專利名稱：：具有生物安全性的植物基因工程操作方法
技術領域：
：本發明涉及一種具有生物安全性的無載體、無選擇標記基因的基因工程技術方法，屬于生物工程領域。技術背景植物基因工程是指采用重組體DNA技術克隆外源基因并導入植物中，通過基因表達使植物獲得新的性狀，培育植物新品種。這一技術克服了植物有性雜交的限制，基因交流的范圍無限擴大，可將從細菌、病毒、動物、人類、遠緣植物甚至人工合成的基因導入植物，所以其應用前景十分廣闊。1983年，世界首例轉基因植物培育成功，標志著人類應用轉基因技術改良農作物的開始。1986年，轉基因農作物獲得批準進入田間試驗。1994年，美國Calgene公司培育的延熟保鮮的轉基因番茄被批準商品化生產。近年來，全球范圍內轉基因農作物的種植面積呈逐年大幅度增長的趨勢，1996年全世界轉基因農作物的種植面積僅為170萬公頃，2000年達到4,420萬公頃，增長了25倍。其中，美國、加拿大、阿根廷三個國家的轉基因植物的種植面積占其中的99％。轉基因作物產品的市場銷售額從1995年的0.75億美元增長到1999年的22億美元左右，五年間增長約30倍。據不完全統計，轉基因研究至少在35科120種植物中獲得了成功，所涉及到的性狀包括抗蟲、抗病毒、抗細菌、抗真菌、抗除草劑、抗逆境、品質改良，以及對生長發育的調控以提高產量潛力等。根據“經濟合作與發展組織”(OECD)的統計，從1986年到2000年的15年間，OECD國家共批準10,313例轉基因生物進入田間試驗，其中轉基因植物占總數的98.4％，涉及的植物種類有40多種。在全部被批準的10,313例田間試驗中，美國占71.1％，種植面積在100萬公頃以上的有大豆、玉米、棉花和油菜，主要為抗除草劑基因和抗蟲基因。尤其需要指出的是，美國1999年種植轉基因大豆面積為1,500萬公頃，占全國大豆種植面積的50％；轉基因玉米的種植面積為1,030萬公頃，占全國玉米種植面積的33％。目前，美國超過60％的加工食品中含有轉基因成分，轉基因食品的銷售額高達百億美元。中國現有6種轉基因植物被批準進入商品化生產，包括耐儲藏番茄(1997)、抗蟲棉(1997)、觀賞植物矮牽牛(1997)、抗病毒甜椒(1998)、抗病毒番茄(1998)，以及美國孟三都公司培育的抗蟲棉(1997)。其中種植面積最大的是抗蟲棉，到2000年底止，國產抗蟲棉的累計推廣面積達37萬公頃，減少農藥用量達80％，創造效益7.7億元人民幣。轉基因植物的產業化，尤其是轉基因農作物的產業化，由于能夠提高產量、減少除草劑和殺蟲劑等農藥的使用量以及節約大量勞力，為人類帶來了巨大的經濟效益和社會效益。據聯合國估計，全球有八億五千六百萬人口遭受饑餓的折磨。轉基因技術能夠培育出高產、優質的農作物新品種，從而使這一狀況得到根本緩解。另外，利用轉基因技術培育出抗病、抗蟲的農作物新品，可以解決由于長期過量使用農藥和化肥所帶來的難以治理的環境危害。植物轉基因技術在顯示出極為廣闊的應用前景的同時，也引發了轉基因植物包括環境和食品兩個方面的安全性問題。環境安全性評價的核心問題是轉基因植物釋放到田間后，是否會將所轉基因移到野生植物中，是否會破壞自然生態環境，打破原有生物種群的動態平衡，包括(1)轉基因植物演變成農田雜草的可能性。(2)基因漂流到近緣野生種的可能性。(3)對生物類群的影響。關于食品的安全性主要涉及到(1)有毒物質。必須確保轉入的外源基因或基因產物對人畜無害。(2)過敏源。在自然條件下存在著許多過敏源，在基因工程操作中如果將控制過敏源形成的基因轉入目標植物，則會產生不利的影響。引發安全性問題的根源在于(1)目前的植物基因轉化系統中，所導入的外源基因和所使用的載體元件通常來源于非近緣物種，甚至為人工合成，可能成為人類新的過敏源；(2)采用抗抗生素類藥物基因或抗除草劑類藥物基因作為選擇標記基因用于轉化體的篩選，可能造成對生態環境的潛在危害。導入外源基因所編碼的蛋白在下列情況可能產生過敏性(1)所轉基因編碼已知的過敏蛋白；(2)基因源含有過敏蛋白；(3)導入基因編碼的蛋白與已知過敏蛋白的氨基酸序列在免疫學上有明顯的同源性；(4)導入基因編碼的蛋白屬某類蛋白的成員，而這類蛋白家族中的某些成員是過敏蛋白。由標記基因引發的安全性問題主要取決于(1)標記基因有無直接毒性；(2)基因的水平轉移(HorizontalTransfer)；(3)未預料的基因多效性；(4)標記基因編碼蛋白的安全性，包括直接毒性、過敏性、因蛋白的催化功能而產生的副作用等。由標記基因帶來的安全性問題主要包括(1)編碼除草劑的基因是否會通過基因逃逸渠道使轉基因植物的近源野生種轉變成雜草，破壞自然生態環境，打破生物種群動態平衡；(2)轉基因植物是否會對土壤產生影響；(3)抗生素編碼基因的水平轉移是否會導致微生物和某些害蟲的抗藥性等。載體骨架序列整合到植物基因組中所導致的安全性問題目前尚不清楚。雖然這些序列在轉基因植物中沒有任何價值，但卻有可能產生有負面作用的蛋白質，或者影響植物正常基因的表達和促進轉基因的重排等。另外，這些序列也有可能會逃逸到環境中，對生態環境造成潛在的負面影響。近年來，有關轉基因生物安全性的爭論主要有Pusztai事件1998年，英國研究人員Pusztai的研究表明，幼鼠食用轉基因馬鈴薯后，導致其內臟和免疫系統損壞，體重減輕，從此引發了國際上對轉基因作物安全性的爭論。帝王蝶事件1999年，美國康奈爾大學Losey等報道，用涂有轉Bt基因抗蟲玉米花粉的馬利筋草葉片喂養帝王蝶(Monarchbutterfly)，導致幼蟲發育不良，死亡率顯著提高。在美國衣阿華州進行的野外實驗也獲得了同樣的結果。丹麥科學家的研究表明，把抗除草劑的轉基因油菜與雜草一起培養，產生了抗除草劑的雜草，預示著通過轉基因技術產生的基因可以擴散到自然界中。美國亞利桑那大學的研究結果指出，已經發現一些昆蟲，吃了抗蟲的轉基因農作物后并不死亡，具備了一定的抵抗力。有關研究還發現，Bt基因的農作物產生的具有殺蟲功能的毒素(Bt)可由根部滲入周圍的土壤，并可保持很強的活性，仍能殺蟲，有可能使一些害蟲產生抗藥性，對環境生態產生長遠的負面影響。目前，對上述轉基因植物安全性問題的解決方案是對轉基因植物進行安全性評價，主要包括表型性狀(形態、產量等農藝性狀)、關鍵營養成分(脂肪、蛋白質、碳水化合物或微量營養成分)及抗營養因子、有無毒性物質及有無過敏性蛋白等，主要針對導入外源基因編碼的蛋白質的特性研究，并不能有效地解決由基因轉化系統，尤其是由選擇標記基因帶來的安全性問題。為了從根本上解決轉基因植物可能引起的食用安全性和環境安全性問題，人們已經在建立無載體轉化系統或無選擇標記基因轉化系統方面進行了嘗試，如位點特異性重組(SiteSpecificRecombination)、轉座子介導的再定位(Intra-genomicRelocationofTransgenesViatransposableElements)、共轉化(Co-transformation)、選擇標記基因的組織特異性表達(TissueSpecificExpressionofSelectableMarkerGenes)、靶基因替換(TargetedGeneReplacement)、同源重組(HomologousRecombination)等。上述各種植物基因工程操作方法盡管已經取得了一些進展，但在徹底去除選擇標記基因和載體骨架序列、建立可應用的植物遺傳轉化技術上等方面還存在許多有待于解決的技術問題。因此，尋找一種僅將外源的目的基因及表達調控序列轉入植物的途徑并建立成熟的植物基因工程操作方法，從根本上解決植物轉基因安全性存在的問題，將具有十分廣泛的應用前景。
發明內容本發明提供了一種具有生物安全性的無載體、無選擇標記基因的植物基因工程操作方法。本發明采用的方法能夠解決常規植物基因工程操作中由載體骨架序列和選擇標記基因所引起的轉基因植物安全性問題。本發明提供的植物基因工程操作方法，其要點是構建由外源基因和調控序列，以及兩側的邊界序列共同組成的基因轉化元件，再通過花粉管通道等途徑進行基因轉化操作，并根據基因轉化元件中外源基因的表達和邊界序列插入植物基因組后引起轉化植株性狀的變化，在DNA水平、蛋白質水平和形態性狀水平進行檢測，以鑒別轉化植株。本發明提供的供轉化的基因轉化元件是一段線性的脫氧核糖核苷酸序列，包括編碼某一功能蛋白的結構基因和植物基因的表達調控序列，以及位于表達調控序列兩側的邊界序列。本發明提供的基因轉化元件中的邊界序列，可以是T-DNA的邊界序列或轉座子的全部(或部分)DNA序列。采用T-DNA的邊界序列構建的基因轉化元件進行植物轉化時，轉化率為10-1-10-2。本發明也可以將所轉化的植物基因組中某一編碼區的全部(或部分)DNA序列作為邊界序列，或將某一編碼區的調控序列作為邊界序列，還可以將所轉化的植物基因組中某一非編碼區的DNA序列作為邊界序列。采用植物基因組中某一編碼區、或將某一編碼區的調控序列、或非編碼區DNA序列作為基因轉化元件中的邊界序列是外源基因與受體DNA同源重組的基礎，這類邊界序列的主要功能是在基因轉化過程中有助于基因轉化元件可以定向地整合到物基因組中，由其構建成的基因轉化元件的轉化率為10-3-10-4。本發明提供的將所轉化的植物基因組中作為邊界序列的某一編碼區DNA序列，可以是編碼決定植物某一形態性狀的結構基因，其改變可引起植物在育性、葉片是否有毛、葉片顏色、植株矮化等形態性狀發生變化。本發明提供的將所轉化的植物基因組中作為邊界序列的某一編碼區DNA邊界序列，也可以是編碼決定植物體內某一生理、生化性狀的結構基因，如編碼調控植物體內某一代謝環節的酶或蛋白質基因的改變，可以引起植物某一氨基酸或其它代謝產物發生變化。選擇所轉化的植物基因組中某一編碼區的DNA序列作為邊界序列，在轉化過程中可以通過同源重組方式使基因轉化元件定向地插入到植物基因組中，導致編碼決定植物某一性狀基因的失活，該基因的失活通常不會明顯地影響植物的正常生長。植物轉化后代基因組中，由于基因轉化元件的插入將導致某一形態性狀或生理、生化性狀的改變，本發明據此建立相應的檢測方法以便有效地鑒別外源基因是否轉化到植株中。本發明提供的將所轉化的植物基因組中某一結構基因的調控序列作為邊界序列，包括啟動子區域(及部分結構基因序列)和3’端調控區域(及部分結構基因序列)。在轉化過程中可以通過同源重組方式使基因轉化元件替換掉該結構基因，使外源基因特異性表達。本發明提供的將所轉化的植物基因組中作為邊界序列的某一非編碼DNA序列，可以是真核生物染色質中可以與核基質結合的核基質結合區(MatrixAttachmentRegion，MAR)DNA序列。MAR序列有助于提高外源基因的整體表達水平，并增強外源基因表達的穩定性。也可以是在真核生物基因組中的中度或高度重復序列，如18SrRNA序列等。本發明提供的編碼某一功能蛋白的結構基因，包括來源于無花果曲霉(A.ficuumAs3.324)的植酸酶(phytase)基因，以及來源于鹽生植物遼寧堿蓬(Suaedaliaotungensiskitag)的可提高轉化植株甜菜堿含量，從而提高其耐鹽堿和耐旱能力的膽堿單加氧酶(cholinemonooxygenase，CMO)和甜菜堿醛脫氫酶(betainealdehydedehydro-genase，BADH)基因等。本發明使用的位于結構基因兩側的植物基因表達調控序列包括啟動子、轉錄終止子、增強子等。本發明主要采用花粉管通道法轉化植物，即將裸露的線形的外源的基因轉化元件通過花粉管通道進入胚囊，直接轉化尚不具備正常細胞壁的卵細胞、合子或早期胚胎細胞，不需經過原生質體培養、細胞培養、組織培養以及再生植株等遺傳轉化過程。本發明還可以采用種子浸泡法和胚囊注射法轉化植物。本發明采用花粉管通道等方法將構建的基因轉化元件導入植物體內，獲得的是轉化的植物種子。由于轉化的種子和未轉化的種子混雜在一起，本發明根據所設計的邊界序列和使用的外源基因，提供了DNA水平、蛋白質水平和形態性狀水平三個層次的基因轉化植株(種子)的檢測策略。DNA水平的檢測方法包括PCR、DNA序列測定、SOUTHERN雜交、NORTHERN雜交等；蛋白質水平的檢測方法包括表達蛋白(或酶)的生理生化指標檢測、氨基酸含量變化的測定、WESTERN雜交等；形態性狀水平的檢測包括對外觀性狀的觀察和檢出等。利用本發明提供的植物基因操作方法所構建的基因轉化元件，由外源基因、表達調控序列和邊界序列組成，因此從根本上解決了常規轉化方法中由于使用來源于微生物等其它非近緣物種載體，以及采用抗抗生素類藥物基因或抗除草劑類基因作為選擇標記基因所帶來的安全性問題。本發明提供的位于表達調控序列兩側的邊界序列是外源基因與受體植物基因組DNA重組的基礎。應用花粉管通道方法可以實現該基因轉化元件導入植物，方法簡便有效，轉化速度較快，一般當年即可獲得轉基因植株，并且可基本上應用于任何開花植物，進行任何物種之間包括人工合成的基因轉移，不受植物基因型的限制，從而極大地擴大了基因工程目的基因的來源和受體植物的范圍。具體實施方式以下是本發明提供的六個最佳實施例。實施例1含有T-DNA邊界序列和植酸酶基因轉化元件的構建及花粉管通道法轉化玉米和大豆(a)植酸酶基因phyI的獲得用馬鈴薯培養基30℃震蕩培養無花果曲霉A.ficuumAs3.324，24小時后收集菌體提取基因組DNA。以A.ficuumNRRL3135的phyA核苷酸序列作參考，設計兩條PCR引物(F15’-AGGTGGGATGAAGGGGTTAT-3’，R15’-CAGCGGCCGCCTAAGCAAAACTCTCCGCCC-3’)，PCR擴增獲得全長為1515bp的phyI結構基因(GenBank，AY013315)，+46-+156的11個核苷酸為內含子序列，其中含有真菌內含子的特征保守序列(Doner序列GTATGC；Lariat序列GCTGAC；Acceptor序列CAG)。phyI共編碼467個氨基酸，N端的19個氨基酸為信號肽。在phyI編碼的氨基酸序列中存在10個潛在的糖基化位點，81-88位氨基酸為植酸酶的活性位點保守序列RHGARYPT。phyI基因序列如下1gaggaccggctggtccggtgcaatggccatcgccatcaattgctgctgtgcaagaaattt61ctcctcataggtatcatgggtgtctctgccgttctacttcctttgtacctcctgtccgga241ggactggcagtccccgcctcgagaaatcaatccacttgcgatacggtcgatcaggggtat301caatgcttctcggagacttcgcatctttggggccaatacgcgccgttcttttctctggca361aacaaatcggccatctcccctgatgttcctgccggatgccatgtcactttcgcccaggtt481atcgaggagatccagcagaacgcgacaaccttcgaggggaaatatgccttcctgaagaca541tacaactacagcctgggcgcggatgacctgactcccttcggagagcaggagctggtcaac601tccggcgtcaagttctaccagcgatacgaatcgctcacaagaaacattgtcccgttcatc661cgatcctcaggctccagccgcgtgattgcctctggcaataaattcatcgagggcttccag721agcactaagctgaaggatcctcgtgcccagcccggccaatcgtcgcccaagatcgacgtg781gtcatttcagaggccagcacatccaacaacactctcgatccgggcacctgcaccgttttc841gaagatagcgaattggccgatgacatcgaagccaatttcaccgccacgttcgtcccctcc901attcgtcaacgtctggagaacgacttgtctggcgtgtctctcacggacacagaagtgacc961tacctcatggacatgtgctccttcgacaccatctccaccagcaccgtcgacaccaagctg1021tcccccttctgtgacctgttcacccatgaagaatggatcaactacgactacctccagtcc1081ctgaacaaatactacggccatggcgcaggtaacccgctcggcccgacccagggcgtcggc1141tacgctaacgagctcatcgcccgtctcacccactcgcctgtccacgatgacaccagctcc1201aaccacacattggactccaacccggctactttcccgctcaactccactctctatgcggac1261ttttcgcatgataacggcatcatctctatcctctttgctttgggtctgtacaacggcacc1321aagccgctgtcttccacgaccgcggagaatatcacccagaccgatgggttctcatctgcc1381cggacggttcctttcgcgtcgcgcatgtacgtcgagatgatgcaatgccagtccgagcag1441gagcctttggtccgtgtcttggttaatgatcgtgttgttccgctgcatggctgtccggtt1501gatgctttgggaagatgtacgcgggatagcttcgtgaaggggttgagctttgccagatct1561ggcggtgattgggcggagtgttttgcttag注翻譯起始密碼子；翻譯終止密碼子；內含子序列酶活性中心編碼序列。(b)基因轉化元件TCPNT的構建基因轉化元件TCPNT結構為5’-T-DNA-CaMV35S-phyII-Nos-T-DNA-3’具體策略如下利用PCR方法獲得去掉內含子的植酸酶基因phyII。克隆至植物表達載體pBI121中，構成pBI121/phyII重組質粒，用PCR方法擴增獲得帶有T-DNA邊界序列的轉化元件TCPNT。引物序列如下TR5’-GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCACCGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3’TF5’-TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACTGCCTGCAGGTCCCCAGATTAGCCTT-3’注下劃線為T-DNA邊界序列。PCR反應條件如下94℃預變性5min，94℃變性30sec，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共30個循環，最后72℃延伸10min。PCR擴增TCpNT片段大小約2.7kb，經氯仿/異戊醇抽提，吸取上清，無水乙醇沉淀，吹干后溶于0.1×SSC溶液，終濃度為300ng/ul，待用于轉化。(c)花粉管通道法轉化玉米和大豆種植玉米自交系137、K12和C8605-2，待生長至開花期做雌、雄花套袋隔離，雄花套袋隔離24小時后自花授粉。24小時后切除部分雌花柱頭，將100ulTCPNT溶液滴于切口處，套袋。對照植株只轉化0.1×SSC溶液(不含TCPNT)。成熟后收獲種子。選擇大豆品種早熟91025-7、遼豆16和鐵豐29，在大豆自花授粉后6-32小時(花冠高于花萼1mm左右)切除柱頭，將5ulTCPNT溶液滴于切口處。如果氣溫較高，補滴一次。標記處理的花朵，并摘除該花所在果枝的頂心。成熟后收獲種子。(d)轉化植株的檢測PCR檢測根據phyII基因序列設計引物F45’-CCAAGGGCAAGAAATACTCC-3’R45’-GAGAGACACGCCAGACAAG-3’以玉米幼葉基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得0.5kb的目的基因片段。檢測137品系1019株，其中陽性植株132株；檢測C8605-2品系960株，獲得陽性植株94株。以大豆幼葉基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得0.5kb的目的基因片段。檢測早熟91025-7品種121株，其中陽性植株19株；檢測遼豆16品種259株，其中陽性植株57株，檢測鐵豐29品種78株，其中陽性植株6株。SOUTHERNBLOT分析PCR檢測陽性植株的玉米和大豆基因組DNA經EcoRI酶切，瓊脂糖電泳，轉膜。以R4和F4為引物，以pBI121/phyII質粒為模板進行PCR擴增獲得約0.5KbDNA片段，用ECL試劑盒(amershampharmaciabiotech)標記探針，進行SOUTHERN雜交。SOUTHERN雜交分析表明，轉化的植酸酶基因已經整合到玉米和大豆的基因組上。酶活性分析取PCR檢測陽性的玉米或大豆葉片及對照植株葉片于研缽中，加入適量的pH5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，研磨、離心，取上清液用于植酸酶活性測定。取0.1ml待測液(空白對照為0.1ml蒸餾水)，加0.9ml1.25mM植酸鈉溶液搖勻，37℃水浴保溫反應15min后，立即加入1ml10％TCA搖勻終止反應(對照樣品為先加入1ml10％TCA，然后37℃水浴保溫反應15min)，加入2ml0.5％對苯二酚溶液搖勻，用蒸餾水定容至20ml，靜置30min后，在660nm處用分光光度計測定吸光值。酶活性計算公式如下U酶活性單位(nmol/min.ml)OD測定樣品660nm下的吸光度OD0對照樣品660nm下的吸光度N樣品的稀釋倍數3l磷的原子量K標準曲線斜率T酶作用時間透明圈篩選首先配制植酸鈣溶液3克醋酸鈣溶于100毫升去離子水中，1克植酸溶于400毫升去離子水中。將醋酸鈣溶液在不斷攪拌下緩緩加入到植酸溶液中，將混合液加熱至沸，并不斷攪拌，混合液冷至室溫后于4℃下過夜。用此植酸鈣溶液中，按PDA培養基配方加入各種組分，151bf/in2(1.034×105Pa)高壓下蒸汽滅菌20min，倒平板備用。選取8株玉米轉基因幼苗，接種于植酸酶菌株篩選培養基上，30℃，倒置培養72小時。水解培養基中的不溶性植酸鈣形成水解圈。8株被檢幼苗中，5株有水解圈，證明植酸酶基因已獲得表達。(e)轉基因植株遺傳穩定性分析對于子二代的玉米植株采用上述檢測手段分析。實驗數據表明外源植酸酶基因已在玉米基因組內穩定遺傳，其它形態性狀沒有變化。實施例2含有核基質區(MAR)邊界序列和膽堿單加氧酶(CMO)基因轉化元件的構建及花粉管通道法轉化水稻(a)膽堿單加氧酶(cholinemonooxygenase，CMO)基因的獲得用RT-PCR和RACE技術獲得鹽生植物遼寧堿蓬(Suaedaliaotungensiskitag)膽堿單加氧酶基因(CMO，GenBank，AF354442)cDNA全序列。CMOcDNA全長1820bp，5′端非編碼區123bp，3′端非編碼區368bp，含有2個可能的加polyA信號AATAA、AATTAA，開放閱讀框1329個核苷酸，編碼442個氨基酸，其中含有成熟肽鏈起始區“AVA”，具備Rieske-type〔2Fe-S〕蛋白的保守Cys-His對“CTH”和“CPYH”，包括保守的多鐵原子核結合域“DNYLD”和“HVPYAH”。CMO基因序列如下1gcacaaacttgttagttgtataactctacacaacacaagcaagaagctaagccaaaccaa61gctaagcttaaggaggaataacatttcatcatataatcttaatttaatttaaggtcttgt121ttgatggctgcatcagcaagtgctaccacaatgttgctaaaatacccaactatttgtgga181gtaccaaacaatgaatcttcatcttgttcaccaaaagataatcatctcaatgtttctcaa241caacaaaacaacaacaaccctttactcaaatttagaacacaaccaactaaactagttgcc301aacgcagtcgcttcgccggttttccctgcttcttcaaccacaacatcatcaccttcttct361tcttccatcaatcaacttgttcatgaatttgatcctaaaattccacctgaagatgctttt421actcctcctagctcttggtatactgaacctgccttctactctcatgaacttgaccgtatc481ttttacaaaggatggcaagttgcaggaataagtgaccaaatcaaggagaaaaaccagtac541ttcactggcactttaggaaatgttgaatatgtggtgagccgagatggtgaaggaaaagtt601catgcatttcacaatgtttgcactcaccgtgcttctattcttgcttgtggaagtggcaaa661aagtcctgctttgtgtgcccttaccatggatgggtgtttggcatggatggagacctcaca721aaagccacccaaacaactgatgcacaaacatttgatcctaaagaatatggcttaaaaccc781ctaaaggttgcagtatggggaccattcgttctcatcagtttggacaaaactcttccggaa841agtgatgttggcactgagtggcttggttctagtgccgaagatgttaaggcccatgccttt901gatccctctctcaaattcattcatagaagtgaattccccatggaatgtaactggaaggtc961tttagtgacaactacttggatagctcataccatgttccttacgcacacaaatactatgca1021actgaacttgactttgatacttatgacactcaaacaatcggcaaagttgtgatccaaaga1081gttggaagcaacacaaacaggcctgatggtttcgatagacttggagagaaagcattctat1141gcttttacttatcccaactttgctgtggaaaggtatggcccttggatgacaacaatgcat1201gttcagccaatagctcaaaggaaatgcaaattagtggtggactattacattgaagactct1261ttgctggataacaaggattacatcgaaaaaggaatagcaatcaacgacaacgtacagaaa1321gaagataaggtgttgtgtgaaagtgtccaaaagggtctggagacaccagcatatcgttct1381ggcagatatgtgatgccaattgagaaaggaatccaccatttccactgctggttgcaccaa1441attttgaagtgatttaatttgccctaagtttcattgttccatggatattaattataaaga1501gtcgaagtcgaattccgcataattaaaactgttgtcaaacatatggtcttaatgtagtat1561tttttatgtatgttgtatggtcataagcaaatgttttattgcttgtgttcttggaaaaca1621atttggtgctaatgtctattataaataaacaccaccatagcaccctctccccgaaaagaa1681tctcgaatattcccaaagaggatgggaatctgagattgttgatgaatgatgaacatgtat1741tgagaactatgtatgatttttcatcagttatattatagaatgaaagaacaatgtgtgttg1801attaaaaaaaaaaaaaaaaa(b)基因轉化元件MCCNM的構建基因轉化元件MCCNM結構為5’-MAR-CaMV35S-CMO-Nos-MAR-3’具體策略如下利用PCR方法獲得CMO基因的編碼區，克隆到植物表達載體pBI121中，構成pBI121/CMO重組質粒，引物序列如下CF5’-GGGGATCCAATTTAAGGTCTTGTTTGATGGCTG-3’CR5’-GGGAGCTCTCACTTCAAAATTTGGTGCAACC-3’通過PCR方法從煙草基因組DNA中獲得MAR序列(上游引物5’-CGATTAAAAATCCCAATTATATTTGG-3’，下游引物5’-CCCTTGAAGAAGACTTTTATCA-3’)，長度為1167bp。將兩個MAR片段同向連接在pUC19載體上。MAR序列如下1cgattaaaaatcccaattatatttggtctaatttagtttggtattgagtaaaacaaattc61gaaccaaaccaaaatataaatatatagtttttatatatatgcctttaagactttttatag121aattttctttaaaaaatatctagaaatatttgcgactcttctggcatgtaatatttcgtt181aaatatgaagtgctccatttttattaactttaaataattggttgtacgatcactttctta241tcaagtgttactaaaatgcgtcaatctctttgttcttccatattcatatgtcaaaatcta301tcaaaattcttatatatctttttcgaatttgaagtgaaatttcgataatttaaaattaaa361tagaacatatcattatttaggtatcatattgatttttatacttaattactaaatttggtt421aactttgaaagtgtacatcaacgaaaaattagtcaaacgactaaaataaataaatatcat481gtgttattaagaaaattctcctataagaatattttaatagatcatatgtttgtaaaaaaa541attaatttttactaacacatatatttacttatcaaaaatttgacaaagtaagattaaaat601aatattcatctaacaaaaaaaaaaccagaaaatgctgaaaacccggcaaaaccgaaccaa661tccaaaccgatatagttggtttggtttgattttgatataaaccgaaccaactcggtccat721ttgcacccctaatcataatagctttaatatttcaagatattattaagttaacgttgtcaa781tatcctggaaattttgcaaaatgaatcaagcctatatggctgtaatatgaatttaaaagc841agctcgatgtggtggtaatatgtaatttacttgattctaaaaaaatatcccaagtattaa901taatttctgctaggaagaaggttagctacgatttacagcaaagccagaatacaaagaacc961ataaagtgattgaagctcgaaatatacgaaggaacaaatatttttaaaaaaatacgcaat1021gacttggaacaaaagaaagtgatatattttttgttcttaaacaagcatcccctctaaaga1081atggcagttttcctttgcatgtaactattatgctcccttcgttacaaaaattttggacta1141ctattgggaacttcttctgaaaatagt用PstI/EcoRI酶切pBI121/CMO重組質粒，獲得含有CaMV35S-CMO-Nos的片段，并插入到pUC19/MAR片段之間，構成基因轉化元件MCCNM。酶切獲得MCCNM片段大小約4.9kb，經氯仿/異戊醇抽提，吸取上清，無水乙醇沉淀，吹干后溶于0.1×SSC溶液，終濃度為300ng/ul，待用于轉化。(c)花粉管通道法轉化水稻選擇水稻品種遼粳294、遼粳454和鐵粳4號。在水稻開花后1-3小時內，剪掉已開過的穎花和當日不能開的穎花，選擇當日開放的穎花，逐個將穎殼剪掉1/3，用微量注射器滴注MCCNM溶液，每朵穎花10ul，套袋。對照植株只轉化0.1×SSC溶液(不含MCCNM)。成熟后收獲種子。(d)轉化植株的檢測PCR檢測用CF和CR引物，以轉化的水稻幼苗基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得1.4kb的目的基因片段。SOUTHERNBLOT分析PCR檢測陽性植株的水稻基因組DNA經EcoRI酶切，瓊脂糖電泳，轉膜。以CF和CR1(5’-GAATAGAAGCACGGTGAGTGC-3’)為引物，以pBI121/CMO質粒為模板進行PCR擴增獲得約0.52KbDNA片段，用ECL試劑盒(AmershamPharmaciaBiotech)標記探針，進行SOUTHERN雜交。SOUTHERN雜交分析表明，轉化的CMO基因已經整合到水稻基因組上。甜菜堿含量測定取1.5g植物材料加入10ml甜菜堿提取液(甲醇∶氯仿∶水＝12∶5∶3(V/V))后進行研磨。勻漿液在60～70℃水浴中保溫10min。冷卻后，于20℃下1000×g離心10min，收集水相。氯仿相再加入10ml提取液，反復振蕩，離心取上層水相合并，調pH至5～7，在70℃下蒸干，用3ml超純水重新溶解。在10～400g/ml范圍內分別制作甜菜堿和膽堿標準曲線。甜菜堿的標準曲線配制QACs沉淀溶液。每個濃度的標準溶液0.5ml加入0.2mlQACs沉淀溶液混勻，0℃下保溫90min，間歇振蕩。加入2ml預冷水，迅速加入20ml經10℃預冷的二氯乙烷，在4℃下劇烈振蕩5min，4℃下靜置至兩相完全分開。恢復至室溫，取下相測OD365。膽堿的標準曲線步驟同上，但反應試劑為膽堿沉淀溶液。按標準曲線制作方法分別測得四價銨化合物與膽堿在365nm處的吸收值，通過標準曲線得到相應的四價銨化合物與膽堿的含量，兩項相減，即求出甜菜堿的含量。耐鹽能力檢測在轉化水稻三葉期開始用1％-1.5％Nacl溶液澆灌，每2-3天一次，共篩選4-6周，存活植株經緩苗后移栽。相對電導率測定將新鮮葉片用300mmol/LNaCl脅迫處理4h，分別稱取0.2g葉片兩份，各加5ml超純水，一份于25℃、170rpm/min振蕩2h，另一份于沸水浴中加熱30min，分別用DDS-12數字電導儀測定電導率(所用的電極參數為0.95)。前者定義為Rc，后者定義為Rc′，相對電導率為Rc/Rc′×100％。(e)轉基因植株遺傳穩定性分析對于子代的水稻植株采用上述檢測手段分析，實驗數據表明外源CMO基因在水稻基因組內穩定遺傳。實施例3含有核基質區(MAR)邊界序列和甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因轉化元件的構建及花粉管通道法轉化小麥(a)甜菜堿醛脫氫酶(betainealdehydedehydrogenase，BADH)基因的獲得用RT-PCR和RACE技術獲得遼寧堿蓬(Suaedaliaotungensiskitag)甜菜堿醛脫氫酶基因(BADH，GenBank，AF359282)cDNA全序列。BADHcDNA全長1901bp，5’端非編碼區66bp，3’端非編碼區329bp，含有2個可能的加polyA信號AATAA，開放閱讀框1506bp，編碼502個氨基酸，其中有醛脫氫酶的保守序列VTLELGGKSP和半胱氨酸殘基C。BADH序列如下1gcttctcactctttcccttttctctcctcccatttttcatcgtcaactcaatttctttct61gcaacaatgtcgatccctataccttctcgtcagctattcattgatggagagtggagagaa121cccatcaaacgaaatcgtctcccaattattaatccttccactgaagaaaccattggggaa181attccagcagcaacagctgaggatgttgaagcagcagtaagtgctgctagaagagcactt241aagaggaacaaagggagagattgggctgctacttctggagctcaccgtgctagatacttg301cgtgctattgctgctaaggtatcagaaaaaaaagaccattttgttaaacttgaaaccatg361gattctgggaaaccactggatgaagcagtgttggacatagatgacgtttcgacatgtttt421gaatattttgctgatcaagcagaagctctggacaacaagcaaaagtatccagtcaaactt481cctatggacagatttaaaagtcatgttctcaggcagcctattggtgttgtgggattaatt541tcgccatggaattacccacttttgatggcgacatggaaaatcgctccagctcttgctgca601ggctgtacagctgtacttaagccatccgagttggcatctgtgacttgtctagaattcggt661gaagtttgcaacgaagtgggacttcctcctggtgtgttaaatattttgacgggattaggt721ccagatgcgggtgcaccattagtgtctcatcctgatgttgacaaggttgcattcactggg781agtagtgctactggaagcaaggttatgggttctgctgcccaattggttaagcctgtcacc841ttggaacttggaggtaaaagtcctataatcgtgttcgaagatgttgttgatcttgatgta901gctgctgaatggactatctttggtgttttctggacaaatggtcaaatatgtagcgcaact961tctagactgcttgtgcatgagagtattgcagctgaatttgttgaaaagcttgtaaaatgg1021tccaagaaaataaagatttctgatccatttgaagaaggatgccggcttggccctgttatt1081agcaagggacagtatgacaaaattatgaagtacatatcgacagcaaagagtgagggggca1141actattttgtgtggaggatctcgtcctgagcatctgaagaagggatacttcattgagcca1201accattgtaactgatatcaccacatccatgcaaatttggaaggaggaagtttttggccct1261gtcttatgtgttaaaacatttagtaccgaagaggaagcccttgaattagcaaatgacaca1321gaatatggtttagctgctgctgtgttttctaaagaccttgaaaggtgtgagagggtaaca1381aaggctctagaagttggggctgtctgggtgaattgctcacagccatgcttttgccatgct1441ccatggggaggcgtcaagcgtagcggttttggacgtgagcttggagaatggggtattgaa1501aattacttgaacattaagcaagtgactagcgatatttccgatgaaccatgggggtggtac1561aagtctccttaaaggcaaaagaggatatttgcaagataatgctgttatcaagtgaactgt1621gacacaagagtgacgaccatgtaatgttgtataacgatctagctcacagtttgtctattt1681gattaaataagggtcgtgcgatgctggagttccataggcattgattgattttgctatttg1741tgttattttggaccattgagaaaatttttggaccagggataagatgcttgcatataacat1801taagcctgttatatttgcaagtttaaattatatttgggtgtgttatgtaactaatgtttc1861attaataaaattctccttcgtctcgaaaaaaaaaaaaaaaa(b)基因轉化元件MCBNM的構建基因轉化元件MCBNM結構為5’-MAR-CaMV35S-BADH-Nos-MAR-3’具體策略如下利用PCR方法獲得BADH基因的編碼區，克隆到植物表達載體pBI121中，構成pBI121/BADH重組質粒。引物序列如下BF5’-TCGATCCCTATACCTTCTTCGTC-3’BR5’-CATGGTCACCTTAAGGAGACTTGTACCACC-3’SphI/EcoRI酶切pBI121/BADH重組質粒，獲得含有CaMV35S-CMO-Nos的片段，并按照實施例2方法構成基因轉化元件MCBNM。酶切獲得MCBNM片段大小約5.1kb，經氯仿/異戊醇抽提，吸取上清，無水乙醇沉淀，吹干后溶于0.1×SSC溶液，終濃度為300ng/ul，待用于轉化。(c)花粉管通道法轉化小麥選擇小麥品種遼春9、遼春10和遼春13。在小麥開花后1-3小時內，剪掉已開過的穎花和當日不能開的穎花，選擇當日開放的穎花，逐個將穎殼剪掉1/3，用微量注射器滴注MCCNM溶液，每朵穎花10ul，套袋。對照植株只轉化0.1×SSC溶液(不含MCBNM)。成熟后收獲種子。(d)轉化植株的檢測PCR檢測用BF和BR引物，以小麥幼苗基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得1.5kb的目的基因片段。SOUTHERNBLOT分析PCR檢測陽性植株的小麥基因組DNA經EcoRI酶切，瓊脂糖電泳，轉膜。以BF和BR1(5’-TAGGCTGCCTGAGAACATGAC-3’)為引物，以pBI121/BADH質粒為模板進行PCR擴增獲得約0.45KbDNA片段，用ECL試劑盒(AmershamPharmaciaBiotech)標記探針，進行SOUTHERN雜交。SOUTHERN雜交分析表明，轉化的BADH基因已經整合到小麥基因組上。甜菜堿含量測定同實施例2。耐鹽能力檢測同實施例2。相對電導率測定同實施例2。(e)轉基因植株遺傳穩定性分析對于子代的小麥植株采用上述檢測手段分析。實驗數據表明外源BADH基因在小麥基因組內穩定遺傳。實施例4含有玉米LKRSDH基因邊界序列和植酸酶基因轉化元件的構建及花粉管通道法轉化玉米(a)植酸酶基因的獲得同實施例1。(b)基因轉化元件LCPNL的構建基因轉化元件LCPNL結構為-LKRSDH5’端部分序列-CaMV35S-phyII-Nos-LKRSDH3’端部分序列-具體策略為根據LKRSDH基因序列設計合成引物，從玉米的基因組DNA中分別獲得5’和3’端部分序列，連接在pUC19上。用DNAExtractionKitforGMODetection試劑盒，提取玉米的DNA后，用引物L1(5’-TGGCTACTACTGAGAGTGATCGTTG-3’)和L2(5’-GTCATCATACTTACGCTGTCCGAGAC-3’)，獲得LKRSDH基因的5’端部分序列，長度為1350bp。LKRSDH基因5’端部分序列如下1tggctactactgagagtgatcgttgcgccgttcaagccgtgcgaagaccagttcatagta61caggagaaaaggaagcggacatgttcttcaatcatcttacactagtagtgaagtcacatg121ctacactactatcgtctctttgtcgggtagtaatcttgatttggaaccttccgttgcttt181ggagtttggactggttcattcagtggctgacactgggatggtgtactctgtccgacagct241acctttccgacagctacctggttggactactagctttctcttttgtttctttgcccgcca301gcgcctggcgactatattcagattcagtaaaatgggcgaatttcaactagtaatttgtta361tcgtagctcgtagcaccagattgccatgccgtctttgaactgtattccgtcccctgacaa421catctcactgtattaattttgacactttctaacggcctgactgtgtaaactcacttcatt481ttcaggaggttgtggatttcatgtccgtgatctaggcgccttacttggactcaggtatgg541gttctgctgctactgaggtgtgtaatctgaccccttttgttgttgcaaaccgtgcggtgt601ttgataaccttgttctttaatgtgacggttaattatgttgattcaatttccactcgcagg661gcaatgacaccttgctgggcaatggagttgttgggattcttgctgagacttgtaatatgt721gggaaagaagggcgccgttaactccttcccattgtgcccgccttctgctaggaggaggca781agaacggacctcgagtaaaccggattattgtgcagccaagcacaaggaggatccatcatg841acgctcagtatgaggatgcaggatgcgagatttcagaagacctgtcagaatgcggcctta901tcataggcatcaaacaacccaaggtcatatttctcattaagttagatactctattggaca961gtgctctataccaatatcagatatcaccatggttctgaaacgcttggaggtgtcttcact1021tgggcagctgcagatgattctttcagatagagcgtacgctttcttttcacacacacacaa1081agcccaaaaagagaatatgccactgttagacaaggtattaaacataagctcgtaccttca1141tcatttcagtcgtcaactgccattgtcattcatgtaggatattaaatcattgactaatgt1201cctcagatccttgaagaaagggtgtccttgtttgattatgagctaattgttggagatgat1261gggaaaagatcactagcatttgggaaatttgctggtagagctggactgatagatttctta1321catggtctcggacagcgtaagtatgatgac用另一對引物L3(5’-TAAAGATAGTATGATATAGCAGG-3’)和L4(5’-TTTCGGTGATTGTGTCATCGTGAG-3’)進行PCR擴增獲得LKRSDH基因的3’端部分序列，長度為0.9Kb。LKRSDH基因3’端部分序列如下1taaagatagtatgatatagcagggcacatgtatcttttgtattaactccgttctggaata61tatatttgtgaactaaaatgtgacaaataaaaagaacgggtggagtatattgtaagagac121ggcaaagaaacctctgtatatatgacctgtcgatatcaaataatgccgatcagttagttg181gcttggctcttttgagggtttagtttatactagtaaatgagagcaaccagcgaagcataa241acaagatgagacgtcagagcagcaacaacaacctgcgttgcctttggtttatattgcatc301ggttctccgaatgaactttgcatcctgtgcacatcagacatgtcccagagggatttcatt361ttcattaaattgacatatcagcaaatctgcttatgcgtcgagatatttatgagaggggaa421gagagcttcatgaaaccaaaccggtcctcacgactacccaggcgatgaaatccccgctag481gctgattgcttgatctatctactgcggctgctccagttcctcaggtgggcaccggcgcct541ccttccacggctgctacagtccagactcttcctgtttcgcgccaactccctcaagcccct601accctacaaacccgcttcaacggctgttcctcaggtggacagtttctttttcagtcagta661atacaacgctatatttaaacaggcacccactgtatttcttccttttcaacactcactgta721gcctgtttctgactttatgttcagttcggtgtcggcaacaattgccacaggtacagtgaa781ccaccaagcggataaccttgtcttaaaaacatgtggtacaggatgcaatccctggggatc841cagatttcaaaacaaacaacaatccttgcatagaacctcacgatgacacaatcaccgaaa酶切實施例1中的pBI121/phyII重組質粒，獲得含有CaMV35S-phyII-Nos的片段，并插入到pUC19/LKRSDH片段之間，構成基因轉化元件LCPNL。酶切獲得LCPNL片段大小約4.55kb，經氯仿/異戊醇抽提，吸取上清，無水乙醇沉淀，吹干后溶于0.1×SSC溶液，終濃度為300ng/ul，待用于轉化。(c)花粉管通道法轉化玉米同實施例1。(b)轉化植株的檢測賴氨酸含量檢測賴氨酸含量以每100克玉米所含賴氨酸克數或每100克玉米總蛋白質所含賴氨酸克數表示。玉米種子粉碎后，采用剴氏定氮法測出總蛋白含量。酶法水解(6mol/LHCl于110℃，在真空或充氮的安瓶內進行水解10-24小時)獲得樣液，利用氨基酸分析儀進行HPLC(茚三酮柱后衍生)檢測氨基酸組成，并計算氨基酸含量。其它檢測方法同實施例1。實施例5含有玉米絨氈層特異表達的MZm3-4基因邊界序列和植酸酶基因轉化元件的構建及花粉管通道法轉化玉米(a)植酸酶基因的獲得同實施例1。(b)基因轉化元件MCPNM的構建基因轉化元件MCPNM結構為5’-MZm3-4部分序列-CaMV35S-phyII-Nos-MZm3-4部分序列-具體策略為根據MZm3-4基因cDNA序列設計引物，從玉米基因組DNA中分別獲得5’和3’端部分MZm3-4序列，連接在pUC19上。用引物MZ1(5’-GACTAGAGTGGGATCGCGAGGAAGAA-3’)和MZ2(5’-GTCGCAGGTGCAGCTGGC-3’)進行PCR擴增，獲得MZm3-4基因的5’端部分序列，長度為約0.24Kb。堿基序列如下1gactagagtgggatcgcgaggaagaaggatgtcgtgctgcggaggaaactgcgggtgcgg61cagcggatgcaagtgcggcagcgggtgcggagggtgcaagatgtacccggacatggctga121gcaggtgaccaccaccaccaccatcatgggtgttgcaccatccaagggcgggttcgaggc181ggccgccggagctgagaacggcgggtgcaagtgcggcgccgccagctgcacctgcgac用引物MZ3(5’-TGCACCTGCAAGTGAGGA-3’)和MZ4(5’-CCATGTGGATTAGGCGTTATTGAGTCG-3’)進行PCR擴增，獲得MZm3-4基因的3’端部分序列，長度為約0.41Kb。堿基序列如下1tgcacctgcaagtgaggatgaccgggtgcagcatgcaggcccgtgacgatggaggaagta61gatcggaaggacacccttcagtatctctagctaaatcaagctctgagagtatgttgtagc121agcgtcgtctgtgtttgccgccatgcgtagctagctagctagtggtggtaaacgaataat181tgtcctgttcttcttcctcctcggcccctgccagtgttgcgtcgtgtgggccggccgggt241gcatgcacagcaccaggccatgcccgctgctatgtaagtgctcgagccagtagcatcgta301actcggtttgttaccgctagagctcgagccagttcgagagtagccattttaaaatgaagt361ctgcgcttgtgtgttatggatttaaatcgactcaataacgcctaatccacatgg酶切實施例1中構建的pBI121/phyII重組質粒，獲得含有CaMV35S-phyII-Nos的片段，并插入到pUC19/MZm3-4片段之間，構成基因轉化元件MCPNM。酶切獲得MCPNM片段大小約3.4kb，經氯仿/異戊醇抽提，吸取上清，無水乙醇沉淀，吹干后溶于0.1×SSC溶液，終濃度為300ng/ul，待用于轉化。(c)花粉管通道法轉化玉米同實施例1。(b)轉化植株的檢測花粉敗育檢測取轉化植株雄花穗，挑取花藥在解剖鏡下觀察花粉粒，根據花粉形態判斷敗育的花粉比例情況。其它檢測方法同實施例1。實施例6含有水稻醇溶蛋白(種子貯藏蛋白)基因ssp邊界序列和植酸酶基因轉化元件的構建及花粉管通道法轉化水稻(a)植酸酶基因的獲得同實施例1。(b)基因轉化元件SPS的構建基因轉化元件SPS結構為5’-ssp5’調控序列(包括啟動子區)-phyII-ssp3’調控序列-3’具體策略為根據水稻ssp基因序列設計引物，從水稻基因組DNA中分別獲得ssp基因5’調控序列(包括啟動子區)和3’端調控序列，連接在pUC19上。用引物1(5’-CTTGCATGGTGTCAGTAGTGCCTG-3’)和引物2(5’-GGGCAAAGATCTTGCTGGTGTATG-3’)進行PCR擴增，獲得ssp基因的5’端調控序列(包括啟動子區序列)，長度為約0.8Kb。堿基序列如下1cttgcatggtgtcagtagtgcctgcctaagaaatgtgtcttgtcataatatgattacatg61aaatatgtttacttcctcgtttctctttatttgtaagataaagaactagatatgtggaaa121gtaggatagcaaagagtatggccaaactctaatctttgctttattttttgggatggaccc181aaaatttgtttctcctttacttctttccctttacaacaatgttctttacttccaattctt241attaacaaaactccaaatacatgccaaactgcatatgtatgtatgctattaaggcacatt301tacaaagctccaagtttacctactcaatcattcacatatggcgatgactcaaactcttaa361ttgttatctgtgtaagctgtgacttgtgtaacacattctacaagtcccatacgaattctg421ttcacaaaagtttctttgtccagctcataatttacaaaactgcaaaatgccaaagcaatc481tggcacaaccttatcatcatattttctttccacgcattaaagcactggcagaattatctt541tgtgtagatattccaaaagtattggttgaataaatgtccaaataaattccatgcctcatg601atttccagcttatgtggcctccactaggtggttttgcaaaggccaaactctttcctggct661tacacagctaccagcatgtataaataggcccctaggcaaccattattccatcatcctcaa721caatattgtctacaccatctggaatcttgtttaacactagtattgtagaatcagcaatgg781cagcatacaccagcaagatctttgccc用引物3(5’-ATCAAACGTTGGTTACATGTACTC-3’)和引物4(5’-ATAGGGATATGTTAATGAGACATC-3’)進行PCR擴增，獲得ssp基因的3’端調控序列，長度為約0.3Kb。堿基序列如下1atcaaacgttggttacatgtactctagtaataaggtgttgcatactatcgtgtgcaaaca61ctagaaataagaaccattgaataaaatatcaatcattttcagacttgcaaatattgggta121tttggatttctgtcccatgtccctcttgaaagccatgctgtacatgttggagttccccct181tggacccaacctactccatgctcccatgttgatcttaaattccctgttcccccagagcat241gtaaattttcttatgctaatcagagcaagctcgatgtctcattaacatatccctatttga酶切實施例1中構建的pBI121/phyII重組質粒，獲得含有phyII的片段，并插入到pUC19/ssp片段之間，構成基因轉化元件SPS。酶切獲得片段SPS大小約2.2kb，經氯仿/異戊醇抽提，吸取上清，無水乙醇沉淀，吹干后溶于0.1×SSC溶液，終濃度為300ng/ul，待用于轉化。(c)花粉管通道法轉化水稻同實施例2。(b)轉化植株的檢測同實施例1。權利要求1.一種具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是①構建由外源基因和調控序列，以及兩側的邊界序列共同組成的基因轉化元件；②通過花粉管通道、種子浸泡法、胚囊注射法等途徑進行基因轉化操作；③根據轉化后邊界序列插入植物基因組和外源基因的表達引起轉化植株性狀的變化，建立相應的篩選轉化植株的檢測方法。2.按照權利要求1所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是上述供轉化的基因轉化元件是一段線性的脫氧核糖核苷酸序列，包括編碼某一功能蛋白的結構基因和表達調控序列，以及位于表達調控序列兩側的邊界序列。3.按照權利要求2所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是上述提供的基因轉化元件中的邊界序列，在基因轉化過程中可以使基因轉化元件定向或非定向地整合到植物基因組中。4.按照權利要求3所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是上述提供的有助于基因轉化元件非定向地整合到植物基因組中的邊界序列，是T-DNA的邊界序列，也可以是轉座子的全部或部分DNA序列。5.按照權利要求3所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是上述提供的有助于基因轉化元件定向地整合到植物基因組中的邊界序列，可以是所轉化的植物基因組中某一編碼區的全部或部分序列，可以是植物基因組某一結構基因的調控序列，也可以是植物基因組某一非編碼區的DNA序列。6.按照權利要求5所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是上述提供的基因轉化元件中由所轉化的植物基因組中某一編碼區的全部或部分序列構建的邊界序列，可以通過同源重組方式使基因轉化元件定向地插入到植物基因組中，導致編碼決定植物某一性狀基因的失活。7.按照權利要求5所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是上述提供的基因轉化元件中由植物基因組某一結構基因的調控序列構建的邊界序列，包括啟動子區域及部分結構基因序列和3’端調控區域及部分結構基因序列，在轉化過程中可以通過同源重組方式使基因轉化元件替換掉該結構基因，使外源基因特異性表達。8.按照權利要求5所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是上述提供的基因轉化元件中由植物基因組中某一非編碼區序列構建的邊界序列，是真核生物染色質中的核基質結合區DNA序列，也可以是在真核生物基因組中的中度或高度重復序列。9.按照權利要求6所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是上述提供的將所轉化的植物基因組中作為邊界序列的某一編碼區的全部或部分序列，可以是編碼決定植物某一形態性狀的結構基因。10.按照權利要求6所述的具有生物安全性的植物基因工程操作方法，其特征是上述提供的將所轉化的植物基因組中作為邊界序列的某一編碼區的全部或部分序列，也可以是編碼決定植物體內某一生理、生化性狀的結構基因。全文摘要本發明涉及一種具有生物安全性的無載體、無選擇標記基因的基因工程操作方法，可以解決在常規植物基因工程操作中，由載體骨架序列和選擇標記基因所引起的轉基因植物在環境和食品兩個方面的安全性問題。本發明的技術要點是，構建由外源基因和調控序列，以及兩側的邊界序列共同組成的基因轉化元件，再通過花粉管通道等途徑進行基因轉化操作，并根據基因轉化元件中外源基因的表達和邊界序列插入植物基因組后引起轉化植株性狀的變化進行檢測。本發明解決了常規轉化方法中由于使用來源于微生物等其它非近緣物種載體，以及采用抗生素類藥物基因或抗除草劑類基因作為選擇標記基因所帶來的安全性問題。文檔編號C12N15/53GK1480530SQ02132838公開日2004年3月10日申請日期2002年9月2日優先權日2002年9月2日發明者安利佳,蘇喬,高曉蓉,金禮吉,楊君,畢曉穎,夏秀英申請人:大連科源農業生物工程有限公司