專利名稱：發酵生產門冬酰胺酶的方法
技術領域：
本發明屬于生物發酵領域，更具體地說是關于一種發酵生產門冬酰胺酶的方法。
背景技術：
門冬酰胺酶是治療急性淋巴白血病的重要藥物，在治療小兒急性淋巴細胞白血病中有著不可替代的作用。國內現有的生產門冬酰胺酶技術存在很多不足，主要是①發酵效價低(10單位/毫升)，生產成本過高而不適合市場的要求，②發酵效價高的只局限于基因工程菌，且分離提純技術達不到要求。
發明內容
本發明克服了現有技術的不足，提供了一種高效表達生產門冬酰胺酶的方法。
本發明的方法包括平板培養、種子罐培養、發酵罐培養，具體工藝過程如下(1)平板培養將凍干的大腸桿菌菌種用水溶解后，涂布至凝固有培養基的平皿上于36-40℃培養10-36小時；(2)種子罐培養將(1)中已長好的平皿菌種接入種子罐中，在36-40℃，轉速250-500轉/分，風量1∶0.3-1∶1.2體積/體積/分的條件下，培養10-16小時；(3)發酵罐培養將(2)中已培養好的種子罐菌種接入發酵罐中，接種量為10-30％，在36-40℃，轉速180-350轉/分，風量1∶0.3-1∶1.2體積/體積/分，pH 6.5-7.5的條件下，培養10-16小時；其中平板培養所用培養基的組分及重量百分含量為牛肉膏2-6％、無機鹽0.1-2％、瓊脂0.5-2.5％、pH 6.5-7.5；其中種子罐和發酵罐培養所用的液體培養基的組分及重量百分含量為牛肉膏2-6％、玉米漿0.5-4％、酵母粉0.5-2.5％、味精1-3％、pH 6.5-7.5。
本發明的方法中，平板培養所用培養基的組分及重量百分含量的優選方案為牛肉膏3-5％、NaCl 0.5-1.5％、瓊脂1-2％、pH6.5-7.5；種子罐和發酵罐培養所用的液體培養基的組分及重量百分含量的優選方案為牛肉膏3-5％、玉米漿1-3％、酵母粉1-2％、味精1.5-2.2％，pH 6.5-7.5。
本發明中對所使用的大腸桿菌菌種可以是野生的大腸桿菌菌種，也可以是經過化學或物理誘變的大腸桿菌菌種，誘變因子為常規的處理因子，如紫外線(UV)，氯化鋰(LiCl)等。
利用本發明的方法，門冬酰胺酶的產酶單位達到50-80單位/毫升，生產門冬酰胺酶針劑原材料成本大大降低。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明的方法作進一步的說明。
實施例1(1)平板培養準備10個平皿，牛皮紙包好，滅菌備用。按牛肉膏3.5％，NaCl 1％，瓊脂1.2％，pH 6.8的配方，配300毫升培養基，裝在500毫升三角瓶中，滅菌，冷卻至70℃，倒平皿(30毫升/皿)，凝固，待用。將凍干的大腸桿菌野生菌種用200微升無菌水溶解，取100微升至平皿中涂布，在39℃下，培養14小時。
(2)種子罐培養發酵培養配方牛肉膏3.5％，玉米漿2％，酵母粉1％，味精1.5％，pH 6.8。
種子罐采用100升罐，以裝量為60升計，則應按上述配方配60升培養基(實際只加水至55升，預算滅菌后的蒸汽冷凝水為5升)，配好培養基后加入100升罐中，滅菌，待溫度下降至40℃時，接入已長好的3個平皿菌種(用無菌水稍沖洗)，控制溫度39℃，轉速300轉/分，風量1∶1體積/體積/分，培養時間14小時。
(3)發酵罐培養發酵采用500升發酵罐，實際裝量為300升，減去種子罐菌種60升，實際配培養基量為300-60＝240升，按步驟(2)中所述配方，配240升培養基裝于500升罐中，滅菌，冷卻至40℃時，把已培養好的種子罐菌種接入500升罐內，控制溫度39℃，轉速250轉/分，風量1∶1體積/體積/分，pH 7.0，13小時后離心，收集菌體，即得門冬酰胺酶粗品。發酵效價為60單位/毫升。
實施例2(1)平板培養準備10個平皿，牛皮紙包好，滅菌備用。按牛肉膏4％，NaCl 1％，瓊脂1.5％，pH 7.0的配方，配300毫升培養基，裝在500毫升三角瓶中，滅菌，冷卻至70℃，倒平皿(30毫升/皿)，凝固，待用。將凍干的經紫外線(UV)誘變的大腸桿菌菌種用200微升無菌水溶解，取100微升至平皿中涂布，在39℃下，培養14小時。
(2)種子罐培養發酵培養配方牛肉膏4％，玉米漿2％，酵母粉1.5％，味精1.8％，pH 7.0。
種子罐采用100升罐，以裝量為60升計，則應按上述配方配60升培養基(實際只加水至55升，預算滅菌后的蒸汽冷凝水為5升)，配好培養基后加入100升罐中，滅菌，待溫度下降至40℃時，接入已長好的3個平皿菌種(用無菌水稍沖洗)，控制溫度39℃，轉速300轉/分，風量1∶1體積/體積/分，培養時間14小時。
(3)發酵罐培養發酵采用500升發酵罐，實際裝量為300升，減去種子罐菌種60升，實際配培養基量為300-60＝240升，按本實施例步驟(2)中所述配方，配240升培養基裝于500升罐中，滅菌，冷卻至40℃時，把已培養好的種子罐菌種接入500升罐內，控制溫度39℃，轉速250轉/分，風量1∶1體積/體積/分，pH 7.0，13小時后離心，收集菌體，即得門冬酰胺酶粗品。發酵效價為78單位/毫升。
權利要求
1.一種發酵生產門冬酰胺酶的方法，包括平板培養、種子罐培養、發酵罐培養，其特征在于(1)平板培養將凍干的大腸桿菌菌種用水溶解后，涂布至凝固有培養基的平皿上于36-40℃培養10-36小時；(2)種子罐培養將(1)中已長好的平皿菌種接入種子罐中，在36-40℃，轉速250-500轉/分，風量1∶0.3-1∶1.2體積/體積/分的條件下，培養10-16小時；(3)發酵罐培養將(2)中已培養好的種子罐菌種接入發酵罐中，接種量為10-30％，在36-40℃，轉速180-350轉/分，風量1∶0.3-1∶1.2體積/體積/分，pH6.5-7.5的條件下，培養10-16小時；其中平板培養所用培養基的組分及重量百分含量為牛肉膏2-6％、無機鹽0.1-2％、瓊脂0.5-2.5％、pH 6.5-7.5；其中種子罐和發酵罐培養所用的液體培養基的組分及重量百分含量為牛肉膏2-6％、玉米漿0.5-4％、酵母粉0.5-2.5％、味精1-3％、pH 6.5-7.5。
2.根據權利要求1所述的發酵生產門冬酰胺酶的方法，其特征在于平板培養所用培養基的組分及重量百分含量為牛肉膏3-5％、NaCl 0.5-1.5％、瓊脂1-2％、pH 6.5-7.5。
3.根據權利要求1所述的發酵生產門冬酰胺酶的方法，其特征在于種子罐和發酵罐培養所用的液體培養基的組分及重量百分含量為牛肉膏3-5％、玉米漿1-3％、酵母粉1-2％、味精1.5-2.2％，pH 6.5-7.5。
4.根據權利要求1所述的發酵生產門冬酰胺酶的方法，其特征在于所述的大腸桿菌菌種可以是野生型的，也可以是經過化學或物理誘變的大腸桿菌菌種。
全文摘要
本發明屬于生物發酵領域，提供了一種發酵生產門冬酰胺酶的方法。以大腸桿菌為出發菌進行發酵生產，在適合的培養基和培養條件下，能使門冬酰胺酶獲得高效表達，產酶單位為50－80單位/毫升。使用本發明的方法生產門冬酰胺酶針劑，原材料成本大大降低。
文檔編號C12N9/78GK1397645SQ0213457
公開日2003年2月19日 申請日期2002年8月19日 優先權日2002年8月19日
發明者梁淑娃, 彭中健, 杜少平, 楊冠東 申請人:廣州市微生物研究所