細胞,通過22μm和15μm的不銹鋼網過篩核的粗懸液,在5000g下離心20min,收集沉淀,用60%和30%的Percoll 1000g不連續密度梯度離心,收集沉淀。按每毫升15OD(A260)懸浮于24ml保存液中,液氮冷凍,80℃保存。
            c.核基質的制備 將儲存的核融化,收集核,加入EcoR I和Hind III兩種限制性內切酶,在37℃下輕搖處理3h,然后在16℃下用RNase(20μg/L)消化30min,再用2mol/l NaCl的高鹽溶液抽提,離心即可得核基質沉淀。
            d.體外結合實驗 用[α-32P]dCTP(北京亞輝生物技術有限公司)末端標記切下的MARs序列和相應的空載體,加入經超聲波處理的長度約為1~1.5kb的大腸桿菌基因組DNA,至終濃度50g/L作為競爭性抑制劑,與相當于3 OD(A260)的核基質在400μl反應體系中37℃溫育8小時,使MAR序列與核基質充分結合,離心分離核基質(沉淀)與上清,分別用蛋白酶K和SDS處理,苯酚/氯仿抽提,純化與核基質結合的DNA及殘留于上清中的DNA,分別取1/5 DNA在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳,然后用TCA(三氯乙酸)固定,干膠機干膠,X光片放射性自顯影3h,洗片。樣品在X光片上呈現4條帶,即上清中殘留的載體片段、MAR序列以及核基質結合的載體片段、MAR序列,條帶的放射性強度用LabworksTMAnalysis Software Version 3.0軟件定量分析,用MAR序列、載體片段與核基質的結合率比較結合的相對強弱。
            實施例3植物表達載體的構建將該MAR序列順向重復插入pBI121(圖2(a))gus基因表達盒兩側。用EcoR I將MAR從質粒pGEMpMAR上切下來,一部分插入到堿性磷酸酶處理的pBI121上的EcoR I酶切位點,獲得質粒pBI121MAR I(圖2(b))。用gus上游引物(ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCA)和MAR的3′端特異引物通過PCR擴增來鑒別片段的插入方向。篩選出正向插入MAR的表達載體pBI121MAR I,用Hind III酶切后再用堿性磷酸酶去磷,然后將另一部分帶有EcoR I粘性末端的MAR用Klenow酶補平,連接Hind III接頭,經Hind III酶切后插入到pBI121MAR I的HindIII酶切位點產生pBI121MARII(圖2(c)),用35S下游引物(TGTTCTCTCCAAATGAAAT)和MARs的5′端特異引物擴增來鑒別片段的插入方向,得到正向重復插入MAR的植物表達載體pBI121TM2MAR II(圖3)。
            實施例4煙草轉化與GUS表達活性的檢測a.煙草轉化與鑒定將植物表達載體pBI121TM2MAR II和不含MAR的對照pBI121通過凍融法轉化農桿菌LBA4404。用葉盤法轉化煙草,在含有羧芐和卡那霉素的MS培養基(3mg/L 6BA+0.2mg/L NAA+100mg/L Km+250mg/L Crb)上篩選抗性植株,然后將其移到生根培養基(MS基本培養基+50mg/L Km+250mg/L Crb)上生根,最后移栽到基質中在溫室中長大。用CTAB法提取葉片基因組DNA,以基因組DNA為模板,用gus基因引物P1(ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCA)和P2(TTCCGGCATAGTTAAAGAAAT)進行PCR擴增,檢測gus基因的整合情況,轉化的煙草植株中能擴出508bp的gus片段,而未轉化的植株不能擴增出此片段。PCR檢測證明為陽性的植株用于GUS表達活性的定量測定。
            b.GUS表達活性的定量測定 取轉基因煙草底部第五片葉片150mg,加入500μl提取緩沖液在研缽中研成勻漿,3000g離心10min,收集上清液。在1ml預熱的反應緩沖液中(提取液中加入1mmol/L MUG)加入20μl上清,混勻,于37℃下反應30min后取出100μl加入到900μl反應終止液中終止反應,用日立850型熒光分光光度計測定各樣品Ex365/Em455值。蛋白質含量按Bradford的方法測定,取上清20μl,用重蒸水定容至4ml,加入1ml考馬斯亮藍溶液,測定595nm光吸收值。用4甲基傘形酮(4MU)的納摩爾數與蛋白質含量及時間的比值(nmol MU/mg·蛋白/min)表示GUS活性。GUS酶活測定表明,含MAR序列表達載體轉化植物和不含MAR序列的表達載體轉化植物的GUS酶活性分別為23.6nmol MU/mg·蛋白/min(圖4(a)),4.46nmol MU/mg·蛋白/min(圖4(b)),空白對照為0.54nmol MU/mg·蛋白/min,為本底活性,MAR序列使gus基因表達活性增強約5倍(見圖4(c))。證明該強MAR序列可以用于構建高效表達載體用于增強外源基因在轉基因植物中的表達強度。
            序列表<110>山東農業大學<120>一個煙草強核基質結合序列及其分離鑒定方法與應用<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1001<212>DNA<213>Nicotiana tabacum L.cv.NC89<221>DNA解旋序列<222>(40)..(45)<221>DNA解旋序列<222>(976)..(980)<221>拓撲異構酶結合位點II<222>(653)..(667)<221>T-box<222>(388)..(397)<400>1tcgattaaaa atcccaatta ttgcgagtga aagctgctca atattgctta atagaagaaa 60atttgtatcg aaatgttcat gggaccctta gcacggtgcc ttggtctatc acaaactgaa120tatgtgatgc aagaagtaca taaagaacat tgttgcaatc acgttggagg aaggtcattt180taaagacgct aaaaggggcg gtattatttg caaaaaatag aagacaaagc gaaaattttt240attagaaggt gtgataaatg tcaacggggt gcaaacaata tgcatcaacc agcagtgttt300cttcattcaa tcatagcacc gtggccgttt atgaagtggg ttatgtattg taggtcctct360acctaaagca ccaggaaagg aacgactttt attaatctta actgattatt tttctatgtg420ggtagaagca tgtgccttta aatagatcga gagaaagagg ttgttgatat tatttggagg480aacataatat gtcgattttg tgtcccaaga aaaatagtac gcgataatgg gccacaattc540gtaggttcaa aagttaccga ttttctcaaa atctgggaaa ttaaacaaat tatttcggcg600cactgccatc ccatagctaa tgggaaacca taatcgacaa atacaattat tgtcaacaat660ataaagaaac ggttagaatc atcaaaaggc aggttccctg aagtactact tgggctagta720tgggattaca ggacaacgac gaagataagc acaagagaaa caccattctc acttatttat780ggtactgagg ccttaatttc ggtggaaata ggagagccaa gaacaagata cgtacataca840aatgaagtaa caaatgagaa agaactttta acaaatttag atttgacaaa ggagataagg900gaagcaactt tgatacagat ggcggcacaa aagtagagga ttgagcaata ttacaacaga960aaggcgaacc ttcgatattt caagattggg aacttcttcc t 100權利要求
            1.一個煙草核基質結合序列,其特征在于,具有SEQ ID NO 1所示的序列SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*長度1001堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性*A/T百分含量62.8%*A box(AATAAAYAAA)數目0個*T box(TTWTWTTWTT)數目1個*解旋序列(AATATATTT或AATATT)目2個*拓撲異構酶II結合位點(GTNWAYATTNATNNR)數目1個(b)分子類型DNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源煙草NC89(Nicotiana tabacum L.cv NC89)(f)序列描述SEQ ID NO.1TCGATTAAAAATCCCAATTATTGCGAGTGAAAGCTGCTCAATATTGCTTAATAGAAGAAA 60ATTTGTATCGAAATGTTCATGGGACCCTTAGCACGGTGCCTTGGTCTATCACAAACTGAA 120TATGTGATGCAAGAAGTACATAAAGAACATTGTTGCAATCACGTTGGAGGAAGGTCATTT 180TAAAGACGCTAAAAGGGGCGGTATTATTTGCAAAAAATAGAAGACAAAGCGAAAATTTTT 240ATTAGAAGGTGTGATAAATGTCAACGGGGTGCAAACAATATGCATCAACCAGCAGTGTTT 300CTTCATTCAATCATAGCACCGTGGCCGTTTATGAAGTGGGTTATGTATTGTAGGTCCTCT 360ACCTAAAGCACCAGGAAAGGAACGACTTTTATTAATCTTAACTGATTATTTTTCTATGTG 420GGTAGAAGCATGTGCCTTTAAATAGATCGAGAGAAAGAGGTTGTTGATATTATTTGGAGG 480AACATAATATGTCGATTTTGTGTCCCAAGAAAAATAGTACGCGATAATGGGCCACAATTC 540GTAGGTTCAAAAGTTACCGATTTTCTCAAAATCTGGGAAATTAAACAAATTATTTCGGCG 600CACTGCCATCCCATAGCTAATGGGAAACCATAATCGACAAATACAATTATTGTCAACAAT 660ATAAAGAAACGGTTAGAATCATCAAAAGGCAGGTTCCCTGAAGTACTACTTGGGCTAGTA 720TGGGATTACAGGACAACGACGAAGATAAGCACAAGAGAAACACCATTCTCACTTATTTAT 780GGTACTGAGGCCTTAATTTCGGTGGAAATAGGAGAGCCAAGAACAAGATACGTACATACA 840AATGAAGTAACAAATGAGAAAGAACTTTTAACAAATTTAGATTTGACAAAGGAGATAAGG 900GAAGCAACTTTGATACAGATGGCGGCACAAAAGTAGAGGATTGAGCAATATTACAACAGA 960AAGGCGAACCTTCGATATTTCAAGATTGGGAACTTCTTCCT 1001
            2.一種權利要求1所述的一個煙草強MAR的分離方法,其特征在于設計富含A/T的引物,進行聚合酶鏈式反應(PCR),將得到的片段克隆到pGEM-T Easy載體,測序,選取具有MAR序列特征的片段在體外與核基質進行體外結合實驗,選取體外結合能力強的片段插入pBI121載體gus基因表達盒兩側,轉化煙草,通過測轉基因植物的GUS酶活來確定MAR序列對gus基因表達的影響。
            3.一種權利要求2所述的MAR與核基質的體外結合實驗的方法,其特征在于將MAR及其克隆載體分別用[α-32P]dCTP末端標記,加入經超聲波處理的大腸桿菌基因組DNA至終濃度50g/L作為競爭性抑制劑,與相當于3A260的核基質在400μl反應體系中37℃溫育8小時,使MARs序列與核基質充分結合,然后分離結合到核基質上的和殘留上清中的標記片段,通過放射性自顯影強度來比較不同MARs序列的相對強弱。
            4.一種權利要求2所述的體內鑒定方法,其特征在于將MAR順向重復插入到pBI121 gus基因表達盒兩側,形成高效表達載體pBI121TM2MARII,以不含MAR的植物表達載體作對照,通過檢測轉基因植株的GUS活性來檢測MAR對gus基因表達的影響。
            5.一種權利要求4內所述的MAR及其產生的pBI121TM2MARII的應用,其特征在于將該MAR序列構建到某個表達載體結構基因表達盒兩側時,可以構建高效表達載體,用于轉基因研究和應用,pBI121TM2MARII可以直接用做植物表達載體。
            全文摘要
            一個煙草強核基質結合序列(MAR)及其分離鑒定方法和應用,屬細胞生物學和真核基因表達調控領域。具體涉及從煙草基因組中分離出一段新的強MAR序列,具有典型的MAR序列特征,在體外與核基質有較強的特異結合能力。將該MAR序列應用于植物基因表達載體的構建,即將其順向構建到表達載體pBI121 gus基因表達盒兩側(見附圖1),以不加MAR序列的表達載體pBI121作為對照,轉化煙草,GUS酶活檢測證明該MAR序列可使外源基因gus基因的平均表達水平比對照提高5倍。表明分離得到的煙草新MAR序列是一個很強的增強子元件,可以極大的提高外源基因在轉基因植物中穩定、高效表達水平,能夠作為一個重要增強元件用于各種類型的植物高效表達載體的構建,應用于植物基因工程的研究和產業化。
            文檔編號C12Q1/68GK1401790SQ02135530
            公開日2003年3月12日 申請日期2002年9月13日 優先權日2002年9月13日
            發明者鄭成超, 張可偉, 王健美, 楊國棟 申請人:山東農業大學
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