專利名稱：生化需氧量生物傳感微生物固定化膜的制造方法
技術領域：
本發明涉及一種可用于生化需氧量微生物傳感器傳感探頭中的微生物固定化膜。
(2)背景技術生化需氧量(Biochemical Oxygen Demand，BOD)作為國際上最常用、最重要的水質有機污染指標和監測參數之一，其傳統測定方法一五日生化需氧量(BOD5)標準稀釋法，仍是目前國內外比較普遍采用的分析檢測方法，但該標準方法需要5天分析周期，操作過程繁瑣，因而給污水處理及環境監測帶來了許多不便。在環境分析高度發展的今天，一種被稱之為BOD微生物傳感器的儀器逐漸發展起來，其原理基于微生物對有機物的耗氧代謝，測定BOD只涉及到初始氧化速率，因而可在10～15min內完成一個樣品的測定，大大縮短了測定所需的時間。
BOD微生物傳感器的傳感探頭主要由用于檢測溶解氧變化的氧傳感探頭和固定在氧探頭表面的微生物固定化膜組成。微生物固定化膜的制備是BOD微生物傳感器研究的關鍵技術之一，微生物的固定化效果直接影響到BOD測定的靈敏度、穩定性和使用壽命。一種好的微生物固定方法必需滿足簡單、快速、固定的微生物不發生流失且能長期保持其生物活性。目前國內外報道的最常見的BOD微生物傳感膜的固定方法為采用商品化微孔膜的物理夾層包裹法，如聚四氟乙烯膜(Liu et a1.Biosensors & Bioelectronics 2000，14883～893；Kim et a1.Biosensors & Bioelectronics 1999，141～7；Tammeveski et al.Sensorsand Actuators B，1998，4721～29；張先恩等，環境科學學報，1986，2184～192)，醋酸纖維素膜(Yoshida et al.Journal of Biotechnology 2001，88269～275；魏恩棋等，城市環境與城市生態，1998，446～49；硝酸纖維素膜(Chee et al.Analytica ChimicaActa，1999，379185～191；Chee et al.Analytica Chimica Acta，1999，39465～71；Cheeet al.Biosensors & Bioelectronics，2001，15371～376)，聚碳酸酯纖維膜(Tan etal.Sensors and Actuators B，1997，4065～70；Tan et al.Sensors and Actuators B，1999，54252～260)等，該方法雖然操作簡單，但膜的穩定性較差，菌種易于流失，使用壽命較短；另外，以海藻酸鈣凝膠包埋的菌體(Sohn et al.Analytica ChimicaActa，1995，313221～227；張悅等，海洋環境科學，2001，151～54)在磷酸鹽緩沖空白測試中會逐漸發生溶解流失，同時不耐酸堿，不耐滲透壓，具有逐漸吸水脹大的現象；采用化學健合的方法如紫外活化交聯樹脂鍵合(Yang et al.Appl Microbiol Biotechnol，1996，4610～14)、戊二醛-牛血清蛋白交聯(劉寶紅等，環境科學，1994，68～11)等制備微生物膜也見報道，但這些方法固定微生物較復雜和費時，有時由于被固定的微生物與基質之間較強的化學鍵合作用使被固定微生物的活性降低。因此，探索微生物的有效包埋方法，制備響應靈敏、穩定和活性保持高的BOD生物傳感微生物固定化膜，仍有待于進一步研究。
已有的一些有關BOD生物傳感器的專利主要側重于整體測定儀的設計和測定裝置的改進，大都使用三電極系統的電化學方法測定溶解氧，微生物的固定采用簡便的夾層法，未能從根本上解決BOD微生物膜穩定性差的缺點。
(3)發明內容本發明的目的在于提供一種采用溶膠-凝膠雜化聚乙烯醇(PVA)包埋菌體制作BOD生物傳感微生物固定化膜的方法，通過優化微生物膜的制作條件，獲得了響應迅速、穩定、使用壽命長、線性范圍寬的BOD微生物膜，為實現BOD微生物傳感器的商品化奠定基礎。
BOD生物傳感微生物固定化膜的制造方法是四甲氧基硅烷(TMOS)與二甲基二甲氧基硅烷(DiMe-DMOS)按1∶(0.5～1.8)體積比混勻；再加入pH為1～6的HCl水溶液；將混合液于水浴下敞口攪拌水解，混合液呈乳白狀后靜置；移去上層清液，留下層凝膠液備用；配制8％(W/V)的PVA-124水溶液，后同磷酸緩沖液保存的菌懸液按1∶1體積比混合，再加入等體積的上述凝膠液，即可在所需基質(體)表面鋪成所需厚度的微生物固定化膜，干燥成型。
與已有的采用夾層法、聚乙烯醇凝膠包埋等BOD生物傳感微生物固定化膜相比，采用溶膠-凝膠雜化PVA制備的微生物膜，具有如下優點1)通過改進溶膠-凝膠過程，以凝膠液摻雜PVA對菌體進行包埋，成功解決了單純使用PVA包埋存在的微生物膜溶漲性問題，微生物膜同玻璃、光纖等載基具有良好的粘合作用，長期浸泡于水中未發現微生物膜有脫落和溶解、溶漲現象；2)微生物被物理地包裹在凝膠液與PVA雜化的多孔基質中，不易發生微生物的流失，而大多數有機物和溶解氧能夠擴散進入微生物膜，擴散阻力小；3)溶膠-凝膠雜化基質中含有足夠的水，生物分子處于水溶液的微環境中，保持了它的活性和穩定性，在冰箱中能夠長期保存。
(4)具體實施方式
以下實施例將對本發明作進一步的說明。
實施例1將四甲氧基硅烷(TMOS)與二甲基二甲氧基硅烷(DiMe-DMOS)按1∶1.2體積比加入小瓶中，充分振蕩均勻后，再攪拌逐滴加入與TMOS同體積的0.01mol/L的HCl水溶液，pH為3，將混合液于60℃水浴下敞口攪拌水解2h，混合液呈乳白狀，靜置30min，留下層凝膠液備用；配制8％(W/V)的PVA-124水溶液，待冷卻后同0.067mol/L磷酸緩沖液(pH為7.2)保存的菌懸液按1∶1體積比混合均勻后，再加入等體積的上述凝膠液，充分混合均勻，可在玻璃基質、氧化感探頭等表面鋪成不同厚度的微生物膜。
上述制備過程主要具有以下幾個特點1)起始反應液中不加入醇，用水解生成的醇作互溶劑，同時反應結束后敞口攪拌冷卻水解產物，使所產生的醇在菌體加入前已基本揮發；2)前驅體采用含甲氧基的硅氧烷，其水解、聚合產生的甲醇比其它高級醇對細胞的危害小；3)利用DiMe-DMOS有機雜化TMOS水解聚合制備凝膠液，通過調整適當的DiMe-DMOS與TMOS兩者的比例，可以控制產物的極性，從而使所獲得的凝膠液與PVA水溶液的極性相匹配，解決了溶膠-凝膠雜化PVA的關鍵性問題；4)菌體采用磷酸緩沖液懸浮保存，加入凝膠液中時此緩沖液起到了很好的緩沖混合液酸度的效果，以維持體系的酸度在細胞適應的范圍內。
實施例2以異常漢遜氏酵母(Hansennula anomala)為工作菌種，采用上述制備方法制備微生物固定化膜，TMOS∶DiMe-DMOS按1∶0.5體積比，與HCl水溶液(pH為6)的混合液于50℃水浴下敞口攪拌水解2.5h，混合液呈乳白狀后在室溫下靜置，混合液分為上下兩層，移去上層清液。PVA-124水溶液的配制可采用溫水，并將制成的微生物膜直接固化于氧傳感膜表面，利用氧傳感膜進行二次傳感檢測溶解氧濃度的變化，從而考察用該方法制備的微生物固定化膜的響應特性。所使用的氧傳感膜以4，7-二苯基-1，10-鄰菲咯啉釕為熒光探針，以有機改性硅酸鹽凝膠為基質，基于熒光猝滅原理檢測溶解氧。
實施例3所說的TMOS∶DiMe-DMOS按1∶1.8體積比配置，制成的微生物膜可置于4℃冰箱中約2d后干燥成型。可加入BOD值100mg/L的葡萄糖-谷氨酸(GGA)液繼續在冰箱中4℃保存。通過實驗發現，以上述方法制備的微生物固定化膜對葡萄糖-谷氨酸(GGA)標準溶液具有響應靈敏、快速的特點，通常完成一個GGA標準溶液測定的時間在10min之內。通過改變微生物膜中菌體包埋量，可以獲得不同BOD值濃度的線性范圍，在相同的條件下連續6次測定BOD值為100mg/L的GGA溶液的重現性，熒光強度變化速率最大值的相對偏差為2.85％，在BOD5分析要求的重現性范圍內。另外，實驗考察了微生物膜儲存于4℃冰箱中2個月后響應性的差異，發現微生物固定化膜適于冰箱中長期儲存備用，其對有機物的響應活性在實驗測定誤差內基本保持不變。實驗同時發現微生物膜在1個月的頻繁使用中，具有良好的響應活性，對BOD值為100mg/L的GGA溶液響應值波動范圍在±10％之內。以上結果都表明了以本方法制備的BOD微生物固定化膜具有較長的使用壽命和良好的穩定性。
權利要求
1.生化需氧量生物傳感微生物固定化膜的制造方法，其特征在于將四甲氧基硅烷與二甲基二甲氧基硅烷按1∶(0.5～1.8)體積比混勻；再加入pH為1～6的HCl水溶液；將混合液于水浴下敞口攪拌水解，混合液呈乳白狀后靜置；移去上層清液，留下層凝膠液備用；配制8％(W/V)的PVA-124水溶液，后同磷酸緩沖液保存的菌懸液按1∶1體積比混合，再加入等體積的上述凝膠液，即可在所需基質表面鋪成所需厚度的微生物固定化膜，干燥成型。
2.如權利要求1所述的生化需氧量生物傳感微生物固定化膜的制造方法，其特征在于將四甲氧基硅烷與二甲基二甲氧基硅烷按1∶1.2體積比加入小瓶中。
3.如權利要求1所述的生化需氧量生物傳感微生物固定化膜的制造方法，其特征在于所說的HCl水溶液為與TMOS同體積的0.01mol/L的HCl水溶液。
4.如權利要求1所述的生化需氧量生物傳感微生物固定化膜的制造方法，其特征在于所說的混合液于50～60℃水浴下敞口攪拌水解。
全文摘要
涉及一種可用于生化需氧量微生物傳感器傳感探頭中的微生物固定化膜。將四甲氧基硅烷與二甲基二甲氧基硅烷混勻；再加入HCl水溶液；將混合液于水浴下敞口攪拌水解，混合液呈乳白狀；留下層凝膠液備用；配制8％(W/V)的PVA－124水溶液，后同磷酸緩沖液保存的菌懸液按1∶1體積比混合，再加入等體積的上述凝膠液。以凝膠液摻雜PVA對菌體進行包埋，成功解決了單純使用PVA包埋存在的微生物膜溶漲性問題；微生物被物理地包裹在凝膠液與PVA雜化的多孔基質中，不易發生微生物的流失；溶膠－凝膠雜化基質中含有足夠的水，生物分子處于水溶液的微環境中，保持了它的活性和穩定性，在冰箱中能夠長期保存。
文檔編號C12M1/34GK1396264SQ0212845
公開日2003年2月12日 申請日期2002年8月1日 優先權日2002年8月1日
發明者陳曦, 鐘振明, 戴媛靜, 王小如 申請人:廈門大學