專利名稱：動物成纖維細胞向乳腺上皮樣細胞轉化的定向誘導方法
背景技術：
目前在生物學和生物技術領域，哺乳動物胚胎工程、組織工程以及同源重組轉基因動物的研制成為新的研究熱點，這三大領域的研究均需要以哺乳動物胚胎干細胞(ESC)為基點。而ESC的建系本身，就是一大難題，成為上述領域的限速步驟，也成為世界范圍生物學家研究的難點、熱點和焦點。胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ESC)是一種可以在體外培養，能無限自我更新，又具有分化為動物個體各種組織細胞(包括生殖細胞)的潛能的細胞。正是由于這些特征，使ES細胞成為生物高科技的核心技術。然而ESC的建系本身，就是一大難題，成為上述領域的限速步驟。眾所周知，哺乳動物胚胎干細胞系，除小鼠ESC技術比較成熟外，其它哺乳動物的ESC系技術還不成熟，只有個別實驗室獲得了人、牛、豬等ESC，且細胞系并不穩定，重復性差。ESC的建系研究需要昂貴的經費，實驗條件要求苛刻，不定因素很多，取材難，體外培養也非常困難，且隨機分化難以控制，因此，獲得穩定ESC系是相當困難的。而成纖維細胞，取材容易，體外培養條件要求較寬松，不需要添加細胞因子，因而成本比ESC要低的多，技術容易掌握，細胞特性和傳代相對穩定，重復性強。不足之處與ESC相比，成纖維細胞傳代代數有限，分化的全能性較差。目前，科學家們已開始用成纖維細胞進行基因同源重組，并已有成功報道[沈子龍等，中國藥科大學學報，2002，33(2)81～86]，但靶位的選擇受到極大的限制，成功率也很低，(受到靶基因位點活化或抑制狀態的限制，ESC同樣受此限制)，因為，外源基因大多趨向于整合到處于松散(解聚)、“敏感”即活化狀態的染色質部位，通常是轉錄活躍的區域。而轉基因時的細胞(通常是受精卵、胚胎干細胞或成纖維細胞)通常并不處于所需狀態，即目標基因靶位并不處于活化狀態，造成外源基因不能整合到正確靶位。因此如果用適當誘導因子對細胞進行誘導，使細胞可以定向分化，以達到有選擇地活化目標基因靶位就可以提高外源基因整合的準確性。根據這一原理，我們嘗試用相應激素(雌激素和孕激素和胰島素)誘導成纖維細胞向乳腺上皮樣細胞分化，致使細胞處于泌乳或受孕似的模擬狀態，使相應基因族活化，人為制造目標靶位的敏感區，使外源基因更準確整合到目標靶位上或提供更多的正確的整合位點(這對于ESC同樣重要和適用)，提高基因打靶的效率。這一發明的直接應用就是可以克服轉基因技術的瓶頸一外源基因隨機整合所致轉基因動物的遺傳與基因表達的不確定性，通過細胞轉染，篩選同源重組克隆。其次，提示哺乳類成纖維細胞同哺乳動物ESC一樣也具有定向誘導分化的潛力，成纖維細胞可以替代或部分替代胚胎干細胞用做組織工程或胚胎工程的細胞平臺。
本發明所述的定向誘導動物成纖維細胞向特定組織分化的方法，包括來源于不同發育時期、不同組織來源的成纖維細胞；各種誘導因素對成纖維細胞的誘導；分化細胞的內源特征基因的表達檢測；組織特異表達的基因載體(包括報告基因)的轉基因表達檢測，以及細胞形態的變化。
在本發明的方法中，所述的動物成纖維細胞可以是哺乳類，也可以擴展到脊椎動物類。動物成纖維細胞的體外培養，按照常規方法[D.L.斯佩克特，R.D.戈德曼，L.A.萊因萬德著，黃培堂等譯。細胞實驗指南，科學出版社，2001年2月第一版，p27-31(書名原文CellA LaborataryManual)進行。
所述的分化細胞的內源特征基因的表達檢測，是指分化細胞或同類分化細胞特異表達基因的mRNA或蛋白檢測，如RT-PCR(或RT-PCR-Southern Blot)、Northern Blot、Western Blot或Elisa檢測。在我們的實驗中用乳腺上皮細胞特異表達的酪蛋白基因片段為探針，用RT-PCR-Southem Blot方法檢測經泌乳激素誘導后的小鼠胎兒成纖維細胞，獲得了乳腺上皮細胞特異的酪蛋白基因的表達信號。結果表明，小鼠成纖維細胞在與泌乳有關的激素誘導下，促使原“沉默”的乳蛋白基因轉為活化狀態。使成纖維細胞在一定程度上模擬了乳腺上皮細胞的基因表達模式。
所述的組織特異表達的基因載體，是指只能在特定組織細胞中表達的基因載體，即此類載體上編碼基因的表達是受到組織類型限定的。如乳腺特異表達的啟動子(Promoters)α-酪蛋白(α-Casein)、β-酪蛋白(β-Casein)、β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin)、κ-酪蛋白(κ-Casein)等的啟動子調控的基因表達只能在乳腺組織中表達。通過轉基因瞬時表達技術，可以驗證外源乳蛋白啟動子在經相應激素誘導后的小鼠胎兒成纖維細胞中是否具有功能，進而表明此成纖維細胞是否具有了乳腺上皮樣細胞的內環境。進一步提供成纖維細胞向乳腺上皮細胞誘導分化的實驗證據。
所述與泌乳相關的誘導物，包括激素、蛋白因子及有機分子。其中所述的激素有催產素、孕酮、胰島素、催乳素和生長激素；具有建立和維持乳腺泌乳系統和促進乳汁蛋白表達功能的蛋白因子，如胰島素樣生長因子、表皮生長因子、血管生長因子、腫瘤壞死因子；有機分子涉及某些具相同功能的甾醇類分子。在我們的實驗中用到了三種結構不同的激素，蛋白類-胰島素、環肽類-催產素、甾醇類-孕酮，均獲得了陽性結果，表明具相同功能的物質均可作為同向分化的誘導物。
Prime-a-Gene Labeling System和限制性內切酶均購自Promega公司，α-P32-dATP為北京亞輝生物醫藥工程公司產品；PCR試劑盒購自日本TaKaRa Biotechnology(大連)有限公司；尼龍雜交膜為Hybond公司產品；Reverse Transcription kit是日本TAKARA產品；DNA純化試劑盒為鼎國科技有限公司產品；細胞培養基D-MEM、Trizol Reagent為GiBco BRL產品；細胞轉染試劑盒Lipofectamine Reagent為Invitrogen產品；縮宮素注射液(Oxytocin Injection，10單位/ml，又稱催產素)，南京新天生物化學制藥有限公司；黃體酮注射液(Pregnendione；Progesterone Injection，20mg/ml，又稱孕烯二酮、孕[甾]酮、孕烯醇酮)，上海通用藥業股份有限公司；胰島素注射液(Insulin Injection，400單位/10ml)，中國徐州萬邦生化制藥有限公司。其它試劑均是國產分析純。(2)熒光倒置顯微鏡，Olympus CK40/U-RFLT50(日本產)。(3)實驗動物.昆明白小鼠。(4)基因、基因構件和引物以質粒pEGFP-N1(CLONTECH產品)的結構為基本骨架，基因構件的5’上游啟動子-CMV啟動子用乳蛋白基因的啟動子替代，報告基因為增強型綠色熒光蛋白基因(EGFP)，共構建了三種乳腺細胞特異表達的基因載體牛α-s1-casein-EGFP，綿羊β-Casein-EGFP，綿羊β-Lactoglobulin-EGFP(見
圖1)。牛α-s1-casein的克隆見文獻[陳瑞環，汪波，張玉芝等，生物工程學報19928(3)218-226]，綿羊β-Casein啟動子和β-乳球蛋白β-Lactoglobulin啟動子序列，均由本室克隆，經測序鑒定(上海生工)，所獲基因序列與GenBank中登錄的已知序列完全相符(β-Casein登錄號為X79703；β-Lactoglobulin為X12817)。小鼠α-s-casein cDNA(650bp)和β-Casein cDNA(420bp)片段(為本室克隆)用做Southern雜交探針。(5)RT-PCR-Southem雜交方法檢測內源α-s1-casein和β-Casein基因的表達引物依據α-s1-casein和β-Casein蛋白編碼區序列(GenBank登錄號分別為M36780和BC013332)設計的(由上海生工公司合成)，α-s1-caseinF引物5’-CTCATCCTCACCTGCCTCG-3’，R引物5’-GTGCCTGATCCACTACACTCAT-3’；β-Casein F引物5’-GGTGAATCTCATGGGACA-3’，R引物5’-GAAGGGTGCTACTTGCTG-3’。以小鼠β-actin mRNA做為內對照RT-PCR檢測(參見序列GenBankAccession No.AB004047)，F引物5′-AGGGAAATCGTGGGTGACATCAAA-3′和R引物5′-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3′。(6)小鼠胚胎成纖維細胞的培養與激素誘導小鼠胚胎成纖維細胞的培養，按照文獻[D.L.斯佩克特，R.D.戈德曼，L.A.萊因萬德著，黃培堂等譯。細胞實驗指南，科學出版社，2001年2月第一版，p27-31(書名原文CellA Laboratary Manual)]。
用于RT-PCR-Southem雜交檢測的激素誘導按常規方法將細胞傳至25毫升的培養瓶(105×細胞/瓶)中，于37℃、5％CO2中培養至90％匯合度(confluence)時，換新鮮培養基，并按表加入不同激素。
用于基因轉染的激素誘導將細胞按3×104/孔傳代到6孔板(或35mm)，正常培養(D-MEM+5％胎牛血清+青霉素+鏈霉素)細胞至90％匯合度(confluence)時，進行轉染[方法見(9)]，換新鮮培養基，并按下表加入不同激素。
繼續培養三天，分別收集細胞，待提取總RNA。(7)提取總RNA按試劑說明進行，主要有用Trizol reagent 0.5ml(對于25毫升培養瓶培養的細胞數)吹打細胞，使之破解。加入氯仿與水飽和酚混合液，抽提兩次。取上清液，加入等倍體積的異丙醇，充分混合，10,000rpm離心10分鐘，取沉淀，用70％乙醇洗一次。(8)RT-PCR-Southern雜交檢測內源酪蛋白基因的表達用總RNA約1微克，以olig(dT)14為引物，進行反轉錄合成cDNA第一條鏈(按照試劑盒說明書進行)。PCR反應系統按照試劑盒說明進行，以2ul cDNA第一鏈為模板，每一反應含上游引物和下游引物各30pmol。分別以小鼠α-s1-casein和β-Casein片段為陽性對照(已經測序證明序列正確)，PCR循環95℃180sec，46℃60sec，72℃60sec，一個循環；進入35循環94℃60sec，50℃60sec，72℃60sec。α-s1-casein的PCR長度770bp，β-Casein的PCR長度460bp。取5ul PCR反應液進行電泳(0.8％瓊脂糖凝膠)，再進行Southern轉膜，和常規Southern雜交(65℃)[Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.Molecular Cloning.A LaboratoryManual.2nd ed.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press.1989.中譯本，金冬雁黎孟楓等譯.分子克隆，實驗指南.第二版.北京科學出版社，1992，474～504]。雜交探針為陽性模板的PCR片段，用α-P32-dATP隨機引物法標記。β-actin PCR條件95℃180sec，46℃60sec，72℃60sec，一個循環；56℃60sec，72℃60sec，94℃60sec，35循環，PCR長度為478bp。(9)小鼠胚胎成纖維細胞的基因轉染與觀察用Lipofectamine Reagent將上述三種乳腺特異表達的基因載體對正常培養的成纖維細胞(90％匯合度)進行轉染，每一基因構件轉染經不同激素誘導的5孔細胞，方法按試劑盒說明，每一轉染反應用約1微克質粒DNA。轉染5小時后，用含不同激素的DMEM-胎牛血清(10％)換掉轉染液，繼續在37℃、5％CO2下培養，直至顯微鏡下觀察。結果1.乳腺上皮細胞特異表達的酪蛋白基因在小鼠成纖維細胞中的誘導表達小鼠胎兒成纖維細胞在經胰島素、黃體酮、縮宮素以及這三種激素的混合誘導三天后，經RT-PCR-Southern雜交檢測，結果表明對于α-Casein基因，胰島素和混合激素均可誘導其表達；縮宮素信號很微弱；未誘導對照組和黃體酮組均未見其mRNA信號(圖2A)。對于β-Casein基因，三種激素分別誘導和混合誘導均使該基因進行了表達，但表達水平有差異；而未經誘導的對照組則無特征信號(圖2B)。由此證明，在體外培養體系，與泌乳有關的激素可以直接作用于胎兒成纖維細胞，促使原“沉默”的乳蛋白基因轉為活化狀態。但不同激素其作用機制也不相同，故表現為表達水平的差異。
內源酪蛋白基因的表達是具有嚴格的組織特異性的，正常情況下只能在乳腺上皮細胞中表達，上述結果也符合這一特征不管是S-1-Casein基因或者是β-Casein基因，未經激素誘導的對照組均未見其表達。2.乳腺特異表達基因構件在胎兒成纖維細胞中的轉基因瞬時表達將三種乳腺特異表達基因構件牛S-1-Casein啟動子指導的綠色熒光蛋白基因表達載體(α-Casein-EGFP-N1)、綿羊β-Casein啟動子指導的綠色熒光蛋白基因表達載體(β-Casein-EGFP-N1)和綿羊β-乳球蛋白啟動子指導的綠色熒光蛋白基因表達載體(β-LG-EGFP-N1)分別轉染胎兒成纖維細胞，再分別用胰島素、黃體酮、縮宮素，以及這三種激素混合誘導。結果顯示β-Casein啟動子指導的綠色熒光蛋白基因表達載體的成纖維細胞，經過縮宮素、胰島素，“混合激素”誘導后，均可檢測到綠色熒光蛋白的瞬時表達(圖3A，B，C)；轉染S-1-Casein啟動子指導的綠色熒光蛋白基因表達載體的成纖維細胞，經過黃體酮(圖3D)和“混合激素”誘導的細胞可檢測到綠色熒光蛋白基因的瞬時表達；經縮宮素誘導的β-LG-EGFP-N1也可以表達(圖3E)。而未經激素誘導的成纖維細胞對照組，同樣轉染了上述三種基因構件，均未觀察到綠色熒光蛋白的表達。這一結果進一步證明經過激素的誘導后，成纖維細胞的基因表達模式(patterns)確實發生了變化使得細胞由處于成纖維細胞內環境狀態向乳腺上皮細胞內環境轉換，進而使得乳汁蛋白基因位點轉為活化狀態。也就是說經上述處理的成纖維細胞在一定程度上模擬了乳腺上皮樣細胞的內環境或生理狀態。但不同激素對不同基因啟動子的作用是有差異的。3.形態學變化經三種激素分別誘導或混合誘導的小鼠胎兒成纖維細胞，在培養一周后，形態開始發生變化；培養兩周后，形態差異較大，且未經誘導和縮宮素誘導的細胞已呈現死亡跡象，而經胰島素、黃體酮以及三激素混合誘導的細胞仍生活狀態良好(圖4)。上述結果提示1)成纖維細胞可能具有相當大的可誘導性或多能性分化的潛力。
2)作用于分化末端組織的激素(如本文用到的三種激素，尤其是黃體酮和縮宮素)，除了其正常的生理功能外，還可能具有其它的生物學作用，而不是通常認為的那樣，功能單一或局限于某一方面。胰島素的促細胞生長和促蛋白合成的作用，已有文獻報道。但其可以直接作用于胎兒成纖維細胞卻是首次發現。而黃體酮和縮宮素直接與胎兒成纖維細胞作用更是首次發現。
3)可以通過不同誘分化因子如激素、細胞因子和其它物理因素等定向誘導成纖維細胞向不同方向進行分化，為基因打靶和組織工程提供可進行遺傳修飾的細胞平臺。
總上所述，與泌乳相關的這三種激素，不僅可以改變成纖維細胞的基因表達模式，而且，還可以在一定程度上使其形態發生了改變。小鼠成纖維細胞在泌乳激素作用下確實可以向乳腺上皮樣細胞---一種末端分化組織細胞轉化。
權利要求
1.一種利用成纖維細胞定向誘導細胞分化的方法，其特征在于成纖維細胞通過與泌乳相關的誘導物作用，定向向乳腺上皮樣細胞分化的方法，該方法還涉及相關的分子生物學檢測方法。
2.根據權利要求1所述的方法，其中成纖維細胞取自脊椎動物的胎兒組織、成體組織的肌肉、皮膚、內臟、骨骼及血液等經培養得到的成纖維樣細胞。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述的與泌乳相關的誘導物有激素、蛋白因子及有機或無機分子。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述的激素有催產素、孕酮、胰島素、催乳素和生長激素；蛋白因子有表皮生長因子、血管生長因子、腫瘤壞死因子等；有機分子涉及某些甾醇類分子。
5.根據權利要求1所述的方法，應用于制備乳腺反應器或定向誘導成纖維細胞向特定組織轉化，以及提供組織工程所需的細胞。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述的相關的生物學檢測方法包括乳腺上皮細胞特異表達的基因一內源性乳汁蛋白mRNA水平和蛋白水平的檢測；轉基因瞬時表達一由乳汁蛋白啟動子或5’上游調控序列與報告基因和/或目標基因構建乳腺上皮細胞特異表達載體，通過基因導入方法將基因構件導入細胞，報告基因或特征基因獲得表達；細胞形態學的變化細胞由纖維狀向上皮狀轉變。
全文摘要
本發明提供了一種動物成纖維細胞向乳腺上皮樣細胞誘導分化的方法。包括使用誘導因子，如與泌乳相關的激素(如催產素、孕酮、胰島素、催乳素等)、具有誘導作用的蛋白因子、有機分子及基因誘導等，以適當濃度和條件與細胞作用；使用分子雜交技術進行內源性乳汁蛋白mRNA水平和蛋白水平的檢測；構建乳腺上皮細胞特異表達載體；使用轉基因瞬時表達技術檢測外源乳腺上皮細胞特異的基因表達；誘導后細胞形態學發生變化細胞由纖維狀向上皮細胞狀轉變。
文檔編號C12N5/06GK1472311SQ0212718
公開日2004年2月4日 申請日期2002年7月30日 優先權日2002年7月30日
發明者張靖溥, 王森, 朱少俠 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所