專利名稱：提高dna檢測靈敏度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于DNA檢測領(lǐng)域，特別涉及基于DNA堿基配對原理上的一種提高靈敏度的檢測DNA雜交與錯配的方法。
背景技術(shù)：
近年來，基因分析廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)，法學(xué)，環(huán)境等諸多領(lǐng)域，成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)。如何從分子水平上檢測基因突變，快速而靈敏的檢測到基因突變的數(shù)量，從而為尋找基因突變與病變之間的相關(guān)性提供基本數(shù)據(jù)一直是人們研究的主要議題。因此開發(fā)一種簡便、經(jīng)濟(jì)的快速檢測微量基因突變的手段顯得十分的重要和迫切。石英晶體微天平(QCM)可以適時的檢測DNA，方法快速簡便，但是目前這種方法靈敏度還比較低，無法達(dá)到臨床應(yīng)用的程度，因此限制了這種方法的推廣，如[a].Payolsky，F(xiàn).；Lichtenstein，A.；Willner，I.J.Am.Chem.Soc.2001，123，5194-5205；[b].Bardea，a.；Dagan，A.；Ben-Dov，I；Amit，B.；Willner，I.Chem.Commun.1998，839；[c].Payolsky，F(xiàn).；Lichtenstein，A.；Willner，I.J.Am.Chem.Soc.2000，122，418-419所報(bào)道的。
有鑒于此，本發(fā)明人等曾經(jīng)利用過包以DNA單鏈的納米金顆粒來增大此類DNA傳感器的靈敏度，如[a].Zhao，H.Q.；Lin，L.；Li，J.R.；Tang，J.A.；Duan，M.X.；Jiang，L.Journal of NanoparticleResearch 2001，3，321；[b].Lin，L.；Zhao，H.Q.；Li，J.R.；Tang，J.A.；Duan，M.X.；Jiang，L.Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，274，7；[c].Zhao，H.Q.；Lin，L.；Tang，J.A.；Duan，M.X.；Jiang，L.Chinese science Bulletin 2001，13，1074。并且在國外也有類似的報(bào)道，如[a].Patolsky，F(xiàn).；Ranjit，K.T.；Lichtenstein，A.；Willner，I.Chem.Commun.2000，1025；[b].Zhou，X.C.；O’Shea，S.J.；Li，S.F.Y.Chem.Commun.2000，953；[c].Weizmann，Y.；Patolsky，F(xiàn).；Willner，I.Analyst.2001，126，1502。利用包以DNA單鏈的納米金顆粒來增大此類DNA傳感器的靈敏度，這種方法收到了很好的效果，其DNA檢測靈敏度能達(dá)到10-14mol/L，而且具有易于安裝，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。在利用包以DNA單鏈的納米金顆粒的放大效應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)這一效應(yīng)與金屬顆粒尺寸有關(guān)，當(dāng)顆粒尺寸在50nm以下時，顆粒愈大，效應(yīng)愈明顯，但當(dāng)顆粒尺寸大于50nm時，其放大效應(yīng)將逐步消失。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服納米金顆粒作為DNA傳感器增感放大器時，增感顆粒重量的增加所帶來的DNA檢測靈敏度下降的問題。本發(fā)明利用納米金屬顆粒在QCM表面的固定技術(shù)，提高DNA探針在QCM表面的固定量和牢固度，實(shí)現(xiàn)了DNA的檢測極限降低到10-16mol/L以下，提供了一種提高DNA檢測靈敏度的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的采用一定粒徑的納米金屬顆粒作為石英晶體微天平(QCM)的表面處理劑和作為DNA檢測器的識別放大器，重點(diǎn)是利用這兩種方法的結(jié)合來提高DNA檢測靈敏度。
以DNA的堿基匹配進(jìn)行雜交的原理為基礎(chǔ)，采用石英晶體微天平技術(shù)，利用雙官能團(tuán)化合物與QCM表面金屬及金屬納米顆粒之間可以形成化學(xué)鍵來實(shí)現(xiàn)石英晶體微天平表面的納米修飾和DNA探針的固定。利用金屬納米顆粒自身具有的大比重和生物相容性好的特點(diǎn)，把它作為重量傳感器，來達(dá)到增感目的。將DNA雜交檢測前對QCM表面的修飾和后續(xù)的倍增雜交兩項(xiàng)技術(shù)相結(jié)合，使增感納米顆粒的粒徑范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，大大降低了DNA的檢出極限。本發(fā)明包括雙官能團(tuán)化合物對QCM表面的修飾、納米顆粒的連接、DNA探針在修飾的納米金屬表面的固定、探針與靶標(biāo)DNA的雜交以及納米顆粒的增感等幾個步驟。
本發(fā)明的提高DNA檢測靈敏度的方法步驟為(1).雙官能團(tuán)化合物在石英晶體微天平表面的固定本發(fā)明人選用能與QCM的電極表面金屬以及納米金屬顆粒同時作用的雙官能團(tuán)化合物分子作為連接劑，對石英晶體微天平表面做了修飾，以實(shí)現(xiàn)后續(xù)對納米金屬顆粒的組裝。
在保濕的密閉室中，將濃度為5×10-4mol/L的雙官能團(tuán)化合物連接劑滴加到清潔的QCM的電極表面上，浸泡30分鐘左右后分別用乙醇或癸醇和二次重蒸水沖洗，自然晾干。經(jīng)石英晶體微天平測試，有質(zhì)量變化，說明順利的完成了修飾。
(2).納米金屬顆粒在石英晶體微天平表面的組裝在保濕的密閉室中，將步驟(1)中固定有雙官能團(tuán)化合物連接劑的QCM的電極表面用金屬納米溶膠浸泡至吸附達(dá)到飽和，分別用緩沖溶液和二次重蒸水沖洗，自然晾干。經(jīng)石英晶體微天平測試，有較大的質(zhì)量變化，說明納米金屬顆粒成功的完成在QCM的電極表面的組裝。當(dāng)用金納米顆粒做修飾時，通過對DNA探針固定量及對靶標(biāo)DNA雜交率的考察，確定采用粒徑為20nm的金顆粒對QCM的電極表面修飾，最有利于提高DNA的檢測靈敏度。
(3).DNA探針在修飾過納米金屬顆粒后的QCM的電極表面的固定在步驟(2)組裝有納米金屬顆粒的QCM的電極片上，滴加摩爾濃度為10-5mol/L的DNA探針的緩沖溶液，在保濕的密閉室中放置一段時間后，分別用緩沖溶液和二次重蒸水沖洗，晾干后測定晶體震蕩頻率變化值；重復(fù)以上步驟，直到DNA探針在修飾過納米金屬顆粒后的QCM的電極表面達(dá)到吸附飽和。結(jié)果顯示，DNA探針迅速吸附并固定在修飾過納米金屬顆粒后的QCM的電極表面，且在1小時左右達(dá)到吸附飽和狀態(tài)，經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用金納米顆粒對QCM的電極表面進(jìn)行修飾時，能將DNA探針在晶片上的飽和吸附量提高約為3～5倍。
(4).DNA的雜交檢測在保濕的密閉室中，在溫度為15℃～65℃下，將濃度為10-16mol/L的互補(bǔ)DNA序列的待測靶標(biāo)溶液滴加到經(jīng)步驟(3)處理過的QCM的電極表面上進(jìn)行探針DNA與靶標(biāo)DNA的雜交，然后用緩沖溶液和二次重蒸水沖洗，并用石英晶體微天平檢測其頻率變化，得到有靶標(biāo)DNA的QCM的電極晶片，待用。
(5).納米金屬顆粒對DNA傳感器的倍增在金屬納米顆粒溶膠中，加入含有與靶標(biāo)DNA末端互補(bǔ)的DNA的磷酸緩沖溶液，靜置若干時間，隨后用磷酸緩沖溶液對其進(jìn)行稀釋，進(jìn)一步放置40～60小時。然后高速離心移去上層清液，以除去未與納米金屬顆粒結(jié)合的DNA。沉淀物質(zhì)即為DNA功能化的納米金屬顆粒。將下層沉淀用磷酸緩沖溶液清洗，再離心分離出沉淀。重復(fù)以上洗滌過程兩次，然后將經(jīng)過DNA功能化的納米金屬顆粒分散到緩沖溶液的容器里備用。在保濕的密閉室中，將用納米金屬顆粒功能化的的DNA滴加到步驟(4)中有靶標(biāo)DNA的QCM的電極晶片上，在15℃～65℃下進(jìn)行雜交后用緩沖溶液和二次重蒸水沖洗，并用石英晶體微天平分別檢測其頻率變化。
本發(fā)明中用于固定納米金屬顆粒的雙官能團(tuán)化合物，其官能團(tuán)分別可以為不同鏈長的雙巰基、雙氨基或各類一端帶有巰基或氨基的醇類化合物，化合物的鏈長可以改變。
所述的待測靶標(biāo)DNA的長度可在17～25bp范圍；DNA探針的長度、被納米金屬顆粒功能化的DNA長度均可在8～13bp范圍變化。
所述的納米金屬顆?？梢詾榻?、銀或鉑等。
所述的QCM檢測器的表面電極可以為金或鉑。
所述的緩沖溶液是磷酸緩沖溶液，其pH＝6.83。
所述的DNA探針的緩沖溶液是磷酸緩沖溶液，其pH＝6.83.
所述的步驟(3)用于修飾QCM檢測器電極表面的納米金屬顆粒的粒徑范圍為5～60nm，當(dāng)修飾金屬為金時，以20nm的金溶膠對表面DNA探針的固定作用和雜交效果為最佳。
所述的步驟(5)用于倍增的納米金屬顆粒的粒徑范圍為5～100nm。
通過雙官能團(tuán)的連接劑對石英晶體微天平金屬表面的修飾，將納米金屬顆粒固定在QCM表面上，然后將單鏈DNA探針固定在這個用納米顆粒修飾的表面上，該DNA探針與待測定的靶標(biāo)DNA單鏈雜交，靶標(biāo)DNA比探針長，其一部分與探針DNA互補(bǔ)，固定在石英晶體微天平上，另一部分與連結(jié)有納米金屬顆粒的互補(bǔ)DNA單鏈配對，以增大其重量，從而提高石英晶體微天平對靶標(biāo)DNA的檢測靈敏度。此方法其檢測靈敏度可達(dá)到10-16M以上。
本發(fā)明的最大優(yōu)點(diǎn)是采用自組裝技術(shù)，以一種較為溫和的方式固定了DNA探針，研制了一種新型的高靈敏度檢測DNA的方法。通過控制不同粒徑的納米金屬顆粒對石英晶體微天平做表面修飾，使DNA探針的固定程度和吸附量大大提高，并使后續(xù)的雜交過程達(dá)到最大的雜交率，這樣，作為放大器的納米金屬粒徑增長時，倍增效果和納米金屬顆粒粒徑的增長趨勢一致。
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明。
圖1.本發(fā)明的技術(shù)路線示意圖；圖2.本發(fā)明實(shí)施例2的QCM質(zhì)量變化～時間的關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1采用1，6-己二硫醇做連接劑組裝5 nm金顆粒在QCM表面，用20nm金顆粒做增感放大器來做DNA檢測取AT-cut 9MHz的QCM金片，使用前用熱的Piranha溶液(98％H2SO430％H2O2)浸泡3min，用二次重蒸水充分沖洗，用石英晶體微天平測定其頻率。用1，6-己二硫醇修飾QCM表面，半小時后用乙醇和二次重蒸水沖洗，晾干，QCM檢測后滴加20微升的5nm金溶膠，浸泡4h，沖洗，晾干測頻。滴加2×10-6mol/L的HS-DNA，浸泡1h后充分沖洗晾干后測頻。滴加2×10-16mol/L靶標(biāo)DNA，40℃雜交2h后用磷酸緩沖溶液和二次重蒸水沖洗，并用石英晶體微天平分別檢測其頻率變化。滴加20nm金溶膠功能化的DNA 20微升，雜交2h后用磷酸緩沖溶液和二次重蒸水沖洗，并用石英晶體微天平檢測，其頻率變化約為44ng，與文獻(xiàn)([a].Zhao，H.Q.；Lin，L.；Li，J.R.；Tang，J.A.；Duan，M.X.；Jiang，L.Journal of Nanoparticle Research 2001，3，321；[b].Lin，L.；Zhao，H.Q.；Li，J.R.；Tang，J.A.；Duan，M.X.；Jiang，L.Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，274，7)中報(bào)道的沒有納米顆粒修飾的QCM表面上檢測DNA的靈敏度10-14mol/L相比，提高了兩個數(shù)量級，可達(dá)到10-16mol/L，磷酸緩沖溶液的pH＝6.83。
實(shí)施例2采用1，6-己二硫醇做連接劑組裝20nm金顆粒在QCM表面用20nm金顆粒做增感放大器來做DNA檢測在一保濕的密閉小室中，將1，6-己二硫醇的0.5％的乙醇溶液滴加到QCM表面，半小時后用乙醇和二次重蒸水沖洗，晾干，QCM檢測后滴加20微升的20nm金溶膠，浸泡4h，沖洗，晾干測頻，約有50ng左右的質(zhì)量變化。滴加2×10-6mol/L的HS-DNA，浸泡1h后充分沖洗晾干后測頻，質(zhì)量變化為107ng，而直接在裸露的QCM表面上固定HS-DNA，質(zhì)量變化為28ng。滴加2×10-16mol/L靶標(biāo)DNA，40℃雜交2h后用磷酸緩沖溶液和二次重蒸水沖洗，其頻率變化為93ng。滴加20nm金溶膠功能化的DNA 20微升，40℃雜交2h后用磷酸緩沖溶液和二次重蒸水沖洗，檢測其頻率變化為164ng。而相應(yīng)的在裸露QCM表面上雜交分別有4ng和7ng的質(zhì)量變化。所以通過本發(fā)明把原有的檢測靈敏度提高了至少2個數(shù)量級，達(dá)到10-16mol/L。
如圖2所示，QCM質(zhì)量變化～時間的關(guān)系圖，其中(i)為20nm金顆粒修飾QCM表面后做雜交檢測，而(ii)為雜交在裸露的QCM表面完成的。
實(shí)施例3采用1-氨基6-巰基己硫醇做連接劑組裝10nm金顆粒在QCM表面用20nm金顆粒做增感放大器來做DNA檢測用1-氨基6-巰基己醇修飾QCM表面，QCM檢測后滴加20微升的5nm金溶膠，浸泡4h，沖洗，晾干測頻。滴加2×10-6mol/L的HS-DNA，浸泡1h后充分沖洗晾干后測頻。滴加2×10-16mol/L靶標(biāo)DNA，40℃雜交2h后用磷酸緩沖溶液和二次重蒸水沖洗，并用石英晶體微天平分別檢測其頻率變化。與20nm金溶膠功能化的DNA 20微升雜交，并用石英晶體微天平分別檢測其頻率變化發(fā)現(xiàn)其檢測靈敏度可達(dá)到10-16mol/L。
實(shí)施例4采用1，6-己二硫醇做連接劑組裝20nm金顆粒在QCM表面用68nm金顆粒做增感放大器來做DNA檢測用1，6-己二硫醇修飾QCM表面，固定20nm金溶膠后滴加2×10-6mol/L的HS-DNA，浸泡1h后充分沖洗晾干后測頻。滴加2×10-16mol/L靶標(biāo)DNA，雜交后與68nm金溶膠功能化的DNA雜交2h后用石英晶體微天平檢測可檢測到340ng的質(zhì)量變化。與文獻(xiàn)([a].Zhao，H.Q.；Lin，L.；Li，J.R.；Tang，J.A.；Duan，M.X.；Jiang，L.Journal ofNanoparticle Research 2001，3，321；[b].Lin，L.；Zhao，H.Q.；Li，J.R.；Tang，J.A.；Duan，M.X.；Jiang，L.Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，274，7)中報(bào)道的沒有納米顆粒修飾的QCM表面上檢測DNA的靈敏度10-14mol/L相比，檢測靈敏度提高了兩個數(shù)量級。
實(shí)施例5采用雙硫醇做連接劑組裝20nm鉑顆粒在QCM表面用68nm鉑顆粒做增感放大器來做DNA檢測用1，6-己二硫醇修飾QCM的鉑表面，固定20nm鉑溶膠后滴加2×10-6mol/L的HS-DNA，浸泡1h后充分沖洗晾干后測頻。滴加2×10-16mol/L靶標(biāo)DNA，雜交后與68nm鉑溶膠功能化的DNA雜交2h后用石英晶體微天平檢測可檢測到90ng的質(zhì)量變化。與文獻(xiàn)([a].Zhao，H.Q.；Lin，L.；Li，J.R.；Tang，J.A.；Duan，M.X.；Jiang，L.Journal ofNanoparticle Research 2001，3，321；[b].Lin，L.；Zhao，H.Q.；Li，J.R.；Tang，J.A.；Duan，M.X.；Jiang，L.Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，274，7)中報(bào)道的沒有納米顆粒修飾的QCM表面上檢測DNA的靈敏度10-14mol/L相比，靈敏度提高了兩個數(shù)量級。
實(shí)施例6采用1，10-雙硫醇做連接劑組裝20 nm鉑顆粒在QCM表面用68nm鉑顆粒做增感放大器來做DNA檢測用1，10-雙硫醇修飾QCM的鉑表面，固定20nm鉑溶膠后滴加2×10-6mol/L的HS-DNA，浸泡1 h后充分沖洗晾干后測頻。滴加2×10-16mol/L靶標(biāo)DNA，雜交后與68nm鉑溶膠功能化的DNA雜交2h后用石英晶體微天平檢測可檢測到76ng的質(zhì)量變化。與文獻(xiàn)([a].Zhao，H.Q.；Lin，L.；Li，J.R.；Tang，J.A.；Duan，M.X.；Jiang，L.Journal ofNanoparticle Research 2001，3，321；[b].Lin，L.；Zhao，H.Q.；Li，J.R.；Tang，J.A.；Duan，M.X.；Jiang，L.Biochem.Biophys.Res.Commun.2000，274，7)中報(bào)道的沒有納米顆粒修飾的QCM表面上檢測DNA的靈敏度10-14mol/L相比，靈敏度提高了兩個數(shù)量級。
權(quán)利要求
1.一種提高DNA檢測靈敏度的方法，其特征是該方法的步驟為(1).雙官能團(tuán)化合物在石英晶體微天平表面的固定在保濕的密閉室中，將濃度為5×10-4mol/L的雙官能團(tuán)化合物連接劑的溶液滴加到清潔的QCM的電極表面上，浸泡后，分別用乙醇或癸醇和二次重蒸水沖洗，自然晾干；(2).納米金屬顆粒在石英晶體微天平表面的組裝在保濕的密閉室中，將步驟(1)中固定有雙官能團(tuán)化合物連接劑的QCM的電極表面用金屬納米溶膠浸泡至吸附達(dá)到飽和，然后分別用緩沖溶液和二次重蒸水沖洗，自然晾干；(3).DNA探針在修飾過納米金屬顆粒后的QCM的電極表面的固定在步驟(2)組裝有納米金屬顆粒的QCM的電極片上，滴加10-5mol/L的DNA探針的緩沖溶液，在保濕的密閉室中放置一段時間后，分別用緩沖溶液和二次重蒸水沖洗，晾干后測定晶體震蕩頻率變化值；重復(fù)以上步驟，直到DNA探針在修飾過納米金屬顆粒后的QCM的電極表面達(dá)到吸附飽和；(4).DNA的雜交檢測在保濕的密閉室中，在溫度為15℃～65℃下，將濃度為10-16mol/L的互補(bǔ)DNA序列的待測靶標(biāo)溶液滴加到經(jīng)步驟(3)處理過的QCM的電極表面上進(jìn)行探針DNA與靶標(biāo)DNA的雜交，然后用緩沖溶液和二次重蒸水沖洗，并用石英晶體微天平檢測其頻率變化，得到有靶標(biāo)DNA的QCM的電極晶片，待用；(5).納米金屬顆粒對DNA傳感器的倍增在金屬納米顆粒溶膠中，加入含有與靶標(biāo)DNA末端互補(bǔ)的DNA的磷酸緩沖溶液，靜置，隨后用磷酸緩沖溶液對其進(jìn)行稀釋，進(jìn)一步放置；然后高速離心移去上層清液，以除去未與納米金屬粒子結(jié)合的DNA；沉淀物質(zhì)即為DNA功能化的納米金屬顆粒，將下層沉淀用磷酸緩沖溶液清洗，再離心分離出沉淀；重復(fù)以上洗滌過程，然后將經(jīng)過DNA功能化的納米金屬顆粒分散到緩沖溶液的容器里備用；在保濕的密閉室中，將功能化的納米金屬顆粒的DNA滴加到步驟(4)中有靶標(biāo)DNA的QCM的電極晶片上，在15℃～65℃下進(jìn)行雜交后用緩沖溶液和二次重蒸水沖洗，并用石英晶體微天平分別檢測其頻率變化；所述的緩沖溶液是磷酸緩沖溶液，其pH＝6.83。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的雙官能團(tuán)化合物的官能團(tuán)是不同鏈長的雙巰基、雙氨基或各類一端帶有巰基或氨基的醇類化合物。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的待測靶標(biāo)DNA的長度在17～25bp范圍。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的DNA探針的長度、被納米金屬顆粒功能化的DNA長度均在8～13bp范圍。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的金屬納米顆粒為金、銀或鉑。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的QCM檢測器表面電極可為金或鉑。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的步驟(3)用于修飾QCM檢測器電極表面的納米金屬顆粒的粒徑范圍為5～60nm。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征是所述的納米金屬顆粒的粒徑為20nm。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的步驟(5)用于倍增的納米金屬顆粒的粒徑范圍為5～100nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于DNA堿基配對原理上的一種提高靈敏度的檢測DNA雜交與錯配的方法。分別采用不同粒徑的納米金顆粒作為石英晶體微天平(QCM)的表面處理劑和作為DNA檢測器的識別放大器。通過雙官能團(tuán)的連接劑對石英晶體微天平金屬表面的修飾，將納米金屬顆粒固定在QCM表面上，然后將單鏈DNA探針固定在這個用納米金屬顆粒修飾的表面上，該DNA探針與待測定的靶標(biāo)DNA單鏈雜交，靶標(biāo)DNA比探針長，其一部分與探針DNA互補(bǔ)，固定在石英晶體微天平上，另一部分與連結(jié)有納米金屬顆粒的互補(bǔ)DNA單鏈配對，以增大其重量，從而提高石英晶體微天平對靶標(biāo)DNA的檢測靈敏度。此方法其檢測靈敏度可達(dá)到10
文檔編號C12Q1/68GK1464070SQ0212371
公開日2003年12月31日 申請日期2002年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月20日
發(fā)明者江龍, 唐季安, 劉濤 申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所