專利名稱：蠶絲心蛋白轉基因棉纖維及其基因工程生產方法
技術領域：
本發明涉及棉纖維改良基因工程，尤其是涉及一種蠶絲心蛋白轉基因棉纖維及其基因工程生產方法。
背景技術：
棉纖維作為一種天然纖維，一直是紡織業和其相關產業的主要原材料。棉纖維由棉花種皮的表皮細胞分化產生。成熟棉纖維中纖維素含量達90％以上，同時含有一部分蛋白。棉纖維的品質，主要決定于纖維強力、長度、伸長度等性狀。這些性狀主要受基因型控制，環境因子和栽培對其影響低于20％。隨著分子生物學研究的深入和植物轉基因技術的逐漸成熟，用基因工程方法改良棉纖維品質，將成為培育優質棉的重要手段。目前，美國、澳大利亞等國都投入大量資金進行棉纖維的分子生物學研究。美國Agrocetus公司的科學家M.E.John博士等克隆了數個棉纖維特異表達的基因(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，895769-5773；John ME，Plant Mol Biol，1996，30297-306；John ME，Critical Reviews in Biotechnology，1997，17(3)185-203)，并利用棉纖維特異表達啟動子將外源合成PHB的基因轉入棉花，使棉花纖維中產生脂肪聚酯復合物-PHB(多羥基丁酸酯)(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1996，9312768-12773)。
角蛋白可分為兩類，一類是α-角蛋白，一類是β-角蛋白。蠶絲和蜘蛛絲的一種蛋白絲心蛋白是β-角蛋白。絲心蛋白分子是片層結構，鏈間主要以氫鍵連接，層間主要靠范德華力維系。由于這種結構方式使絲纖維具有很高的抗張強度，又有很柔軟的特性。
蠶絲由蠶絲心蛋白組成，國外已從蠶中分離到了蠶絲心蛋白基因(Yoshimi，K等，Gene.110(1992)151-158)。蠶絲心蛋白由兩條鏈組成，一條重鏈和一條輕鏈，其中重鏈350kDa大小，輕鏈25kDa大小。
將蠶絲心蛋白輕鏈基因轉入棉花，在棉纖維中特異表達，以改進棉纖維的纖維韌性及柔軟性等。這是一種新的思路和技術，具有重大的實用意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種蠶絲心蛋白轉基因棉纖維，即應用基因工程途徑將蠶絲心蛋白基因轉入棉花，使棉纖維中產生蠶絲心蛋白成分，改良棉纖維的韌性、彈性等。
運用本實驗室從亞洲棉基因組文庫中分離到棉纖維特異表達的啟動子；克隆出蠶絲心蛋白基因，并在原核細胞中表達，制備蠶絲心蛋白抗體；接著構建由棉纖維特異啟動子驅動蠶絲心蛋白基因的轉基因二元載體，轉化棉花后，對轉基因棉花進行了組織化學染色、PCR等分子驗證。現T2代正處于生長期，纖維成熟后進一步應用Western blot驗證棉纖維中蠶絲心蛋白的表達；最后對轉基因棉花纖維進行顯微結構、強力、彈性等品質特征分析，并分析其長度、強度等各種性能。轉基因棉花纖維T1代棉纖維已經檢測，其強度、彈性等都有增強。本發明技術方案詳述于后。
本發明提供一種轉蠶絲心蛋白基因棉纖維及其基因工程上產方法，利用棉花轉基因技術，在棉纖維中特異表達蠶絲心蛋白基因，能生產出全新的基因工程棉花，使棉纖維產生蠶絲心蛋白成分，使棉纖維強力提高，手感等更好。
本發明蠶絲心蛋白轉基因棉纖維及其轉基因工程方法及鑒定包括1、棉纖維特異表達的GAE6基因的克隆以亞洲棉DNA為模板進行PCR擴增。所用引物為參閱文獻(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，895769-5773)設計的，分別為E61(5’GCAACCATAGCCATGGCT 3’)和E62(5’GCTTAGTGGACTCGTAGG 3’)。
PCR產物純化后，采用TA克隆方法裝入pGEM-T載體(購自Promega公司)中，轉化XL1-Blue(本實驗室保存菌種)，然后對插入片段進行PCR鑒定和酶切鑒定(Yu Xiao-hong，Zhu Yong-qing等，Acta PhytophysiologicaSinica，2000，26(2)143-147)。DNA序列由中國科學院上海生命科學院植物生理生態研究所分子遺傳國家重點實驗室技術組用Appliedbiosystem373型全自動熒光序列分析儀測定。序列用PCGENE軟件系統分析。
以PCR-96孔板方法篩選亞洲棉基因組文庫，正向引物為E605’CCATGGCTTCCTCACCAA 3’，反向引物為E635’GGCATTCTTGTTGTAGTAG 3’。經7輪篩選，將陽性孔噬菌體稀釋后鋪板，挑取單個噬菌斑到SM溶液中，再以PCR鑒定陽性噬菌斑，依照Stratagene的實驗指南釋放質粒，得到一個陽性克隆，命名為GAE6-3A，經多種酶切鑒定其插入片段長8.0千堿基對。
DNA序列由寶生物工程公司Applied biosystem373型全自動熒光序列分析儀測定，所得的GAE6-3A克隆上游啟動子長1457個堿基對，其核苷酸序列見SEQ ID No.1。
將該啟動子克隆于含有內含子的GUS基因前，基因槍法轉化了正常的棉花胚珠和突變體無絮棉胚珠，培養2天后進行組織化學染色檢查GUS的活性，結果發現在正常胚珠中染色為多為深藍色并且GUS陽性比例遠遠高于突變體，說明該啟動子具有棉纖維特異性。
2、蠶絲心蛋白基因的克隆提取即將吐絲的蠶總RNA，反轉錄合成了cDNA，根據文獻(YoshimiKikuchi等，Gene，1992，110151-158) 設計合成引物FBN4(5’CGGGATCCATCGGTGACCATCAATCAATAC 3’)和FBN2(5’GATATCTTAGACGTGAACCTGGCTG 3’)，PCR擴增克隆了蠶絲心蛋白基因，其核苷酸序列見SEQ ID No.2，并亞克隆至pGEM-T載體(購自Promega公司)中構建了質粒TFBN。序列測定表明所克隆的蠶絲心蛋白基因FBN核苷酸序列與已發表的蠶絲心蛋白基因同源性達99％，并將其克隆到原核表達載體中以檢測其表達。
3、蠶絲心蛋白抗體的制備割取聚丙烯酰胺凝膠電泳中蠶絲心蛋白特異表達條帶免疫兔(蠶絲心蛋白量為100-200μg)，每3周加強一次，免疫4次，一周后取血清作為蠶絲心蛋白抗體以用于Western-blot檢測。
4、轉基因表達載體HAN的構建(由北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，2002年3月11日，保藏編號為CGMCC NO.0726)使用中國科學院上海生命科學院植物生理生態研究所分子遺傳國家重點實驗室提供的BKT質粒(Yu Xiao-hong，Zhu Yong-qing等，ActaPhytophysiologica Sinica，2000，26(2)143-147)，BKT質粒經SacI/BamHI雙酶切后與TFBN經BamHI/EcoRV雙酶切后連接。后用HindIII/SacI雙酶切后與2301質粒經HindIII/Sac I雙酶切后連接，構建了由GAE6-3A啟動子驅動的植物轉基因二元載體HAN(含有35S啟動子啟動的含有內含子的GUS基因)-KAN-E6-FBN-35S-GUS-KAN-。
5、棉花轉化電擊法將構建的轉化載體導入根癌農桿菌LBA4404中，應用農桿菌法轉化棉花。同時大量提取質粒，于棉花開花當天經花粉管途徑注射入子房中進行轉化，轉化棉花蘇抗103、蘇抗310、蘇8、蘇12、中20、石遠321、渝棉等多個品種。共獲得棉花種子1000粒。
6、轉基因棉花的分子生物學鑒定轉基因棉花的分子驗證，包括組織化學染色、PCR、Southern雜交，棉纖維中蠶絲心蛋白的Western分析等。
取棉花種子進行無菌培養，待萌發3天后取根尖進行組織化學染色植物組織浸泡于GUS染色液中，37℃溫浴24h，以70％乙醇和90％乙醇各脫色一次。在解剖鏡下觀察并照相。共獲得GUS陽性植株(根尖染成藍色)55棵。
選取GUS活性強的51棵植株，提取DNA后進行PCR檢測，應用引物P正(5’CACCATTCACCACTTGCTC 3’)和引物FBNR(5’GTTGTTGCTTTGGCTGTTGC 3’)進行PCR，復性溫度為54℃，25個循環后，取1μl反應產物，應用引物P3(5’GCTCCTAATTGAGTTGAAATCTTT3’)和FBNP(5’TTCCGGCGGTTTGGGCCACC 3’)再擴增30個循環，其中22棵棉花擴增出特異條帶。
7、轉基因植物的Western檢測取轉基因棉花的棉纖維，用液氮充分研磨后，加入適量的蛋白提取緩沖液(50mM Tris/Hcl，10mM EDTA，pH8.0；1％巰基乙醇)，4℃，15,000rpm，離心10分鐘后，取上清液，按卡馬斯亮藍法測定蛋白含量。各取5μg總蛋白進行10％SDS-PAGE電泳，然后用Bio-Rad電轉移裝置轉移到硝酸纖維素膜上(50mA電流轉移2hr，4℃)，按Sambrook方法(1989)進行雜交以檢測蠶絲心蛋白基因的表達。兔抗蠶絲心蛋白基因多克隆抗體以1∶300、第二抗體羊抗兔IgG抗體(購自Promega公司)以1∶2500稀釋使用。顯色劑為BCIP和NBT(購自Promega公司)。
8、轉基因棉纖維的品質分析轉基因棉花纖維的顯微結構分析，強度、長度等品質特征分析。發現強度、長度、光澤等指標都有改良。
與棉纖維相比，蠶絲心蛋白在光澤、強度、長度、手感等方面有明顯的優勢。本發明最大的優點和特點，是用基因工程的方法將蠶絲心蛋白基因引入棉纖維，所產生的轉基因棉纖維便遺傳性地具有蠶絲的某些性狀而無需混紡，從而為棉纖維家族提供了新的成員，為棉纖維改良提供了一條新的途徑。將絲心蛋白基因轉入棉花中并使其在棉纖維中特異表達，可使轉基因棉纖維含有蠶絲的成分，使轉基因纖維具有新的特性，強度改善，手感等更好。
盡管以品種間雜交為主的傳統育種培育了一些具有較好纖維性狀的棉花品種，但是受到遠緣雜交不親和的局限，而且也不可能將動物毛、絲的性狀引入棉花。通過基因工程提高纖維品質是棉花育種研究的新領域，這使所有生物的基因、甚至合成基因都成為可供利用的外源基因。通過遺傳轉化等方法將特定的外源基因導入棉花并使其穩定地遺傳表達，以改良特定的性狀。應用棉纖維特異表達的啟動子可使蠶絲心蛋白基因在棉纖維中特異表達而不在其它部位表達，避免影響棉花植株的性狀。
圖1為GAE6基因克隆的酶切分析圖。
其中泳道1為1kb Ladder Marker DNA分子標準物，泳道2-6分別為GAE6-3A克隆經EcoRI，EcoRI+HindIII，NcoI+EcoRI，HindIII，BamHI酶切產物。
圖2為蠶絲心蛋白基因植物轉基因載體HAN的構建圖。
TFBN蠶絲心蛋白基因的中間載體；BKT中國科學院上海生命科學院植物生理生態研究所分子遺傳國家重點實驗室提供的菌種；BFN蠶絲心蛋白基因的中間載體；2301中國科學院上海生命科學院植物生理生態研究所分子遺傳國家重點實驗室提供基因表達載體；HAN蠶絲心蛋白基因的植物表達載體；Fibroin蠶絲心蛋白基因；GAE6-3A promoter/E6 promoterE6啟動子(棉纖維特異表達的啟動子)；Keratin角蛋白基因；35S promoter35S啟動子；AMP氨芐青霉素抗性基因；Kanamycin(R)卡那霉素抗性基因；NOS-T終止子；GUSβ-葡萄糖苷酸酶基因。
圖3為轉基因植物PCR陽性鑒定電泳圖。
泳道1為轉基因質粒正對照，泳道2-5為轉絲心蛋白基因轉基因棉花，泳道6為未轉基因棉花，泳道7為體系負對照。
圖4為基因同源性比較圖。
其中QueryFibroin，由中國科學院上海生命科學院植物生理生態研究所分子遺傳國家重點實驗室克隆得到的蠶絲心蛋白輕鏈基因。
Sbjctfibroin light chain precursor(已發表蠶絲心蛋白輕鏈基因)。
具體實施例方式
實施例1 棉纖維特異表達的GAE6基因的克隆(1)亞洲棉葉片DNA的少量提取取約100毫克葉片加液氮迅速研磨成粉末，加入500μl抽提緩沖液(500mmol/L NaCl；50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)；50mmol/L EDTA(pH8.0)；1％β-巰基乙醇)；加入60μl 20％的PVP及100μl10％的SDS，混勻；65℃水浴20分鐘，加入160μl 3M的KAc(pH4.8)，冰浴30分鐘；4℃，15,000rpm離心10分鐘，上清移入新管，加0.6倍體積的異丙醇，混勻；冰浴10分鐘；4℃，12,000rpm離心5分鐘，棄去上清，75％乙醇洗滌后抽干，加入500μlTE溶解；加入等體積的酚∶氯仿∶異丙醇(25∶24∶1)抽提1-2次；12,000rpm室溫離心10分鐘，吸上清至新管，加入等體積的異丙醇，1/10體積3N的NaAc(pH5.2)，-20℃放置5分鐘；4℃，15,000rpm離心10分鐘，75％乙醇洗滌沉淀，抽干后獲得DNA，溶于100μlTE中。
(2)GAE6基因片段的擴增及序列分析以亞洲棉DNA為模板進行PCR擴增。兩個引物分別為E61(5’GCAACCATAGCCATGGCT 3’)和E62(5’GCTTAGTGGACTCGTAGG 3’)。PCR反應體系MgCl2(10×)3μl，PCR反應緩沖液(10×)3μl，dNTPs(2.5μMeach)3μl，E61(25μM)0.5μl，E62(25μM)0.5μl，模板(0.1μg/μl)1μl，牛血清白蛋白(10mg/ml)0.3μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，最后加水至30μl。PCR反應條件94℃預變性10分鐘；然后94℃變性40秒，54℃復性30秒，延伸30秒，共30個循環；最后，72℃延伸7分鐘。PCR反應后獲得一特異擴增產物GAE6基因片段。
PCR產物經Wizard柱(Promega公司)純化后，采用TA克隆方法將擴增片段裝入pGEM-T載體中，轉化XL1-Blue，然后對擴增片段進行PCR鑒定和酶切鑒定。DNA序列由中國科學院上海生命科學院植物生理生態研究所分子遺傳國家重點實驗室技術組用Applied biosystem373型全自動熒光序列分析儀測定。結果表明所克隆片段與已發表海島棉的E6基因高度同源(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，895769-5773)。
(3)從亞洲棉基因組文庫中篩選GAE6基因根據上述(2)中所得片段順序合成兩個引物，正向引物為E605’CCATGGCTTCCTCACCAA 3’，反向引物為E635’GGCATTCTTGTTGTAGTAG 3’。以PCR-96孔板方法篩選亞洲棉基因組文庫，取1μl基因組文庫(λ-ZAP)溶液(約108pfu)與400μl XL1-Blue菌液共培養30分鐘后，分置于96孔板各孔中37℃培養8～9小時。每列8孔各取5μl混勻，各取1μl作PCR。選取陽性列的各孔分別作PCR。取陽性孔混合物進行倍比稀釋作PCR，以能擴增出條帶的最大稀釋度進行稀釋，再鋪96孔板。經7輪篩選，獲得一陽性克隆。
該陽性克隆依照Stratagene的實驗指南釋放質粒。在1.5ml離心管中加入200μl XL1-BLUE細胞，200μl陽性噬菌斑SM溶液，1μl ExAssit helper噬菌體(Stratagen公司)，混勻，37℃溫育15分鐘。將混合液轉至3ml LB中，37℃振蕩培養2-2.5小時。2,000g離心15分鐘，吸出上清液。70℃溫育15分鐘，4,000g離心15分鐘，吸出上清液。兩個1.5ml離心管中各加入200μl新鮮的SOLR細胞，并分別加入上述上清液100、10μl，37℃溫育15分鐘，各取10-50μl鋪LB(含100μg/ml Amp)平板，37℃培養過夜。挑單克隆鑒定。經限制性酶切結果顯示該克隆PCR擴增片段約為8.0kb(參見圖1)。DNA測序表明該基因為亞洲棉的E6基因，上游啟動子長1457個堿基對，命名為GAE6-3A，見SEQ ID No.1。
實施例2 GAE6-3A啟動子的表達特異性從棉花基因組文庫中分離出棉纖維特異表達啟動子，并將該啟動子克隆于含有內含子的GUS基因前，基因槍法轉化了正常的棉花胚珠和突變體無絮棉胚珠，培養2天后進行組織化學染色檢查GUS的活性，結果發現在正常胚珠中染色為多為深藍色并且GUS陽性比例遠遠高于突變體，初步說明該啟動子具有棉纖維特異性。
實施例3 蠶絲心蛋白基因的克隆(1)蠶絲心蛋白基因RNA的提取取0.1-3g即將成熟的蠶，用液氮研磨成粉末后，轉移到50ml的離心管中，加入3ml預冷的提取緩沖液(1M Tris/HCl，50mM EDTA，1.4％SDS(w/v)，0.1％DEPC，Ph9.5)混勻，再加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混勻稱。冰上放置1小時，不時顛倒混勻。12,000rpm，4℃離心10分鐘。將水相轉移至另一離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻后，12,000rpm，4℃離心10分鐘。取水相，加入1/2體積的高鹽溶液和1/2體積的異丙醇，混勻后-70℃放置30分鐘。10,000rpm，4℃離心5分鐘，棄去上清，沉淀溶于2ml的DEPC水中。加入1/3體積的8M的LiCl溶液，混勻后，-20℃放置過夜。10,000rpm，4℃離心5分鐘，棄去上清，沉淀用70％的乙醇洗滌后，晾干，用DEPC水溶解。
(2)蠶絲心蛋白基因的擴增提取蠶的RNA后，用TaKaRa公司的反轉錄試劑盒，反轉錄成cDNA。20μl體系，42℃反應30分鐘，反轉錄產物在沸水中煮5分鐘。
反轉錄體系MgCl2(25mM)4μl，10xRNA PCR Buffer2μlRnase Free dH2O8.5μldNTP Mixture(10mM)2μlRnase Inhibitor(40U/μl)0.5μlReverse Transcriptase(5U/μl)1μlOligo dT-Adaptor Primer(2.5pmol/μl)1μl
蠶RNA(1μg/μl)1μl取1μl反轉錄產物，應用引物FBN2(5’GATATCTTAGACGTGAACCTGGCTG 3’)和FBN4(5’CGGGATCCATCGGTGACCATCAATCAATAC 3’)擴增克隆了蠶絲心蛋白基因并測定了其序列。
PCR反應體系10x PCR Buffer 10μldNTP Mixture(2.5μM each) 8μlFBN2(25μM) 3μlFBN4(25μM) 3μl蠶的RNA反轉錄產物 1μlExTaq DNA polymerase(5U/μl)0.5μlddH2O 74.5μlPCR條件94℃預變性5分鐘；然后94℃變性40秒，54℃復性30秒，延伸50秒，共35個循環；最后，72℃延伸7分鐘。反應后獲得特異的長789bp的擴增片段，克隆至pGEM-T載體中獲得TFBN。DNA測序及序列分析表明其為蠶絲心蛋白基因，其核苷酸序列見SEQ ID No.2，與已發表的蠶絲心蛋白基因的同源性達99.2％。
實施例4 蠶絲心蛋白基因的原核表達及抗體的制備應用BamHI和SacI酶切下蠶絲心蛋白基因，克隆至原核表達載體PET-32b(+)中，獲得高效表達。從聚丙烯酰胺凝膠中割取蠶絲心蛋白特異表達條帶免疫兔(蠶絲心蛋白量為100-200μg)，隔4周加強一次，后隔1周加強一次，共免疫4次，一周后取血清測定效價，作為蠶絲心蛋白抗體。加入0.02％的疊氮鈉保存于4℃或直接保存于-70℃備用。
實施例5 植物轉基因載體HAN的構建使用中科院上海植物生理研究所開放實驗室提供的已構建好的BKT(YuXiao-hong，Zhu Yong-qing等，Acta Phytophysiologica Sinica，2000，26(2)143-147)質粒，BKT質粒經SacI/BamHI雙酶切后與TFBN經BamHI/EcoRV雙酶切后連接。后用HindIII/SacI雙酶切后與2301(中國科學院上海生命科學院植物生理生態研究所分子遺傳國家重點實驗室提供)質粒經HindIII/SacI雙酶切后連接，構建了由GAE6-3A啟動子驅動的植物轉基因二元載體HAN(含有35S啟動子啟動的含有內含子的GUS基因)-KAN-E6-FBN-35S-GUS-KAN-，參見圖2。以上所用酶均購自PROMEGA公司，反應溫度條件為37℃溫育2小時。
實施例6 棉花的轉化(1)農桿菌法轉化棉花首先培養細菌農桿菌LBA4404(中國科學院上海生命科學院植物生理生態研究所分子遺傳國家重點實驗室提供)培養于附加100μg/μl利福平和300μg/μl鏈霉素的LB培養基中，28℃振蕩過夜。HB101(含pRK2013，中國科學院上海生命科學院植物生理生態研究所分子遺傳國家重點實驗室提供)菌株培養于含卡那霉素50μg/μl的LB培養基中，37℃振蕩過夜。含中間載體的大腸桿菌(DH5α，中國科學院上海生命科學院植物生理生態研究所分子遺傳國家重點實驗室提供)于含添加卡那霉素50μg/μl的LB培養基中，37℃振蕩過夜；三種培養物各取100μl于Eppendorf管內混合，4000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入1ml LB重新懸浮菌體，短時離下菌體，棄去上清液；菌體重懸于50μl LB中，點于LB平板上，28℃培養過夜；次日將過夜培養的培養皿取出，交叉取2環培養，重新懸浮于100μl LB；倍比稀釋上述菌懸液；涂板，即取100-200μl菌液涂布于含100μg/μl利福平，300μg/μl鏈霉素和卡那霉素50μg/μl的LB平板上，28℃培養2-3天；挑單菌落點于含如上三種抗生素的LB平板上，28℃培養2-3天，再篩選一次；挑取數個菌落進行懸浮培養，PCR和質粒酶切鑒定。三親雜交將構建的轉化載體導入根癌農桿菌LBA440后，應用農桿菌法轉化棉花。或用電擊法將構建的轉化載體導入根癌農桿菌LBA4404中。
(2)花粉管微注射法轉化棉花大量提取質粒，用于花粉管微注射法轉化棉花蘇抗103、蘇抗310、蘇8、蘇12、中20、石遠321、渝棉等多個品種。
挑單克隆菌落于500ml LB培養基，振搖培養20小時；5,000rpm離心5分鐘收菌，棄去上清液；加入5ml溶液1(成分見《分子克隆》第19頁)，混勻；加入10ml溶液2(成分見《分子克隆》第20頁)，上下顛倒混勻，室溫靜置5分鐘；加入7.5ml溶液3(成分見《分子克隆》第20頁)，溫和混勻；7,000rpm離心5分鐘，取上清液倒入45ml離心管中，加入7.5ml異丙醇，混勻；7,000rpm離心2分鐘。上清液倒入另一支45ml離心管中，加6ml異丙醇，混勻；7,000rpm離心5分鐘，棄上清液；沉淀用200μl TE懸浮，轉入1.5ml小離心管中，再用200μl TE洗一遍含沉淀的離心管，合并于小離心管中，加入2μl RNase(10mg/ml)，37℃，放置30分鐘；加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，振蕩30秒。12,000rpm離心5分鐘；吸上層溶液至新的Eppendorf管中，加入1/10體積的3N醋酸鈉，再加總體積2-3倍的無水冷乙醇，-20℃放置10分鐘；10,000rpm離心5分鐘，棄上清；加入1ml 70％乙醇沖洗后，干燥；將沉淀溶于TE，10％PEG純化。
于棉花開花后一天將質粒經花粉管途徑注射入子房中進行轉化，共獲得棉花種子1000粒；實施例7 轉基因棉花的分子生物學鑒定轉基因棉花的分子驗證，包括組織化學染色、PCR、Southern雜交、Northern雜交，棉纖維中蠶絲心蛋白的Western分析等。
(1)組織化學染色取棉花種子進行無菌培養，待萌發3天后取根尖進行組織化學染色植物組織浸泡于GUS染色液中，37℃溫浴24h，以70％乙醇和90％乙醇各脫色一次。在解剖鏡下觀察并照相。GUS染色液25ml磷酸緩沖液(pH7.0)，0.25ml 0.1M K3[Fe(CN6)]，0.25ml 0.1M K4[Fe(CN6)]，1ml 0.5M Na2EDTA，ddH2O 23.5ml，Gluc 50mg。共獲得GUS陽性植株(根尖GUS染色為藍色)55棵。
(2)PCR檢測選取GUS活性強的51棵植株，提取DNA后進行PCR檢測，應用引物P正(5’CACCATTCACCACTTGCTC 3’)和引物FBNR(5’GTTGTTGCTTTGGCTGTTGC 3’)進行PCR，復性溫度為54℃，25個循環后，取1μl反應產物，應用引物P3(5’GCTCCTAATTGAGTTGAAATCTTT3’)和FBNP(5‘TTCCGGCGGTTTGGGCCACC 3’)再擴增30個循環，其中22棵棉花擴增出特異條帶(參見圖3)。
(3)DNA分子雜交a棉花基因組DNA提取方法取1g棉花葉片加液氮研磨成粉末，轉移到50ml離心管中，加入5ml抽提緩沖液(500mM NaCl；50mM Tris/Hcl，pH8.0；50mM EDTA，pH8.0；1％β-巰基乙醇)，0.6ml 20％PVP及1ml 10％SDS，輕輕混勻。65℃溫育20分鐘后，加入1/10體積的5M KAC，冰浴30分鐘。4℃，15,000rpm離心10分鐘，吸出上清液。加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，冰浴10分鐘，4℃，10,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。沉淀用75％乙醇洗滌后晾干，加入500μl TE溶解。加入適量的RNase，37℃溫育30分鐘后，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提1-2次。將上層液轉移到新管中，加入等體積的異丙醇和1/10體積的3N NaAC(pH5.2)，冰浴10分鐘。4℃，12,000rpm離心5分鐘后，沉淀用75％乙醇洗滌抽干，溶于100μl TE中。
b DNA雜交任意選取陽性植株，提取基因組DNA，分別以質粒HAN和未轉化棉花的基因組DNA為正、負對照進行分子生物學鑒定(Southern)。
(4)轉基因植物的Western檢測取轉基因棉花的棉纖維，用液氮充分研磨后，加入適量的蛋白提取緩沖液(50mM Tris/Hcl，10mM EDTA，pH8.0；1％巰基乙醇)，4℃，15,000rpm，離心10分鐘后，取上清液，按卡馬斯亮藍法測定蛋白含量。各取5μg總蛋白進行10％SDS-PAGE電泳，然后用Bio-Rad電轉移裝置轉移到硝酸纖維素膜上(50mA電流轉移過夜，4℃)，按Sambrook方法(1989)進行雜交以證明轉基因棉纖維中蠶絲心蛋白的表達。兔抗絲心蛋白基因多克隆抗體以1∶300、第二抗體羊抗兔IgG抗體(購自Promega公司)以1∶2500稀釋使用。顯色劑為BCIP和NBT(購自Promega公司)。
xuliebiao.ST25SEQUENCE LISTING<110>中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態研究所<120>蠶絲心蛋白轉基因棉纖維及其基因工程生產方法<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1457<212>DNA<213>Gossypium arboreum Linn<400>1aattcatagg tataggaaga agccctgtca aatagagatt ttttctttcg accatatttc 60gattgttaat acgatatata aggaccgcta ctacaaatag tactacaccc ttgatcgtga120aatatcgatt gcttgttgaa ccctgtgaat tgcgtgaaag taggatactc caaattcggg180ggtccaagag ttttataaaa cgttcttggt ggaaaaaaat gtgaatgaaa gatcccactg240aattgaattg ggtccatgaa tctaagaaat agtgagaatt ctcctatttt tatttattta300tttgcttagg aagttttact gacactgctt ttatttttcc atcaatcaaa tttaagagac360aattcacttt ttataattaa caaaaaaaaa caaaaagaaa ataaaagaaa ttactttttt420ctttttcgtg ttcgatacaa gatagatgaa atatgaaaaa taaaatgaaa tgaaaatata480ttactagtga tatatcacct ccattatgta ggggaaagaa ataaaaataa tattaattta540tgatacttcc ataatgtggt taaaaataat tatctagtat ttttttgtaa aaaaaaaaag600ttgatatcta tgctactaat gaggtttctt agtgagtttg ttactactaa taaagtttat660
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xuliebiao.ST25<222>(1)..(789)<223><400>2atg aag cct ata ttt ttg gta tta ctc gtc gct aca agc gcc tac gct48Met Lys Pro Ile Phe Leu Val Leu Leu Val Ala Thr Ser Ala Tyr Ala1 5 10 15gca cca tcg gtg acc atc aat caa tac agt gat aat gaa att cca cgc96Ala Pro Ser Val Thr Ile Asn Gln Tyr Ser Asp Asn Glu Ile Pro Arg20 25 30gac att gat gat gga aaa gct agt tcc gta ttc tca cgt gca tgg gac 144Asp Ile Asp Asp Gly Lys Ala Ser Ser Val Phe Ser Arg Ala Trp Asp35 40 45tac gtc gat gac acc gac aaa agc atc gcc atc ctc aac gtt caa gag 192Tyr Val Asp Asp Thr Asp Lys Ser Ile Ala Ile Leu Asn Val Gln Glu50 55 60atc ttg aag gac atg gcc agc cag ggc gac tat gca agt caa gca tca 240Ile Leu Lys Asp Met Ala Ser Gln Gly Asp Tyr Ala Ser Gln Ala Ser65 70 75 80gcg gtg gcc caa acc gcc gga att atc gcc cat cta tct gcc ggt atc 288Ala Val Ala Gln Thr Ala Gly Ile Ile Ala His Leu Ser Ala Gly Ile85 90 95ccc ggt gat gcc tgt gca gcc gct aac gtc att aac tct tac aca gac 336Pro Gly Asp Ala Cys Ala Ala Ala Asn Val Ile Asn Ser Tyr Thr Asp100 105 110ggc gtc agg tcc gga aac ttc gcc ggc ttc aga caa tct ctc ggt ccc 384Gly Val Arg Ser Gly Asn Phe Ala Gly Phe Arg Gln Ser Leu Gly Pro115 120 125ttc ttc gga cac gtg gga caa aac ttg aat ctt atc aat caa ctc gtc 432
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權利要求
1.一種轉基因棉纖維，其特征在于，它是動物絲心蛋白轉基因棉纖維。
2.如權利要求1所述的轉基因棉纖維，其特征在于，所述的動物絲心蛋白是蠶絲心蛋白。
3.一種如權利要求1或2所述的轉基因棉纖維的基因工程生產方法，其特征在于，該方法包括如下步驟a.棉纖維特異表達基因的克隆；b.動物絲心蛋白基因的克隆；c.轉基因表達載體的制備；d.棉花轉化。
4.如權利要求3所述的轉基因棉纖維的基因工程生產方法，其特征在于，所述的棉纖維特異表達啟動子為GAE6-3A啟動子，其核苷酸序列為SEQIDNo.1，長1457個堿基對。
5.如權利要求3所述的轉基因棉纖維的基因工程生產方法，其特征在于，PCR擴增了蠶絲心蛋白基因，其核苷酸序列見SEQ ID No.2，并亞克隆至pPGEM-T載體中構建了質粒TFBN。
6.如權利要求3所述的轉基因棉纖維的基因工程生產方法，其特征在于，所述的轉基因表達載體為HAN，它是由GAE6-3A啟動子驅動的植物轉基因二元載體，含有35S啟動子啟動的含有內含子的GUS基因，該載體由北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNO.0726。
7.如權利要求3所述的轉基因棉纖維的基因工程生產方法，其特征在于，BKT質粒經SacI/BamHI雙酶切后與TFBN經BamHI/EcoRV雙酶切后連接，后用HindIII/SacI雙酶切后與2301質粒經HindIII/Sac I雙酶切后連接構建了轉基因表達載體HAN。
全文摘要
一種含動物蠶絲心蛋白基因棉纖維及其基因工程方法。應用中棉基因組DNA經PCR擴增了E6基因片段,根據該序列設計引物,用PCR－96孔板方法篩選亞洲棉基因組文庫,得到該基因GAE6－3A克隆,其插入片段長約8kb,上游啟動子長1457bp,該GAE6－3A啟動子在棉纖維中特異表達。提取了蠶的RNA,反轉錄后擴增克隆了編碼蠶絲心蛋白的基因,并將其裝入原核表達載體中獲得高效表達后,免疫兔制備蠶絲心蛋白抗體。進一步構建了由GAE6－3A啟動子驅動的絲心蛋白植物轉基因載體,轉化棉花,經組織化學染色、PCR及DNA分子雜交驗證蠶絲心蛋白基因已轉入棉花中。
文檔編號C12N15/12GK1369560SQ0211114
公開日2002年9月18日 申請日期2002年3月22日 優先權日2002年3月22日
發明者陳曉亞, 朱勇清, 許可香, 周寶良, 陳松, 林芝萍 申請人:中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態研究所