專利名稱：含脫氫酶生物硅凝膠的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種含脫氫酶生物硅凝膠的制備方法，屬于酶的凝膠包埋固定化技術。
背景技術：
sol-gel法一般是前驅體在水、助溶劑(通常為醇)及催化劑(酸或堿)存在下，發生水解和縮聚反應，釋放出水和相應的醇等，形成三維網絡，得到濕凝膠，濕凝膠經過陳化、干燥得到干凝膠。其特點是通過低溫化學手段在相對小的尺寸范圍內能夠裁剪和調控材料的顯微結構，使均勻性達到亞微米級、納米級甚至分子水平。作為一種“軟化學”方法，sol-gel法為生物分子摻雜于無機或無機-有機復合基質中提供了新穎途徑。
與物理吸附法、化學交聯法和化學鍵合法等固定化方法相比，酶的sol-gel固定化方法具有以下突出優點(1)固定化酶的可調控性酶作為三維有序的有機分子，可從微觀和介觀水平上控制sol-gel過程，從而形成具有特殊組裝方式和多級結構特點的生物礦化凝膠。根據需要，可以控制基質(Matrix)中孔的比表面積、結構尺寸，并可以對基質的前驅體進行各種化學改性。另外，固定化酶可以制成薄膜狀、塊狀、粒狀或涂覆于其它載體的表面。
(2)固定化過程的高效性sol-gel法包埋酶通常在常溫或低溫下進行，通過溫和、簡便的物理過程，即可達到很高的酶空間結構維持率。另外，基質的籠效應(Cage effect)使固定在基質中的酶一般不會滲出；基質的剛性提高了酶的熱穩定性；基質中足夠量的水為酶分子提供了適宜的微環境，從而保證了酶的活性和穩定性，使固定化酶呈現出與游離酶相似的行為。化學鍵合法則要求酶分子具有一定的取向，這樣可能會阻礙底物分子進入酶的活性位點而影響酶的催化活性。
(3)固定化方法的普適性sol-gel法包埋酶的過程是在溶膠轉變為凝膠的過程中逐步把酶包埋在基質中的，因此，酶對基質無特殊要求，而吸附交聯法則要考慮基質孔與酶的適配性。Sol-gel法基質對酶也無特殊要求，而化學鍵合法則要求酶分子要有一定的功能基團。
但現有的Sol-gel法也有一些明顯缺點，總體表現是由于Sol-gel反應的復雜性和缺乏分子水平上調控凝膠結構的手段，酶的Sol-gel固定化基本上停留在試差水平。具體的問題主要體現在下述方面溶膠凝膠過程多用一步法，缺乏對水解縮聚速率有效的調控手段；基質的剛性強而柔性差，易破碎；基質的孔徑偏小(一般均小于1.5納米)，內擴散阻力大，底物與產物在基質中的傳遞速度慢；基質的生物相容性差，一定程度上破壞酶的活性和穩定性。此外，前驅體多為烷基硅酸鹽、烷氧基烷基硅烷，水溶性差需助溶劑和催化劑，而助溶劑和催化劑都會對凝膠的性能帶來不利影響。水解反應釋放出的醇容易引起酶分子的折疊和團簇化而使二級和三級結構受到一定程度的破壞，醇蒸發在干凝膠形成時會引起較大幅度的收縮和孔塌陷。這樣的復雜性再加上老化效應控制方面的困難意味著重復地制備結構適宜、活性和穩定性高、機械強度大的生物凝膠面臨著相當大的困難和挑戰。
發明內容
本發明的目的在于提供一種含脫氫酶生物硅凝膠的制備方法。本發明提供的凝膠凝膠化時間短且可靈活調控，過程操作易行，凝膠的平均孔徑較大。因此，酶的空間結構維持率和酶的活性維持率較高。
為達到上述目的，本發明是通過下述技術方案實現的。以酯為前驅體，在酸、堿和無機鹽的分步催化作用下，與水發生反應，生成氧化硅溶膠。過程中通過調節pH值來控制水解和縮聚反應的速度。把該溶膠與溶于磷酸鹽緩沖液中的濃度為10-100mg/ml的酶原溶液混合，在1分鐘之內形成凝膠，靜置老化5-7天后得到含酶生物凝膠，其特征在于前驅體為正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸異丙酯，其用量是，與水的摩爾比為0.05-0.10，催化劑為鹽酸、硫酸、硝酸、乙酸、氫氧化鈉、氨水、磷酸鹽、醋酸鹽，其用量與正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸異丙酯的摩爾比為1.0-2.0。水解和縮聚反應溫度控制在20-25℃，反應最終pH值控制在7.0。
本發明制備的含酶凝膠經測定，其平均孔徑為3.0-6.0納米，比表面積為200-300m2/g。本發明提出的制備方法的優點在于凝膠化時間短且可以靈活調控，固定化過程簡便易行，凝膠的平均孔徑較大，固定化后酶的空間結構維持率和酶活性維持率高。
具體實施例方式
稱取FateDH 7.0mg、FaldDH 2.0mg、ADH(均來自Sigma公司)2.0mg，溶于1ml 0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中，形成總濃度11mg/ml的酶原溶液(B)。取1ml空白溶膠(A)與酶原溶液(B)在苯乙烯試管中混合，大約50-60s內形成凝膠。將試管密封，3℃下靜置老化7天，記為1#凝膠。
稱取FateDH 14.0mg、FaldDH 4.0mg、ADH 4.0mg，溶于1ml 0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中，形成總濃度22mg/ml的酶原溶液(C)。取1ml空白溶膠(A)與酶原溶液(C)在苯乙烯試管中混合，大約5-10s內形成凝膠。將試管密封，3℃下靜置老化7天，記為2#凝膠。
稱取FateDH 7.0mg、FaldDH 2.0mg、ADH(均來自Sigma公司)2.0mg，溶于1ml 0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中，形成總濃度11mg/ml的酶原溶液(B)。取1ml空白溶膠(A)與酶原溶液(B)在苯乙烯試管中混合，大約50-60s內形成凝膠。將試管密封，3℃下靜置老化7天，記為3#凝膠。
稱取FateDH 14.0mg、FaldDH 4.0mg、ADH 4.0mg，溶于1ml 0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中，形成總濃度22mg/ml的酶原溶液(C)。取1ml空白溶膠(A)與酶原溶液(C)在苯乙烯試管中混合，大約5-10s內形成凝膠。將試管密封，3℃下靜置老化7天，記為4#凝膠。
將處理好的凝膠和溶液一并移入反應器，通入CO2，反應器內壓力維持在3atm，反應8hr。反應產物取樣，氣相色譜分析甲醇含量。
本發明采用Sol-gel法將甲酸脫氫酶(FateDH)、甲醛脫氫酶(FaldDH)和甲醇脫氫酶(ADH)三種酶包埋于SiO2多孔基質中作為催化劑，以還原型煙酰胺腺嘌呤二核甙酸(NADH)作為電子供體，通過酶促反應將CO2轉化為甲醇。
本發明采用的酶法將CO2轉化為甲醇反應中的甲醇收率最高達到了92.1％，相同實驗條件下，游離酶酶促反應中甲醇收率達98.1％。可見，酶經凝膠包埋后，反應活性有所下降，估計是由于酶空間構型的微小變化和空阻效應所致。
用本發明制備的含酶凝膠作為催化劑，考察了酶包埋量、溫度、pH值、NADH用量等因素對二氧化碳酶催化反應的影響。
3.1酶包埋量對酶催化CO2轉化甲醇反應的影響表1 酶包埋量對酶轉化CO2反應的影響編號 PH溫度/℃ NADH壓力 收率/％用量/Mpammol1# 7.0 37100 0.3 92.12# 7.0 37100 0.3 52.31# 7.0 37150 0.3 42.2
2# 7.0 37 150 0.335.13.2溫度對酶催化CO2轉化甲醇的影響表2 反應溫度對酶CO2轉化甲醇的影響(1#凝膠)溫度/℃PHNADH 壓力 收率/％用量 /Mpammol25 7.0 100 0.33037 7.0 100 0.392.125 7.0 150 0.52737 7.0 150 0.342.23.3 pH值對酶催化CO2轉化甲醇的影響表3 pH值對酶催化CO2轉化甲醇的影響(1#凝膠)PH 溫度/℃ NADH 壓力 收率/％用量 /Mpammol7.037100 0.392.17.537100 0.366.98.037100 0.349.53.4 NADH用量對酶催化CO2轉化甲醇的影響表.4 NADH用量對酶催化CO2轉化甲醇的影響(1#凝膠)NADH用量 溫度/℃pH 壓力/Mpa 收率/％mmol50 25 8.0 0.368.810037 8.0 0.549.515037 8.0 0.532.0
權利要求
1一種含脫氫酶生物硅凝膠的制備方法，該方法以酯為前驅體，在酸、堿和無機鹽的分步催化作用下，與水發生反應，生成氧化硅溶膠。過程中通過調節pH值來控制水解和縮聚反應的速度，把該溶膠與溶于磷酸鹽緩沖液中的濃度為10-100mg/ml的酶原溶液混合，在1分鐘之內形成凝膠，靜置老化5-7天后得到含酶生物凝膠，其特征在于前驅體為正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸異丙酯，其用量是，與水的摩爾比為0.05-0.10；催化劑為鹽酸、硫酸、硝酸、乙酸、氫氧化鈉、氨水、磷酸鹽、醋酸鹽，其用量與正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸異丙酯的摩爾比為1.0-2.0；水解和縮聚反應溫度控制在20-25℃，反應最終pH值控制在7.0。
全文摘要
本發明公開了一種含脫氫酶生物硅凝膠的制備方法。屬于酶的凝膠包埋固定化技術。該方法以酯為前驅體,在酸、堿和無機鹽的分步催化作用下,與水發生反應,生成氧化硅溶膠。把該溶膠與溶于緩沖液中一定濃度的酶原溶液混合,在短時間內形成凝膠,靜置老化后得到含酶生物凝膠,其特征在于:前驅體為正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸異丙酯,其用量是,與水的摩爾比為0.05－0.10;催化劑為鹽酸、硫酸、硝酸、乙酸、氫氧化鈉、氨水、磷酸鹽、醋酸鹽,其用量與正硅酸甲酯、正硅酸乙酯或正硅酸異丙酯的摩爾比為1.0－2.0;水解和縮聚反應溫度控制在20－25℃,反應最終pH值控制在7.0。凝膠化時間短,固定化過程簡便易行,凝膠平均孔徑較大,固定化后酶活性維持率高。
文檔編號C12N11/00GK1382802SQ02121430
公開日2002年12月4日 申請日期2002年6月21日 優先權日2002年6月21日
發明者姜忠義, 吳洪, 許松偉 申請人:天津大學