專利名稱：一種臨床感染性疾病基因芯片診斷方案的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種臨床感染性疾病基因芯片診斷方案，屬于生物技術領域。
背景技術：
基因芯片技術是一種新興的生物技術，它在生物學各領域有廣泛的應用前景。臨床診斷是其應用領域之一。感染性疾病是基因芯片最早應用的領域之一，但該技術在臨床上的應用涉及的難點是靈敏度、特異性、成本和PCR擴增的污染防止。通常的臨床診斷基因芯片檢測方案是提取臨床樣本DNA，然后用隨機引物標記，將熒光染料標記到樣品DNA中去，以標記的DNA與芯片進行雜交檢測。這一檢測方案中，只有一次雜交，沒有特異引物的擴增程序，所以特異性只有雜交程序保證，靈敏性只能依靠熒光檢測的高靈敏性決定。為了提高檢測靈敏度，只好增加標記底物，由于標記底物的價格昂貴，導致成本過高，消費者很難承受，從而使基因芯片在臨床上的普及應用受到限制。
發明內容
本發明在于建立了一套用于臨床感染性疾病基因芯片診斷方案，本技術方案的工作原理是將待檢測的靶分子富集后進行標記和雜交，該方案為1.將臨床樣本DNA用特異PCR引物進行多重PCR(multiplex PCR)擴增，然后用特異PCR引物進行多重PCR擴增標記，標記產物再與芯片進行雜交檢測。該方案結合了PCR高靈敏性和分子雜交的高特異性，以及標記物只標記待檢測的靶位點序列，獲得了一套高靈敏性、高特異性和低成本的檢測方法。
2.本方案設置了空白對照，可以通過空白對照信號剔除系統污染，同時加UNG酶以有效地防止先前的PCR擴增產物的污染。在樣品檢測的同時作一PCR擴增空白對照，并用與樣品檢測標記不同的標記物標記，然后與樣品標記物等量混合后與芯片進行雜交檢測，根據樣品標記物的雜交信號和空白對照的雜交信號的比值(ration)，確定樣品是否有陽性信號。
3.設置陽性模板梯度，確定PCR擴增循環數，使檢測信號的強度與模板的拷貝數成正相關，從而可以進行半定量。
本技術方案與現有技術相比，具有特異性和靈敏度高、成本低、能有效地防止PCR產物污染、檢測可進行半定量等優點。本技術方案既適用于臨床感染性疾病基因芯片診斷，也適用于利用基因芯片技術進行所有以特異序列為檢測靶點的種群、類群和個體鑒定。
具體實施例方式本發明的實施按如下程序進行1.采用現有的DNA提取方法(目前有多種快速而簡單的DNA提取方法可用)，獲得樣本DNA(或cDNA)。
2.引物設計根據已固定在芯片上的探針DNA，尋找相對應的序列，根據這段序列設計PCR引物。引物序列位于探針序列的外則。每一個DNA探針設計一對引物，由于要進行多重PCR擴增，所以引物的擴增條件要一致。本方案采用Primer3軟件在默認參數條件下進行引物設計。
3.多重PCR擴增，將所有探針所對應的檢測引物混合在一起，每種引物的用量適當(0.08-1pmol/ul)，PCR擴增為20-25個循環(通過實驗確定，使擴增效率不到平臺效應)，擴增反應系統中加入UNG酶及dUTP以防止PCR產物污染，擴增反應系統的其余成分及熱循環參數按常規方案設置，并考慮引物及擴增模板不同的差異。同時，擴增空白對照。空白對照除了不加入模板在擴增反應液中外，其余的擴增條件都與樣品的檢測檢測一樣。
4.標記PCR擴增產物，取PCR擴增產物的部分，于PCR標記反應系統中，加入特異PCR引物和加入標記物，其中檢測的樣品和空白對照分別用不同的標記物標記，比如樣品用Cy5標記，空白對照用Cy3標記。標記循環數為11個混合。
5.雜交，檢測樣品的擴增標記產物和空白對照擴增標記產物各取等量(2-5ul)進行雜交，雜交條件與常規方法一致。
6.信號檢測，雜交以后的洗脫條件與常規方法一致。洗脫后的片子，用激光掃描儀掃描檢測。
7.雜交信號分析，根據以下公式計算每個位點的信號比值ration＝ΔF1/ΔF2式中ΔF1為樣品標記物信號減去背景信號的差值(比如Cy5標記時，為F635-B635)，ΔF2為空白對照的標記信號與背景信號的差值(比如用Cy3標記時，為F532-B532).用等量的模板DNA，用相同的擴增標記條件，而用不同的標記后進行上述檢測后，計算兩種標記信號的Ration平均值，這個值為判斷的Cut off值。樣品檢測時，芯片位點的ration值大于Cut off值為陽性，低于Cut off值為陰性。
權利要求
1.一種臨床感染性疾病基因芯片診斷方案，該方案的特征在于1.1將臨床樣本DNA用特異PCR引物進行多重PCR擴增，然后用特異PCR引物進行多重PCR擴增標記；1.2.在樣品檢測的同時作一PCR擴增空白對照，并用與樣品檢測標記不同的標記物標記，然后與樣品標記物等量混合后與芯片進行雜交檢測，根據樣品標記物的雜交信號和空白對照的雜交信號的比值，確定樣品是否有陽性信號；1.3.確定PCR擴增循環數，使檢測信號的強度與模板的拷貝數成正相關，從而可以進行半定量。
全文摘要
本發明涉及一種臨床感染性疾病基因芯片診斷方案，屬于生物技術領域。該方案為1.將臨床樣本DNA用特異PCR引物進行多重PCR擴增，然后用特異PCR引物進行多重PCR擴增標記，標記產物再與芯片進行雜交檢測。2.本方案設置了空白對照，可以通過空白對照信號剔除系統污染，同時加UNG酶以有效地防止先前的PCR擴增產物的污染。3.配置適當的擴增循環數，使芯片雜交信號的強度與模板的拷貝數成正相關，因而可以進行半定量。該方案具有高靈敏性、高特異性、低成本、有效防止PCR產物污染等優點。本技術方案既適用于臨床感染性疾病基因芯片診斷，也適用于利用基因芯片技術進行所有以特異序列為檢測靶點的種群、類群和個體鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK1508264SQ02128069
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月18日 優先權日2002年12月18日
發明者譚德勇, 賴建華, 余敏 申請人:云南大學