新的特異性切割存活素的核酶及其藥物組合物和應用的制作方法

專利名稱：新的特異性切割存活素的核酶及其藥物組合物和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域，具體地說，本發明涉及新的專一性的抗存活素核酶、含有該核酶的藥物組合物及其在抗腫瘤基因治療領域中的應用。
背景技術：
多細胞生命體的結構和功能的完整性的有效維持是通過對細胞的增殖以及細胞凋亡兩個相關過程中的精細平衡來獲得。細胞增殖亢起與凋亡銳減的最終后果是相同的，即腫瘤的形成。細胞凋亡這一復雜的生物學過程受到多個環節，涉及到正或負的效應因子的控制。存活素(Survivin，NCBI Database，登錄號NO.BC008718)就是新進發現一個細胞凋亡的拮抗性蛋白質[1]，它在細胞周期的G2期和M期含量最高，并與參與細胞分裂的細胞骨架系統直接結合[2，3]。鑒于該存活素的啟動子的活性在G2期遠較在G1期為高，這一蛋白的細胞周期性表達似乎主要是在轉錄水平上受控。
大量依據表明存活素的表達在腫瘤細胞中異常升高，這與腫瘤細胞的凋亡速率極低呈正相關[1，9]。用反義RNA[2]或用顯性負調存活素[6，8]，強制性抑制存活素的表達，可引起腫瘤細胞的凋亡和瘤體消退。
一種很有前景的可下調RNA水平的方法涉及到特異性切割目標蛋白的mRNA的核酶。核酶是具有順序特異性切割RNA分子的能力的核糖核酸酶[5]。核糖核酸(RNA)是它的唯一成分。由于它是一個酶，因此與反義RNA相比，它抑制基因表達的效率更為高。錘頭型(Hammerhead)的核酶是最小的一種核酶，它僅含有37個核苷酸的單鏈，從而也是最廣泛應用的核酶[4，5]。
鑒于錘頭型核酶的上述特征，本領域中迫切需要有特異性切割存活素RNA的核酶。

發明內容
本發明的一個目的是提供對存活素有專一性核酶活性的錘頭型核酶(下簡稱核酶)。
本發明的另一個目的是用本發明核酶來加速存活素表達過度的腫瘤細胞的凋亡。
本發明還有一個目的是用本發明的核酶或其重組表達載體來制備治療與存活素過度表達相關的疾病的藥物。
本發明還有一個目的是提供一種含有本發明核酶的藥物組合物。
本發明還有一個目的是利用本發明所發現的存活素RNA編碼區中的特定位點來設計能特異性切割存活素RNA的核酶。
本發明一方面涉及一種分離的多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼特異性切割存活素RNA的錘頭型核酶，該核酶具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。
本發明另一方面涉及一種重組表達載體，該載體含有一種或多種上述多核苷酸序列的腺病毒及腺病毒相關病毒表達質粒或逆轉錄病毒表達質粒。
在一個較佳的實施方案中，所述載體是含有一種或多種上述多核苷酸序列的腺病毒或逆轉錄病毒表達質粒。
本發明另一方面涉及一種促進存活素表達過度的細胞的凋亡的方法，該方法包括將上述重組表達載體導入所述存活素表達過度的細胞。
在一個較佳的實施方案中，所述重組表達載體是通過腺病毒、腺病毒相關病毒或逆轉錄病毒介導來導入所述細胞的。
在另一較佳的實施方案中，所述存活素表達過度的細胞是腫瘤細胞，更佳的是，所述存活素表達過度的細胞是肝癌細胞。
本發明另一方面涉及一種藥物組合物，它包含特異性切割存活素編碼區61、83、232、294或358位點的核酶或含有該核酶的重組表達載體以及藥學上可接受的載體。
在一個較佳的實施方案中，所述特異性切割存活素編碼區61、83、232、294或358位點的核酶是錘頭型核酶，它具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。
本發明還有一方面涉及上述多核苷酸序列或重組表達載體在制備治療與存活素過度表達相關的疾病的藥物中的應用。
在一個較佳的實施方案中，所述與存活素過度表達相關的疾病是癌癥。
本發明還有一個方面涉及存活素mRNA編碼區61、83、232、294或358位點的應用，所述位點可用來設計或篩選特異性切割存活素RNA的核酶。
本發明提供了對存活素mRNA不同位點有專一性核酶活性的錘頭型的核酶。這些核酶通過逆轉錄病毒或腺病毒載體運載入受體細胞內表達后，致使存活素的表達在RNA、蛋白質水平上降低，從而使細胞的凋亡過程去抑制而引起細胞死亡。
本發明的其它目的和優點將在下文的詳細描述中有進一步揭示。
附圖簡述

圖1顯示了腫瘤細胞和腫瘤組織樣本中存活素表達水平的RT-PCR結果。
圖2顯示了預測的存活素mRNA的二級結構，其中箭頭表示候選的核酶酶切位點。
圖3是用來構建核酶表達質粒的pGVal以及回文區(loop)中插入了核酶序列的pGVal-Rz的示意圖。
圖4顯示了用于進行體外實驗的存活素表達質粒pcDNA-HA-存活素以及加入了檢測標記螢光素酶片段的表達質粒pcDNA-HA-存活素-螢光素酶的示意圖。
圖5顯示了本發明中采用的5種針對存活素RNA的核酶的序列，其中箭頭表示切點位置。
圖6顯示了用引物延伸法檢測活性的結果和切割位點。其中，圖6A是引物和預計的切割位點的示意圖；圖6B是引物延伸實驗的結果，箭頭表示存活素RNA經核酶切割產生的片段。
圖7A顯示了核酶體外切割活性實驗中螢光素酶活性檢測的結果。
圖7B顯示了核酶切割產物經體外翻譯后的Western印跡結果。
圖8是含有核酶序列Rz的逆轉錄病毒表達質粒的示意圖。
圖9顯示了逆轉錄病毒介導的核酶導入的實驗結果。其中圖9A是RT-PCR結果，以β-肌動蛋白作為內對照；圖9B是Western印跡結果，以PCNA作為內對照。
圖10顯示了MTT試驗的結果。
圖11是顯示了腺病毒介導的核酶導入的實驗結果。RT-PCR結果，以β-肌動蛋白作為內對照。
具體實施方案核酶切割RNA的效率取決于以下多個因素a)核酶的構型，它的酶活性中心是否外露；b)底物RNA分子的二級結構，有關的核酶酶切位點是否充分暴露和c)核酶在細胞內表達的水平[4]。
Lieber利用腺病毒的VA I和RNA分子作為支架，將其中設計有暴露性結構的核酶插入[4]。VA I屬pol III酶的基因家族，pol III在生長迅速的細胞中活性極高，從而這一系統可以很好的解決上述三個問題中的第一和第三個問題。對底物RNA的核酶位點的暴露性問題的解決方式有兩種1)根據自由能計算來對其二級結構進行預測；2)對所預期到的核酶可切性進行試驗。
本發明者通過對存活素RNA分子處于暴露區的核酶切點進行選擇，設計并合成了5種具有特異性切割存活素活性的核酶，并以腺病毒和逆轉錄病毒等作為常用載體進行了細胞水平的試驗，證實了所合成的核酶具有預期的可切性，從而完成了本發明。
本發明一方面涉及一種分離的多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼特異性切割存活素RNA的錘頭型核酶，它具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。
具體地說，所述核酶具有選自下列的多核苷酸序列CUUGAAUGCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGAGAUGC(SEQ ID NO1)AGCCCUCCCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGAAGGGC(SEQ ID NO2)AUGCUUUUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAUGUUCCU(SEQ ID NO3)AAUUCACCCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGGGUUAA(SEQ ID NO4)UUUCUUCUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAUUGUUGG(SEQ ID NO5)。
它們在與存活素的mRNA序列特異性結合時呈現出如圖5所示的結構。
本文所用的術語“分離的”在用于核酸時，表示核酸基本上不含其它在天然狀態下相關的細胞成分，其最好呈均質狀態，但也可以是干的或水溶液。純度和均一性通常可用分析化學方法如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法來測定。
本文所用的術語“錘頭核酶”具有本領域技術人員眾所周知的含義，它是僅含約37個核苷酸的單鏈RNA。
本發明中的核酶可用幾種方法獲得。例如，直接用化學方法合成DNA序列，然后利用DNA重組技術連接到重組質粒中轉錄制得。另外，可用PCR技術來擴增RNA(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)。
在得到了所述制得的核酶后，可用本領域技術人員熟知的各種技術，例如Sanger等人的雙脫氧鏈終止法(PNAS，1977，745463-5467)等來進行測序。
本發明另一方面涉及一種重組表達載體，該載體含有一種或多種上述多核苷酸序列以及與所述多核苷酸序列操作性相連的表達調控序列。
本文所用的術語“重組表達載體”指本領域熟知的質粒、粘粒、噬菌體、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體，例如但不局限于，在細菌中表達的基于T7的表達載體；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。然而，本發明范圍并不局限于該載體。只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。
這里所用的術語“表達調控序列”通常指參與控制核苷酸序列轉錄表達的序列。表達調控序列包括與目標核苷酸序列操作性相連的啟動子和終止信號。典型的啟動子例如有pol III啟動子、T7啟動子等。“操作性相連”是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果啟動子或增強子增加了編碼序列的轉錄，則它與編碼序列是操作性相連的。在上述重組表達載體中也可根據需要加入選擇性標記基因。
由于本發明的核酶對存活素基因mRNA的位點有特異性切割活性，而存活素又與細胞凋亡的速度降低呈正相關，因此本發明還涉及一種促進存活素表達過度的細胞凋亡的方法，該方法包括將上述重組表達載體導入所述存活素表達過度的細胞。
所述“存活素表達過度的細胞”通常是真核細胞，更通常的是腫瘤細胞，例如肝腫瘤細胞。
可將多種含有上述相同或不同核酶多核苷酸序列的重組表達載體分別或同時導入存活素表達過度的細胞中。
將上述重組表達載體導入目標細胞的技術是本領域普通技術人員所熟知的的，例如，采用腺病毒和逆轉錄病毒介導的導入方法。然而，利用其它病毒載體或是利用其它方式來導入上述重組載體對于本領域技術人員來說是顯而易見的。
本發明另一方面涉及一種藥物組合物，它包含特異性切割存活素編碼區61、83、232、294或358位點的核酶或含有該核酶的重組表達載體以及藥學上可接受的載體。
在一個較佳的實施方案中，所述特異性切割存活素編碼區61、83、232、294或358位點的核酶是錘頭型核酶，它具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。存活素編碼區61、83、232、294或358位點如圖5所示。
本文所用的術語“藥學上可接受的”是指當該載體以及組合物適當地給予動物或人時，它們不會產生不利的、過敏的或其它不良反應。通常，可作為藥學上可接受的載體或其組分的一些物質的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween；潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調味劑；壓片劑、穩定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等。
本發明還涉及用上述多核苷酸序列或重組表達載體來制備治療與存活素過度表達相關的疾病的藥物。
在這里，所用的術語“疾病”表示可從上述處理獲益的與存活素表達過度有關的任何病征，例如包括癌癥。“癌癥”是指哺乳動物中以無控制性細胞生長為典型特征的生理性癥狀。可從本發明獲益的癌癥例子包括，但不局限于，鱗狀細胞癌、肺癌、腸胃癌、胰癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳房癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、腎癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌等。
本發明還有一個方面涉及存活素mRNA編碼區61、83、232、294或358位點的應用，所述位點可用來設計或篩選特異性切割存活素RNA的核酶。盡管本發明中僅僅描述了根據存活素mRNA編碼區61、83、232、294或358位點來設計合成錘頭型核酶，但是本領域技術人員也很容易根據這些位點來設計或篩選其它更復雜的且可能更有效切割這些位點的核酶。
下面結合具體實施例進一步詳細描述本發明。本領域技術人員應當理解，這些實施例僅用于描述本發明而不用于限制本發明的范圍。
實施例存活素基因在腫瘤細胞和腫瘤組織樣本中的過度表達存活素在腫瘤細胞中的過度表達與所述細胞的高度增殖的特征密切相關。
以肝癌為對象對存活素在肝癌組織，癌旁正常組織以及健康人的正常肝組織細胞中在穩定態RNA水平上的表達RT-PCR的方法進行了比較。
1)RNA的抽提組織RNA的抽提取125-250毫克磨碎的組織，加入2.5毫升Trizol(Gibco)。加入氯仿，劇烈震蕩。室溫靜置5分鐘，4℃ 10,000rpm離心15分鐘。上清轉移到一個無RNA酶的50毫升離心管，加入6毫升異丙醇，在離心管上標記沉淀所在的位置，4℃ 10,000rpm離心10分鐘。輕輕倒去上清，用5毫升75％乙醇洗滌。室溫下干燥5分鐘。加入100微升DEPC水，轉移至1.5毫升離心管，-80℃保存。
細胞RNA的抽提取一瓶細胞(T25cm2)，倒去培液，用PBS洗2遍，每瓶細胞中加入0.5毫升Trizol。其余試劑等比例縮小，具體步驟同組織RNA抽提。
2)反轉錄取RNA 5微克，加入10mM dNTP，OligodT(0.5微克/微升)各1微升，再補加DEPC H2O至總體積為10微升。將Eppendorf管置于65℃，5分鐘。然后置于冰上1分鐘。在同一管中加入10×緩沖液2微升，0.1mM DTT 2微升，RNase抑制劑1微升。輕輕混勻后置于42℃，2分鐘。再加入反轉錄酶(50U/微升)1微升。置于42℃，50分鐘。然后置70℃，15分鐘，滅活RTase。所用反轉錄試劑盒是購自GIBICO的用于第一鏈cDNA合成的SuperScript預擴增系統。
3)半定量PCR擴增以反轉錄cDNA為模板，在一個反應體系中同時擴增存活素和β-肌動蛋白(β-肌動蛋白作為內對照)。所使用的引物為β-肌動蛋白上游引物(5’-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3’)(SEQ ID NO6)，下游引物(5’-TCAAGTTGGGGGACAAAAAG-3’)(SEQ ID NO7)，PCR產物為641bp；存活素上游引物(5’-TTTGCCACTGCTGTGTGATT-3’)(SEQ ID NO8)，下游引物(5’-ATTTCTCAGGAACAGCCGAG-3’)(SEQ ID NO9)，PCR產物為372bp。
反應條件為94℃ 3分鐘1輪94℃ 30秒60℃ 30秒 25輪72℃ 30秒72℃ 5分鐘1輪分別取健康正常人的肝組織、肝癌患者的癌組織及其毗鄰的正常肝組織，用上述步驟抽提出細胞/組織中的RNA，反轉錄并用半定量RT-PCR方法測定RNA在各組織中的表達水平。如圖1所示，半定量RT-PCR方法檢驗的結果表明，正常肝和癌旁組織中的存活素水平遠較肝癌組織中低。另外，在包括正常原代的人胚纖維母細胞株在內的多種細胞株中，存活素均有相關水平的表達。
存活素基因特異性核酶表達質粒的構建對存活素基因mRNA序列進行二級結構分析，并根據錘頭型核酶特異性切割位點的NUH(N表示任何一種核苷酸，U為尿嘧啶，H表示除G以外的任何一種核苷酸，切點位于H后)規律[5]，在mRNA單鏈區選擇出五個合適的位點(分別為存活素基因編碼區61、83、232、294或358位點)。圖2中顯示了根據能量最低原則來預計的存活素RNA的二級結構，其中候選的5個核酶特異性切割位點位于環狀區。
如下所示，設計并合成針對這五個位點的核酶片段。另外，為了構建克隆，還在核酶片段兩端分別加上了SalI和PstI酶切位點R1U(5’TCGACCTTGAATGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGAGATGCATGCA3’)(SEQ ID NO10)R1D(5’TGCATCTCTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGCATTCAAGG3’)(SEQID NO11)
R2U(5’TCGACAGCCCTCCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGAAGGGCATGCA3’)(SEQ ID NO12)R2D(5’TGCCCTTCTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGGAGGGCTG3’)(SEQID NO13)R3U(5’TCGACATGCTTTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAATGTTCCTATGCA3’)(SEQ ID NO14)R3D(5’TAGGAACATTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAAAAGCATG3’)(SEQID NO15)R4U(5’TCGACAATTCACCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGGGTTAAATGCA3’)(SEQ ID NO16)R4D(5’TTTAACCCTTTCGTCCTCCTCACGGACTCATCAGGGTGAATTG3’)(SEQ ID NO17)R5U(5’TCGACTTTCTTCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAATTGTTGGATGCA3’)(SEQ ID NO18)R5D(5’TCCAACAATTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAGAAGAAAG3’)(SEQID NO19)將上述合成的核酶片段加磷退火后，連接到pGVaL的SalI和PstI酶切位點中。pGaL質粒的酶切圖如圖3所示。該質粒具有以下特點，即其中的VAI基因中間加入了一個迴文結構的順序(loop)，從而使核酶插入其中后，能夠得以充分暴露。VAI基因的上游有poll III啟動子，該啟動子可使該基因有效地在真核細胞中表達。另外，VAI基因地上游還有一個T7啟動子，使得在試管內驗證該核酶的機制成為可能。
經測序證實后，將重組質粒命名為pGVaL-R1，pGVaL-R2，pGVaL-R3，pGVaL-R4，pGVaL-R5，統稱為pGVaL-Rz(圖3)。本實驗中核酶表達質粒pGVaL-Rz在體外由T7RNA聚合酶轉錄，而在細胞內則由真核RNA聚合酶III轉錄。
存活素表達質粒的構建存活素基因片段用RT-PCR方法從BEL7402人肝癌細胞株(購自中國庫，上海生化細胞所)cDNA中擴增，PCR引物為上游引物(5’CCGCTCGAGATGGGTGCCCCGACG 3’)(SEQ ID NO20)，下游引物(5’GAAGATCTATCCATGGCAGCCAGCT 3’)(SEQ ID NO21)。
PCR產物經BglII和XhoI消化、純化后，克隆到pCDNA-HA3載體的同樣位點中。pCDNA-HA3載體是是以pcDNA(invitrogen，CA，USA)為基本骨架、在其多克隆位點區中的EcoRI和XhoI之間插入了三個流感病毒血凝素抗原決定簇(HA)多肽序列構建而成的真核細胞表達載體。經測序證實后，存活素基因表達質粒命名為pCDNA-HA-存活素(圖4)，簡稱為HA-Sur。
為了檢測的需要，我們將pGL-3 control質粒(Promega，USA)中的螢光素酶片段克隆到HA-Sur的BglII和XbaI位點，形成可表達存活素和螢光素酶融合蛋白的質粒，命名為pCDNA-HA-存活素-熒光素(圖4)，簡稱HA-Sur-Luc。
體外轉錄1)核酶的體外制備質粒pGVaL-R1，pGVaL-R2，pGVaL-R3，pGVaL-R4，pGVaL-R5經HindIII線性化后，用T7 RNA聚合酶分別進行體外轉錄。2微克線性質粒，2.5微升10×緩沖液，2.5微升50mM DTT，10單位RNase抑制劑，2.5微升5mMNTPs和50單位T7 RNA聚合酶(Takara)，總體積25微升，37℃反應1小時，再加入20單位DnaseI，37℃10分鐘。體外轉錄產物用無水乙醇沉淀純化后，溶解于20微升DEPC水中，用RT-PCR方法，以已知量的質粒模板擴增產物為標準，對體外轉錄產物進行定量，以pGVaL作為對照。
2)目的片段的體外轉錄質粒HA-Sur和HA-Sur-Luc經Xba I線性化后，體外轉錄及定量過程同上。
核酶體外切割活性檢測取等摩爾數的核酶和目的片段RNA，在50mM Iris(pH7.5)和1mM EDTA條件下，95℃90秒后，立即放入冰中，再加入MgCl2至終濃度10mM，37℃反應1小時，反應總體積10微升。反應結束后，用無水乙醇沉淀，沉淀產物溶于10微升DEPC水，進行下面的檢測。
引物延伸實驗確定核酶切割位點引物SPE1(5’TGAAGCAGAAGAAACACTGGGCCAAGTCTG 3’)(SEQ ID NO22)，SPE2(5’GCAATTTTGTTCTTGGCTCTTTCTCTGTCCAG 3’)(SEQ ID NO23)，SPE3(5’ATCCATGGCAGCCAGCTGCTCGATG 3’)(SEQ ID NO24)各0.5pm用32P進行5’末端標記。用同樣的引物以質粒HA-Sur和HA-Sur-Luc為模板進行測序反應。引物延伸產物和測序產物經6％尿素變性膠電泳，放射自顯影分析結果，確定每個核酶在存活素RNA上的切割位點。
如圖5(B)所示，引物延伸實驗結果表明，經本發明設計的核酶處理過的底物均在預期位置上有切點。這表明這些切割確實是本發明所設計的核酶活性的佐證。
螢光素酶活性檢測取3微升HA-Sur-Luc RNA的核酶切割產物進行體外翻譯(Rabbit Reticulocyte Lysate System，Promega)，反應總體積10微升。2微升的翻譯產物用于檢測螢光素酶活性，同時以pGVaL轉錄產物作為核酶的陰性對照。結果顯示在圖6(A)中。
Western印跡雜交將存活素RNA分別與5個核酶進行體外切割反應的產物進行體外翻譯，方法同上。各2微升體外翻譯產物經7.5％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉膜，用抗HA抗體(Santa Cruz，USA)1∶5000檢測切割后的存活素表達情況。結果顯示在圖6(B)中。
螢光素酶活性檢測和核酶切割產物經體外翻譯后的Western印跡雜交結果均證實上述所得的結果是一致的。
如上所述，本發明所設計和檢測的5個核酶中，以1，3和5號的活性最高。所觀察到的各單一的核酶僅能部分地切割存活素RNA，可能是以下幾個原因所致a，其中僅部分存活素RNA分子呈對某一核酶敏感的二級構象，b，核酶分子的穩定性和效率等等。由于試管內存活素RNA構象與細胞內可能不同，因此本發明者將所有5種核酶分別克隆到逆轉錄病毒(pFB，Stratagne)或腺病毒載體，以存活素過度表達的腫瘤細胞BEL7402為受體細胞進行核酶效率的檢測。
核酶逆轉錄病毒載體的構建pGVaL-Rz系列質粒經XbaI酶切，用Klenow酶補平，再經MluI酶切后，回收570bp核酶片段(其中包括幫助核酶維持活性結構的vaI、vaII、loop序列)。將此核酶片段克隆至pFB-neo質粒的5’EcoRI(補平)和3’MluI位點，酶切鑒定后，重組質粒命名為pFB-R1，pFB-R2，pFB-R3，pFB-R4，pFB-R5，統稱為pFB-Rz。圖8中顯示了核酶逆轉錄病毒表達質粒pFB-Rz的示意圖。
對照質粒pFB-VaL用同樣方法，從pGVaL質粒中切出VaL片段(僅含有vaI、vaII、loop序列)，克隆到pFB-neo質粒中獲得。
細胞轉染及逆轉錄病毒病毒顆粒的收獲將上述獲得的pFB-Rz系列質粒和對照pFB-VaL各10微克用磷酸鈣沉淀法轉染5×106 PA317細胞，2星期后，用200毫克/毫升G418篩選。擴增轉入pFB-Rz和pFB-VaL的PA317細胞克隆，收獲細胞培液，用0.22um孔徑的濾器過濾，4℃保存。將含病毒上清按10倍梯度稀釋，感染NIH3T3細胞，用G418 200毫克/毫升篩克隆，2周后，根據克隆數計算病毒滴度。
細胞內核酶活性檢測1)細胞培養及逆轉錄病毒介導核酶導入用病毒上清10倍稀釋液5毫升感染1×106人肝癌細胞BEL7402細胞，并加入硫酸魚精蛋白(Protamine sulfate)至5微克/毫升，37℃，5％CO2條件下培養24小時后，棄去培養液，換新鮮完全培養液(含10％新生小牛血清，青霉素、鏈霉素各100U/毫升的DMEM)，繼續培養24小時后，收獲細胞，用于RT-PCR檢測和Western印跡分析。
2)RT-PCR檢測存活素在細胞內的表達用Trizol(Gibco)抽提分別轉入了5種核酶病毒和對照病毒的BEL7402細胞的總RNA，cDNA制備如前所述。用PCR擴增存活素片段，以β-肌動蛋白作為內參照，引物序列及反應條件同1.3)所述。用Smartview凝膠成像分析系統測定條帶灰度，檢測五種核酶對存活素mRNA的切割作用及其效率，其結果顯示在圖9(a)和下表1中。
表1 五種核酶的切割效率

3)Western印跡法檢測存活素在細胞內的表達用細胞裂解液裂解收獲的BEL7402細胞，細胞總蛋白量用BCA試劑盒(PIERCE)測定。15％的SDS-聚丙烯酰胺膠分離蛋白，用半干法將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，用存活素抗體(AlpaDiagnostic International)1∶2000檢測存活素表達，用抗PCNA抗體(Santa Cruz)1∶5000檢測PCNA表達，作為內參照。分析轉入不同核酶的BEL7402細胞中存活素表達情況，其結果顯示在圖9(b)和表2中。
表2 轉入不同核酶的BEL7402細胞中存活素表達情況

核酶腺病毒載體的構建用Stratagene公司的AdeasyTM adenoviral vector system.pGVaL-Rz系列質粒經XbaI酶切，Klenow酶補平，再經HindIII酶切后，回收570bp核酶片段(包括幫助核酶維持活性結構的vaI、vaII、loop序列)。將此核酶片段克隆至pShuttle-CMV質粒的5’SalI(補平)和3’HindIII位點，酶切鑒定后，重組質粒命名為pShuttle-R1，pShuttle-R2，pShuttle-R3，pShuttle-R4，pShuttle-R5，統稱為pShuttle-Rz。對照質粒pShuttle-VaL用同樣的方法，從pGVaL質粒中切出VaL片段(僅含有vaI、vaII、loop序列)，克隆到pShuttle-CMV質粒中獲得。
pShuttle-Rz系列質粒和pShuttle-VaL各1微克經PmeI線性化，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀純化后，與0.1微克pAdEasy質粒共轉E.coli BJ5183電轉感受態。克隆用50微克/毫升的卡那霉素篩選。挑取單克隆，抽質粒，用PacI酶切鑒定，所得到的重組質粒命名為pAd-R1，pAd-R2，pAd-R3，pAd-R4，pAd-R5，統稱為pAd-Rz，以及對照pAd-VaL。
細胞轉染及腺病毒病毒顆粒的收獲pAd-Rz系列質粒和對照pAd-VaL各10微克經PacI酶切線性化后，用磷酸鈣沉淀法轉染5×106HEK293細胞，7-8天后細胞發生病變，收獲細胞，反復凍融4次后，離心收集上清。2毫升上清液再用于感染5×106 HEK293細胞，2-3天后收獲病毒。為了提高病毒滴度，這一過程需反復4次。用空斑實驗測定每種病毒的滴度，同時用PCR方法檢測病毒顆粒數。
細胞內核酶活性檢測細胞培養及腺病毒介導的核酶導入按MOI為50的比例在人肝癌細胞BEL7402細胞中加入核酶腺病毒，37℃，5％CO2條件下8小時后，棄去培養液，換新鮮的含10％新生小牛血清，青霉素、鏈霉素各100U/毫升的DMEM，繼續培養48小時后，收獲細胞，用于RT-PCR檢測分析。
用上述相同方法，用RT-PCR檢測存活素在細胞內的表達，其結果顯示在圖10中和下表3中。
表3 存活素在細胞內的表達結果

進行MTT實驗檢測核酶活性。在96孔板中接種BEL7402細胞4×103/孔，5小時后，按MOI為50的量分別加入不同核酶及對照的腺病毒，每種平行作3孔。8小時后，棄去培養液，換新鮮的DMEM全培液。在37℃，5％CO2的條件下繼續培養48小時后，加入30微升MTT溶液(5毫克/毫升)，4小時后，棄去培養液，用100微升DMSO將Formosan結晶完全溶解，加入顯色液(0.1M甘氨酸，NaCl，pH10)25微升顯色，570nm測OD。重復3次，結果顯示在圖11中。
本發明中核酶1，3和5在試管內和細胞內均為最有效。這提示在相當程度上試管內的實驗結果對有關何種核酶為優有很高的預見力。
雖然，任一有效的核酶并非能夠完全抑制存活素的表達，但或許可以通過聯合使用2個或更多的核酶來提高療效。譬如，核酶1，3和5可以串聯的方式放入腺病毒，腺相關病毒或逆轉錄病毒載體中，而用這種含有復合核酶基因的病毒來感染腫瘤細胞，可以通過對細胞中存活素的表達抑制來殺死腫瘤細胞。
下面列出了在本發明中提及的所有參考文獻，所有這些文獻均納入本文作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述內容后，本領域技術人員可以對本發明作各種變化或修改，這些變化或修改均包括在本申請所附權利要求書所限定的范圍內。
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1.一種分離的多核苷酸序列，它編碼特異性切割存活素RNA的錘頭型核酶，其特征在于，該核酶具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ IDNO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。
2.一種重組表達載體，其特征在于，該載體含有權利要求1所述的一種或多種多核苷酸序列以及與所述多核苷酸序列操作性相連的表達調控序列。
3.根據權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于，所述載體是含有權利要求1所述的一種或多種多核苷酸序列的腺病毒及腺病毒相關病毒表達質粒或逆轉錄病毒表達質粒。
4.一種促進存活素表達過度的細胞的凋亡的方法，其特征在于，將權利要求2所述的重組表達載體導入所述存活素表達過度的細胞。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，通過腺病毒、腺病毒相關病毒或逆轉錄病毒介導將所述重組表達載體導入所述細胞。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述存活素表達過度的細胞是腫瘤細胞。
7.一種藥物組合物，其特征在于，它包含特異性切割存活素編碼區61、83、232、294或358位點的核酶或含有該核酶的重組表達載體以及藥學上可接受的載體。
8.權利要求1所述的多核苷酸序列、權利要求2所述的重組表達載體在制備治療與存活素過度表達相關的疾病的藥物中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述與存活素過度表達相關的疾病是癌癥。
10.存活素mRNA編碼區61、83、232、294或358位點的應用，其特征在于，所述位點可用來設計或篩選特異性切割存活素RNA的核酶。
全文摘要
本發明提供了特異性切割存活素RNA的錘頭型核酶，它具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。本發明還提供了含有該核酶的重組表達載體、用該載體來促進存活素表達過度的細胞凋亡的方法以及上述核酶或重組表達載體在制備治療與存活素過度表達相關的疾病的藥物中的應用。
文檔編號C12N15/63GK1465701SQ0211195
公開日2004年1月7日 申請日期2002年6月5日 優先權日2002年6月5日
發明者朱景德, 倪敏 申請人:上海市腫瘤研究所