一種生物晶片的制備方法

專利名稱：一種生物晶片的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物晶片的制備方法；特別是，涉及采用微注射方式制造的生物晶片的制備方法。
背景技術：
生物晶片是二十世紀末生物科技上一項突破性的發明，對于生物科技產業的發展可媲美當年亨利福特所組織的汽車生產線對汽車工業的大革命，或是類似半導體對于電腦工業的革命性發展。廣義來說，生物晶片是指在玻璃(glass)、硅片(slica)、塑料(plastic)或硝化纖維(nitrocellulose)等材質上，利用微電子、微機械、光電、自動化等工業技術來制成應用于生物化學分析的產品，其作用對象可以為基因、蛋白質或細胞組織等。生物晶片技術的主要特點是分析可信度及精確度高、分析速度快，所使用的樣品及試劑少，可同時處理大量樣品，并獲得整體性且平行化的實驗數據。
總體來說，生物晶片研究在國際上仍屬于初期發展階段，但已有許多重大成果。目前生物晶片的種類有微陣列(microarray)、DNA晶片(DNAchip)、蛋白質/抗體晶片(protein/antibody chip)、組織晶片(tissue chip)及實驗室晶片(lab-on-a-chip)等，其中以微陣列(microarray)及DNA晶片(DNA chip)發展較為成熟。而生物晶片的用途十分廣泛，包括基因測序、毒理學分析、疾病基因表現、單一核糖核酸多形性檢定、法醫學上的應用、藥物的篩選及生化武器的偵測等，由此可見生物晶片必定是未來產業界競相爭食的大餅。但是，如何掌握競爭優勢則取決于如何以較低成本制備出高密度的生物晶片。
生物晶片依探針(probe)制備的方式不同可分為三種，第一種是Affymetrix公司研發出的光蝕刻法(photolithography)與化學合成法相結合的光引導原位合成法(light-directed synthesis)。第二種是史丹福大學所使用的接觸式點樣法(pin)，是利用預先合成好的DNA、RNA或蛋白質以機器手臂快速、高密度地固定到基質上。第三種為微注射法(micro-injection method)，如Rosetta Inpharmatics公司利用微注射(micro-injection)方式去制備互補核苷酸。最后資料的判讀方式是將欲檢測的樣品與晶片進行雜交作用(hybridization)，之后再以樣品中標的物(target)上的標記(label)，例如螢光、放射物質或酵素呈色等方式進行電腦掃描以及資料分析。
目前制作生物晶片常見的方法可能是(a)利用微陣列點制機將合成的探針溶液藉由精密的定位機構布植到晶片上，或是(b)利用光學蝕刻的技術進行核苷酸光直接原位合成法(light-directed in-situ synthesis)。其中，點制機中輸送探針溶液的機械結構可分為接觸式的針頭(pin)與非接觸式的微注射器(micro-injector)。接觸式的針頭(pin)成本低，但液滴較大，陣列密度較低(每一點約150～200μm)，且易破壞晶片表面；而非接觸式的微注射器(micro-injector)不會破壞晶片表面，液滴較小，陣列密度較高(每一點約50～150μm)。
例如，以源自光學蝕刻的技術在玻璃表面進行光直接原位DNA合成法的方式，可以在面積1.6cm2的玻璃上制備種類多達40萬種核酸探針的高密度微陣列。雖然是目前最領先的技術，但受限于光化學反應率依核酸探針長度增加而遞減的速度太快且光罩成本昂貴，所以未能普及。因此，目前常用的方法為點針式(pin)及微注射法(micro-injection method)，其中微注射法又分為壓電式微注射法及熱氣泡式微注射法。例如Protogene公司利用壓電式微注射技術(piezo micro-injection，U.S.Pat.No.5985551；6,177,558 B1)在晶片表面進行DNA原位合成(DNA in-situ synthesis)，成本較低，但密度僅約為10～104spots/cm2。
上述所提及的不論是光蝕刻法、點針法或壓電法都有其缺點，因此就生物晶片的制備而言，如何制備出品質好、解析度夠及價格便宜的生物晶片將是主要的致勝因素。以微注射方式制備生物晶片需注意探針液滴彼此間的污染。為了克服污染問題，美國專利第5,552,270號已揭露用聚丙烯酰胺膠體(polyacrylamide)做成許多小隔間，其膠體的厚度為30μm，可防止探針溶液的相互污染，且可增加探針溶液固定的量，但是缺點是制程麻煩、花費高且因水分易蒸發所以需儲存在非揮發性的油中，因此，使用之前需再以氯仿(chloroform)或乙醇(ethanol)洗凈，整體而言使用并不方便。另外，也可以利用半導體蝕刻的方式在硅片(silicon)上蝕刻成許多小槽室來防止探針溶液間的污染，但是此法制程麻煩且花費高昂。上述現有技術的缺點即是本發明所欲解決的問題。

發明內容
本發明的目的是提供一種簡單且便宜的生物晶片的制備方法，其包括下列步驟以微注射方式將一疏水性物質噴灑于一基材上；于該基材表面形成一疏水性區，并由該疏水性區區隔出復數個小隔間；以及以微注射方式將一探針固定于該小隔間上。本發明方法不但可防止探針液滴間彼此的干擾現象，還可增加探針密度及晶片的解析度。因此，本發明方法可制備出高密度、液滴小、解析力佳且成本低的生物晶片。


圖1A至圖1B為顯示本發明以微注射器將疏水性物質噴灑于基材上的示意圖。圖1A顯示利用微注射器可以垂直方向噴灑疏水性物質至基材表面；圖1B顯示利用微注射器可以水平方向噴灑疏水性物質至基材表面。
圖2A至圖2B顯示本發明利用微注射器噴灑疏水性物質至基材表面后，在基材表面形成小隔間的可能形狀。圖2A顯示方形的小隔間；圖2B顯示圓形的小隔間。
圖3顯示本發明的基材表面上疏水性物質的分布以及探針液滴覆蓋情形的剖面圖。
圖4A至圖4D顯示本發明以疏水性物質區隔出的小隔間后，固定核酸探針至基材的示意圖。圖4A顯示以微注射器將帶有保護基的核苷酸溶液滴入不同的小隔間(親水性區)；圖4B顯示以酸性溶液將保護基去除；圖4C顯示以微注射器將第2層帶有保護基的核苷酸溶液滴入不同的小隔間(親水性區)；以及圖4D顯示制備完成的生物晶片。
圖5是本發明最佳實施例所采用的熱氣泡式微注射器的構造圖。
圖6A-圖6D是圖5的微注射器的操作示意圖，圖6A為微注射器的橫截面圖，圖6B為形成第一氣泡的情形，圖6C為接著形成第二氣泡，使二氣泡結合而擠出液滴的情形，圖6D為兩氣泡消失使多余液體流回液體槽的情形。
具體實施例方式
本發明提供一種生物晶片的制備方法，首先以微注射方式將一疏水性物質噴灑于一基材上，于該基材表面形成一疏水性區，并由該疏水性物質區隔出復數個小隔間。接著，再以微注射方式將一探針固定于每一小隔間中。
通常可用來作為生物晶片基材的材料可以是疏水性基材或親水性基材。疏水性基材包括但不限于下列物質--玻璃、硅片、塑膠、尼龍膜、樹酯、石英、陶瓷、以及金屬材質。親水性基材則多為聚合物，包括如聚苯乙烯(polystyrene)、聚酯(polyester)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚氯乙烯(polyvinylchloride)、聚乙烯(polyethylene)、聚丙烯(polypropylene)、聚砜(polysulfone)、聚氨基甲酸酯(polyurethane)或聚基丙烯酸甲酯(PMMA)等材料，但不限于此處所列舉者。
若采用疏水性基材，則當噴灑完疏水性物質后，疏水性物質形成的疏水性區所區隔出的小隔間表面，必需先處理成具有親水性官能團才能與探針結合。此處所指的親水性官能團可以為胺基(-NH2)、羧基(-COOH)、硫羥基(-SH)、環氧基(epoxide)、醛基(aldehyde)或是抗生蛋白鏈菌素(Streptavidin)等。
若是采用親水性基材，則需先將表面處理成疏水性，然后才能噴灑疏水性物質，以形成疏水性區。之后，需再將小隔間處理成親水性，才能與探針結合。基材表面修飾方法可參考下述論文Souther，Chem.abst.113；152979r(1990)和Anal.Biochem.157；283(1986)，在此不再贅述。
本發明的微注射方式是采用一微注射器(micro-injector)，以垂直、水平或任意方向，單向或雙向來回噴灑，如圖1A及圖1B所顯示。所采用的微注射器包含熱氣泡式微注射器以及壓電式微注射器。所采用的熱氣泡式微注射器包括一槽室，用以放置液體；一微注射孔，位于槽室上，可使槽室中的液體流出；以及一第一加熱器與一第二加熱器，分別排列于該微注射孔的兩側。當槽室裝滿液體時，第一加熱器會產生第一氣泡，接著，第二加熱器會產生第二氣泡，利用兩氣泡將液體切斷噴出，并且第一加熱器與第二加熱器是由一共同訊號所驅動。此外，第一氣泡的產生是作為一閥門，限制該槽室中的液體流出，下文將詳細說明。
本發明以微注射方式噴灑的疏水性物質包括，但不限于，聚四氟乙烯(Teflon)、聚酰亞胺(polyimide)、含硅及含氟潑水劑、以及含氟及含硅化合物等。當將疏水性物質噴灑至基材上后，疏水性物質會在基材表面形成疏水區，由疏水區區隔出復數個小隔間，小隔間可以為方形、圓形或任意幾何圖形，如圖2A與圖2B所示。小隔間大小范圍可以為20～200μm，疏水性物質的厚度范圍可以為1～30μm，寬度范圍可以為5～100μm。
如圖3所示，欲固定于基材表面上的探針是以液滴的形式由微注射器噴灑出來，覆蓋在小隔間(親水性區)中。微注射器中裝有探針溶液，該探針溶液可以是脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、核苷酸(Nucleotides)、寡核苷酸(Oligonucleotides)、蛋白質(Protein)、抗體(Antibodies)或肽(Peptides)等，但不限于以上列舉者。上述探針固定于小隔間的方法是經由一官能團結合的方式達成，而官能團結合方式包括吸附(adsorption)法、共價結合法(covalent binding)、包覆法(encapsulation)、交聯法(cross-linking)及包埋法(entrapment)等，但不限于上述方法。通常探針溶液若為DNA、RNA或核苷酸時，必須先經過一些化學修飾使得其與基材表面上的官能團結合更緊密，例如修飾成膦酸鹽(phosphonate)、膦酸氫鹽(hydrogen phosphonate)、亞膦酰胺(phosphonamidite)、亞磷酰胺(phosphoramidite)、亞磷酸鹽(phosphite)或甲基亞膦酰胺(methylphosphonamidite)類化合物，若是制備寡核苷酸微陣列(oligonucleotide microarray)的話，在核苷酸的5′或3′端必須接上保護基以防止同一層的核苷酸結合在一起。
要產生液滴小的微陣列生物晶片，其中核苷酸溶液本身的表面張力、粘度及微注射孔的大小是主要決定因子，通常一般液滴大小約為25～250μm。
若是以熱氣泡式微注射器來制備核苷酸微陣列的話，則必須更考慮到核苷酸溶液中溶劑的選擇以及溶劑的粘度。一般來說，液滴愈小則愈容易揮發，因此，通常所使用的溶劑中必須至少含有一種高沸點溶劑，例如沸點大于140℃的溶劑，來防止核酸溶液的揮發。所選擇的溶劑以極性非質子溶劑較為適合，常用的有如雙腈類(dinitriles)、單腈類(mononitriles)、甘醇二甲醚類(glymes)、雙甘醇二甲醚類(diglymes)、三甘醇二甲醚類(triglymes)、三甲基磷酸酯(trimethylphosphates)、二甲基甲酰胺(dimethylformamides，DMF)和N-甲基吡咯烷酮(N-methyl pyrrolidinone，NMP)等。
于制備寡核苷酸微陣列(oligonucleotide microarray)晶片時，利用微注射器將各個受保護的核苷酸(protected nucleotides)有如堆積木的方式依序地固定于基材上，在核苷酸上接的保護基是用來預防每一層的核苷酸彼此重疊在一起。當第一層的核苷酸溶液固定上去之后，利用酸性溶液將核苷酸上的保護基去除，然后再固定上第二層的核苷酸，以此類推可快速地制備出所要的生物晶片，此種方法在核苷酸探針的設計上較有彈性。若是制備DNA、RNA或蛋白質晶片時，則直接將已合成好的脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或蛋白質直接噴灑于基材的小隔間中。而制備肽(peptides)晶片時則如同核苷酸微陣列方式將肽一個一個接上去。
最后將欲檢測的樣品與上述制備好的生物晶片進行雜交作用(hybridization)，之后再由樣品中標的物(target)上的標記(label)進行不同反應，例如螢光、放射物質、酵素呈色等方式，進行電腦掃描以及資料分析。
實施例以下將以實施例具體說明本發明，然本發明的范疇并不限于實施例所示的范圍。
實施例1第一種以熱氣泡式微注射器進行批次式寡核苷酸微陣列(oligonucleotide microarray)的制備方法。
1.以微注射器的玻璃表面形成小隔間以玻璃為基材，先在玻璃表面以含有疏水性物質，如特氟隆(Teflon)的熱氣泡式微注射器直接、規律地噴灑疏水性物質，以形成疏水性物質區隔而出的方形小隔間，如圖2A所示。其中隔間的寬度范圍約為50μm，而疏水性物質噴灑的厚度為2μm，寬度為5μm。
2.于小隔間中進行親水性處理在疏水性區隔出的方形小隔間中，以含有辛基三氯硅烷(octyltrichlorosilane)的微注射器，進行硅烷化(silanization)處理，使小隔間區域成為親水性區，其表面具有硫羥基(-SH)得以與核苷酸探針結合，詳細方法如美國專利第6,159,695號，可以形成一永久性的硫醚鍵或是一化學選擇可逆性的雙硫鍵至親水性區表面的硫羥鍵。
3.使寡核苷酸結合于微陣列片上將含有四唑(tetrazole)活化劑的二甲氧基三芐基核苷酸磷酰胺酸溶液(DMTr-nucleotide phosphoramidite)以微注射器噴灑于已硅烷化處理的親水性區上，第一層核苷酸會與親水性區上的硫羥基(-SH)結合。然后利用酸性溶液，如三氯醋酸(trichloroacetic acid)或鹽酸(HCl)溶液將保護基去除，再噴灑第二層核苷酸。以上述程序依次接上各個核苷酸，最后可得到寡核苷酸微陣列(oligonucleotide microarray)，詳細的步驟可參考美國專利第6,184,347B1號、第5,985,551號，在此不再贅述。
4.以得到的寡核苷酸微陣列進行雜交反應(hybridization)最后將欲檢測的目標核苷酸序列(target)與上述的寡核苷酸微陣列進行雜交反應，然后藉由目標核苷酸(target)上的標記(Label)，即可得知目標核苷酸(target)的序列是什么，詳細做法可參考美國專利第5,985,551號。
實施例2第二種批次式寡核苷酸微陣列的制備方法。
寡核苷酸微陣列(oligonucleotide microarray)的隔間形狀亦可以為圓形，如圖2B所示。可直接以微注射器噴灑疏水性物質形成圓形的隔間。或是先做一相對應的圓形板罩在基材上，然后以微注射器噴灑疏水性物質，隨后拿掉圓形板，最后可得到圓形的隔間。其中圓形板材料以親水性物質為佳，例如尼龍膜等。之后的制備過程與實施例1相同。
實施例3以壓電式微注射器進行蛋白質晶片(Protein chip)的制備方法。
1.以微注射器在玻璃表面形成疏水性隔間以玻璃為基材，先在玻璃表面以含有疏水性物質，如聚酰亞胺(polyimide)，的壓電式微注射器直接、規律地噴灑疏水性物質，用以形成方形疏水性隔間，如圖2A所示，其中隔間的寬度范圍約為50μm，而疏水性物質噴灑的厚度為2μm，寬度為5μm。
2.使蛋白質結合于微陣列片上以辛基三氯硅烷(octyltrichlorosilane)，使疏水性物質所隔出的方形小隔間表面修飾成具有硫羥基(-SH)，使得蛋白質探針可以結合于其上。蛋白質探針與基材的結合方法可參考美國專利第6,225,047 B1號，在此不再贅述。
3.以蛋白質晶片進行檢測標的蛋白的試驗當上述蛋白質晶片制備好之后，將蛋白質樣品(sample)加入晶片上的小隔間中，藉由樣品上的螢光標的物(Cy3，Cy5)可得知樣品中含有何種蛋白質。
雖然本發明已以較佳實施例進行描述，然其并非用以限定本發明，本領域的普通技術人員熟悉此技藝者，在不脫離本發明的精神和范圍下，可作各種的更動與修飾，因此本發明的保護范圍以權利要求書的范圍為準。
為了讓本發明的上述和其他目的、特征、以及優點能更明顯易懂，下文通過優選實施例并結合所附圖示，作詳細說明如下符號的說明圖1-4D的符號10～微注射器；12～疏水性物質；14～微注射器移動方向；16～基材；18～疏水性區；20～小隔間；21～親水性區；22～核酸液滴；24～帶有保護基的核苷酸液滴；26～保護基；28～酸性溶液；圖5-6D的符號1～噴墨孔；2～第一加熱器；3～第二加熱器；4～電極；5～槽室；6～微管道；7～液體；8～晶圓片；a～第一氣泡；b～第二氣泡；P～氣泡擴大方向；F～液滴噴出方向。
權利要求
1.一種生物晶片的制備方法，包括下列步驟(a)提供一基材；(b)以微注射方式將一疏水性物質噴灑于該基材上，于該基材表面形成一疏水性區，并由該疏水性區區隔出復數個小隔間；以及(c)以微注射方式將一探針固定于該小隔間。
2.如權利要求1所述的生物晶片的制備方法，其中該疏水性物質包括聚四氟乙烯(Teflon)、聚酰亞胺(polyimide)、含硅及含氟潑水劑、以及含氟或含硅化合物。
3.如權利要求1所述的生物晶片的制備方法，其中該微注射方式是采用一微注射器，以垂直、水平和任意方向，單向或雙向噴灑。
4.如權利要求3所述的生物晶片的制備方法，其中該微注射器包含熱氣泡式微注射器或壓電式微注射器。
5.如權利要求1所述的生物晶片的制備方法，其中該基材為一疏水性基材，其由下列任一材料組成玻璃、硅晶片、石英、云母、陶瓷材料或金屬材質。
6.如權利要求5所述的生物晶片的制備方法，在步驟(b)之后，還包含步驟(d)，將每一小隔間內進行一親水性處理，使每一小隔間的表面具有一親水性官能團。
7.如權利要求6所述的生物晶片的制備方法，其中該親水性官能團包括胺基(-NH2)、羧基(-COOH)、硫羥基(-SH)或是抗生蛋白鏈菌素(Streptavidin)。
8.如權利要求1所述的生物晶片的制備方法，其中該基材為一親水性基材，其由下列任一材料組成聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸鹽、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚砜、聚氨基甲酸酯或聚甲烯順丁烯二酸酐。
9.如權利要求8所述的生物晶片的制備方法，還包含下列步驟(e)于步驟(a)之后，在該親水性基板表面進行一疏水性處理，使該基材表面處理成疏水性的；以及(f)于步驟(b)之后，于每一小隔間內進行一親水性處理，使每一小隔間表面具有一親水性官能團。
10.如權利要求9所述的生物晶片的制備方法，其中該親水性官能團包括胺基(-NH2)、羧基(-COOH)、硫羥基(-SH)或是抗生蛋白鏈菌素(Streptavidin)。
11.如權利要求1所述的生物晶片的制備方法，其中該小隔間的形狀包括方形、圓形或其他幾何圖形。
12.如權利要求1所述的生物晶片的制備方法，其中該探針包括脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、核苷酸(Nucleotides)、寡核苷酸(Oligonucleotides)、蛋白質(Protein)、抗體(Antibodies)或肽(Peptides)。
13.如權利要求1所述的生物晶片的制備方法，其中該探針固定于該小隔間是經由一官能團結合方式。
14.如權利要求13所述的生物晶片的制備方法，其中該官能團結合方式包括吸附(absorption)法、共價結合法(covalent binding)、包覆法(encapsulation)、交聯法(cross-linking)或包埋法(entrapment)。
15.如權利要求1所述的生物晶片的制備方法，其中該微注射方式是應用一熱氣泡式微注射器，該熱氣泡式微注射器包括一槽室，用以放置液體；一微注射孔，位于槽室上，可使槽室中的液體流出；以及一第一加熱器與一第二加熱器，分別排列于該微注射孔的兩側；當該槽室裝滿液體時，該第一加熱器會產生一第一氣泡，該第二加熱器會產生一第二氣泡，利用兩氣泡將液體切斷噴出。
16.如權利要求15所述的生物晶片的制備方法，其中該第一加熱器與該第二加熱器是由一共同訊號所驅動。
17.如權利要求15所述的生物晶片的制備方法，其中第一氣泡的產生是作為一閥門，限制該槽室中的液體流出。
18.一種生物晶片，其包括(i)一基材；(ii)一疏水性區與復數個疏水性區所區隔出的小隔間，位于基材上，其中該疏水性區是由微注射方式噴灑一疏水性物質所形成；以及(iii)一探針，是以微注射方式固定于該小隔間上。
19.如權利要求18所述的生物晶片，其中該基材為一疏水性基材，其由下列任一材料組成玻璃、硅晶片、石英、云母、陶瓷材料或金屬材質。
20.如權利要求19所述的生物晶片，其中每一小隔間內的疏水性基材表面，經過一親水性處理后，該基材表面具有一親水性官能團。
21.如權利要求20所述的生物晶片，其中該親水性官能團包括胺基(-NH2)、羧基(-COOH)、硫羥基(-SH)或是抗生蛋白鏈菌素(Streptavidin)。
22.如權利要求21所述的生物晶片，其中該基材為一親水性基材，可由下列任一材料組成聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸鹽、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚砜、聚氨基甲酸酯或聚甲烯順丁烯二酸酐。
23.如權利要求20所述的生物晶片，其中形成該復數個小隔間之前，于該親水性基板上還進行一疏水性前處理，使該基材表面處理成疏水性的。
24.如權利要求23所述的生物晶片，其中于該小隔間形成后，還進行一親水性處理，使該小隔間表面具有一親水性官能團。
25.如權利要求24所述的生物晶片，其中該親水性官能團包括胺基(-NH2)、羧基(-COOH)、硫羥基(-SH)或是抗生蛋白鏈菌素(Streptavidin)。
26.如權利要求18所述的生物晶片，其中該疏水性物質包括聚四氟乙烯(Teflon)、聚酰亞胺(polyimide)、含硅及含氟潑水劑、或是含氟及含硅化合物。
27.如權利要求1 8所述的生物晶片，其中該探針包括脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、核苷酸(Nucleotides)、寡核苷酸(Oligonucleotides)、蛋白質(Protein)、抗體(Antibodies)或肽(Peptides)。
28.如權利要求18所述的生物晶片，其中該探針是以下列方式的一種固定于該小隔間上吸附(absorption)法、共價結合法(covalent binding)、包覆法(encapsulation)、交聯法(cross-linking)或包埋法(entrapment)。
全文摘要
本發明提供一種生物晶片的制備方法，包括下列步驟以微注射方式將一疏水性物質噴灑于一基材上，于該基材表面形成一疏水性區，并由該疏水性區區隔出復數個小隔間；以及以微注射方式將一探針固定于該小隔間上。
文檔編號C12Q1/68GK1472340SQ0212733
公開日2004年2月4日 申請日期2002年8月2日 優先權日2002年8月2日
發明者林郁庭, 沈昱璋, 佘怡璇 申請人:明基電通股份有限公司