肝癌相關基因啟動子CpG島的甲基化狀態及其應用的制作方法

專利名稱：肝癌相關基因啟動子CpG島的甲基化狀態及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學領域，更具體地涉及與原發性肝癌發生相關的腫瘤發生相關基因的啟動子區CpG島區的甲基化狀態信息及其應用。本發明還涉及檢測原發性肝癌的方法和試劑盒。
背景技術：
長期以來，人們對生命體遺傳的觀點是用DNA語言(即以4個堿基核苷酸，腺苷酸(G)，胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)為語符的)來描述的。生命體表型的維持及異化均歸結于攜帶決定這些表型的基因的攜帶者DNA(在某些情況下，以RNA的形式)的忠實或突變后的代間傳遞。雙倍體生物的表型多樣性亦可由父本及母本的基因組的組合而大大地提高。然而，越來越多的證據表明，不涉及到基因組一級結構變化的表觀遺傳學的機制，也參與了高等生物體的遺傳和變異。
DNA甲基化是表觀遺傳學現象的核心機制。在高等生命體中，組成DNA的4個堿基核苷酸，僅胞嘧啶的5’碳原子可被甲基化。這也只發生在其3’端毗鄰的堿基核苷酸為鳥苷的胞嘧啶5’碳原子上，即5’CpG 3’的二連體中的胞嘧啶。這些GpG二連體在高等生命體基因組中的出現的頻率僅為0.6％左右，遠遠低于二連體均態出現的預期值8.35％。這一分布的非隨機性偏移是與甲基化的C很易經脫氨等反應過程而轉變為(尿嘧啶U，胸腺嘧啶T)，即，與胞嘧啶甲基化可促進C向T的點突變的現象相關。在高等生命體中，大部分CpG二連體散在于象Alu I和Line等類高度重復序列中，且甲基化程度高。CpG的甲基化將抑制重復序列的轉錄活性從而負調該類DNA的片段轉座和重排，以確保基因組的穩定。剩余的CpG則富集在所謂的CpG島區(長度為200-1000bp左右，CpG的頻率在8.33％左右)。CpG島的分布有著高度的選擇性，尤以見之于核糖體RNA基因和50％左右編碼蛋白質的基因的啟動子區而令人矚目。在多數情況下，這類CpG島的甲基化程度很低，是這類基因得以轉錄所必需。全豐度的甲基化僅見于完全靜息化了的常染色體的遺傳印記基因或女性個體失活了的X染色體上的多個基因的CpG島。
CpG二連體的甲基化是一由甲基轉移酶以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體和DNA為模板的反應過程。在高等生命體發現了三種以DNA為模板的甲基轉移酶，分別為DNMTS 1，3a和3b[Bestor，2000(1)]。DNMTS1在對單鏈性CpG甲基化的DNA模板上的酶活性，較在全無甲基化的模板的為高。該基因剃除小鼠原代培養的胚胎細胞，仍有以全無甲基化DNA為模板，向CpG轉上甲基的活性(從頭開始的甲基化的能力)。這表明DNMTS1僅起著維持DNA的甲基化樣式不因遺傳物質代間傳遞而丟失的作用。DNA復制后時，此酶根據母鏈上CpG的C的甲基化的狀態向新生鏈互補的CpG的C上加或不加甲基。DNMTS3a和3b可有效地向全未甲基化的雙鏈DNA模板上CpG中C上加甲基。它們的表達及其酶活性均僅在高等生命體胚胎發育早期一個短暫的時期為高，這與全基因組水平上的去甲基化后，重新甲基化在時相上吻合。因此，這兩個酶被認為是主要參予對無甲基化的DNA模板進行從頭全甲基化的酶，在高等生物的早期發育中起著重要的作用。
CpG二連體的C甲基化雖不影響C與G之間的堿基配對，但可明顯地改變的DNA高級結構。對其高級結構的精細分析表明甲基基團外伸在DNA雙螺旋原先空置的大溝區中，這直接影響DNA與蛋白質相互的作用。參與基因轉錄調控過程中的很多轉錄調控因子所識別的DNA序列中含有CpG序列。由此這類CpG的甲基化會使其與相應蛋白的結合能力減弱，從而引起有關的下游基因轉錄受抑以至失活。甲基化的CpG也會促進蛋白與DNA之間的相互作用。甲基轉移酶I和甲基化DNA的結合蛋白家族的成員均對甲基化CpG有顯著為高的親和力。后一類結合可直接或間接地調動組蛋白去乙酰化酶復合體到富含甲基化DNA的區段，引起該區與相鄰區的核心組蛋白的去乙酰基化，進而導致該區的染色質結構的緊縮，喪失轉錄的活性。
長期在以來癌被認為是一種涉及到多個關鍵基因的量或質發生改變的遺傳性的疾病。癌相關的染色質數目和結構的宏觀水平改變，早在上世紀初已有報道。近代癌癥分子遺傳學研究在核苷酸序列的水平上已精確地描述了眾多正或負地影響正常細胞向癌變細胞惡化過程的基因的變化(點突變、缺失重排等等)。另外，在腫瘤細胞中抑癌基因的去表達似乎也可因其啟動子CpG島的甲基化程度提高所致[Baylin，2000(2)；Esteller，2002(3)]。同樣，癌基因啟動子的去甲基化和該基因的活化亦同見之于某些腫瘤細胞中。另外一個有意義的現象是，在從正常向癌細胞演變過程中，有著一個在全基因組水平的去甲基化的過程[Lin，2001(4)；Narayan，1998(5)]和抑癌基因的啟動子區CpG島的甲基化的步驟。現已表明基因組整體水平的去甲基化程度的提高可能與高等生物中的轉座子的活性的增加有關，基因組的突變率提高，基因組穩定性降低[Chen，1998(6)]，這與癌細胞的基因組的高度失穩的特征相吻合。與此同時，CpG島區選擇性的甲基化也可導致抑癌基因的失活。確有報道，癌細胞中甲基化轉移酶I的表達較正常細胞的為高[Hattori，2001(7)][Roberson，1999(8)]。
隨著人們對DNA的甲基化在腫瘤發生相關基因的表達的影響的重視程度的提高，對各類腫瘤的DNA甲基化的分析已成為當前種腫瘤分子生物些研究的一個熱點。肝癌是一預后兇險，早期診斷困難的危及中國人健康的重大疾病。然而對肝癌，包括中國在內的東南亞地區高發的惡性腫瘤這一方面的研究還很局限，所研究的基因僅有抑癌基因p16與p15這兩種。
因此，本領域迫切需要研究各種腫瘤相關基因在DNA甲基化狀態與肝癌的相關性，并在此基礎上開發更為敏感和有效的早期診斷的方法和發展新的包括基因治療在內的抗腫瘤治療的途徑。

發明內容
本發明的目的就是提供新的更敏感和更有效的檢測肝癌或肝癌易感性的方法和試劑盒。
本發明的另一目的是提供新的治療肝癌的方法。
在本發明的第一方面，提供了一種檢測肝癌的試劑盒，它含有(a)甲基化敏感性限制性內切酶，以及針對選自下組基因的啟動子CpG島特異性引物對APC、BRCA1、Caspase8、DAPK1、E-鈣粘蛋白(E-CAD)、GST-pi、H-鈣粘蛋白(CDH13)、hMLH1、O6甲基鳥嘌呤甲基轉移酶(MGMT)、P14/ARF、P15、P16、RAR-Beta2、RASSF1a和c、RB1、TERT、TIMP3、VHL、Survivn、和PTEN或含有(b)使非甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶的試劑，以及針對選自下組基因的啟動子CpG島的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對APC、BRCAl、Caspase 8、DAPKl、E-鈣粘蛋白(E-CAD)、GST-pi、H-鈣粘蛋白(CDH13)、hMLHl、O6甲基鳥嘌呤甲基轉移酶(MGMT)、P14/ARF、P15、P16、RAR-Beta2、RASSF1a和c、RBl、TERT、TIMP3、VHL、Survivn、和PTEN。
在一優選例中，所述的試劑盒還包括陽性對照和/或陰性對照。
在另一優選例中，所述的基因選自P16、H-鈣粘蛋白CDH13、RASSFla和c、Caspase8、Survivn。
在另一優選例中，所述的啟動子CpG島特異性引物對(包括啟動子CpG島甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對)的長度為15-35bp，所擴增出的擴增產物的長度為100-2000bp或更長，例如3000bp。
在另一優選例中，所述的試劑盒含有甲基化敏感性限制性內切酶，且所述的啟動子CpG島特異性引物對選自下組靶基因有義引物SEQ ID 反義引物SEQ ID
NONOAPAF gagtccggcattggtgggaac81 agactccccacctctggttctatcc 82APCgacctcccccgactctttac 83 atacagccacatgtcggtca84ARFtgggtcccagtctgcagttaagg 85 atcagcacgagggccacagc86BRCAl gtccctcccatcctctgatt 87 gcccagttatctgagaaacccc 88Caspase-8 cacgtggagttaggcaggtt 89 aacggctcagagagaaacca90CDH13 ccaaagaagcaaatgggatg 91 agttctcggctgcattttgt92DPAK ggaggacag ccggaccgag ccaacgcc93 ccgg cgcctgggag ggatctg 94E-鈣粘蛋白 agaccctagcaactccaggctagag95 cgggctggagtctgaactgacttc96hMLHl ccctgacgcagacgctccaccagggccgc97 cgcgggtagctacgatgaggcggc98p15ccccactctgccagagcgag 99 cgtcgtccttctgcggcttg 100p16accggaggaagaaagaggag101 ggcctccgaccgtaactatt 102pten cggtcttccgaggcgcccg 103 agttgagccgctgtgaggcg 104RAR-B gaagtgagctgttcagaggcagg 105 ctggtgctctgtgtttcaattgc106RASSF1acaaagccagcgaagcac 107 cggtagtggcaggtgaactt 108RASSFlccggcacagagaggctaattc109 acagaccccacctaccacag 110RBlccagtttaattcctcatgacttagc 111 gtcaagttgaagccgagacc 112Survivin gactacaactcccggcacac113 tgtagagatgcggtggtcct 114TERT ggtagtcgaggtgaaccgcgtc 115 aggcccaccctccgcaac 116TIMP3 ggcggcattattccctataa117 aggagcaagaggaggaggag 118VHLgcctccgttacaacagccta119 tcttcagggccgtactcttc 120。
更佳地，所述的甲基化敏感性限制性內切酶選自Hpa II、BstuI和HhaI。
在另一優選例中，所述的試劑盒含有使非甲基化胞嘧啶選擇性地轉化為尿嘧啶的試劑；且所述的啟動子CpG島的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對選自下組名稱 SEQ ID NOVHLM-上游引物TGGAGGATTTTTTTGCGTACGC 1M-下游引物GAACCGAACGCCGCGAA 2U-上游引物GTTGGAGGATTTTTTTGTGTATGT 3U-下游引物CCCAAACCAAACACCACAAA 4APCM-上游引物TATTGCGGAGTGCGGGTC 5M-下游引物TCGACGAACTCCCGACGA 6
U-上游引物GTGTTTTATTGTGGAGTGTGGGTT 7U-下游引物CCAATCAACAAACTCCCAACAA 8DAPKM-上游引物GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC 9M-下游引物CCCTCCCAAACGCCGA 10U-上游引物CAAATCCCTCCCAAACACCAA11U-下游引物CAAATCCCTCCCAAACACCAA12RBlM-上游引物GGGAGTTTCGCGGACGTGAC 13M-下游引物ACGTCGAAACACGCCCCG 14U-上游引物GGGAGTTTTGTGGATGTGAT 15U-下游引物ACATCAAAACACACCCCA 16APAFlM-上游引物AGGTTTAGTTACGTTTCGTTCG 17M-下游引物CGTCCACTCGCTACCTCTTC 18U-上游引物GAGGTTTAGTTATGTTTTGTTTGTGG 19U-下游引物 CCACTCACTACCTCTTCTTCTCC 20ARFM-上游引物GTGTTAAAGGGCGGCGTAGC 21M-下游引物AAAACCCTCACTCGCGACGA 22U-上游引物TTTTTGGTGTTAAAGGGTGGTGTAGT 23U-下游引物CACAAAAACCCTCACTCACAACAA 24P16INK4AM-上游引物TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC 25M-下游引物ACCCCGAACCGCGACCGTAA 26U-上游引物TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT 27U-下游引物CAACCCCAAACCACAACCATAA 28BrcalM-上游引物GGTTAATTTAGAGTTTCGAGAGACG29M-下游引物TCAACGAACTCACGCCGCGCAATCG30U-上游引物GGTTAATTTAGAGTTTTGAGAGATG31M-下游引物TCAACAAACTCACACCACACAATCA32
CDH13M-上游引物TCGCGGGGTTCGTTTTTCGC 33M-下游引物GACGTTTTCATTCATACACGCG 34U-上游引物TTGTGGGGTTGTTTTTTGT 35U-下游引物AACTTTTCATTCATACACACA36E-鈣粘蛋白M-上游引物GTGGGCGGGTCGTTAGTTTC 37M-下游引物CTCACAAATACTTTACAATTCCGACG 38U-上游引物GGTGGGTGGGTTGTTAGTTTTGT 39U-下游引物AACTCACAAATCTTTACAATTCCAACA 40P15-ink4bM-上游引物GCGTTCGTATTTTGCGGTT 41M-下游引物CGTACAATAACCGAACGACCGA 42U-上游引物TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT43U-下游引物CCATACAATAACCAAACAACCAA 44PTENM-上游引物GGTTTTTCGAGGCGTTCG 45M-下游引物CGCCTCACAACGACTCAACT 46U-上游引物TGGTTTTTTGAGGTGTTTG 47U-下游引物TTCCATCATAACTACAACTTCCA 48Rar-betaM-上游引物TCGAGAACGCGAGCGATTCG 49M-下游引物 GACCAATCCAACCGAAACGA 50U-上游引物TTGAGAATGTGAGTGATTTGA 51U-下游引物 AACCAATCCAACCAAAACAA 52HTERTM-上游引物GACGTAAAGTTTTTTTCGGACG 53M-下游引物ACCCGATACGCTACCGAACG 54U-上游引物GTAAAGATGTAAAGTTTTTTTTGGATG 55U-下游引物CCACAACCCAATACACTACCA56TIMP3M-上游引物CGTTTCGTTATTTTTTGTTTTCGGTTTC 57M-下游引物 CCGAAAACCCCGCCTCG58
U-上游引物 TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT59U-下游引物 CCCCCAAAAACCCCACCTCA 60RassflaM-上游引物GTGTTAACGCGTTGCGTATC 61M-下游引物AACCCCGCGAACTAAAAACGA 62U-上游引物TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG63U-下游引物CAAACCCCACAAACTAAAAACAA64RassflcM-上游引物AGTTTGGATTGTCGGTTTCG 65M-下游引物TCACAAACCCCACCTACCAC 66U-上游引物GGAGTTTGGATTGTTGGTTTTG 67U-下游引物CACCCCCAAAAATAACCTCAT 68SURVIVINM-上游引物GGCGGGAGGATTATAATTTTCG 69M-下游引物CCGCCACCTCTACCAACG 70U-上游引物GGTGGGAGGATTATAATTTTTG 71U-下游引物CCACCACCACCACCTCTAC72Caspase-8M-上游引物TAGGGGATTCGGACATTGCGA 73M-下游引物CGTATATCTACATTCGAAACG 74U-上游引物TAGGGGATTTGGAGATTGTGA 75U-下游引物CCATATATATCTACATTCAAAACAA 76hMLhlM-上游引物TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT 77M-下游引物ACCACCTCATCATAACTACCCACA 78U-上游引物ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC 79U-下游引物CCTCATCGTAACTACCCGCG 80。
更佳地，所述的使甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶的試劑包括亞硫酸氫鹽，聯苯二酚和氫氧化鈉。
在本發明的第二方面，提供了一種檢測肝癌的方法，它包括步驟檢測樣品中基因的啟動子CpG島的甲基化狀態，與正常對照相比甲基化狀態不同就表示個體患有肝癌或肝癌易感性高于正常人群，所述的基因選自下組
APC、BRCAl、Caspase 8、DAPKl、E-鈣粘蛋白(ECAD)、GST-pi、H-鈣粘蛋白(CDH13)、hMLHl、O6甲基鳥嘌呤甲基轉移酶(MGMT)、P14/ARF、P15、P16、RAR-Beta2、RASSFla和c、RBl、TERT、TIMP3、VHL、Survivn、和PTEN。
更佳地，所述的檢測步驟是通過(a)亞硫酸氫鹽處理DNA+甲基化和非甲基化胞嘧啶特異性PCR法，或(b)甲基化敏感性限制性內切酶+PCR法進行。
在本發明的第三方面，提供了一種治療肝癌的方法，它包括步驟改變肝癌細胞中所述基因的啟動子CpG島的甲基化狀態。


圖1顯示了各基因用啟動子CpG島特異性引物擴增的結果。
圖2顯示了各基因的RT-PCR擴增結果。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，對許多例肝癌患者的癌及其癌旁組織，中性粒細胞以及外周血清的DNA的各種基因的啟動子的CpG島區的情況進行了分析，發現了下列數種基因的啟動子CpG島的甲基化狀態與肝癌之間存在密切相關性，即APC、BRCAl、Caspase 8(CASPASE 8)、DAPKl、ECAD(E-鈣粘蛋白)、GST-pi、H-鈣粘蛋白(CDH13)、hMLHl、MGMT(O6甲基鳥嘌呤甲基轉移酶)、P14/ARF、P15(CDKN2B)、P16(CDKN2A)、RAR-Beta2、RASSFla和c、RBl、TERT、TIMP3、VHL(Von-Hippell Lindau)、Survivn、PTEN。在此基礎上完成了本發明。
如本文所用，“啟動子CpG島特異性引物”指與模板DNA基本上完全匹配且與模板的結合位點中包括啟動子CpG島或其一部分的引物。例如，用甲基化敏感性限制性內切酶處理樣品DNA后，未甲基化的CpG島被切割開，而甲基化的CpG島未被切割。使用特異性結合于該啟動子CpG島的引物(即啟動子CpG島特異性引物)時，前者不會產生PCR產物，而后者則會產生PCR產物。
又例如，如果采用使胞嘧啶轉化為尿嘧啶的試劑(包括亞硫酸氫鈉，聯苯二酚和氫氧化鈉)使胞嘧啶轉化為尿嘧啶，這可以使用二對引物，一對引物針對甲基化情況，另一對引物針對未甲基化情況，它們會因該CpG島的甲基化或非甲基化以否而特異地結合于含啟動子CpG島的區域，從而引發甲基化或非甲基化特異性的PCR擴增。
在本發明提供的肝癌相關基因中，分為二大類。第一類是抑癌基因。當抑癌基因的啟動子CpG島發生甲基化后，導致抑癌基因不表達或表達水平下降，從而導致癌癥。第二類是原癌基因。當原癌基因的啟動子CpG島發生去甲基化后，導致原癌基因的表達被激活，從而發生表達或表達水平上升。這兩者的后果均促進癌細胞形成和增殖，從而導致癌癥。
因此，在本發明的檢測方法中，檢測抑癌基因的啟動子Cp6島是否發生了甲基化，以及檢測原癌基因的啟動子CpG島是否發生了去甲基化。如果存在上述情況，就表明被檢測對象患有肝癌或肝癌易感性高于正常人群。
分析DNA甲基化的常見方法有以下二種(1)使用對甲基化敏感的限制性內切酶；(2)甲基化胞嘧啶核苷酸特異性的PCR。
第一種方法(使用對甲基化敏感的限制性內切酶)方便簡單，但受限于限制性內切酶的DNA識別序列的有限性。目前可供使用的酶僅有三種Hpa II(CCGG)(注MspI是可以切動甲基化的CCGG序列的酶)、BstuI(CGCG)和HhaI(GCGC)。這些酶無法切動其中CpG二連體中C甲基化了的識別序列。基因組DNA經這些酶分別充分消化后，作為模板用相應的引物對有關的區段進行PCR分析。PCR結果陽性意味著相應CpG沒有被甲基化，否則即甲基化。顯然這種方法受到“并非所有CpG二連體會位于限制性內切酶的識別序列之中”這一事實的限制，且只能提供存在上述核苷酸序列中CpG中的C的甲基化的狀態的信息，對其它CpG的甲基化狀態的評估毫無價值。
第二種方法(甲基化胞嘧啶核苷酸特異性的PCR)，可以對任一對象片段中的每個CpG二聯體中的C是否甲基化進行測定。由于亞硫酸氫鹽處理單鏈的DNA中，所有的未甲基化的胞嘧啶脫氨后均變為尿嘧啶，其配對由CG變為TA，而甲基化C不會被脫氨而仍保持CG配對。結果是前者(未甲基化)的二連體序列變為CpGTpG，而后者(甲基化的)則仍為CpG。通過對PCR擴增的片段進行測序，人們可以研究該研究區域中的每個CpG的甲基化的狀態[Herman，1996(9)]。
CpG島的長度可達1kb之長，為了研究上的方便而又不失去所研究區域的信息量，以及二磺酸鹽處理DNA的方法學上要求(DNA片段不易大于200bp)，本發明人在每個基因啟動子的CpG島區僅取了部分DNA序列。
本發明人采用甲基化專一性PCR反應對多位肝癌患者的癌與癌旁組織(表1)的DNA中的多個靶點基因進行了分析，另外取了4位人正常人的肝組織DNA作為對照。本發明人發現了13個靶基因的啟動子區的CpG島區的甲基化的狀態，在這些患者的正常肝及肝癌組織的DNA與取自正常人的肝組織的DNA完全相同。這似乎提示對這些基因的表達而言所述區域的甲基化狀態并無必要的關聯。在其余的靶點中，不同的病例表現為明顯不同的甲基化狀態，且這種甲基化狀態與肝癌的發生密切相關。
抑癌基因p16是Rb/p16 GI期檢測控制(check-point)上游的抑癌基因，因基因結構的改變和啟動子甲基化所至的失活見之于很多的惡性腫瘤。在本發明人研究中，p16啟動子的甲基化見之于17例肝癌組織(其中兩例為雜合，即甲基化與非甲基化并存)，但僅見之于6例癌旁正常組織(其中3例為雜合)。而正常肝組織DNA中p16啟動子呈非甲基化。這一結果表明p16啟動子CpG島的甲基化最為肝癌特異，并提示甲基化介導的p16的失活是一個肝癌發生最為晚期的事件。
RASSFl基因是新近發現的與Ras信號傳導系統有關的抑癌基因，它可以GTP依賴的方式和Ras結合[Agathanggelou，2001(10)；Dammann，2001(11)；Lo，2001(12)]。人為的RASSFl的過度表達可引起細胞凋亡。在啟動子使用及RNA剪切上的差異性選擇該基因的表達可產生兩種亞型，A和C。本發明人對這兩個啟動子相關的CpG島進行了甲基化狀態的檢測。在正常肝中這兩個啟動子均處于非甲基化狀態，在癌與癌旁組織DNA分析中RASSFlc啟動子區的CpG島均為非甲基化，僅一例的癌及癌旁組織表現為雜合現象。RASSFla啟動子CpG島的甲基化形式則截然不同，癌旁組織的有23例為甲基化(其中2例為純和性甲基化)，而癌組織DNA均為甲基化(其中15例為雜合性甲基化)。
CDH13是編碼細胞表面粘附因子的一個基因(H-鈣依粘連蛋白(H-cadherin))，它是一種抑癌基因。在30例肝癌患者的病例材料的研究中，癌旁正常組織的DNA中僅5例呈甲基化(均為雜合)，而在癌組織DNA中6例呈甲基化(其中4例為雜合)。這一觀察提示僅在某些肝癌病例中甲基化使該基因去表達。
Survivin是一個在腫瘤細胞高度表達表現為G2期轉錄的抗凋亡的基因。它的啟動子在迅速進入細胞周期的細胞中活性為高。有報道表明，該基因在正常細胞的表達低或無表達是由于其啟動子中的CpG島的甲基化有關。本發明人的研究表明，在整體水平上正常肝中該基因的啟動子還處于非甲基化的狀態，然而在核苷酸水平上該區中位于Sp1/Ap2轉錄因子的結合順序的一個CpG甲基化。這可能會使該轉錄因子失去與該位點結合而導致Survivin在正常細胞中的不表達或極低表達。在肝癌病例中該區均處于非甲基化狀態且表達增高。
抑癌基因p15是與p16相關的抑癌基因，Rb是它們下游的抑癌基因。本發明人研究了p15處于非甲基化狀態。一項先前有關p15甲基化在肝癌中的作用表明，只有這一部分肝癌的p15基因的啟動子可表現為甲基化。而本發明人的結果表明，若非全部，絕大多數的肝癌病例會發生p15的啟動子區的去甲基化。而Rb基因啟動子的CpG島均為非甲基化狀態，這表明Rb基因的功能失活與其啟動子的CpG島甲基化可能有關。
在這項研究中，本發明人還對10例正常人的白細胞和4例正常肝細胞的DNA作了同樣的比較性結果的討論研究。
為了避免PCR所產生的人為影響，多數甲基化特異性的PCR產物均克隆到T載體中(Promega.USA)后送去測序，以驗證結果。
另外，本發明人也采用半定量的RT-PCR對以下一些基因在正常肝和數例癌和癌旁肝組織中的水平作了一個評估(見圖2)。本發明人還對癌，癌旁正常組織及正常肝甲基轉移酶I表達進行了半定量的RT-PCR分析，結果表明DMTSl在癌旁組織為高。
最后，本發明人也通過HpaII，Hha I，或Bst UI(甲基化敏感的限制性內切酶)酶切與PCR反應聯合使用的方法，對幾例正常肝、癌、癌旁、白細胞以及外周上清的DNA中的部分靶基因點的啟動子的CpG島狀態進行了分析，結果與甲基化特征性的PCR方法所獲得結果基本符合。
此外，本發明人采用甲基化C敏感性限制性內切酶與PCR聯合使用的方法進行直接分析，發現血清DNA的所研究的基因之啟動子甲基化的狀態與癌組織DNA的狀態相吻合(數據未示出)。這表明，是有可能直接通過檢測血清或血漿或血液中DNA，來進行肝癌診斷。
本發明所提供的腫瘤發生的重要基因的甲基化狀態信息，在肝癌的基因診斷和治療上有極為重大的指導性意義。
在診斷方面，由于所研究的對象是DNA，它較蛋白質及RNA材料的穩定性明顯為高，對發展簡單易用檢驗方法是有利的。診斷新方法的準確、快速以及方便上的程度都是影響其的應用前景的關鍵因素。以血清或血漿為對象的診斷方法可廣泛地應用于對包括肝癌在內的多種疾病的臨床生化及免疫學功能檢測。現已確認，腫瘤患者的血清或血漿中含有高達每毫升300ng以上的DNA，而正常人的血清中DNA含量僅為10-20ng左右。這些DNA的來源有以下幾種，腫瘤細胞及相鄰細胞死亡所釋放出的DNA，和潛逃到血循環中的活的腫瘤細胞。利用血清中的DNA對于肝癌發病相關的靶基因的啟動子甲基化狀態的分析并用其作為將來臨床診斷試劑盒的基礎是很有價值的嘗試。鑒于患者血清中DNA的甲基化樣式與癌組織的極為相似，從而用患者血清DNA為檢驗樣品使所發展起來檢驗更容易為臨床所接受。上面所提到兩種檢測甲基化的方法都用于檢測，即，使用對甲基化敏感的限制性內切酶酶切方法以及亞硫酸氫鈉處理DNA的方法，再分別結合PCR反應的程序。另外，DNA芯片技術也可以用于將來的臨床檢驗的方法。此外，還可通過對檢測樣品直接進行測序，而進行檢測。
就肝癌基因治療而言，本發明所獲得的信息將有助于發展以改變DNA甲基化樣式為基礎的技術。對于抑癌基因，這種技術在腫瘤細胞對因其啟動子CpG甲基化而喪失了轉錄活性的抑癌基因選擇性地去甲基化，從而將其激活；對于原癌基因，還可以研發能選擇性對活動的癌基因的啟動子CpG區選擇性的甲基化而抑制該基因的活性和/或表達。Survivin以及IGF-2的啟動子就是很有潛力的靶點。
可選擇性的改變啟動子去甲基化的途徑是，利用與有關的基因啟動子區序列上互補的單鏈核酸分子，選擇性將甲基轉移酶的抑制劑或活化劑帶到腫瘤細胞中的靶基因的位點去，而專一性地改變表達該區甲基化狀態，進而改變該基因的表達狀態，抑制或殺死腫瘤細胞，而達到臨床掃除腫瘤的治療效果。
另外，鑒于任一靶點基因啟動子CpG島區的甲基化的狀態在腫瘤細胞有極高的選擇性，呈基因特異性，因此，可以在試管內甲基化下述一類啟動子來控制治療基因作為基因治療的藥物。這類啟動子的選擇標準是，它在正常細胞中處于甲基化的狀態，而在腫瘤細胞中非甲基化。鑒于這類基因的甲基化狀態完全是由所處的細胞的內在環境所決定，一個導入同源片段會受到類似的機制的調控。本發明人提議用在肝癌細胞非甲基化的，而在正常細胞中甲基化的啟動子(如Survivin或Igf-2基因的)來控制任何一種或幾種治療基因(包括前體藥物活化基因，免疫調節基因抑制細胞增殖式誘發細胞凋亡的基因等)。該類DNA將經過試管內MSss I甲基化酶的處理，或者該質粒DNA在表達MSssI甲基化酶的細菌中制備而使該質粒DNA中CpG的C的5’位C全部甲基化，然后用這類DNA作為基因治療的藥物來導入到動物或患者體內。因在腫瘤細胞中與其同源的內源性的DNA片段處于非甲基化的狀態，該機制會使導入的DNA的甲基逐步去掉，使該啟動子得以活化，使治療基因可有效地表達其產物，直接或間接地殺死受體腫瘤細胞。相反，在正常細胞中同源基因啟動子仍以甲基化狀態存在，導入的DNA仍維持在甲基化的狀態而難以被轉錄，治療基因不表達正常細胞即能存活。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1收集肝癌病例收集了30例肝癌病例，情況如下。分別取得各病例的肝癌組織、癌旁組織、中性粒細胞和外周血清。并按以下方法獲得DNA樣品。
(a).組織DNA的抽提取組織大約1g→碾碎(液氮中)→放入內有5ml裂解緩沖液(100mM NaCl，10mM Tris(PH7.5)，25mM EDTA(PH8)，0.5％SDS)的管子→加100ul(終濃度200ug/ml)蛋白酶K→37℃過夜(或50℃2小時)。
次日用苯酚抽提兩次→氯仿/苯酚抽提一次→氯仿抽提一次→上清+1/37.5M NH4Ac+3倍體積乙醇→沉淀+用500ul TE(10mM Tris HCl，1mMEDTA)溶解DNA的沉淀。
向溶解DNA的溶液中加入200ug/ml RNAse A→37℃45’+200ug/ml蛋白酶K→37℃2小時→氯仿/苯酚X1→1/10 7.5M NH4Ac+2.5倍體積乙醇→-20℃過夜→12000rpm 3’→獲得沉淀→70％酒精洗→室溫下晾干→加TE溶解。
(b).白細胞基因組DNA的抽提抗凝血離心2000rpm10分鐘，血清轉移到另一個管子后→向細胞沉淀加入等體積緩沖液I(10mM Tris PH7.6，10mM KCl，10mM MgCl2，2mM EDTA-2Na)/125ul NP-40，混合至溶液為透明→離心2000rpm 10分鐘后去上清→加入緩沖液I混合，離心去上清直至沉淀為白色→1.2ml緩沖液II(10mM Tris PH7.6，10mMKCl，10mM MgCl2，2mM EDTA-2Na，0.4mM NaCl)去懸浮沉淀，加40ul20％SDS50℃10’→20ul 20mg/ml蛋白酶K(0.5％)37℃3小時或過夜→加入540ul NaCl混合→13000rpm 5’→棄沉淀將上清移入一個干凈的1.5ml試管中→加3倍體積的酒精→將沉淀70％酒精。
(c)血清DNA的制備1、準備好血清樣品，以及提取所需的試劑，旋轉離心柱，2ml離心管，1.5ml離心管和接液管等。
2、把1ml血清加入2ml離心管中，再加入等體積1×CLB溶液，蓋好蓋子，振蕩(300rpm)混勻20s，離心(10,000rpm)2min。棄去上清，保留離心管底部的淡紅色或白色的沉淀。
3、加入200μl1×CLB試劑，在漩渦振蕩器上混勻30s，使沉淀重懸浮。
4、加入20μl蛋白酶并振蕩混勻。
5、將上述樣品在振蕩中加入200μl H1試劑，在漩渦振蕩器上混勻30s，充分6、混勻直至沉淀完全溶解。
7、將加過H1試劑的樣品置于70℃水浴10min。取出離心(5,000rpm，30s)，取上清400μl于另一干凈離心管中。
8、加H2試劑將上清液在振蕩中加入200μl H2試劑，并繼續振蕩10s以上，充分混勻。
9、上柱離心將混合液轉移到套有干凈接液管的星普旋轉離心柱中，離心(13,000rpm，60s)。
10、H3洗滌將星普旋轉離心柱轉移到干凈接液管中，加入400μl H3試劑，離心(13,000rpm，60s)。重復一次。
11、空柱離心將星普旋轉離心柱轉移到干凈接液管中，離心(13,000rpm，60s)。
12、H4溶液洗脫將星普旋轉離心柱轉移到干凈的1.5ml離心管中，加入100μl H4試劑(70℃預熱)，在漩渦振蕩器上混勻8～10s，再在室溫下靜置3～5min，離心(13,000rpm，60s)。
表1病例情況


實施例2被研究的基因的信息選取了幾十種候選基因，部分經本發明證實與肝癌相關的基因的信息列于下表表2基因相關序信息


實施例3甲基化胞嘧啶特異性PCR法檢測各基因啟動子CpG島的甲基化狀態(a)亞硫酸氫鈉處理取10ug DNA，加入3M NaOH至終濃度0.3M，37℃15分鐘→加入新鮮配制的對苯二酚至終濃度5mM→加入新鮮配制的亞硫酸氫鈉(sodium bisulfite，pH5.0)至終濃度3.1M→加礦物油，50℃16小時。
將1％的瓊脂糖加入2ml的試管，插入200ul的管尖。待瓊脂糖凝固后拔出tip，在孔中加入上述處理樣品。室溫下靜置45分鐘。重復以上操作3次。吸出以上樣品加入3M NaOH至終濃度0.3M，37℃15分鐘。加入1ug/1ul糖原，加入10M NH4Ac至終濃度3M，加入3倍體積無水乙醇。沉淀DNA(-20℃過夜，離心30分鐘)，70％乙醇洗滌，干燥，溶解于20ul的水中。保存在-20℃。
(b)甲基化胞嘧啶特異性PCR法分別用甲基化特異性或非甲基化特異性引物對(表3)對處理過的DNA進行PCR。反應體系是在PCR管中加入15ug石蠟油。和1ul消化過的DNA，1ul引物(4pmole)


PCR反應條件如下先94℃2分鐘，然后是90℃15秒，55-60℃15秒，72℃15秒，共30個循環，最后是72℃延伸10分鐘。PCR產物經2％瓊脂糖(0.5X TBE)電泳后分析。
表3靶基因與寡核苷酸引物(注M針對甲基化的引物 U針對非甲基化的引物。)名稱基因登錄號/引物序列(5’至3’方向) 結合位置 產物長度 SEQ ID NOVHL GeneBank NO.AF010238M-上游引物TGGAGGATTTTTTTGCGTACGC 532-689157bp 1M-下游引物GAACCGAACGCCGCGAA2U-上游引物GTTGGAGGATTTTTTTGTGTATGT 3U-下游引物CCCAAACCAAACACCACAAA 4APC GeneBank NO.U02509M-上游引物TATTGCGGAGTGCGGGTC 702-79997bp 5M-下游引物TCGACGAACTCCCGACGA 6U-上游引物GTGTTTTATTGTGGAGTGTGGGTT 695-803108bp 7U-下游引物CCAATCAACAAACTCCCAACAA 8DAPKGeneGank NO.NM_004938.M-上游引物GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC 2-102 101bp 9M-下游引物CCCTCCCAAACGCCGA 10U-上游引物CAAATCCCTCCCAAACACCAA 5-107 103bp 11U-下游引物CAAATCCCTCCCAAACACCAA12RB1 GeneBank NO.L11910M-上游引物GGGAGTTTCGCGGACGTGAC 1833-1983 149bp 13M-下游引物ACGTCGAAACACGCCCCG 14U-上游引物GGGAGTTTTGTGGATGTGAT 15U-下游引物ACATCAAAACACACCCCA 16APAFl GeneBank NO.AB070829M-上游引物AGGTTTAGTTACGTTTCGTTCG 946-1162217bp 17M-下游引物CGTCCACTCGCTACCTCTTC 18U-上游引物GAGGTTTAGTTATGTTTTGTTTGTGG 945-1159215bp 19U-下游引物 CCACTCACTACCTCTTCTTCTCC 20ARF GeneBank NO.L41934M-上游引物GTGTTAAAGGGCGGCGTAGC201-322 21M-下游引物AAAACCCTCACTCGCGACGA 22U-上游引物TTTTTGGTGTTAAAGGGTGGTGTAGT23U-下游引物CACAAAAACCCTCACTCACAACAA 24P16INK4AGeneBank NO.NM_000077M-上游引物TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC192-340 25M-下游引物ACCCCGAACCGCGACCGTAA 26U-上游引物TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT192-342 27U-下游引物CAACCCCAAACCACAACCATAA28Brcal GeneBank NO.L78833M-上游引物GGTTAATTTAGAGTTTCGAGAGACG 3183-3365 182bp 29M-下游引物TCAACGAACTCACGCCGCGCAATCG 30U-上游引物GGTTAATTTAGAGTTTTGAGAGATG 31M-下游引物TCAACAAACTCACACCACACAATCA 32CDH13 GeneBank NO.AB001090M-上游引物TCGCGGGGTTCGTTTTTCGC1402-1644 243bp 33M-下游引物GACGTTTTCATTCATACACGCG34U-上游引物TTGTGGGGTTGTTTTTTGT 35U-下游引物AACTTTTCATTCATACACACA 36E-cadherin GeneBank NO.L34545M-上游引物GTGGGCGGGTCGTTAGTTTC881-1053172bp 37M-下游引物CTCACAAATACTTTACAATTCCGACG38U-上游引物GGTGGGTGGGTTGTTAGTTTTGT 881-1055175bp 39U-下游引物AACTCACAAATCTTTACAATTCCAACA 40P15-ink4b GeneBank NO.NM_004935M-上游引物GCGTTCGTATTTTGCGGTT 145-292 41M-下游引物CGTACAATAACCGAACGACCGA42U-上游引物TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT 130-293 43U-下游引物CCATACAATAACCAAACAACCAA 44PTENGeneBank NO.NM_000314M-上游引物GGTTTTTCGAGGCGTTCG57-249 45M-下游引物CGCCTCACAACGACTCAACT 46U-上游引物TGGTTTTTTGAGGTGTTTG 47U-下游引物TTCCATCATAACTACAACTTCCA 56-222 48Rar-betaGeneBank NO.NM_016152M-上游引物TCGAGAACGCGAGCGATTCG 105-250149bp49M-下游引物 GACCAATCCAACCGAAACGA 50U-上游引物 TTGAGAATGTGAGTGATTTGA 51U-下游引物 AACCAATCCAACCAAAACAA 52HTERT GeneBank NO.AF047386M-上游引物GACGTAAAGTTTTTTTCGGACG605-821 53M-下游引物ACCCGATACGCTACCGAACG 54U-上游引物GTAAAGATGTAAAGTTTTTTTTGGATG 601-827 55U-下游引物CCACAACCCAATACACTACCA 56TIMP3 GeneBank NO.NM_000362M-上游引物CGTTTCGTTATTTTTTGTTTTCGGTTTC 733-848118bp57M-下游引物 CCGAAAACCCCGCCTCG 58U-上游引物 TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT 59U-下游引物 CCCCCAAAAACCCCACCTCA 60Rassfla GeneBank NO.XM_040961M-上游引物GTGTTAACGCGTTGCGTATC 119-202 61M-下游引物AACCCCGCGAACTAAAAACGA 62U-上游引物TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG 107-204 63U-下游引物CAAACCCCACAAACTAAAAACAA 64RassflC GeneBankNO.ref|NT006014.7|Hs3_6171M-上游引物AGTTTGGATTGTCGGTTTCG 682182- 65682369M-下游引物TCACAAACCCCACCTACCAC 66U-上游引物GGAGTTTGGATTGTTGGTTTTG 67U-下游引物CACCCCCAAAAATAACCTCAT 68SURVIVINGeneBank NO.U75285M-上游引物GGCGGGAGGATTATAATTTTCG 2640-2803 69M-下游引物CCGCCACCTCTACCAACG 70U-上游引物GGTGGGAGGATTATAATTTTTG 71U-下游引物CCACCACCACCACCTCTAC72Caspase-8 GeneBank NO.AF210257M-上游引物TAGGGGATTCGGACATTGCGA536-857 73M-下游引物CGTATATCTACATTCGAAACG 74U-上游引物TAGGGGATTTGGAGATTGTGA 75U-下游引物CCATATATATCTACATTCAAAACAA 76hMLhl GeneBank NO.AB017806M-上游引物TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT1067-1191 77M-下游引物ACCACCTCATCATAACTACCCACA 78U-上游引物ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC 1073-1190 79U-下游引物CCTCATCGTAACTACCCGCG 80擴增結果如圖1和表4所示。結果表明，上述各基因啟動子CpG島的甲基化狀態與肝癌存在密切的相關性。
表4 各基因啟動子CpG島甲基化情況匯總表 注各基因名稱如下1 CDH132 p163 caspase-84 ARF5 E-鈣粘蛋白6 APAF-l7 hMLHl8 Brcal9 HTERT10 VHL11 Rassflc12 Rassfla13 RAR-β214 TIMP315 MGMT16 DAPK17 P1518 RBl19 APC20 Survivin21 PTEN
表5用于甲基化特異性限制性內切酶+PCR法的引物


注在Bst UI、Hha I、Hpa II三欄中給出的酶切位點的數目。
結果匯總于表4。結果表明，上述各基因啟動子CpG島的甲基化狀態與肝癌存在密切的相關性。
為了驗證結果，將多數甲基化特異性的PCR產物均克隆到T載體中(Promega.USA)后送去測序。同時，采用半定量的RT-PCR對以下一些基因在正常肝和數例癌和癌旁肝組織中的水平作了一個評估(見圖2)。結果證實了實施例3和4中的結果。
本發明人還對癌，癌旁正常組織及正常肝甲基轉移酶I表達進行了半定量的RT-PCR分析，結果表明DMTS1在癌旁組織為高。
實施例5試劑盒的制備制備一肝癌檢測試劑盒，它含有甲基化特異性限制性內切酶Hpa II、BstuI和HhaI各200單位，并且含有啟動子CpG島特異性引物對各100微升，所述引物對就是表5中各引物對SEQ ID NO81-120。該試劑盒還含有使用說明。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
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權利要求
1.一種檢測肝癌的試劑盒，其特征在于，它含有(a)甲基化敏感性限制性內切酶，以及針對選自下組基因的啟動子CpG島特異性引物對APC、BRCAl、Caspase8、DAPKl、E-鈣粘蛋白、GST-pi、H-鈣粘蛋白CDH13、hMLHl、O6甲基鳥嘌呤甲基轉移酶、P14/ARF、P15、P16、RAR-Beta2、RASSFla和c、RBl、TERT、TIMP3、VHL、Survivn、和PTEN或含有(b)使非甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶的試劑，以及針對選自下組基因的啟動子CpG島甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對APC、BRCAl、Caspase 8、DAPKl、E-鈣粘蛋白、GST-pi、H-鈣粘蛋白、hMLHl、O6甲基鳥嘌呤甲基轉移酶、P14/ARF、P15、P16、RAR-Beta2、RASSFla和c、RBl、TERT、TIMP3、VHL、Survivn、和PTEN。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，它還包括陽性對照和/或陰性對照。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的基因選自P16、H-鈣粘蛋白CDH13、RASSFla和c、Caspase 8和Survivn。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的啟動子CpG島特異性引物對長度為15-35bp，所擴增出的擴增產物的長度為100-2000bp。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，它含有甲基化敏感性限制性內切酶，且所述的啟動子CpG島特異性引物對選自下組靶基因有義引物SEQ ID 反義引物 SEQ IDNO NOAPAF gagtccggcattggtgggaac81 agactccccacctctggttctatcc 82APCgacctcccccgactctttac 83 atacagccacatgtcggtca84ARFtgggtcccagtctgcagttaagg 85 atcagcacgagggccacagc86BRCAl gtccctcccatcctctgatt 87 gcccagttatctgagaaacccc 88Caspase-8 cacgtggagttaggcaggtt 89 aacggctcagagagaaacca90CDH13 ccaaagaagcaaatgggatg 91 agttctcggctgcattttgt92DPAK ggaggacag ccggaccgag ccaacgcc93 ccgg cgcctgggag ggatctg 94E-鈣粘蛋白 agaccctagcaactccaggctagag95 cgggctggagtctgaactgacttc96hMLHl ccctgacgcagacgctccaccagggccgc97 cgcgggtagctacgatgaggcggc98p15ccccactctgccagagcgag 99 cgtcgtccttctgcggcttg100p16 accggaggaagaaagaggag 101 ggcctccgaccgtaactatt102pten cggtcttccgaggcgcccg 103 agttgagccgctgtgaggcg104RAR-Bgaagtgagctgttcagaggcagg 105 ctggtgctctgtgtttcaattgc 106RASSFla caaagccagcgaagcac 107 cggtagtggcaggtgaactt108RASSFlc cggcacagagaggctaattc 109 acagaccccacctaccacag110RBl ccagtttaattcctcatgacttagc 111 gtcaagttgaagccgagacc112Survivin gactacaactcccggcacac 113 tgtagagatgcggtggtcct114TERT ggtagtcgaggtgaaccgcgtc115 aggcccaccctccgcaac 116TIMP3ggcggcattattccctataa 117 aggagcaagaggaggaggag118VHL gcctccgttacaacagccta 119 tcttcagggccgtactcttc120。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的甲基化敏感性限制性內切酶選自Hpa II、BstuI和HhaI。
7.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，它含有使非甲基化胞嘧啶選擇性地轉化為尿嘧啶的試劑；且所述的啟動子CpG島的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對選自下組名稱 SEQ ID NOVHLM-上游引物TGGAGGATTTTTTTGCGTACGC 1M-下游引物GAACCGAACGCCGCGAA 2U-上游引物GTTGGAGGATTTTTTTGTGTATGT3U-下游引物CCCAAACCAAACACCACAAA4APCM-上游引物TATTGCGGAGTGCGGGTC 5M-下游引物TCGACGAACTCCCGACGA 6U-上游引物GTGTTTTATTGTGGAGTGTGGGTT7U-下游引物CCAATCAACAAACTCCCAACAA 8DAPKM-上游引物GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC9M-下游引物CCCTCCCAAACGCCGA10U-上游引物CAAATCCCTCCCAAACACCAA 11U-下游引物CAAATCCCTCCCAAACACCAA 12RBlM-上游引物GGGAGTTTCGCGGACGTGAC13M-下游引物ACGTCGAAACACGCCCCG 14U-上游引物GGGAGTTTTGTGGATGTGAT 15U-下游引物ACATCAAAACACACCCCA 16APAFlM-上游引物AGGTTTAGTTACGTTTCGTTCG 17M-下游引物CGTCCACTCGCTACCTCTTC 18U-上游引物GAGGTTTAGTTATGTTTTGTTTGTGG 19U-下游引物 CCACTCACTACCTCTTCTTCTCC20ARFM-上游引物GTGTTAAAGGGCGGCGTAGC 21M-下游引物AAAACCCTCACTCGCGACGA 22U-上游引物TTTTTGGTGTTAAAGGGTGGTGTAGT 23U-下游引物CACAAAAACCCTCACTCACAACAA 24P16INK4AM-上游引物TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC 25M-下游引物ACCCCGAACCGCGACCGTAA 26U-上游引物TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT 27U-下游引物CAACCCCAAACCACAACCATAA 28BrcalM-上游引物GGTTAATTTAGAGTTTCGAGAGACG 29M-下游引物TCAACGAACTCACGCCGCGCAATCG 30U-上游引物GGTTAATTTAGAGTTTTGAGAGATG 31M-下游引物TCAACAAACTCACACCACACAATCA 32CDH13M-上游引物TCGCGGGGTTCGTTTTTCGC 33M-下游引物GACGTTTTCATTCATACACGCG 34U-上游引物TTGTGGGGTTGTTTTTTGT35U-下游引物AACTTTTCATTCATACACACA 36E-鈣粘蛋白M-上游引物GTGGGCGGGTCGTTAGTTTC 37M-下游引物CTCACAAATACTTTACAATTCCGACG 38U-上游引物GGTGGGTGGGTTGTTAGTTTTGT39U-下游引物AACTCACAAATCTTTACAATTCCAACA40P15-ink4bM-上游引物GCGTTCGTATTTTGCGGTT 41M-下游引物CGTACAATAACCGAACGACCGA42U-上游引物TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT 43U-下游引物CCATACAATAACCAAACAACCAA 44PTENM-上游引物GGTTTTTCGAGGCGTTCG45M-下游引物CGCCTCACAACGACTCAACT 46U-上游引物TGGTTTTTTGAGGTGTTTG 47U-下游引物TTCCATCATAACTACAACTTCCA 48Rar-betaM-上游引物TCGAGAACGCGAGCGATTC6 49M-下游引物 GACCAATCCAACCGAAACGA 50U-上游引物 TTGAGAATGTGAGTGATTTGA 51U-下游引物 AACCAATCCAACCAAAACAA 52HTERTM-上游引物GACGTAAAGTTTTTTTCGGACG53M-下游引物ACCCGATACGCTACCGAACG 54U-上游引物GTAAAGATGTAAAGTTTTTTTTGGATG 55U-下游引物CCACAACCCAATACACTACCA 56TIMP3M-上游引物CGTTTCGTTATTTTTTGTTTTCGGTTTC 57M-下游引物 CCGAAAACCCCGCCTCG 58U-上游引物 TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT 59U-下游引物 CCCCCAAAAACCCCACCTCA 60RassflaM-上游引物GTGTTAACGCGTTGCGTATC 61M-下游引物AACCCCGCGAACTAAAAACGA 62U-上游引物TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG 63U-下游引物CAAACCCCACAAACTAAAAACAA 64RassflcM-上游引物AGTTTGGATTGTCGGTTTCG 65M-下游引物TCACAAACCCCACCTACCAC 66U-上游引物GGAGTTTGGATTGTTGGTTTTG 67U-下游引物CACCCCCAAAAATAACCTCAT68SURVIVINM-上游引物GGCGGGAGGATTATAATTTTCG 69M-下游引物CCGCCACCTCTACCAACG 70U-上游引物GGTGGGAGGATTATAATTTTTG 71U-下游引物CCACCACCACCACCTCTAC 72Caspase-8M-上游引物TAGGGGATTCGGACATTGCGA73M-下游引物CGTATATCTACATTCGAAACG74U-上游引物TAGGGGATTTGGAGATTGTGA75U-下游引物CCATATATATCTACATTCAAAACAA76hMLhlM-上游引物TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT77M-下游引物ACCACCTCATCATAACTACCCACA 78U-上游引物ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC 79U-下游引物CCTCATCGTAACTACCCGCG 80。
8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的使甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶的試劑包括亞硫酸氫鹽，聯苯二酚和氫氧化鈉。
9.一種檢測肝癌的方法，其特征在于，它包括步驟檢測樣品中基因的啟動子CpG島的甲基化狀態，與正常對照相比甲基化狀態不同就表示個體患有肝癌或肝癌易感性高于正常人群，所述的基因選自下組APC、BRCAl、Caspase 8、DAPKl、E-鈣粘蛋白、GST-pi、H-鈣粘蛋白、hMLHl、O6甲基鳥嘌呤甲基轉移酶、P14/ARF、P15、P16、RAR-Beta2、RASSFla和c、RBl、TERT、TIMP3、VHL、Survivn、和PTEN。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的檢測步騾是通過(a)亞硫酸氫鹽處理DNA+甲基化和非甲基化胞嘧啶特異性PCR法，或(b)甲基化敏感性限制性內切酶+PCR法進行。
全文摘要
本發明提供了與原發性肝癌發生相關的腫瘤發生相關基因的啟動子區CpG島區的甲基化狀態信息及其應用，還提供了檢測原發性肝癌的方法和試劑盒。該試劑盒含有(a)甲基化特異性限制性內切酶以及針對肝癌相關基因的啟動子CpG島特異性引物對；或(b)使甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶的試劑和針對肝癌相關基因的啟動子CpG島引物包括甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對，所述基因包括APC、BRCA1、Caspase 8、DAPK1、E－鈣粘蛋白、GST－pi、CDH13、hMLH1、MGMT、P14/ARF、P15、P16、RAR－Beta2、RASSF1a和c、RB1、TERT、TIMP3、VHL、Survivn、和PTEN。
文檔編號C12Q1/25GK1451759SQ0211135
公開日2003年10月29日 申請日期2002年4月15日 優先權日2002年4月15日
發明者朱景德 申請人:上海市腫瘤研究所