無花基因與純營養生長植物株系建立及其建立的技術系統的制作方法

專利名稱：無花基因與純營養生長植物株系建立及其建立的技術系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種可導致種子植物喪失花器官發生與形成能力的基因—無花基因、基因表達盒及其植物表達載體；以此基因所建立的純營養生長植物株系，以及無花基因與純營養植物株系建立的技術系統。
本發明所屬技術領域為植物基因工程；應用技術領域為植物種質創新、林業及綠化系統建立、環境保護、經濟植物栽培。
對于人工栽培的某些種子植物來講，其生殖生長并非完全必要。這是因為1.大量植物并不是靠有性繁殖，而是靠扦插、嫁接和組織培養等技術繁殖。原因是無性繁殖可以保持原有植株的優良特性，生產效率高；2.其生殖生長要消耗大量的營養物質和能量，減緩植物的生長速度；3.某些植物的花(粉)、果(毛)、種子(毛)，為過敏原、污染源，污染環境、危及人們的身體健康、特別是對于環境綠化植物尤為重要。
目前，已知創造植物新性狀的技術途徑有兩條1.物理、化學誘變；2.基因工程技術。物理、化學誘變可以造成遺傳物質染色體的缺失、易位、附加等或基因的突變，導致某些基因正常功能的喪失，引起某些性狀變異。由于控制花發生與形成的基因多之又多、且有多條代償途徑，因此物理、化學誘變很難獲得其他任何形狀都正常，唯獨無花的突變體。植物任何性狀變異都可以在其有性后代中保存或積累，唯沒有性器官的變異不能遺傳、積累，因其不能產生有性后代(周業恒等，1993；鮑時來等，1999)。以基因工程技術可以創造出沒有花粉(雄性不育)(Mariani等，1991；Mariani等，1992)或其他花器官發育不全、發育不成熟的新性狀(Lucia Colombo等，1997；Giuseppe Leonardo Rotino等，1997)，但迄今未見到無花的純營養生長植物株系的報道或專利。
本發明以現代基因重組技術建立的種子植物無花基因，及其在此基礎上建立的純營養生長植物，可以從根本上解決種子植物的花(粉)、果(毛)、種子(毛)問題。建立的純營養生長植物除不會開花之外，還具有速生而優質的新特征。
阻止花的發生與形成可以在分子水平上進行，也可以在細胞水平上進行。在分子水平上阻止花的發育，理論上行得通，但實際上難以實現。因為控制花發育的基因有很多，而且又有多條代償途徑，不可能同時對多種基因進行抑制；抑制了這條途徑，還有一條替代途徑。本項發明是利用一種花發育早期組織細胞特異的細胞致死因子基因在莖端營養分生組織細胞中建立一條所謂的“趨花清除”機制，即該組織中一旦出現趨向于成花方向的細胞，就會被立即清除；出現一個清除一個；出現多少清除多少，一個不留。這種阻止方式不是一種基因或阻止另一種基因，而是一種基因阻止所有具有“趨花”特性的組織或細胞，干凈、徹底、完全，沒有后患。
無花基因的建立依賴兩項關鍵技術的發展1.高度特異性抑制或摧毀靶標細胞、組織--花發育早期階段的細胞、組織--花序分生組織、花分生組織、花原基，而不傷及其他細胞和組織；2)抑制或摧毀靶標細胞、組織的方式、手段或技術類型。目前這兩項關鍵技術都取了突破。
近幾十年來，在研究植物從營養生長如何過渡到生殖生長、營養分生組織如何轉換為花序分生組織的過程中已積累了許多豐富資料，揭示了花器官發生與形成的細胞與分子生物學機制(劉良式等，1998)。
已知，植物體處于地面上的組織器官，包括葉、花、芽等均從營養莖端分生組織發育而來。當植株發育到性成熟并接受到開花信號之后，便啟動開花程序，即一系列與花發育相關的基因開始在部分營養莖端分生組織細胞中程序性表達，并使這些組織細胞發育、特化為花序分生組織，再由花序分生組織分化為花分生組織，繼而發育成花原基、花器官，最終形成花(劉良式等，1998)。
這些基因是在這些特化或將被特化的細胞中主動自行表達的，并控制這些細胞的發育方向，具有嚴格時間、空間特異性，即組織、器官與發育階段、發育時期特異性(見附圖5)。
已發現的與花序分生組織發育相關的基因有TERMINAL FLOWER 1(TFL1)(Alvarez等，1992)等。
與花分生組織發育相關的基因有APETALAI(AP1)(Alejandra等，1992)，LEAFY(LFY)(Huala和Sussex，1992)，Nicotiana FLO/LFY(Nfl)(Kelley等，1995)，FLORICAULA(FLO)(Coen等，1990)，SQUAMOS A(SQU A)(Huijser等，1992；Fishleigh等，1987)等。
與花原基、花器官分化相關的基因(A、B、C類基因)有AP1，APETALA3(AP3)(Bowman等，1989；Jack等，1994)，PISTILLATA(PI)(Hauhgn和Somerville，1988；Bradley等，1994)，DEFICIENS(DEF A)(Sommer等，1990；Pollock和Treisman，1990；Wynme和Treisman，1992)，GLOBSA(GLO)(Trobner等，1992)，Califlower(CAL)(Bowman等，1993)，AGAMOUS(AG)(Yanofsky等，1990；Pruitt等，1987；Bowman等，1988，1989，1991)，PLENA(PLE)(Bradley等，1993)等。
介于花分生組織類別基因與花器官類別基因之間的居間調節基因有FIMBRIATA(FIM)(Simon等，1994)，Unusal floral organs(UFO)(Wilkinson和Haughn，1994)等。
這些與花發育相關的基因表達的組織器官與發育階段、發育時期特異性主要是由其調控這些基因的啟動子所決定的，換句話講，這些基因的啟動子均具有各自基因表達的組織器官與發育階段、發育時期特異性。
這些基因及其啟動子的功能、表達時空特異性、結構與序列的發現為特異性抑制或摧毀靶標細胞、組織—花序分生組織、花分生組織、花原基，阻止花的發育提供了可能。
已發現多種基因，其表達物能夠抑制或破壞正常的細胞信號傳遞、能量或物質代謝，導致細胞的生長、分裂、分化受阻，甚至死亡，如DNA酶、RNA酶、蛋白酶等，其中細胞致死因子則是最有效、徹底的一個手段。來源于解淀粉芽孢桿菌的核糖核酸酶(RNase)基因Barnase(Hartley等，1988)，是一種理想的細胞致死因子基因。眾所周知，生物的中心法則為DNA-RNA-Protein。這一基因在細胞中特異表達，產生的RNase，可以有效降解、破壞細胞中的RNA，導致細胞的自殺、死亡。此外，來源于擬南芥三種RNase基因RNS1、RNS2、RNS3(Bariola等，1994；Taylor等，1993)，也都是理想的細胞致死因子基因。這種細胞致死因子基因為摧毀靶標細胞、組織—花序分生組織、花分生組織、花原基，提供了武器或手段。也使利用基因工程技術構建無花基因得以實現。
以花發育早期階段細胞、組織特異啟動子(TFL1、AP1、LFY、NFL、CAL、AGL等)、細胞抑制或致死因子基因編碼序列及終止子融合成的構建物即為無花基因。無花基因在植物中有效表達，可以有效抑制或催毀花發育早期階段細胞或組織，從源頭阻止了花器官的發生與形成，從而導致植株無花。
本發明提供一種可以導致種子植物喪失生殖器官發生與形成能力的基因-無花基因、以此基因建立的純營養植物株系，以及建立這一基因、植物株系的技術系統。其發明內容包括1.植物無花基因；2.純營養生長植物株系；3.植物無花基因與純營養生長植物株系建立的技術系統。1.植物無花基因1.1關于無花基因的定義無花基因實質上是花發育早期階段細胞或組織特異表達基因啟動子控制的細胞致死因子基因。在此，花發育早期階段細胞、組織、器官，系指花序分生組織，花分生組織，花原基。這種基因在種子植物中特異表達，可以在花發育早期階段阻止花的發生與形成，導致其植株無花，以其作用將其稱為“無花基因”。應該說明，無花基因并非正常概念上的基因，而是一種自然界并不存在，完全由人工重組構建的一種完整的“無花基因”的基因表達盒。
1.2關于無花基因的組成、結構與序列無花基因是由花發育早期細胞、組織、器官特異表達基因的啟動子、細胞致死因子編碼基因與終止子三部分構成。
花發育早期細胞、組織、器官特異表達基因的啟動子包括并不限于已發現的花序分生組織、花分生組織、花原基特異啟動子或居間調節基因啟動子及其衍生序列。本發明優選的兩個啟動子為TFL 1(GenBankAB005235)、AP1(GenBankAC008262)基因的啟動子。
細胞抑制因子基因包括并不限于已發現的細胞抑制因子基因。本發明優選的細胞致死因子基因為Barnase(GenBankX12871)基因的編碼序列。
其終止子包括一個多聯終止密碼子序列，一個mRNA切割序列，和一個mRNA切割后加工序列，一個類似多聚腺苷酸化信號序列及多聚腺苷酸化序列。這些調節和控制序列可以是質粒載體中天然固有的，或在其被轉化到適當的克隆宿主之后，在dNTP及適當的DNA合成酶和DNA連接酶的存在與作用下，利用各種已知的技術加入的。在本發明的實施方案中，我們使用了來源于農桿菌Ti質粒的胭脂堿合成酶基因的Nos-Ter(GenBankAF485783)終止子。
為增加無花基因的表達強度，我們在啟動子與編碼基因序列之間添加了衍生于植物病毒衣殼蛋白質基因編碼區的Ω翻譯增強序列。
根據本發明的一個優選實施方案，無花基因采用了擬南芥TFL 1基因啟動子、BARNASE基因的編碼序列以及NOS-Ter終止子，其結構如附

圖1所示，其序列如SEQ ID NO1。(見附軟盤)另一優選實施方案為擬南芥AP1基因啟動子、BARNASE基因的編碼序列以及NOS-Ter終止子，其結構如附圖2所示，其序列如SEQ ID NO2。(見附軟盤)1.3關于無花基因的功能無花基因的主要功能無花基因在植物中特異表達，可以有效摧毀花序、花分生組織或花原基，阻止花器官的發生與形成，導致植株無花，從而建立起無生殖器官的純營養生長植物株系。
1.4關于無花基因適用的植物種類及范圍適用于所有種子植物，其中主要包括因其無花、無果、無種子而導致的直接或間接產生生態、環境、社會與經濟效益的植物。
1.4.1無花、無果(毛)、無種(毛)污染的環境綠化用植物，如懸鈴木、楊樹、柳樹等1.4.2用材樹種，如楊樹、泡桐等。
1.4.3生態系統用植物，如楊樹、柳樹、泡桐、紫穗槐、沙棘等1.4.4葉用植物，如煙草、桑樹、香椿等。
1.4.5根用植物，如薯類、藕、山藥、地黃、百合等。
1.4.6韌皮纖維用植物，如麻類作物等。
1.4.7次生代謝物用植物，如橡膠、漆、中藥材等。2.無花基因建立的技術系統無花基因的建立包括花發育早期組織器官特異啟動子、細胞抑制因子編碼序列、基因終止序列的克隆。無花基因的啟動子、終止子可以采用PCR或其它技術合成。無花基因的編碼序列，來源于原核生物的可以采用PCR或其它技術合成；來源于真核生物的可以采用RT-PCR或其它技術合成。
可使用本領域已知的方法將合成的無花基因的片段連接到任何一種可在細菌細胞或植物細胞中自我復制的載體上。這樣的載體例如包括衍生于大腸桿菌的質粒載體pUC18、pUC19(Gene 103 1985)，pUC118、pUC119，以及衍生于pUC18的專門用于克隆PCR合成片段的pMD-18T載體。尤其是植物表達載體pBI101、pBI121、pBI131系統(Jefferson，et al.，EMBOJ.16 3901，1987)，pCAMBIA1301、pCAMBIA3301(CAMBIA公司生產)等等。在本發明的一系列優選實施方案中，攜帶上述本發明無花基因的克隆載體是pMD-18T及表達載體pCAMBIA1301、pCAMBIA3301。
2.1關于無花基因組成元件的來源及克隆2.1.1啟動子種子植物花發育早期特異啟動子，可以是天然的，也可以是人工合成的，或者為人工修飾改造的。根據本發明的一個優選實施方案，所說的TFL1、AP1啟動子序列是以PCR方法從擬南芥基因組中克隆、合成的。然后將克隆片段插入到pMD-18T載體中測序，以確認PCR序列的可靠性。
實施例一 TFL1基因啟動子的克隆TFL1啟動子設計長度為翻譯起始密碼子ATG之前至5’端1.3kb，其5’端酶切位點為XbaI，3’端酶切位點為BamHI，PCR合成引物為TFL1 F1 5′-GGCTCTATCACTCTAGTTCCC-3′
TFL1 F2 5′-GGATCCTTTCTTTTGTTAACTTAGAGG-3′TFL1 R2 5′-TCTAGACCAAATCTGCGATATGTTTC-3′模板制備以擬南芥幼嫩葉片為材料，采用CTAB法制備。TFL1啟動子的PCR合成反應系統及擴增程序如下TFL1(巢式PCR)第一次PCR反應體系擴增程序buffer 5μL94℃1min TFL R2 0.5μL 72℃10min模板1μL 4℃ 30min水 34.5μL------------------------50μL第二次PCR反應體系擴增程序buffer 5μL 94℃1min TFL R2 0.5μL72℃10min模板1μL 4℃ 30min水 34.5μL-----------------------50μL實施例二AP1基因啟動子的克隆AP1啟動子設計長度為翻譯起始密碼子ATG之前至5’端1.9kb，其5’端酶切位點為XbaI，3’端酶切位點為BamHI，PCR合成引物為AP1 F0 5′-AGATGTAACAAAGGCGAAGA-3′AP1 R0 5′-TAGGGTTCACTTCACTACGG-3’AP1 F1 5′-GGTCTAGAAGGCCACGAGCTTAGATTCTTT-3
AP1 R15′-GGGGATCCATTTTTGATCCTTTTTTAAGAAACTTCTTACTC-3′模板制備以擬南芥幼嫩葉片為材料，采用CTAB法制備。AP1啟動子的PCR合成反應系統及擴增程序如下AP1(巢式PCR)第一次PCR反應體系擴增程序buffer 5μL 94℃1min AP1 R0 0.5μL72℃10min模板 1μL 4℃ 30min水 34.5μL-----------------------50μL第二次PCR反應體系擴增程序buffer5μL 94℃1min AP1 R10.5μL 72℃10min模板 1μL 4℃ 30min水34.5μL----------------------50μL2.1.2編碼序列無花基因的編碼序列，即細胞生長、分裂、分化抑制因子，可以是天然的，如來源于擬南芥的三種RNase基因RNS1、RNS2、RNS3；來源于微生物的解淀粉芽孢桿菌的Barnas基因；也可以是人工合成的。根據本發明的一個優選實施方案，所說的Barnase基因的編碼序列是以PCR方法合成的。將PCR產物克隆于pMD-18T載體中，測序。
實施例三BN基因編碼序列的克隆
BN編碼序列設計長度為333bp，其5’端酶切位點為BamHI、NcoI，3’端酶切位點為SacI，PCR合成引物為BN F 5′-GGGGATCCATGGCACAGGTTATCAACACG-3′BN R 5′-GGGAGCTCTTATCTGATTTTTGTAAAGGT-3′模板制備吸取培養過夜的菌液4μL，加6μL水，99℃10min作模板。BN基因編碼序列的PCR合成反應系統及擴增程序如下模板從培養的解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)平皿中挑一個菌落，37℃液體培養過夜→4μL菌液+6μL水→99℃10min作模板反應體系 PCR程序模板 10μL94℃1min Buffer 5μL 72℃10mindNTP 4μL 4℃ 30mn水 29.75μL------------------50μL2.1.3終止子可以來源于植物，也可以來源于某些植物的病原菌，如根瘤農桿菌Ti質粒胭脂堿(Nopaline)基因終止子NOS-ter。根據本發明的一個優選實施方案，無花基因的終止子采用NOS-ter，系來自早前已存在于表達載體pBI121之中的GUS基因的NOS-ter。
2.1.4無花基因表達盒的構建無花基因表達盒的構建實質上是以事前設計好的程序，依次將其啟動子、編碼序列、終止子插入到克隆載體的相應位點。根據本發明的一個優選實施方案，首先將NOS-ter終止子用EcoRI、SacI酶切出，插入到pUC119質粒的相應位點(A)；再以XbaI、BamHI酶將存在于pMD-18T中的AP1啟動子切出，插入到A中相應位點(B)；最后，以SacI酶切存在于pMD-18T中的Bamase序列，補平，再以BamHI將Bamase的編碼序列切出，插入到B中的BamHI與SmaI位點之間。
2.2無花基因表達載體的建立為了正確地選擇和鑒定被轉化的植物細胞，本發明的上述重組的融合表達載體還進一步含有可選擇標記和報告基因。所使用的選擇標記和報告基因的兩側可帶有各自的調節序列，以促使它們在植物中的表達。適用的選擇標記和報告基因是本領域內已知的。編碼選擇標記的外源基因及其他基因可以包含于同一個表達載體中。本發明優選表達載體為pCAMBIA1301。該載體帶有根瘤農桿菌Ti質粒的T-DNA的左、右邊界LB、RB，使之可以以農桿菌介導方法轉化植物。該表達載體在植物中的選擇標記是潮霉素抗性基因(Hygromycin phosphotransferase)，報告基因為葡萄糖苷酶基因(GUS)，并且含有LacZ藍白斑篩選標記及用于插入目的基因的多克隆位點(MCS)，以便于無花基因的插入。
根據本發明的一個優選實施方案，無花基因表達載體的建立，是以XbaI、EcoRI酶將無花基因表達盒從pUC119中切出，插入到pCAMBIA1301的相應位點。(見附圖2、4)3.純營養生長植物株系建立程序以無花基因轉化建立純營養生長植物株系適用于所有的種子植物。純營養生長植物株系的建立實質上是通過基因轉化，將植物無花基因轉入種子植物體內，并有效表達而實現的。
3.1無花基因的轉化方法將攜帶外源基因的重組載體導入宿主植物或其細胞內的許多方法都是本領域技術人員熟知的。這些方法包括但并不限于1.使用農桿菌(Agrobacterium)作為植物病原體所介導的農桿菌轉化法(Agrobacterium Mediated transformation)、2.物理法，如基因槍法(Particle Bombardment & particle gun & Gene gun)、電擊融合法(Electroporation)、顯微注射法(Microinjection)、超聲波法(Ultrasonic waves)、激光微束法(Laser microwave)、碳化硅纖維介導法(Silicon carbide fiber)、電泳法(Electrophoreti)等。3.化學法，如PEG介導的轉化法、脂質體介導轉化法等。4.種質系統轉化法，如花粉介導法、花粉管通道法、子房注射法、浸泡法。5.以花椰菜花葉病毒(CaMV)、雙生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒載體所介導的轉化法。本發明的一個優選實施方案采用農桿菌介導轉化法。
這里應該特別指出的是，雖然在本發明下述實施例中以轉基因煙草的產生舉例進一步詳細描述了本發明，但這絕不意味著本發明制備的無花基因的DNA序列及攜帶該DNA序列的重組融合載體只用于轉化和生產不開花的轉基因煙草。
因此，使用具有本發明所描述的特征的無花基因表達載體，以本領域技術人員已知的任何一種方法導入任何植物或其組織或細胞中，以及由此而獲得的純營養生長植物株系，均包括在本發明之內。
給出以下實施例的目的是舉例詳細描述本發明，而不構成對本發明待批權利范圍的限制。在本發明技術特征和待批權利要求范圍內，本領域技術人員可以對本發明作出某些等同的改動和顯而易見的改進。
農桿菌介導轉化無花基因實例3.1.1 LBA4404感受態細胞的制備挑取LBA4404單菌落接種于5ml YEB(含利福平100μg/ml，鏈霉素25μg/ml)中，28℃，250rpm培養過夜。吸取2ml菌落加入50ml YEB培養基中，繼續培養至OD值約為0.6。將菌液轉至無菌離心管中，冰浴30分鐘，5000rpm離心5分鐘，用2ml 20mM的重懸菌體，按每管200μl分裝于無菌小離心管中。
3.1.2重組質粒轉入LBA4404細胞在200μL LBA4404感受態細胞中分別加入2μg重組質粒pCAMBIA1301 DNA，置冰浴5分鐘，然后轉至液氮中冷凍8分鐘，迅速于37℃水浴中溫育5分鐘后，加入800μL YEB培養基，28℃ 250rpm預表達培養4-5小時，然后涂鋪于含有卡那霉素的YEB固體平板，28℃培養24-48小時。則長出的農桿菌菌落帶有相應的轉化質粒。
3.1.3煙草的轉化(1)農桿菌的準備28℃過夜分別培養帶有植物表達載體的農桿菌50ml，5000rpm離心5分鐘，收集菌體沉淀，用液體MS培養液洗滌一次，再用MS重懸至OD600＝0.2-0.4。
(2)浸染取煙草無菌苗葉片，用刀切成邊長約0.5厘米小方塊，在農桿菌懸液中浸泡5-10分鐘，然后用滅菌濾紙吸干。
(3)共培養將葉塊擺放在不加抗生素的共培養培養基中(上面墊二層濾紙)于25％避光共培養3天。
(4)選擇培養將葉片繼代到選擇培養基中在光照培養箱中(光照12小時，黑暗12小時)培養至抗性芽的出現。
(5)抗性小苗的獲得將愈傷移至生根培養基，每隔二周繼代培養一次，最后種植到培養缽。
3.2轉基因植物株系的鑒定方法轉基因植物株系的鑒定方法可以分為分子水平、組織化學水平及植株生物學特性鑒定三個水平。
3.2.1分子水平鑒定A PCR鑒定取1-3克煙草鮮葉片，加等量的用液氮研磨，將粉末置于50ml離心管中，加入20mlDNA提取緩沖液(100mM Tris.HCl pH8.0 500mM NaCl，10mM β-巰基乙醇，50mM pH8.0)，劇烈振蕩1分鐘，加入4ml 10％SDS，輕輕混勻，于65℃加熱10-20分鐘，至顏色翠綠，加入冰冷5M KAC 4ml，冰上放置30分鐘，然后在4℃，12000rpm離心15分鐘，吸上清，用0.6倍異丙醇沉淀后，用處理，純化備用。
以轉基因煙草的基因組DNA為模板，分別用無花基因的特異性引物進行如下PCR反應在0.2ml的Eppendorf管中加入H2O 30.5μL10×PCR buffer 5.0μLMgCl2(25mM) 3.0μL4×dNTP(各2.5mM) 5.0μLPrimer1(20pmol/μL)5.0μLPrimer2(20pmol/μL)2.5μL煙草DNA1.0μL
Taq酶(3U/μL) 0.5μL----------------------------------------------50μL反應程序為94℃ 3分鐘94℃ 30秒，46℃ 30秒，72℃ 60秒，30個循環72℃ 5分鐘所用無花基因TFL1-BN-NOS.Ter引物為(20pmol/μL)F5’-GTC TCC CAA ATC ACT ACA A-3’R5’-CAT ATA ATT TCT GTT GAA-3’PCR擴增出478bp片段的為陽性克隆。
所用無花基因AP1-BN-NOS.Ter引物為(20pmol/μL)F5’-CGC AAA TCC TAA AGA AAC-3’R5’-GAT AAT CAT CGC AAG ACC-3’PCR擴增出699bp片段的為陽性克隆。
B PCR產物的Southern分析進一步進行PCR的Southern分析，a將植物DNA的PCR產物通過0.8％瓊脂糖凝膠進行電泳并照相。
b將膠置于小盤中加入200ml變性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)振蕩45分鐘。
c棄去變性液，用蒸餾水漂洗數次，加入中和液(1M Tris，pH7.4，1.5M NaCl)200ml，振蕩30分鐘，然后更換新的中和液，繼續中和15分鐘。
d剪相應大小的硝酸纖維素膜(NC膜)，于蒸餾水中均勻濕透后，將NC膜浸于10×SSC(20×SSC每1000ml含有NaCl 175.3g，檸檬酸鈉88.2g pH7.0)中，放置20分鐘。
e使用Bio-Rad公司的轉膜儀轉膜1小時。
f去掉膠塊，標記好加樣孔位置，用6×SSC洗膜5分鐘，然后紫外照射5分鐘，以固定DNA。2×SSC洗膜，室溫風干。
g將NC膜卷入雜交瓶中，加入20ml預雜交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％SDS，200μg/ml魚精DNA)，使膜均勻浸潤無氣泡，然后置于分子雜交儀中68℃預雜交過夜。
h探針的標記采用公司隨機引物試劑盒標記。取適量待標記片段，變性2分鐘迅速置于冰上，在一新的Eppendorf管中，依次加入5×labling buffer 10μLdCTP、dGTP、dTTP混合物2μL變性模板 25μLBSA 2μLα-32P-Datp 5μL酶1μL加H2O至總體積 50μL輕輕混勻，室溫反應60分鐘。95％變性2分鐘置于冰上。加入2μL 0.5MEDTA。
i向預雜交完畢的袋中加入變性探針30-50μL，重新封好繼續于68℃雜交8-10小時。
j取出雜交膜用2×SSC，0.5％SDS洗膜30分鐘，用2×SSC，0.1％SDS洗15分鐘，再用0.1×SSC，0.5％SDS于42℃洗膜30分鐘-數小時，中間更換新的洗膜液。
k 0.1×SSC洗膜2分鐘，用吸水紙吸去水珠，用保鮮膜包好膜，暗室中壓片。
1-70℃自顯影3-6小時后洗片。
3.2.2組織化學鑒定轉基因煙草的GUS分析取轉基因煙草的葉片，切幾個小塊(0.5mm2)，放到1.5mlEppendorf管中并加入15μL GUS底物，于37℃處理過夜。然后用95％乙醇脫色2小時，70％乙醇繼續脫色數次，每次1小時以上。觀察是否出現藍色反應。結果證明，大部分轉基因植株呈現的GUS陽性反應。
3.2.3轉基因植株開花特性的鑒定A將經過分子、組織化學鑒定的轉基因植株與對照材料同時植于溫室，以觀察其開花習性。
B對于栽植后多年才能開花的植物，將經過選擇、Southern分子雜交鑒定的轉化株系直接嫁接于成年樹上，并設對照，以最終確定其開花及其它生物學特性。一般1-2年時間，即可鑒定出轉化植株是否為真正的無花株系。
3.3可以建立無花種子植物的種類所有的種子植物都可以建立其純營養生長株系，其種類同1.4。4.以無花基因建立的純營養生長株系的特性4.1無花(粉)、無果(毛)、無種子(毛)，可以完全避免其對環境的污染及對人們身體健康的危害。
4.2速生、生產效率高這一特征包括兩個層次。其一，可以提高總生物量因其生殖生長被抑制，使其營養生長更旺盛，枝繁葉茂，可以產生更多的物質和能量，提高了其總生物量；其二，純營養生長植株的營養生長量等于其總生物量因其生殖生長被抑制，使得節約下來的原本應該用于生殖生長的營養物質和能量，用于營養生長，其營養生長量等于其總生物量。
4.3優質營養體的速生與優質在純營養生長植物株系中得以兼顧。這種速生而優質是建立在犧牲生殖器官而不是犧牲質量為前提的、建立在原有優質基礎上的速生。
4.4只能靠無性繁殖因建立的無花株系，無花，無果，無種子，不能進行有性生殖，種群的擴大只能靠扦插、埋根、嫁接、組織培養等無性繁殖。
4.5安全建立的無花株系因無生殖系統，既不會發生基因的漂移，也不會發生基因擴散。
4.6上述5種特性是一種新的種質，可以在其個體及其克隆世代中一直保持下去。
總之，本發明涉及一種可導致種子植物喪失花器官發生與形成能力的基因--無花基因，包含所說無花基因的基因表達盒及其植物表達載體，被所說的表達載體轉化的植物細胞、植株--純營養生長株系及其克隆系、衍生系，無花基因和純營養植物株系建立的技術系統。以此基因建立的純營養植物株系具有無花、速生而優質、安全的特性，但其繁殖只能通過克隆的方式進行。
序列表SEQ ID NO1的信息(i)序列特征A)長度1935堿基對B)類型核苷酸C)鏈型雙鏈D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(iii)結構TFL1啟動子-Barnase-Nos.terA)啟動子TFL1基因啟動子7-1316 5’端XbaI 3’端BamHI、NcoI。
B)編碼序列Barnase基因編碼序列1323-1658 5’端BamHI、NcoI 3’端SacI。
ATG 1323-1325 TAA 1656-1658C)終止子Nos.ter1665-1929 5’端SacI 3’端EcoRI(iv)其它信息種子植物無花基因1(花序分生組織特異表達核糖核酸酶基因)表達盒(v)序列描述SEQ ID NO11 TCTAGACCAA ATCTGCGATA TGTTTCTTTC AAATAGCCTC TGAGCTAGGC51 CTGGGCATTC AGTTTCGGTT CGGTTGCGCA TGGTTTCGGT TATTTCGGTT101 ATAGTAATAT AAGAACCATT TGGATATTTG AGGAATTTTG GTTCGGTTCG151 GTTCGGATAT CTTTCGGTTC GGTTCGGTTT GGATATTAAA CTTGGTAACC201 ATAAATAAAC TAAAACCGAA ATAACCGACT AAAAACCGAA ACAACCAAAA251 AATTTGACCA ATAACCGATA TAGAACGTAC GTAAAAAAGA GAAATATTCA301 CAACTCACAA AGATGGTCCA TACTCTCCAT AATATTAAAA CACCTGATTC351 ACAACTCACG AAATTCAACT TGCAAACTAA TAAAGAGAAA AACATAGTTA401 AGTGTCAATA CATACTGTGA TATATTATCT ATCATACATA TATGCTTTGG451 TTTTCATTTG GTTATCGGTT ATTAACCTAA CCGAAACCGA AACCGAAATC501 TAAGACATAT AATATTCAAC CGGTTATTTT AAGCTATCCA AACCTGAACC551 GAACCATGTT TTTCGGTTCG ATTCGGTTCG GTTAATCGGT TAGCGGTTTT601 TTTGCCCAGG CCTACTCTGA GCAATAATTG TATCCGGAGT TGTAATAGAA651 TCAAAGTACG ATGAGAGTGT TTTTATGACA AATATCTTAA TCTTGGCCAA701 TTATATGTTC TACTGAAATT CTTTTTGAAT TCATCGACCA GTGAGACTTA751 AAAATAGCTT TTTATTCGCC GAGGTATATA TAGCTAGGAA TTTTGTCGAA801 ATTTAGACGT TAGTGGGTTT TGTTCTTCGT GACACAAAAG ATATTCTATA851 TATTAACGAA ATCTAGCGAT CGATATGGTA TTTATATAAA GTCTTGGTCA901 TAGATAGGGG TTGAAACTTG AAACCATGCA TGATATGCCA ATGTTGCTGA951 AGCAGTCAAT GTTGCTGAAG AAGTCAAACG TAATTATATA GTGAATACCA1001 AAAAAGTGAT ATTTCTTAAT TCAATTAAAT ATAATTATAG TTTTAAATCA1051 CCTAAAATAA GTTACTTATT AAAACCCCCC AAATTTACTT TAATATAGTT1101 GGTGTACATG TTTGAGAAAG CAAACAAAAA GAAAAAGAAA AAGAAAAAAA1151 AAAGAGAAAG AGGTTAGTAC ACATAATTGG GAATTAATGT CTATTGATTC1201 TTTTATCTTT CTCTCTCTCT CTAAGACGGA AAACCCCTAT AAATAGATGT1251 CTCGGTCGTC TCTTTGTCTC CCAAATCACT ACAAATCTCT CTTTTCCTCT1301 AAGTTAACAA AAGAAAGGAT CCATGGCACA GGTTATCAAC ACGTTTGACG1351 GGGTTGCGGA TTATCTTCAG ACATATCATA AGCTACCTGA TAATTACATT1401 ACAAAATCAG AAGCACAAGC CCTCGGCTGG GTGGCATCAA AAGGGAACCT1451 TGCAGACGTC GCTCCGGGGA AAAGCATCGG CGGAGACATC TTCTCAAACA1501 GGGAAGGCAA ACTCCCGGGC AAAAGCGGAC GAACATGGCG TGAAGCGGAT1551 ATTAACTATA CATCAGGCTT CAGAAATTCA GACCGGATTC TTTACTCAAG1601 CGACTGGCTG ATTTACAAAA CAACGGACCA TTATCAGACC TTTACAAAAA1651 TCAGATAAGA GCTCGAATTT CCCCGATCGT TCAAACATTT GGCAATAAAG1701 TTTCTTAAGA TTGAATCCTG TTGCCGGTCT TGCGATGATT ATCATATAAT1751 TTCTGTTGAA TTACGTTAAG CATGTAATAA TTAACATGTA ATGCATGACG1801 TTATTTATGA GATGGGTTTT TATGATTAGA GTCCCGCAAT TATACATTTA1851 ATACGCGATA GAAAACAAAA TATAGCGCGC AAACTAGGAT AAATTATCGC1901 GCGCGGTGTC ATCTATGTTA CTAGATCGGG AATTC//SEQ ID NO2的信息(i)序列特征A)長度2542堿基對B)類型核苷酸C)鏈型雙鏈D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(iii)結構AP1啟動子-Barnase-Nos.terA)啟動子AP1基因啟動子7-1923 5’端XbaI 3’端BamHI、NcoI。
B)編碼序列Barnase基因編碼序列1930-2265 5’端BamHI、NcoI 3’端SacI。
ATG 1930-1932 TAA 2263-2265C)終止子Nos.ter 2272-25362272-2536 5’端SacI 3’端EcoRI(iV)其它信息種子植物無花基因2(花分生組織特異表達核糖核酸酶基因)表達盒。(v)序列描述SEQ ID NO21 TCTAGAAGGC CACGAGCTTA GATTCTTTTA GTTTTGCTCA ATTTGTTAAG51 TTTCTACTTT TCCTTTTGTT GCTTACTACT TTTGCTCATG ATCTCCATAT101 ACATATCATA CATATATATA GTATACTATC TTTAGACTGA TTTCTCTATA151 CACTATCTTT TAACTTATGT ATCGTTTCAA AACTCAGGAC GTACATGTTT201 AAATTTGGTT ATATAACCAC GACCATTTCA AGTATATATG TCATACCATA251 CCAGATTTAA TATAACTTCT ATGAAGAAAA TACRTAAAGT TGGATTAAAA301 TGCAAGTGAC ATCTTTTTAG CATAGGTTCA TTTGGCATAG AAGAAATATA351 TAACTAAAAA TGAACTTTAA CTTAAATAGA TTTTACTATA TTACRATTTT401 TTCTTTTTAC ATGGTCTAAT TTATTTTTCT AAAATTAGTA TAATTGTTGT451 TTTGATGAAA CAATAATACC GTAAGCAATA GTTGCTAAAA GATGTCCAAA501 TATTTATAAA TTACAAAGTA AATCAAATAA GGAAGAAGAC ACGTGGAAAA551 CACCAAATAA GAGAAGAAAT GGAAAAAACA GAAAGAAATT TTTTAACAAG601 AAAAATCAAT TAGTCCTCAA ACCTGAGATA TTTAAAGTAA TCAACTAAAA651 CAGGAACACT TGACTAACAA AGAAATTTGA AACGTGGTCC AACTTTCACT701 TAATTATATT GTTTTCTCTA AGGCTTATGC AATATATGCC TTAAGCAAAT751 GCCGAATCTG TTTTTTTTTT TTTTTGTTAT TGGATATTGA CTGAAAATAA801 GGGGTTTTTT CACACTTGAA GATCTCAAAA GAGAAAACTA TTACAACGGA851 AATTCATTGT AAAAGAAGTG ATTAAGCAAA TTGAGCAAAG GTTTTTATGT901 GGTTTATTTC ATTATATGAT TGACATCAAA TTGTATATAT ATGGTTGTTT951 TATTTAACAA TATATATGGA TATAACGTAC AAACTAAATA TGTTTGATTG1001 ACGAAAAAAA ATATATGTAT GTTTGATTAA CAACATAGCA CATATTCAAC1051 TGATTTTTGT CCTGATCATC TACAACTTAA TAAGAACACA CAACATTGAA1101 CAAATCTTTG ACAAAATACT ATTTTTGGGT TTGAAATTTT GAATACTTAC1151 AATTATTCTT CTCGATCTTC CTCTCTTTCC TTAAATCCTG CGTACAAATC1201 CGTCGACGCA ATACATTACA CAGTTGTCAA TTGGTTCTCA GCTCTACCAA1251 AAACATCTAT TGCCAAAAGA AAGGTCTATT TGTACTTCAC TGTTACRGCT1301 GAGAACATTA AATATAATAA GCAAATTTGA TAAAACAAAG GGTTCTCACC1351 TTATTCCAAA AGAATAGTGT AAAATAGGGT AATAGAGAAA TGTTAATAAA1401 AGGAAATTAA AAATAGATAT TTTGGTTGGT TCAGATTTTG TTTCGTAGAT1451 CTACAGGGAA ATCTCCGCCG TCAATGCAAA GCGAAGGTGA CACTTGGGGA1501 AGGACCAGTG GTCCGTACAA TGTTACTTAC CCATTTCTCT TCACGAGACG1551 TCGATAATCA AATTGTTTAT TTTCATATTT TTAAGTCCGC AGTTTTATTA1601 AAAAATCATG GACCCGACAT TAGTACGAGA TATACCAATG AGAAGTCGAC1651 ACGCAAATCC TAAAGAAACC ACTGTGGTTT TTGCAAACAA GAGAAACCAG1701 CTTTAGCTTT TCCCTAAAAC CACTCTTACC CAAATCTCTC CATAAATAAA1751 GATCCCGAGA CTCAAACACA AGTCTTTTTA TAAAGGAAAG AAAGAAAAAC1801 TTTCCTAATT GGTTCATACC AAAGTCTGAG CTCTTCTTTA TATCTCTCTT1851 GTAGTTTCTT ATTGGGGGTC TTTGTTTTGT TTGGTTCTTT TAGAGTAAGA1901 AGTTTCTTAA AAAAGGATCA AAAGGATCCA TGGCACAGGT TATCAACACG1951 TTTGACGGGG TTGCGGATTA TCTTCAGACA TATCATAAGC TACCTGATAA2001 TTACATTACA AAATCAGAAG CACAAGCCCT CGGCTGGGTG GCATCAAAAG2051 GGAACCTTGC AGACGTCGCT CCGGGGAAAA GCATCGGCGG AGACATCTTC2101 TCAAACAGGG AAGGCAAACT CCCGGGCAAA AGCGGACGAA CATGGCGTGA2151 AGCGGATATT AACTATACAT CAGGCTTCAG AAATTCAGAC CGGATTCTTT2201 ACTCAAGCGA CTGGCTGATT TACAAAACAA CGGACCATTA TCAGACCTTT2251 ACAAAAATCA GATAAGAGCT CGAATTTCCC CGATCGTTCA AACATTTGGC2301 AATAAAGTTT CTTAAGATTG AATCCTGTTG CCGGTCTTGC GATGATTATC2351 ATATAATTTC TGTTGAATTA CGTTAAGCAT GTAATAATTA ACATGTAATG2401 CATGACGTTA TTTATGAGAT GGGTTTTTAT GATTAGAGTC CCGCAATTAT2451 ACATTTAATA CGCGATAGAA AACAAAATAT AGCGCGCAAA CTAGGATAAA2501 TTATCGCGCG CGGTGTCATC TATGTTACTA GATCGGGAAT TC附圖的簡要說明圖1以TFL1基因啟動子為啟動子的無花基因(表達盒)示意2以TFL1基因啟動子為啟動子的無花基因表達載體結構示意3以AP1基因啟動子為啟動子的無花基因(表達盒)示意4以AP1基因啟動子為啟動子的無花基因表達載體結構示意5莖端分生組織發育、調節關系示意圖說明1.符號說明|-|表示相互抑制作用→表示激活作用2.英文縮寫說明TFL1Terminal flower 1基因AP1Apetala 1基因AP2Apetala 2基因LFYLeafy基因CALCauliflower基因VMVegetative meristm營養分生組織IMInflorescence meristm 花序分生組織FMFloral meristm花分生組織
權利要求
1.一類基于花發育早期組織細胞特異表達啟動子與細胞致死因子基因重組的、可以導致種子植物喪失花器官發生與形成能力的基因--植物無花基因及其基因的表達盒(TFL1-BN-Nos.Ter、AP1-BN-Nos.Ter等基因)，如SEQ ID NO1、2所示的核苷酸序列及其克隆系或功能等同序列。
2.根據權利要求1無花基因的基因表達盒，如SEQ ID NO1、2，其特征為該基因表達盒由下列元件組成2.1花發育早期組織細胞特異表達啟動子；2.2細胞抑制或致死因子編碼序列；2.3終止子。
3.根據權利要求1、2所述的無花基因的表達盒，其中啟動子如TFL1、AP1，其特征為花發育早期組織細胞特異表達基因的啟動子，包括但并不限于花序分生組織、花分生組織、花原基特異表達及其居間調節基因的啟動子，及其功能等同的啟動子。
4.根據權利要求1、2所述的無花基因表達盒，其中編碼序列，如解淀粉芽孢桿菌的核糖核酸酶基因Barnase，或者功能等同的基因或序列，其特征為該序列的表達物是一種細胞抑制或致死因子。
5.根據權利要求1、2所述的無花基因表達盒，其中終止子如花椰菜花葉病毒Nopaline(Nos)基因的終止子，包括一個或多聯終止子序列，一個融合基因轉錄產物的切割序列和一個融合基因轉錄產物的加工序列，一個類似多聚腺苷酸化信號序列，和一個多聚腺苷酸化序列所組成或功能等同的序列。
6.無花基因的植物表達載體，該載體的組成和結構特征為該載體適合于在植物細胞或整株植物中表達，含有權利要求1、2所述的無花基因的表達盒，具有如權利要求1～5之一所描述的特征。
7.以任何一種方法用攜帶根據權利要求1、2所述的無花基因的植物達載體轉化的植物細胞，并由此獲得具有純營養生長的植物株系及其克隆系、衍生系，包括任何部分的植物組織或器官。
8.根據權利要求1～7所述，以無花基因創造的無花(粉)、果(毛)、種(毛)污染的環保綠化用植物，其中包括但不限于懸鈴木、杉木、楊樹、柳樹。
9.根據權利要求1～7所述，以無花基因創造的速生(高產)而質地優良的莖用、根用、葉用、次生代謝物生產用及生態保護用植物。
10.根據權利要求1～9所述，以無花基因創造的無花、速生而優質的純營養生長植物及其克隆系，包括但不限于扦插、埋根、嫁接或組織培養方式繁殖的材料。
11.根據權利要求1、2所述，以無花基因建立純營養生長植物株系的方法。
全文摘要
本發明提供一類基于花發育早期組織細胞特異表達的啟動子與細胞致死因子基因重組的、可以導致種子植物喪失花器官發生與形成能力的基因——植物無花基因(見附圖1、2)、以此基因建立的純營養生長植物株系及其建立的技術系統。這一純營養生長植物株系因其無花、果、種子，避免了其對環境的污染及人身健康的危害；而節省下來的物質和能量可以用于營養器官的生長，導致其在保持原有質量上的速生，生產出更多優質的根、莖、葉產品。建立的純營養生長植物株系可用于生態林、用材林、環境綠化系統的建立以及莖用、葉用、根用、次生代謝物用植物產品的生產。
文檔編號C12N15/63GK1459504SQ0211787
公開日2003年12月3日 申請日期2002年5月24日 優先權日2002年5月24日
發明者陳占寬, 馮欣怡, 嚴海燕, 馮長訪, 郅玉寶, 易明林, 陳凈植, 郝建平, 宋蓮芬 申請人:陳占寬