表達調控序列的制作方法

專利名稱：表達調控序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物工業，特別涉及開發新的細菌細胞中受調控基因表達的方法。
背景技術：
對于許多基于開發重組細菌，特別是大腸桿菌的生物工程方法而言，通過加入相對簡單而廉價的化合物誘導克隆基因的表達是一個非常吸引人的想法。顯然，天然的L-氨基酸是用作這類誘導物的非常良好的候選物。但是，據發明者所知，色氨酸酶基因的調控區域是通過往培養基中加入色氨酸而誘導的獨特的天然系統[Landick R.，Tumbough C.L.，Yanofsky C.″轉錄衰減″/″大腸桿菌和沙門氏菌(Salmonella.)細胞和分子生物學″(第二版，F.C.Neidhardt-主編)，(1996)，第1263-1286頁]。相反，存在幾個當細胞中氨基酸過剩時使受調控基因表達減少的系統(特別是色氨酸操縱子阻遏物-操縱基因系統[Platt，T.″大腸桿菌色氨酸操縱子上基因表達調控″/″操縱子″(Miller，J.H.，Reznikoff，W.S.-編)，冷泉港實驗室(1978)，第263-302頁]，氨基酸操縱子轉錄的衰減[Landick R.，Tumbough C.L.，Yanofsky C.″轉錄衰減″/″大腸桿菌和沙門氏菌細胞和分子生物學)″(第二版，F.C.Neidhardt-主編)，(1996)，第1263-1286頁])。
在氨基酸操縱子中，轉錄衰減的分子機理基于在所謂的“衰減子”區域形成可變mRNA二級結構的可能性，其依賴“前導”肽的翻譯，前導肽的基因位于操縱子的第一個結構基因上游。該前導肽基因的編碼部分富含有義氨基酸密碼子(那些其生物合成由相應操縱子的蛋白質產物提供的氨基酸的密碼子對于色氨酸操縱子，有色氨酸密碼子，對于組氨酸操縱子，有組氨酸密碼子，對于蘇氨酸操縱子，有蘇氨酸和異亮氨酸密碼子等)。
圖1中以大腸桿菌色氨酸和組氨酸操縱子的衰減區域為例介紹了已良好地建立的轉錄調控的詳細情況。從圖1可以看出，可變mRNA二級結構可以在相應的DNA片斷轉錄時形成相應于色氨酸前導區形成發夾t1∶t2和t3∶t4或其替代物t2∶t3，類似地，相應于組氨酸前導區形成h1∶h2、h3∶h4和h5∶h6，或h2∶h3和h4∶h5。發夾t3∶t4和h5∶h6為典型的ρ-非依賴型轉錄終止子，因此它們在轉錄的延長期的形成導致轉錄在相應操縱子的衰減子區域終止進而阻止操縱子中結構基因的表達。
由于mRNA二級結構形成過程與mRNA合成過程相結合，因而在色氨酸衰減子中當前導肽未被翻譯時，逐步地形成發夾t1∶t2和其后的t3∶t4(其另一種形式一發夾t2∶t3不能形成，因為t1∶t2已在先形成)。類似地，在合成組氨酸衰減子mRNA但不翻譯相應的前導肽的情況下，發夾h1∶h2、h3∶h4和其后的h5∶h6的較快形成，阻止了其替代物h2∶h3和h4∶h5的形成。如前述，發夾t3∶t4和h5∶h6的形成導致在相應的衰減子區域的終止。在反應混合物中不存在任何翻譯因子，由純RNA聚合酶體外轉錄相應的DNA的過程中，或在體內常規氨基酸饑餓情況下，可以實現這種狀況。
當有義氨基酸過剩(更為確切地說，相應的負載tRNA過剩)或在細菌細胞中處于缺陷狀態時，體內前導肽的翻譯可能會出現更加復雜的情況。已表明，起始衰減子mRNA轉錄的RNA聚合酶停在位于緊鄰于發夾1∶2下游的區域的暫停位點(可能這種發夾的形成是這種暫停的必要但不是充足的條件)[Chan，C.L.，Wang，D.，Landick，R.″多重相互作用穩定了單一暫停轉錄中間體，其中由發夾到3′末端間隔區可區分出暫停和終止途徑″/分子生物學雜志.268(1997)54-68]。翻譯前導肽N-末端部分的核糖體釋放出RNA聚合酶，然后繼續進行轉錄的延長，從而可以形成mRNA-2∶3可變發夾。以下事件取決于有義氨基酸的負載tRNA的細胞內濃度，因為此時必須通過核糖體翻譯相應的前導肽基因的密碼子。
在有義氨基酸饑餓的情況下，核糖體暫停在有義密碼子處且不會破壞發夾2∶3，而RNA聚合酶合成大體上可以形成終止子發夾(對于色氨酸衰減子為t3∶t4，而對于組氨酸衰減子為h5∶h6)的mRNA的下游片斷，但它不折疊，因為存在該可變發夾(t2∶t3-對于色氨酸衰減子，而結構h2∶h3、h4∶h5-對于組氨酸衰減子)，然后延長轉錄并合成操縱子結構基因的mRNA。
在有義氨基酸過剩的情況下，前導肽高效翻譯，因此最初破壞發夾1∶2的核糖體也破壞發夾2∶3，并停在前導肽的終止密碼子處。后者最終導致終止子發夾形成且使轉錄終止于衰減子區域。

發明內容
本發明的目的是創建新的原核人工調控系統，該系統通過增加細胞內有義氨基酸濃度來增加受控基因表達。
本發明人利用基于依賴前導肽翻譯效率而形成可變mRNA二級結構的天然調控機理，成功地創建了一種依賴細胞內氨基酸濃度的新的人工調控系統。與天然氨基酸操縱子的衰減子不同的是，該新系統在有義氨基酸胞內濃度過剩的情況下使受控基因的表達并不減少而是增加。同時，在有義氨基酸饑餓時，受新表達調控序列調控的基因表達水平降低。已公知的轉錄調節、氨基酸操縱子轉錄的衰減已用作該新系統的先祖，但該新系統與其先祖不同的是，在有義氨基酸過剩的情況下，不是降低而是增加受控基因的表達水平。
本發明提供了下述表達調控序列，表達調控方法和使用該表達調控序列的生產方法(1)一種依賴細胞內氨基酸濃度來調控連接于表達調控序列下游的靶基因的表達的表達調控序列，其中，在含有包括表達調控序列、連接在表達調控序列上游的啟動子和連接在表達調控序列下游的靶基因的DNA構建體的細菌中，通過增加細胞內氨基酸濃度而降低在表達調控序列中的終止頻率、起始于啟動子的轉錄頻率，以增加靶基因的表達。
(2)根據(1)的表達調控序列，它包括編碼含有所述氨基酸和ρ-非依賴型終止子的前導肽的區域，其中在氨基酸饑餓的情況下，在翻譯過程中當前導肽的翻譯停在該氨基酸的密碼子處時，在表達調控序列轉錄物上形成ρ-非依賴型終止子的堿基對結構，以增加在表達調控序列中的終止頻率、以及轉錄的頻率。
(3)根據(2)的表達調控序列，它包括不少于3的奇數個區段，其中每個區段可以與其相鄰區段形成堿基對結構，并且在表達調控序列的轉錄物中，當除了末端區段以外的區段各自與其兩個相鄰區段之一形成堿基對結構時，該區段與其兩個相鄰區段的另一區段不形成堿基對結構；在上游末端的第一區段和與翻譯前導肽的核糖體相互作用的區域重疊；在前導肽翻譯過程中，與第一區段相鄰的第二區段和與第二區段相鄰的第三區段形成堿基對結構；由下游末端區段和其相鄰區段形成的堿基對結構是ρ-非依賴型終止子的堿基對結構。
(4)根據(3)的表達調控序列，其中，第一區段與前導肽的氨基酸密碼子重疊。
(5)根據(3)或(4)的表達調控序列，其中區段數為5。
(6)根據(3)-(5)的任一表達調控序列，其中各區段的序列或其部分和相鄰區段的序列或其部分構成反向重復序列。
(7)根據(2)-(6)的任一表達調控序列，其中，ρ-非依賴型終止子能夠在埃希氏桿菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)或沙雷氏菌屬(Serratia)細菌中發揮功能。
(8)根據(7)的表達調控序列，其中，ρ-非依賴型終止子能夠在埃希氏桿菌屬細菌中發揮功能。
(9)根據(7)或(8)的表達調控序列，它順次包括來自上游側的5段區段an1-an5，其中區段an1和an2，以及前導肽的編碼區來自大腸桿菌的色氨酸操縱子的衰減子序列，區段an4和an5來自大腸桿菌的組氨酸操縱子的衰減子序列，而區段an3來自色氨酸操縱子和組氨酸操縱子的衰減子序列的組合。
(10)根據(9)的表達調控序列，該前導肽經修飾為含有不少于2個色氨酸殘基。
(11)一種調控靶基因表達的方法，包括下述步驟在培養基中培養含有包含(1)-(10)之任一定義的表達調控序列、連接在該表達調控序列上游的啟動子和連接在該表達調控序列下游的靶基因的DNA構建體的細菌；和改變該表達調控序列調控表達所依賴的細胞內氨基酸濃度，以調控靶基因的表達。
(12)一種生產靶物質的方法，包括步驟培養能夠生產該物質的細菌以產生該物質并收集該物質，其中該細菌含有包含(1)-(10)之任一定義的表達調控序列、連接在該表達序列上游的啟動子和與該靶物質的生產有關且連接在該表達調控序列下游的靶基因的DNA構建體；并改變該表達調控序列調控表達所依賴的細胞內氨基酸濃度，以調控靶基因的表達。
(13)根據(12)的方法，其中，通過所述細菌合成或降解氨基酸來改變細胞內氨基酸濃度。
根據本發明，提供了一種通過增加細胞內有義氨基酸的濃度而增加被調控基因表達的表達調控序列。根據本發明的表達調控方法，可以通過增加細胞內有義氨基酸的濃度而增加靶基因的表達。根據本發明的生產方法，可以通過增加細胞內有義氨基酸的濃度而增加靶物質的產量，從而有效地生產該靶物質。


圖1是天然衰減子和本發明表達調控序列(人工抗衰減子)的結構和特性的說明圖。
圖2是天然衰減子和人工抗衰減子的詳細結構。A和B分別表示所建議的延滯于“前導”肽的“有義”密碼子(A)并終止于終止密碼子(B)的核糖體所保護的mRNA部分的″下游″區域。C表示由大腸桿菌RNA聚合酶驅動的DNA轉錄的暫停位點。
圖3是人工抗衰減子的基本結構圖。帶叉的圓標記表示與天然序列相比的核苷酸變化。BI∶BamHI，Bg∶BglII，NI∶NdeI，XI；XbaI，XI*；XbaI(dam-)。
圖4是實施例1中的質粒構建圖。
圖5是來自質粒PDR540的Ptac啟動子結構。用網狀點標出用于PCR的″上游″(III)和″下游″(IV)引物序列。
圖6是化學合成的an3∶an4(an4∶an5)片斷結構和將該片斷插到克隆載體的方法。
圖7是天然大腸桿菌色氨酸操縱子的衰減子區域的結構。前導肽由大寫的斜體字母表示。
圖8顯示了包括噬菌體T7基因10的核糖體結合位點(RBS)和色氨酸操縱子前導區之間融合物的中間體的結構。前導肽由大寫的斜體字母表示。
具體實施例方式
<1>表達調控序列本發明的表達調控序列為依賴細胞內氨基酸(有義氨基酸)濃度來調控連接在表達調控序列下游的靶基因的表達的表達調控序列，其中，在含有包括表達調控序列、連接在表達調控序列上游的啟動子和連接在表達調控序列下游的靶基因的DNA構建體的細菌中，通過增加細胞內氨基酸濃度而降低在表達調控序列中的終止頻率、起始于啟動子的轉錄頻率，以增加靶基因的表達。
有義氨基酸是不受限制的，只要其氨酰基tRNA可以合成且該合成的氨酰基tRNA可以用于翻譯本發明表達調控序列所應用的細菌的蛋白質即可。優選的有義氨基酸為色氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、或纈氨酸。
靶基因的實例包括氯霉素乙酰轉移酶基因(cat)，氨基酸操縱子，其蛋白質產物與氨基酸、核苷和核苷酸的生物合成有關的基因；和編碼外源蛋白質產物的基因。
啟動子的實例包括Ptac和任何其它受調控的和組成型原核啟動子。
含有DNA構建體的細菌的實例包括埃希氏桿菌屬、沙門氏菌屬和沙雷氏菌屬細菌。
可以根據常規的基因工程技術(例如，參見分子克隆，第二版，冷泉港出版社(1989)，日本專利申請公開2-207791等)進行表達調控序列和DNA構建體的構建，以及含有DNA構建體的細菌的制備。
還可以根據常規基因工程技術測定通過增加細胞內氨基酸濃度而降低在表達調控序列中的終止頻率、起始于啟動子的轉錄頻率，以增加靶基因的表達。在細胞內有義氨基酸的濃度方面，如果已知細菌細胞內和細胞外濃度的關系，則不需要直接測定細胞內濃度并可以根據細胞外濃度如培養基中的濃度來估算細胞內濃度。也不需要直接測定表達調控序列中的終止頻率及起始于啟動子的轉錄的頻率，測定靶基因表達的增加就夠了。靶基因表達增加的測定可以通過測定靶基因的基因產物的數量，或當該基因產物具有活性時，測定該基因產物的活性來確定。
例如，在一個關于通過增加細胞內氨基酸濃度而降低在表達調控序列中的終止頻率、起始于啟動子的轉錄的頻率，以增加靶基因的表達的實施方案中，當細胞內有義氨基酸的濃度不高于某一水平時，起始于啟動子的轉錄終止于該表達調控序列，當細胞內有義氨基酸的濃度高于某一水平時，該轉錄延長，由此表達靶基因。
本發明的表達調控序列優選包含編碼前導肽的區域，該前導肽含有義氨基酸和ρ-非依賴型終止子，其中在有義氨基酸饑餓的情況下，在翻譯過程中當前導肽的翻譯停在有義氨基酸的密碼子(有義密碼子)處時，在表達調控序列轉錄物上形成ρ-非依賴型終止子的堿基對結構，以增加在表達調控序列中的終止頻率、以及轉錄頻率。
前導肽的長度通常為14-32個殘基。前導肽通常含有占總氨基酸殘基的14-57％，優選30-45％的有義氨基酸殘基。有義氨基酸的比例增大，則通過細胞內有義氨基酸濃度的調控變得精確。
ρ-非依賴型終止子具有可以形成堿基對結構(發夾)的序列，并在形成堿基對結構時終止轉錄。ρ-非依賴型終止子優選能夠在埃希氏桿菌屬、沙門氏菌或沙雷氏菌屬細菌中發揮功能。
關于在翻譯過程中，當前導肽的翻譯停在有義密碼子處時，在表達調控序列的轉錄物上形成ρ-非依賴型終止子的堿基對結構的方法，舉例如下使表達調控序列包含不少于3的奇數個區段，其中每個區段可以與其相鄰區段共同形成堿基對結構，并且在表達調控序列的轉錄物中，當除了末端區段以外的區段各自與其兩個相鄰區段之一形成堿基對結構時，該區段與其兩個相鄰區段的另一區段不形成堿基對結構；在上游末端的第一區段和與翻譯前導肽的核糖體相互作用的區域重疊；與第一區段相鄰的第二區段在前導肽翻譯過程中和與第二區段相鄰的第三區段形成堿基對結構；由下游末端區段和其相鄰區段形成的堿基對結構是ρ-非依賴型終止子的堿基對結構。
在這個實施方案中，有必要使核糖體停在有義氨基酸的密碼子處而阻斷第一區段和第二區段之間的堿基對結構的形成。由于核糖體的質量的原因，核糖體覆蓋從所停留的有義氨基酸密碼子的上游約17bp至所述有義氨基酸密碼子的下游約13bp的區域。與核糖體相互作用的區域是指受核糖體覆蓋的區域。如果第一區段和與翻譯前導肽的核糖體相互作用的區域重疊，則預計可通過使核糖體停在有義氨基酸的密碼子處充分地阻斷第一區段和第二區段之間的堿基對結構的形成。例如，如果有義氨基酸的密碼子剛好出現在前導肽的終止密碼子之前而從有義氨基酸密碼子到第一區段起始點的距離在約13bp之內，則可以阻斷第一區段和第二區段之間的堿基對結構的形成。
第一區段與前導肽上的有義氨基酸的密碼子重疊。
在這個實施方案中，當由于有義氨基酸饑餓而使第一區段受核糖體阻斷時，則形成第二和第三，第四和第五區段...之間的堿基對結構，而最終的堿基對結構用作終止轉錄的終止子。另一方面，如果提供充足的有義氨基酸且核糖體以足夠的速率沿mRNA移動至終止密碼子以進行轉錄過程，導致核糖體阻斷至第二區段，則在第三和第四區段...之間形成堿基對結構以阻止終止子的形成。
在本發明的表達調控序列中，優選RNA聚合酶的暫停位點存在于編碼前導肽C-末端區域的區域，或編碼該前導肽的區域的下游，更優選在第二區段至第三區段的區域。當不存在暫停位位點時，如果與轉錄有關的翻譯不夠充分，則可能不會充分調控靶基因的表達。
在本發明的表達調控序列中，優選RNA聚合酶的暫停位點存在于編碼前導肽C-末端區域的區域，或編碼該前導肽的區域的下游，更優選在第二區段至第三區段的區域。當不存在暫停位點時，如果與轉錄有關的翻譯不夠充分，則可能不會充分調控靶基因的表達。
例如區段的數目為5。
各個區段的核苷酸序列可以是可與其相鄰區段形成堿基對結構的區段。例如，各個區段的序列或其部分和相鄰區段的序列或其部分可以構成反向重復序列。構成反向重復的序列可以不是連續的。換句話說，它可以在其序列內含有不形成堿基對的部分。在除了末端區段之外的區段中，在與其相鄰區段之一構成反向重復序列的部分和與其相鄰的另一區段構成反向重復序列的部分之間存在至少部分重疊就足夠了。
表達調控序列的一個實例順次包含5個從上游側的區段an1-an5，其中區段an1和an2，以及編碼前導肽的編碼區來自大腸桿菌色氨酸操縱子的衰減子序列，區段an4和an5來自大腸桿菌的組氨酸操縱子的衰減子的序列，而區段an3來自色氨酸操縱子和組氨酸操縱子的衰減子序列的組合。
本文所用的術語“來自”是指具有與天然序列相同或類似的序列。獲得序列的方法是不受限制的。可以從生物材料中分離或通過化學合成。類似的序列可以是在天然序列中取代、缺失或插入一種或多種核苷酸的序列并且該序列可以形成等同于在天然序列中形成的堿基對結構。
在優選的表達調控序列的實例中，優選前導肽被修飾為含有不少于2個色氨酸殘基。這些色氨酸殘基優選是連續的。
參照優選的表達調控序列的實例描述本發明。為了方便起見，下文中將表達調控序列稱作人工抗衰減子。
人工抗衰減子的生物特性如圖1所示。從圖1可以看出，在有義氨基酸饑餓和核糖體停在相應的前導肽密碼子的情況下，未受破壞的抗衰減子的發夾an2∶an3可以導致形成作為典型的ρ-非依賴型轉錄終止子一部分的發夾an4∶an5。另一方面，在有義氨基酸過剩的情況下，前導肽的充分翻譯可以破壞人工抗衰減子中的發夾an2∶an3，然后形成可變發夾an3∶an4，該發夾阻止在遠側(下游)基因轉錄之前的終止，因為終止子發夾an4∶an5不能形成。
在兩種已知的天然大腸桿菌色氨酸和組氨酸操縱子的衰減子基礎上設計構建出人工抗衰減子。至于人工抗衰減子的前導肽，使用了天然色氨酸操縱子(trpL)的前導肽基因，并且在其結構部分具有兩個調控色氨酸密碼子。另一方面，與相應的天然組氨酸衰減子區域一樣，在人工抗衰減子的3’-非翻譯區域將形成可變mRNA的二級結構。
在圖2中是作為基礎的兩個天然衰減子(色氨酸和組氨酸)的編碼部分和3’-未翻譯區域的核苷酸序列，以及相應的人工抗衰減子區域的序列。由圖2可以看出，來自天然色氨酸衰減子和來自人工抗衰減子的直至″+85″(將前導肽編碼部分的ATG中的A看作″+1″而得到該數字)的結構相一致。因此可以推測，在轉錄延長過程中，RNA聚合酶在″+66-+67″位置暫停；在色氨酸饑餓情況下，翻譯前導肽的核糖體對發夾an1∶an2進行破壞；以及在細胞中色氨酸過剩的情況下，發夾an2∶an3的額外破壞可以剛好以與天然色氨酸衰減子相同的方式在人工抗衰減子的調控區發生。另一方面，抗衰減子的遠側部分明顯不同于組氨酸衰減子的相應區域，這部分作為第二先祖。
已在可以形成終止子發夾an4∶an5的區域作了最小的改動。但是，如在天然組氨酸衰減子中一樣，在人工抗衰減子上已可能形成可變發夾an3∶an4(該區域的二級結構與天然組氨酸衰減子的h4∶h5同源)，而該發夾的形成可以阻止人工抗衰減子上轉錄的終止。與天然組氨酸衰減子相比，在抗衰減子中不存在形成h3∶h4發夾的DNA片斷，并且其生物學特性發生改變在有義氨基酸饑餓的情況下，形成ρ-非依賴型轉錄終止子而不是其細胞內濃度增加。證明人工抗衰減子特性的結果如下述。
如圖3圖示，已采用常規基因工程技術(包括PCR驅動的天然色氨酸衰減子片斷的擴增和寡核苷酸化學合成等等)合成人工抗衰減子。已經獲得兩種不同類型的人工抗衰減子。天然trpL核糖體結合位點(RBS)用于人工抗衰減子一第一型抗衰減子-I的前導肽的翻譯起始。更有效的噬菌體T7基因10的RBS已插入到第二抗衰減子-II前導肽基因5’-區域。已在載體質粒上高效啟動子Ptac的下游和具有其自身RBS的cat基因結構的上游的克隆了這兩種人工抗衰減子。編碼氯霉素乙酰轉移酶(CAT)的cat基因用作報道基因，其表達水平可以提供關于所創建的依賴細胞內有義氨基酸-色氨酸濃度的調控元件的功能效率信息。
而且，已在相同載體的基礎上構建了多種調控重組質粒。第一種質粒帶有天然色氨酸操縱子-trpL的衰減子。第二種帶有-潛在的轉錄終止子-形成終止子發夾an4∶an5的抗衰減子的3’-末端DNA片斷。第三種質粒帶有較長的3’-末端DNA片斷，它不能形成終止子發夾an4∶an5，因為在mRNA合成期間必須首先形成潛在的可變發夾an3∶an4。
文獻中已知，大腸桿菌色氨酸操縱子中的天然trpL(不同于其它氨基酸操縱子的衰減子)是相當微弱的衰減子″生長培養基中存在或不存在色氨酸一般不影響色氨酸衰減子的通讀；通讀發生的10倍的變化僅發生在突變型細菌極度色氨酸饑餓時或細菌由含色氨酸培養基轉移至不含色氨酸的培養基的瞬間發生″轉錄衰減″/在″大腸桿菌和沙門氏菌細胞和分子生物學″(第二版，F.C.Neidhardt-主編)，(1996)，第1263-1286頁)。后者可能是因為在相應的前導肽結構部分僅存在與有義氨基酸串聯密碼子。由于人工抗衰減子前導肽的編碼部分和天然trpL相同，必須使用特定的模型系統以測定該新系統的調控性能。已在帶有所需重組質粒的trp細胞中測定了報道基因CAT的酶活性，再在色氨酸饑餓條件下生長，然后如果需要的話，在培養基中加入色氨酸。所得結果如表1所示。
表1.在帶有含受試調控元件的重組質粒的菌株中進行的CAT活性測定

從表1可以看出，CAT活性水平并不依賴于將色氨酸加到帶有不含trpL編碼部分的質粒的細胞中。而且，可以根據關于編碼″終止子″和″抗終止子″發夾的調控質粒的所得結果，評價依賴于可變mRNA二級結構形成過程的CAT活性所達到的水平上的理論差異。與在人工抗衰的3’-部分的ρ-非依賴型轉錄終止相比，在″抗終止子″形成的情況下可以實現1/20倍的轉錄增加。
可以推測，在利用具有天然色氨酸衰減子的質粒情況下，CAT活性的測定水平在色氨酸饑餓的情況下已提高了該水平，比將色氨酸加到正在生長的質粒-載體細菌后的水平要高。實際獲得的CAT活性水平(17單位)不能與最高水平(60單位)相比。這是因為，首先，在細菌生長情況下的色氨酸饑餓不保證trpL通讀轉錄的最大效率；其次，cat基因的5’-非翻譯區位于其自身RBS的直接上游，在利用天然trpL和其它受試結構的情況下是不同的，因此CAT翻譯起始效率也可以是不同的。
已獲得關于帶有人工抗衰減子的質粒的主要結果。從表1可以看出，對于兩種質粒-載體細菌菌株而言，在將色氨酸加到正在生長的細菌中之后可以看到CAT活性水平升高。而且，利用高效的噬菌體T7基因10的RBS進行前導肽的翻譯起始，獲得接近于理論最大值的CAT的累積水平(51單位比60單位)。后者可以由以下事實解釋需要改進前導肽的RBS，以在由相當強的啟動子Ptac(比天然色氨酸操縱子的啟動子更強)轉錄人工抗衰減子的情況下，完成實現可變mRNA二級結構形成的分子機理所需的全轉錄-翻譯相結合(對于天然的原核氨基酸操縱子上的衰減轉錄而言是典型的)。
可以在所得結果的基礎上作出以下結論1.可以利用可變mRNA二級結構形成過程來調控轉錄由于利用人工“組氨酸樣”尾，表達水平可以實現多達20倍的差異。
2.所得的人工“抗衰減子”系統是功能活性的2.1.天然色氨酸前導肽編碼部分的存在可以促進依賴細胞內色氨酸水平的mRNA二級結構折疊。
2.2.將Ptac-啟動子用于與優化的前導肽翻譯起始相結合的轉錄(利用噬菌體T7 S10 RBS代替天然trpL的RBS)的情況下，發現了過剩色氨酸的最佳“活化劑”效應。
3.可以推測該研制的系統可以用作創建實際可誘導調控元件的基礎可以在增加抗衰減子區域的前導肽結構部分的有義(色氨酸)氨基酸密碼子的數量后，在培養基中加入過量的色氨酸而將其誘導。
<2>用于調控靶基因表達的方法本發明的表達調控方法是一種調控靶基因表達的方法，它包括步驟
在培養基中培養含包括本發明的表達調控序列、連接在該表達調控序列上游的啟動子和連接在該表達調控序列下游的靶基因的DNA構建體的細菌；并改變該表達調控序列調控表達所依賴的細胞內氨基酸濃度，以調控靶基因的表達。
該DNA構建體和含有該DNA構建體的細菌可以如以上關于表達調控序列中所述。
培養條件是不受限制的，只要細菌可以存活。根據細菌適當選擇條件。
改變細胞內有義氨基酸濃度的方法的例子為在培養細菌的培養基中改變有義氨基酸濃度的方法，改變細胞中有義氨基酸的合成或降解數量的方法。可以通過測定靶基因的基因產物數量確定靶基因表達改變，或當該基因產物具有活性時可以測定該基因產物的活性。
<3>生產靶物質的方法本發明的方法是一種生產靶物質的方法，它包括步驟培養能夠生產該物質的細菌以產生該物質并收集該物質，其中該細菌含包括本發明的表達調控序列、連接在該表達序列上游的啟動子和與該靶物質的生產有關且連接在該表達調控序列下游的靶基因的DNA構建體；并改變該表達調控序列調控表達所依賴的細胞內氨基酸濃度以調控靶基因的表達。
靶物質的實例包括CAT和其它原核酶、外源蛋白質產物、氨基酸、核苷酸和核苷、維生素和其它生物活性物質。
能夠生產靶物質的細菌的實例包括埃希氏桿菌屬、沙門氏菌屬和沙雷氏菌屬的細菌。
培養條件不受限制，只要能夠生產靶物質的細菌能夠生產該靶物質。根據細菌適當選擇條件。
培養通常在需氧條件下進行10-50小時。培養溫度通常控制在28-37℃，pH通常在培養期間控制在6.6-7.4。可以將無機或有機、酸性或堿性物質以及氨氣等等用于調節pH。
培養基可以是含有碳源、氮源、有機離子和可選擇的其它有機組分的普通培養基。
作為碳源，可以使用糖如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖或淀粉水解產物；醇如甘油或山梨醇；或有機酸如富馬酸、檸檬酸或琥珀酸。
作為氮源，可以使用無機銨鹽如硫酸銨、氯化銨或磷酸銨；有機氮如大豆水解產物；氨氣；或氨水。
可允許添加的所需的物質如維生素B1或含有適量的有機微量營養物的酵母提取物。與以上不同的是，如果需要的話，可以加入少量的磷酸、硫酸鎂、鐵離子、鎂離子等等。
通常可以組合離子交換樹脂法、沉淀法和其它已知方法，從培養物如細胞和培養基中收集靶物質。
DNA構建體可以如以上關于表達調控序列所述，只要將與靶物質的生產有關的基因用作靶基因即可。與靶物質生物有關的靶基因的實例包括用于靶物質的生物合成基因、用于產生能量和相關的物質的基因如用于靶物質生物合成的中間體、用于此目的的調控基因等等。其具體的實例包括L-色氨酸生物合成的基因、L-絲氨酸生物合成基因(特別用于L-色氨酸生物合成)、pntAB基因、H+-腺苷三磷酸酶(ATPase)基因。
具體而言，如果在產L-色氨酸細菌中，將L-色氨酸用作有義氨基酸，而作為靶基因的L-絲氨酸生物合成基因連接于本發明表達調控序列的下游，則當細胞內L-色氨酸的累積量增加時，L-絲氨酸生物合成基因的表達增加。細胞內L-色氨酸累積量增加的時間也是作為L-色氨酸生物合成的底物之一的L-絲氨酸減少的時間。因此，L-絲氨酸生物合成基因的表達僅在L-絲氨酸減少時增加。另一方面，L-絲氨酸生物合成基因不可能總是在生產L-色氨酸的細菌中高度表達，因為高濃度的L-絲氨酸對細胞生長有害。因此認識到本發明的表達調控序列用于在L-色氨酸-生產細菌中提高L-絲氨酸生物合成基因的表達時非常有用。
能夠生產靶物質并含有DNA構建體的細菌可以通過能夠生產靶物質的細菌包含DNA構建體或賦予含有DNA構建體的細菌生產靶物質的能力而得到。可以根據常規基因工程技術使細菌包含DNA構建體。可以根據已知方法賦予生產靶物質的能力。例如，當靶物質為CAT時，可以使用引入編碼氯霉素乙酰轉移酶DNA的方法。
改變細胞內有義氨基酸濃度的方法的例子有改變培養細菌的培養基中有義氨基酸濃度的方法，改變細胞內有義氨基酸的合成和降解數量的方法。優選改變細胞內有義氨基酸的合成和降解數量的方法，因為靶物質的生產可以與用于靶物質生產的中間體等的生產結合。靶基因表達改變的確定可以通過測定靶基因的基因產物數量，或當該基因產物具有活性時，測定該基因產物的活性。
實施例實施例1.帶有天然衰減子和人工抗衰減子及其片斷的重組質粒的構建1.載體質粒pML-Ptac-ter_thrL-cat的構建用以下方式構建帶有ColE1樣復制子、作為選擇性標記的ApR-基因、tac啟動子(Ptac)(Russel D.R.，Bennett G.，基因20(1982)231)、合成的大腸桿菌蘇氨酸操縱子(ter_thrL)前導肽的ρ-非依賴型轉錄終止子和Ptac下游的cat-基因結構部分的質粒載體pML-Ptac-ter_thrL-cat。將從Ptac開始轉錄的基因cat用作進一步實驗的報道基因。
1.1.pML-pp-載體的構建兩種質粒用作構建pML-pp-載體的起始質粒。第一個質粒是前述的質粒pML24(Trukhan等人Biotechnologiya(俄文)4，No.3(1988)325-334)。第二個質粒是可商購得到的(MBI″Fermentas″，立陶宛)載體pUC57(GenBank/EMBL入藏號Y14837)。在圖4中顯示了基于常規基因工程方法(Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊″.(1989)第二版，冷泉港實驗室出版社)的pML-pp-載體的構建圖。
1.2.在質粒pML-pp-載體中插入化學合成的ter_thrL由具有以下結構的兩種化學合成的寡核苷酸的退火而構建了合成的大腸桿菌蘇氨酸操縱子前導肽的ρ-非依賴型轉錄終止子I-5′-ctagaaagcttaacacagaaaaaagcccgcacctgacagtgcgggctttttttttcgaccactgcagg→3′(SEQ ID NO4)，和II-5′-gatccctgcagtggtcgaaaaaaaaagcccgcactgtcaggtgcgggcttttttctgtgttaagcttt→3′(SEQ ID NO5)。
在合成的寡核苷酸退火之后，構建了雙鏈DNA片斷，該雙鏈DNA片斷帶有典型的經XbaI-和BamHI處理DNA之后獲得的單鏈“粘性”末端。
根據常規方法，采用T4多核苷酸激酶將該片斷磷酸化，并克隆到由XbaI和BamHI切割的質粒pML-pp-載體上。由插入片斷的限制酶切分析和DNA測序建立所需質粒與所測得的質粒結構之間的聯系。
1.3.Ptac的分子克隆將PCR驅動的DNA擴增用于分子克隆雜合啟動子(Ptac)。為此目的，化學合成了兩種寡核苷酸。
III-5′-gcttaggtaccctccccatccccctgttgac-3′(SEQ ID NO6)，和IV-5′-ctgtttctagatcctgtgtgaaattgttatccgc-3′(SEQ ID NO7)；將可商購得到的帶有Ptac-啟動子的質粒pDR54O(Pharmacia，瑞典)用作PCR模板。
如圖5所示，這些寡核苷酸帶有啟動子的上游(III)和下游(IV)序列。而且它們帶有可被多個限制性內切核酸酶(KpnI和XbaI)(見圖5)識別的序列，以利于以下的分子克隆。用KpnI和XbaI處理擴增的DNA片斷，然后在已事先由相同的限制酶切割(參見1.2項)的載體質粒上進行克隆。所選擇的重組質粒命名為pML-Ptac→ter_thrL→cat，它用作進一步實驗的載體。
2.用天然和人工轉錄調控元件構建質粒上述的質粒pML-Ptac→ter_thrL→cat用作創建所有有用質粒的載體。而且已化學合成了一組寡核苷酸olig15′-cagagctctagaagttcacgtaaaaagggtatcgac-3I(SEQ ID NO8)；olig25′-gtatcgcatatgaaagcaattttcgtactgaaagg-3′(SEQ ID NO9)；olig35′-gtctgagatctagtatctgattgctttacgcatggtg-3′(SEQ ID NO10)；olig45′-atcataggatcctaattttgttcaaaaaaaagcccgctcatt-3′(SEQ ID NO11)；oligs5′-cgactgtctagaacggtacagaaagcccccggcagat-3′(SEQ ID NO12)；cat3′5′-agctcaccgtctttcattgccatacgg-3′(SEQ ID NO13)；cr5′5′-acatgcggtaccgatcccgcgaaattaatacg-3′(SEQ ID NO14)。
如下述，這些寡核苷酸用作PCR驅動的DNA擴增的引物。另一組寡核苷酸olig65′-cagagctctagaagatctgcccgactgcgtacaacggtacagaaagcccccggcagatcacctgc-3′(SEQID NO15)；olig75-cgggggcttttttattgcgcggttgataacgggatccagcgta-3(SEQ ID NO16)；olig85′-tacgctggatcccgttatcaaccgcgcaataaaaaagcccccggcaggtgatctgccgggggctt-3′(SEQID NO17)；
olig95′-tctgtaccgttgtacgcagtcgggcagatcttctagagctctg-3′(SEQ ID NO18)，直接用于該新的人工抗衰減子的3′-末端部分的構建過程(見以下)。
2.1.質粒pML-Ptac-an3∶an4(an4∶an5)-cat的構建在pML-Ptac→ter_thrL→cat的基礎上，插入由化學合成的寡核苷酸(olig6，olig7，olig8和olig9)創建的雙鏈DNA片斷，代替啟動子Ptac和cat-基因結構部分之間的ter_thrL(見圖6)，而構建了該質粒。為此目的，根據建議的方法，采用T4多核苷酸激酶(″MBI Fermentas″，立陶宛)將最初650ng的olig7和650ng的olig9磷酸化。兩種混合物含有在30μl″y+/Tango″緩沖液(″MBI Fermentas″，立陶宛)中的430ng的olig6與650ng的磷酸化olig9，和430ng的olig8與650ng的磷酸化olig7，100℃下將其加熱5分鐘，然后在75℃下退火5分鐘。隨后將其混合在一起，在60℃下加熱5分鐘并在20℃下退火10分鐘。然后加入5單位的T4 DNA連接酶(UMBI Fermentas″，立陶宛)和0.5μl的100mM ATP，并在22℃下保溫4小時，并在+4℃下保溫過夜。68℃下將混合物加熱10分鐘并將其上樣至凝膠-電泳。采用低熔點瓊脂糖技術分離明顯可見的DNA帶。依照制造商建議，采用XbaI(＂MBI Fermentas″，立陶宛)處理所得的雙鏈DNA片斷(長108 bp)。將360ng的該片斷連接至50ng由大腸桿菌(dam-)鏈制備并由XbaI切割的載體pML-Ptac→ter_thrL→cat上。在載體質粒pML-Ptac→ter_thrL→cat和在其基礎上得到的重組質粒必須用限制酶XbaI切割的所有情況下，必須由大腸桿菌(dam-)鏈提供質粒DNA，因為這些質粒的XbaI-限制位點與GATC-序列重疊，這是Dam驅動的DNA修飾的目標，因而XbaI不能切割從大腸桿菌(dam+)菌株中純化的質粒DNA。采用3個單位的T4 DNA連接酶在+4℃下連接過夜。根據常規方案，用BamHI(″MBI Fermentas″，立陶宛)處理所得混合物。在最后步驟，用60μl體積的T4 DNA連接酶緩沖液稀釋DNA混合物，并于+4℃下用5個單位的T4 DNA連接酶處理過夜。將所得混合物轉化至菌株HB101并篩選菌落以獲得所需構建體。因此，得到質粒pML-Ptac-an3∶an4(an4∶an5)-cat，并通過限制酶切分析和根據常規Sanger法進行DNA測序證明了它的結構。我們推測，所得的質粒帶有被轉錄的DNA片斷，可以形成抗終止子發夾an3∶an4(終止子發夾an4∶an5不能形成，因為an3∶an4在先合成)。
2.2.質粒pML-Ptac-an4∶an5-cat的構建上述的質粒pML-Ptac-an3∶an4(an4∶an5)-cat作為構建下一重組DNA的起始質粒它被用作為編碼最后的，an4∶an5，新調控區域發夾的片斷而進行PCR驅動的DNA擴增的模板。在該PCR中，寡核苷酸olig5和cat3′用作引物(見圖6)。這些核苷酸的第一部分相應于較早克隆的編碼發夾an4∶an5的片斷的起始部分，但它還含有5’-末端附近的由XbaI識別的核苷酸(見圖6)。第二個寡核苷酸，cat3′相應于cat-基因的編碼部分的片斷(位置+219-+245，如果來自CAT的ATG起始密碼子的A編號為″+1″的話)(見圖6)。用XbaI處理由PCR得到的雙鏈DNA片斷，將其與由相同的限制酶切割的載體質粒pML-Ptac→ter_thrL→cat連接，然后進行BamHI處理并用T4 DNA連接酶將產物環化。由此得到名為pML-Ptac-an4∶an5-cat的所需質粒。
2.3.質粒pML-Ptac-trpL-cat的構建為了在Ptac-啟動子的轉錄調控下構建帶有天然大腸桿菌色氨酸操縱子前導肽基因(基因trpL)的質粒，將已測定了其全基因組序列的來自菌株大腸桿菌MG1655的染色體DNA用作PCR的模板。相應于trpL-基因的5′和3′-末端部分的寡核苷酸olig1和olig4(見圖7)用作DNA擴增的引物。從圖7中可以看出，這些引物還帶有側翼XbaI和BamHI(相應地在olig1和olig4上)識別位點以便于以下的操作。用XbaI和BamHI處理長175bp的雙鏈DNA片斷，然后將其克隆到由相同的限制酶切割的載體質粒pML-Ptac→ter_thrL→cat上。所得的質粒命名為pML-Ptac-trpL-cat，該載體質粒帶有天然trpL-基因它替代了載體上的ter_thrL。
2.4.質粒pML-Ptac-anti_att-I-cat的構建將上述的質粒pML-Ptac-trpL-cat用作創建下一重組DNA的模板。在該方法中，將上述的寡核苷酸，olig1以及olig3用作引物。olig3相應于天然trpL-基因的中央部位，并在其5′-末端還帶有BglII-識別位點(見圖7)。在PCR驅動的DNA擴增之后，用XbaI處理所得的長133bp的雙鏈片斷，并將其與由相同的限制酶切割的載體質粒pMLPtac-an3∶an4(an4∶an5)-cat連接，然后由BglII水解產物并用T4 DNA連接酶環化產物。將所得的在Ptac-啟動子和cat-基因結構部分之間帶有人工抗衰減子的質粒命名為pML-Ptac-anti_att-I-cat。
2.5 質粒pML-Ptac-anti_att-II-cat的構建用以下方式構建帶有人工抗衰減子的重組質粒，該人工抗衰減子含有位于天然大腸桿菌色氨酸操縱子前導肽編碼部分上游的噬菌體T7基因10的高效核糖體結合位點(RBS)。最初，由PCR得到雙鏈DNA片斷，該PCR使用olig2(見圖7)和olig3作為引物而將質粒pML-Ptac-trpL-cat的DNA作為模板。NdeI的限制性位點重建于前導肽的ATG-起始密碼子的上游(ATG-密碼子的核苷酸是NdeI所識別的序列CATATG的一部分)。將所得的由NdeI切割的DNA片斷與可商購得到的(UNovagenfl，USA)用NdeI處理的質粒載體pET-22b(+)連接。質粒pET-22b(+)在XbaI和NdeI限制位點之間帶有T7基因的RBS。連接反應的產物用作下一步構建的PCR模板。新的寡核苷酸cr5′(見圖8)和前面所用的olig3用作該PCR的引物。用XbaI和BglII處理所得的長210bp的雙鏈DNA片斷，并在質粒pML-Ptac-an3∶an4(an4∶an5)-cat上根據構建pML-Ptac-anti_att-I-cat所用的方案進行克隆。因此，得到新的名為pML-Ptac-anti_att-II-cat的質粒，該質粒帶有人工抗衰減子和處在色氨酸前導肽基因5′-未翻譯區的噬菌體T7基因10的RBS。通過限制酶切分析和常規Sanger法測序證明了所有帶有人工轉錄調控元件的質粒結構。
實施例2.檢測含具有天然trpL、人工抗衰減子及其片斷的重組質粒的菌株中Cat蛋白質累積水平。
根據常規實施方案，將前述的質粒(見實施例1)pML-Ptac-an4∶an5-cat、pML-Ptac-an3∶an4(an4∶an5)-cat、pML-Ptac-trpL-cat、pML-Ptac-anti_att-I-cat、pML-Ptac-anti_att-II-cat引入菌株大腸桿菌TG1(supE、hsd、thi、Δ(lac-proAB)、F′(traD36、proAB+、laclQ、lacZΔM15])和大腸桿菌B7248(trpB-Tnl0，StrR)并在加入氨芐青霉素(100μg/ml)的培養基中選擇質粒載體細胞(Sambrook等人，“分子克隆實驗室手冊”.(1989)第二版，冷泉港實驗室出版社)。所得的細胞培養物在37℃和良好的通風條件下，在含有液體培養基的試管中生長。關于培養基，加入氨芐青霉素的L-肉湯用于TG1-驅動的質粒-載體菌株，而含有氨芐青霉素(100μg/ml)、硫胺素(5μg/ml)和色氨酸(10μg/ml)的極限M9-培養基用于在大腸桿菌B7248的基礎上構建的菌株。用相同的培養基將過夜的B7248-驅動的培養物稀釋50倍，并繼續培養2-4小時直至600nm處的光密度為1(OD600＝1)。將各培養基分成兩部分并將色氨酸(200μg/ml)加到這兩部分之一。繼續培養1小時，然后離心收集細胞，用生理溶液洗滌，并重懸在1/10初始體積磷酸鈣緩沖液中。然后超聲處理細胞，4℃下離心收集碎片。根據制造商所述的方案，采Bio-Rad Coumassie R250試劑測定上清液中的蛋白質濃度。根據常規方法測定氯霉素乙酰轉移酶活性(Schottel JL，Sninsky JJ，Cohen SN″翻譯調控區的變化對細菌基因表達的影響由lac啟動子轉錄的cat基因用作模式系統″基因，28(1984)177-193)。在這些實驗中，5，5′-二硫-雙(2-硝基苯甲酸)-Ellman試劑)(″Sigma″)用作具體的試劑。所得結果如正文的表1所示。
進行SDS-PAGE (0.1％SDS-12.5％ PAAG電泳)以目測檢驗大腸桿菌TG1驅動的質粒-載體菌株累積的CAT。各菌株的生長如上述。將各培養物分成兩部分。往這些培養物上添加IPTG(直至0.4mM的最終濃度)并培養2小時。然后收集細胞，將其重懸于SDS-加樣緩沖液(60mM Tris-HCl pH6.8/2.3％ SDS/10％甘油/5％β-巰基乙醇)，并煮沸15分鐘。將作為試樣的10-20μl所得懸浮液加到PAAG上，并根據Laemmli所述的方法進行電泳(Laemmli V.K.//″在裝配噬菌體T4頭部期間結構蛋白質的切割″，自然227(1970)680-685)。用考馬斯藍給凝膠染色以檢測分離的蛋白質。相應的所得凝膠的帶型如圖3所示。
序列表<110>味之素株式會社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>表達調控序列<130><150>RU 2001104817<151>2001-02-22<160>18<210>1<211>118<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>1atgaaagcaa ttttcgtact gaaaggttgg tggcgcactt cctgaaacgg gcagtgtatt 60caccatgcgt aaagcaatca gatacccagc ccgcctaatg agcgggcttt tttttgaa118<210>2<211>153<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>2atgacacgcg ttcaatttaa acaccaccat catcaccatc atcctgacta gtctttcagg 60cgatgtgtgc tggaagacat tcagatcttc cagtggtgca tgaacgcatg agaaagcccc 120cggaagatca ccttccgggg gcttttttat tgc 153<210>3<211>169<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗衰減子<400>3atgaaagcaa ttttcgtact gaaaggttgg tggcgcactt cctgaaacgg gcagtgtatt 60caccatgcgt aaagcaatca gatactagat ctgcccgact gcgtacaacg gtacagaaag120cccccggcag atcacctgcc gggggctttt ttattggcgg ttgataacg 169<210>4<211>69<212>DNA<213>大腸桿菌(Eshcerichia coli)<400>4ctagaaagct taacacagaa aaaagcccgc acctgacagt gcgggctttt tttttcgacc 60actgcagga 69<210>5<211>69<212>DNA<213>大腸桿菌(Eshcerichia coli)<400>5gatccctgca gtggtcgaaa aaaaaagccc gcactgtcag gtgcgggctt ttttctgtgt60taagcttta69<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6gcttaggtac cctccccatc cccctgttga ca 32<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7ctgtttctag atcctgtgtg aaattgttat ccgca 35<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8cagagctcta gaagttcacg taaaaagggt atcgac 36<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9gtatcgcata tgaaagcaat tttcgtactg aaagg35<210>10<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10gtctgagatc tagtatctga ttgctttacg catggtg 37<210>11<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11atcataggat cctaattttg ttcaaaaaaa agcccgctca tt42<210>12<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12cgactgtcta gaacggtaca gaaagccccc ggcagat47<210>13<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13agctcaccgt ctttcattgc catacgg 27<210>14<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14acatgcggta ccgatcccgc gaaattaata cg 32<210>15<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗衰減子片斷<400>15cagagctcta gaagatctgc ccgactgcgt acaacggtac agaaagcccc cggcagatca 60cctgc 65<210>16<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗衰減子片斷<400>16cgggggcttt tttattgcgc ggttgataac gggatccagc gta 43<210>17<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗衰減子片斷<400>17tacgctggat cccgttatca accgcgcaat aaaaaagccc ccggcaggtg atctgccggg 60ggctt 65<210>18<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>抗衰減子片斷<400>18tctgtaccgt tgtacgcagt cgggcagatc ttctagagct ctg 4權利要求
1.一種依賴細胞內氨基酸濃度來調控連接于表達調控序列下游的靶基因的表達的表達調控序列，其中，在含包括表達調控序列、連接在表達調控序列上游的啟動子和連接在表達調控序列下游的靶基因的DNA構建體的細菌中，通過增加細胞內氨基酸濃度而降低在表達調控序列中的終止頻率、起始于啟動子的轉錄頻率，以增加靶基因的表達。
2.根據權利要求1的表達調控序列，它包括編碼含有所述氨基酸和ρ-非依賴型終止子的前導肽的區域，其中在所述氨基酸饑餓的情況下，在翻譯過程中當前導肽的翻譯停在該氨基酸的密碼子處時，在表達調控序列轉錄物上形成ρ-非依賴型終止子的堿基對結構，以增加在表達調控序列中的終止頻率以及轉錄頻率。
3.根據權利要求2的表達調控序列，它包括不少于3的奇數個區段，其中每個區段可以與其相鄰區段形成堿基對結構，并且在表達調控序列的轉錄物中，當除了末端區段以外的區段各自與其兩個相鄰區段之一形成堿基對結構時，該區段與其兩個相鄰區段的另一區段不形成堿基對結構；在上游末端的第一區段和與翻譯前導肽的核糖體相互作用的區域重疊；在前導肽翻譯過程中，與第一區段相鄰的第二區段和與第二區段相鄰的第三區段形成堿基對結構；由下游末端區段和其相鄰區段形成的堿基對結構是ρ-非依賴型終止子的堿基對結構。
4.根據權利要求3的表達調控序列，其中，第一區段與前導肽的氨基酸密碼子重疊。
5.根據權利要求3或4的表達調控序列，其中的區段數為5。
6.根據權利要求3-5中任一項的表達調控序列，其中各區段的序列或其部分和相鄰區段的序列或其部分構成反向重復序列。
7.根據權利要求2-6中任一項的表達調控序列，其中，ρ-非依賴型終止子能夠在埃希氏桿菌屬、沙門氏菌屬或沙雷氏菌屬細菌中發揮功能。
8.根據權利要求7的表達調控序列，其中，ρ-非依賴型終止子能夠在埃希氏桿菌屬細菌中發揮功能。
9.根據權利要求7或8的表達調控序列，它順次包括來自上游側的5段區段an1-an5，其中區段an1和an2，以及前導肽的編碼區來自大腸桿菌的色氨酸操縱子的衰減子序列，區段an4和an5來自大腸桿菌的組氨酸操縱子的衰減子序列，而區段an3來自色氨酸操縱子和組氨酸操縱子的衰減子序列的組合。
10.根據權利要求9的表達調控序列，該前導肽被修飾成含有不少于2個色氨酸殘基。
11.一種調控靶基因表達的方法，包括下述步驟在培養基中培養含包括權利要求1-10的任一項所定義的表達調控序列、連接在該表達調控序列上游的啟動子和連接在該表達調控序列下游的靶基因的DNA構建體的細菌；和改變該表達調控序列調控表達所依賴的細胞內氨基酸濃度，以調控靶基因的表達。
12.一種生產靶物質的方法，包括步驟培養能夠生產該物質的細菌以產生該物質并收集該物質，其中該細菌含包括權利要求1-10中的任一項所定義的表達調控序列、連接在該表達序列上游的啟動子和與該靶物質的生產有關且連接在該表達調控序列下游的靶基因的DNA構建體；并改變該表達調控序列調控表達所依賴的細胞內氨基酸濃度，以調控靶基因的表達。
13.根據權利要求12的方法，其中，通過細菌氨基酸的合成或降解來改變細胞內氨基酸濃度。
全文摘要
一種依賴細胞內氨基酸濃度來調控連接于表達調控序列下游的靶基因的表達的表達調控序列,其中,在含包括表達調控序列、連接在表達調控序列上游的啟動子和連接在表達調控序列下游的靶基因的DNA構建體的細菌中,通過增加細胞內氨基酸濃度而降低在表達調控序列中的終止頻率、起始于啟動子的轉錄的頻率,以增加靶基因的表達。
文檔編號C12N15/00GK1375556SQ0211855
公開日2002年10月23日 申請日期2002年2月22日 優先權日2001年2月22日
發明者S·V·馬什科, D·V·茲門科夫 申請人:味之素株式會社