專利名稱：具有血小板粘附和聚集抑制活性的雙特異性單鏈抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的雙特異性單鏈抗體，特別是涉及具有抗血小板粘附和聚集活性的新的SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體，其制備方法及其在抑制血小板粘附和聚集，以及抗血栓形成中的應用。
血栓栓塞性疾病，如心肌梗死、腦血管血栓形成等，是嚴重危害人類健康，導致人體死亡的主要原因之一。此外，血栓形成還是許多疾病(如腎小球腎炎、糖尿病小血管病變等)發病機制中所涉及的一種重要病理過程。因此，預防和治療血栓形成，已成為當前臨床上普遍采用的方法。血小板在血栓形成過程中起著十分重要的作用。在正常血液循環過程中，血小板處于靜止狀態。然而，一旦發生血管壁損傷，血小板就會通過其表面膜糖蛋白(GP)Ib-IX復合物中的Ib受體，與血漿von Willebrand因子(vWF)結合并粘附于受損血管處暴露的內皮下組織。粘附的血小板被內皮下組織或局部形成的凝血酶所激活，引發釋放反應和花生四烯酸代謝過程。由前者分泌釋放的ADP或由后者形成的血栓烷(TX)A2均可導致血小板聚集。血小板聚集受血小板GPIIb/IIIa受體的調解。被激活的GPIIb/IIIa受體通過纖維蛋白原分子在相鄰的血小板之間形成橫橋，構成血小板聚集的骨架，最終導致血栓形成。血小板釋放的TXA2等產物還可進一步與血漿蛋白作用，促進血栓的形成。因此，有效地抑制各階段中血小板的作用，是預防或治療血栓形成性疾病的重要途徑。GPIIb/IIIa拮抗劑可直接抑制血小板聚集的共同最終途徑，所以是比目前已知并在臨床上普遍使用的阿斯匹林、噻氯匹啶等其他抗血小板制劑作用更強、更為特異的抗血小板藥物。這些藥物主要包括三類單克隆抗體(McAb)，人工合成的肽類和非肽類小分子物質。例如，已研制成功并臨床應用的人源化抗CD61表位GPIIb/IIIa單克隆抗體7E3(C7EFab，商品名ReoPro)。另外，具有序列RGD(Alg-Gly-Asp)(其為血小板受體配基所共有的特征性序列)的integrelin型環肽也已投入臨床應用(參見美國專利6,168,925號)。
為了克服鼠源性McAb具有免疫原性，以及完整抗體的組織穿透性差等缺陷，人們試圖基于基因工程和蛋白質工程技術制備各種新型抗體。單鏈抗體(scFv)就是利用DNA重組技術，通過一個接頭序列將抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)基因相連接并表達產生的的抗體片段。根據不同的研究和應用目的，將兩條不同來源的scFv組合成為具有兩種不同抗原結合特征的新型抗體(即雙特異性單鏈抗體)，是本領域技術人員普遍關注的研究方向。而且，為了拓展在臨床診斷和治療中和應用，通常選用來源不同的scFv來構建雙特異性單鏈抗體(bisFvs)，這樣，bisFv便集中了雙功能抗體和單鏈抗體的兩方面特點。因此，無論是作為免疫阻斷劑還是藥物導向載體，用于免疫成像診斷還是靶細胞識別，雙特異性單鏈抗體在臨床上均具有更大的應用潛力。
本發明的一個目的是提供一種具有抑制血小板粘附和聚集活性的雙特異性單鏈抗體。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的雙特異性單鏈抗體是由具有抗GPIbα活性的SZ-2單鏈抗體和具有抗GPIIIa活性的SZ-21單鏈抗體融合而成的，并且兩者之間存在有一個接頭序列。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的雙特異性單鏈抗體基本上具有如序列表中SEQ ID NO14所示的氨基酸序列。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的接頭序列是(Gly4Ser)1-3.
本發明的另一個目的是提供如序列表中SEQ ID NO13所示的編碼SZ2/SZ21雙特異性單鏈抗體的DNA序列及其功能等同物。
本發明的再一個目的是提供攜帶上述DNA序列的重組表達載體。
本發明的再一個目的是提供被所說的重組表達載體轉化或轉染的宿主細胞。
本發明的再一個目的是提供生產如上限定的雙特異性單鏈抗體的方法，該方法包括
(1)提供SZ2和SZ21的重鏈和輕鏈可變區DNA編碼序列；(2)通過接頭序列(Gly4Ser)1-3將步驟(1)得到的SZ2或SZ21輕、重鏈可變區的DNA編碼序列連接成單鏈抗體編碼序列；(3)將步驟(2)得到的SZ2、SZ21單鏈抗體DNA編碼序列通過接頭序列(Gly4Ser)1-3可操作地連接到適當的表達載體上；(4)用步驟(3)的重組表達載體轉化或轉染適當的宿主細胞；(5)培養步驟(4)的宿主細胞，并從所說的細胞和其培養基中回收所需的目的多肽。
本發明的再一個目的是提供如上限定的雙特異性單鏈抗體在生產抗血小板粘附和聚集的藥物中的應用。
本發明的再一個目的是提供如上限定的雙特異性單鏈抗體在免疫成像診斷中的應用。
圖1顯示pET22-21-L-2重組質粒的構建示意圖。
圖2顯示pET22-21-L-2重組質粒的酶切鑒定。其中泳道1為DNA/EcoRI+HindIII分子量標準物；泳道2為pET22-21-L-2的EcoRI單酶切產物；泳道3為pET22的EcoRI單酶切對照物；泳道4為pET22-21-L-2的BamHI/NotI雙酶切產物；泳道5為pET22-21-L-2的BamHI/NotI/EcoRI/SalI酶切產物；泳道6為SZ-21的PCR產物；泳道7為接頭序列的PCR產物；泳道8為100梯度(ladder)DNA分子量標準物。
圖3顯示SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體在大腸桿菌中誘導表達后，菌體蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。其中泳道1為蛋白質標準物；泳道2為未誘導的細菌溶菌產物；泳道3為誘導的細菌溶菌產物；泳道4為誘導的細菌菌體蛋白沉淀；泳道5為誘導的細菌菌體蛋白上清；泳道6為純化的蛋白質表達產物。A為未誘導的細菌溶菌產物的Western印跡分析結果；B為誘導的細菌溶菌產物的Western印跡分析結果。
圖4顯示以流式細胞術檢測的SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體的血小板結合活性。框A為血小板陰性對照；框B為SZ-2單克隆抗體與血小板結合陽性對照；框C為SZ-21單克隆抗體與血小板結合陽性對照；框D顯示SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體與血小板的結合。
圖5顯示SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體與血小板裂解液結合的Westem印跡分析。泳道1為蛋白質分子量標準物；泳道2為SZ-2單克隆抗體與血小板裂解液結合的陽性對照；泳道3為SZ-21單克隆抗體與血小板裂解液結合的陽性對照；泳道4顯示SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體與血小板裂解液的結合。
圖6顯示SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體對瑞斯托霉素誘導的血小板聚集的抑制活性。框A為陰性對照；框B為SZ-2單克隆抗體(10μg/mL)+瑞斯托霉素誘導的血小板(陽性對照)；框C為SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體(20μg/mL)+瑞斯托霉素誘導的血小板。
圖7顯示SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體對凝血酶誘導的血小板聚集的抑制活性。框A為陰性對照；框B為SZ-2單克隆抗體(10μg/mL)+凝血酶誘導的血小板(陽性對照)；框C為SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體(20μg/mL)+凝血酶誘導的血小板。
圖8顯示SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體對ADP誘導的血小板聚集的抑制活性。框A為陰性對照；框B為SZ-21單克隆抗體(10μg/mL)+ADP誘導的血小板(陽性對照)；框C為SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體(30μg/mL)+ADP誘導的血小板。
本發明涉及具有血小板粘附和聚集抑制活性的雙特異性單鏈抗體，特別是涉及由已知分別對血小板表面糖蛋白GPIbα和GPIIIa具有特異結合活性的SZ-2和SZ-21單鏈抗體融合而成的雙特異性單鏈抗體。本發明進一步涉及以DNA重組技術生產所說的雙特異性單鏈抗體的方法及其應用。本發明的SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體通過特異地結合血小板表面糖蛋白GPIbα和GPIIIa，有效地抑制血小板的粘附和聚集。
SZ-2是最初由本發明人和其同事制備的一株針對GPIbα的單克隆抗體(阮長耿等，中國科學(B輯)，948-963，1986)。該單克隆抗體不僅可抑制瑞斯托霉素/博托霉素誘導的血小板聚集，即抑制GPIb與vWF的特異性結合，而且還可抑制凝血酶或I型膠原蛋白及血小板活化因子誘導的血小板聚集。為降低鼠原性SZ-2抗體對人體的免疫原性和分子量，探討其在治療血栓性疾病中的應用，我們已成功構建并表達了SZ-2單鏈抗體(阮長耿等，血小板膜糖蛋白單克隆抗體SZ-2單鏈抗體的構建、表達及功能研究，中華血液學雜志，待出版)。
同樣，SZ-21也是由本發明人和其同事制備的一株新的抗GPIIb/IIIa單克隆抗體(阮長耿等，中華醫學雜志，67(2)76-78，1987)。體外和體內試驗表明，SZ21抗體可抑制血小板的聚集反應，并能抑制活體動物模型的動靜脈血栓形成。我們已成功地構建并表達了SZ21單鏈抗體(阮長耿等，血小板膜糖蛋白單克隆抗體SZ-21基因克隆及單鏈抗體的構建、表達，免疫學雜志，17(3)200-203，2001)。研究證明，我們制得的單鏈抗體保留了親本抗體的抗血小板和纖維蛋白原結合能力，并表現有明顯的抗血小板聚集和抗血栓形成活性。
對血栓性疾病發病機理以及現有抗血栓藥物局限性的深入分析后，我們認識到現有抗血小板制劑基本上只是抑制血小板功能的某一個環節，雖然GPIIb/IIIa拮抗劑是抑制血小板聚集的最終共同途徑，但此前由活化的血小板所釋放的生物活性物質，同樣會對出/凝血的生理平衡產生消極影響。因此，希望制備一種既可抑制血小板的始動活化途徑，又可抑制血小板聚集的最終共同途徑的新型抗血小板抗體。
本發明人在已分別獲得了SZ2和SZ21單鏈抗體的基礎上，應用基因工程和蛋白質工程原理及操作，對兩單鏈抗體進行重組和拼接，得到本發明的新的雙特異性單鏈抗體，從而完成了本發明。
為了實現上述發明目的，可以按照本領域技術人員已知的技術(如參見J.Sambrook，E.F.Fritsck&T.Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，2nd ed，Cold Spring Harbour Press，NY，1989)進行基因的分離或合成、核苷酸片段的切割與連接、克隆和表達載體的構建及擴增、核苷酸序列的分析與鑒定、細胞的轉化和培養，以及表達產物的分離與純化等操作。至于單克隆抗體的制備技術，也是本領域普通技術人員所熟知的。簡單地說，用血小板免疫BALB/C小鼠，然后處死動物并分離脾細胞。然后，在聚合劑例如聚乙二醇存在下，將脾細胞的單細胞懸液于骨髓瘤細胞(SP2/0)按適當的細胞比例接觸并融合。用常規HAT培養基篩選已融合的雜交瘤細胞。然后，用Western印跡法、免疫沉淀法、酶聯免疫吸附法等方法鑒定所需的特異性陽性抗性細胞株。
例如，可應用RT-PCR技術，從SZ2、SZ21雜交瘤細胞中擴增出SZ2和SZ21重鏈與輕鏈可變區的DNA編碼序列，通過一個接頭序列[(Gly4Ser)1-3]將輕鏈和重鏈可變區的DNA編碼序列連接在一起，并將所得到序列克隆到適當的原核表達載體例如pET22(SZ2)和pET20(SZ21)中，以構建得到所需的表達載體pET22-SZ2scFv和pET20-SZ21scFv(阮長耿等，血小板膜糖蛋白單克隆抗體SZ-2單鏈抗體的構建、表達及功能研究，中華血液學雜志，待出版；阮長耿等，血小板膜糖蛋白單克隆抗體SZ-21基因克隆及單鏈抗體的構建、表達，免疫學雜志，17(3)200-203，2001))。可根據pET22-SZ2scFv載體中(Gly4Ser)1-3接頭的DNA序列，設計并合成一對PCR引物。然后，ET22-SZ2scFv表達載體為模板，PCR擴增得到相應接頭的DNA編碼序列。借助PCR擴增中引入的適當酶切位點，將所說的多肽編碼序列拼接到我們以前構建的，并已知攜帶SZ-2單鏈抗體多肽之編碼序列的pET22-SZ2scFv載體中SZ-2scFv編碼序列的5’末端。然后，再設計并合成另一對適當的PCR引物，從已知攜帶SZ-21scFv編碼序列的重組載體pET20-SZ21scFv中擴增得到編碼SZ-21scFv的DNA序列。將該序列可操作地連接到上述pET22-SZ2scFv載體中引入了接頭序列的SZ-2多肽編碼序列的5’端，從而得到用于表達本發明的雙特異性單鏈抗體(SZ2/SZ21)的重組表達載體pET22-21-L-2(參見實施例1)。如此得到的重組表達載體攜帶了本發明雙特異性單鏈抗體的編碼序列，并且該序列基本上如SEQ ID NO13所示。
作為構建本發明的重組表達載體的起始質粒，可使用任何一種能夠在細菌細胞中穩定地保留并復制的質粒載體。這樣的起始質粒包括但不只限于pET22b、pTZ18R、pBR322、pKK223-3、pUC18、pUC19、pUC119等。但本發明中優選的是高效表達質粒pET22b。
可使用任何一種適當的方法(如CaCl2處理法)將如上得到的重組表達載體轉化或轉染到適當的原核或真核宿主例如大腸桿菌菌株BL21(DE3)PlysS中，并在適于表達上述SZ2/SZ21多肽的條件下培養被轉化或轉染的宿主細胞。培養并增殖細胞后，根據細菌細胞所獲得的抗藥性來選擇轉化株。在使用大腸桿菌宿主的情況下，最好利用藥物抗性基因作為選擇標志基因，例如氨芐青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四環素抗性基因及博來霉素抗性基因等。
可經簡單地離心分離出培養物上清，然后用各種分離和純化技術從培養物上清和細胞裂解產物中分離并純化SZ2/SZ21多肽產物。用于純化和回收所需多肽的方法包括但不只限于硫酸銨沉淀、超濾、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析、親和層析或這些方法的不同組合。
本發明的純化的SZ2/SZ21雙特異性單鏈抗體多肽基本上具有如序列表中SEQ ID NO14所示的氨基酸序列，在不致于對所說多肽的生物學活性造成實質性影響的前提下，可以在序列中加入、刪除、取代和置換個別或部分氨基酸，例如刪除N或C末端的一個或多個氨基酸、刪除或置換全序列中的接頭部分、將序列中的一個或多個氨基酸改換成具有相似帶電性/疏水性的氨基酸或D型氨基酸等。本領域技術人員也可以理解到，這些改動和改變將落入本發明待批權利要求范圍內。
本發明還提供了如SEQ ID NO13所示的編碼SZ2/SZ21雙特異性單鏈抗體的DNA序列及其功能等同物，該DNA序列融合了編碼SZ2和SZ21單鏈抗體的編碼序列，并且在兩者之間加入了一個接頭序列。所說的接頭序列不表達任何功能性多肽產物，但可有效地改善融合產物的柔曲性和穩定性。同時，本發明還提供了攜帶上述DNA序列的重組表達載體。所說的重組表達載體可以是適于在原核或真核宿主中表達的重組表達載體，但本發明優選的是pET22-21-L-2。另外，本發明還提供了被所說的重組表達載體轉化或轉染的原核或真核宿主細胞，特別是大腸桿菌細胞。應特別指出的是，本發明的編碼SZ2/SZ21雙特異性單鏈抗體的DNA序列包括但不僅限于如序列表中SEQ ID NO13所示的序列。本領域技術人員可以理解到，在不改變其所編碼的氨基酸序列的條件下，對所說的DNA序列的任何加入、刪除、取代或置換均將落入本發明待批權利要求范圍內。
本發明進一步提供了生產如上限定的雙特異性單鏈抗體的方法，該方法包括
(1)提供SZ2和SZ21的重鏈和輕鏈可變區編碼序列；(2)通過接頭序列(Gly4Ser)1-3將步驟(1)得到的SZ2或SZ21輕、重鏈可變區的DNA編碼序列連接成單鏈抗體編碼序列；(3)將步驟(2)得到的SZ2、SZ21單鏈抗體DNA編碼序列通過接頭序列(Gly4Ser)1-3可操作地連接到表達載體上；(4)用步驟(3)的重組表達載體轉化或轉染適當的宿主細胞；(5)培養步驟(4)的宿主細胞，并從所說的細胞和其培養基中回收所需的目的多肽。
根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的SZ-2和SZ-21抗體的DNA編碼序列，可以是基于SZ-2和SZ-21抗體多肽的已知氨基酸從頭合成的；也可以是借助適當的引物以聚合酶鏈式反應(PCR)方法，從已知攜帶SZ-2單鏈抗體之DNA編碼序列的重組質粒中擴增地到的；或應用RT-PCR技術，從SZ2和SZ21雜交瘤細胞中擴增出SZ2和SZ21的重鏈和輕鏈可變區基因后彼此連接而成的。為本發明目的，可使用任何一種能夠在細菌細胞中穩定地保留并復制的質粒載體。例如，用于構建本發明的重組表達載體的起始質粒包括但不只限于pET22b、pTZ18R、pBR322、pKK223-3、pUC18、pUC19、pUC119等。但本發明中優選的是高效表達質粒pET22b。另外，用于表達本發明雙特異性單鏈抗體的宿主細胞可以是能夠在適當條件下表達外源融合蛋白質的任何原核細胞、真核細胞、植物細胞或昆蟲細胞。但為本發明目的，其中優選的是原核細胞，特別是大腸桿菌細胞。可以使用本領域已知的硫酸銨沉淀、超濾、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析、親和層析等常規方法或這些方法的不同組合，分離并純化本發明的融合蛋白質，以得到純度大于或等于98％的蛋白質產物。
可以使用流式細胞術、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、Western印跡試驗等方法檢測表達產物的血小板結合能力，并使用瑞斯托霉素、凝血酶或ADP誘導的血小板聚集試驗研究表達產物的血小板結合功能。結果強有力地表明，如上得到的表達產物不僅具有與血小板暨血小板表面膜糖蛋白Ib和IIIa結合活性，而且能夠有效地抑制瑞斯托霉素、凝血酶或ADP誘導的血小板聚集(參見實施例3和4)。
本發明的SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體能夠識別并結合血小板表面膜糖蛋白(GP)Ib和IIIa，從而可有效地抑制血小板粘附和聚集功能。因此，本發明的SZ2/SZ21雙特異性單鏈抗體既可抑制血小板始動活化環節(即血小板粘附功能)，又可抑制血栓的最終形成過程(即血小板聚集功能)。
由于本發明的雙特異性單鏈抗體既可與GPIIIa結合又可與GPIb結合，致使兩者互為導向，實現雙價結合，從而比其前體多肽具有更好的特異性和穩定性。另外，本發明的SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體的分子量相對較小(約64KDa)，所以其免疫原性也相對較低。再者，由于該抗體不帶有Fc末端，因此不會因其與網狀內皮系統的結合而導致血小板細胞的破壞。
本發明的雙特異性單鏈抗體具有結合血小板表面膜糖蛋白Ib和IIIa的活性，即該雙特異性單鏈抗體同時具有單鏈抗體SZ-2和SZ-21的雙重活性，所以，其不僅可抑制血小板始動活化環節(即血小板粘附功能)，而且，還可抑制血栓的最終形成過程(即血小板聚集功能)。本發明的雙特異性單鏈抗體還具有單克隆抗體所固有的高特異性和高親合力的優點。因此，本發明的新型單鏈抗體可以作為一種新的抗血栓侯選藥物，具有常規抗血栓藥物不可比擬的優點和潛在應用價值。另外，基于本發明雙特異性單鏈抗體的上述這些活性和優點，其還可作為一種高特異性和高親合力診斷試劑，用于動、靜脈血栓的無損傷性影像診斷。
以下借助非限制性實施例舉例詳細描述本發明。本領域技術人員可以在不背離本發明的基本精神和原則前提下，改變或改動本說明書中描述的某些技術內容或技術環節，但人們可以理解到，這些平行的改變或改動均將包括在本發明的待批權利要求范圍之內。
實施例1pET22-21-L-2表達載體的構建本實施例旨在舉例說明用于表達本發明的SZ2/SZ21雙特異性單鏈抗體多肽的重組表達載體的構建。
(1)重組質粒pET22-2scFv的構建(a)SZ-2可變區基因的克隆使用Triol試劑盒(Gibco BRL)，從能夠分泌SZ-2抗體并生長良好的雜交瘤細胞(阮長耿等，中國科學(B輯)，948-963，1986)中提取總RNA。使用隨機引物，逆轉錄合成cDNA。然后以此合成的cDNA為模板，并使用下列輕/重鏈引物P15’-AGGTCCAGCTGCAGGAGTCTGG(SEQ ID NO1)和P25’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG(SEQ ID NO2)，以及P35’-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA(SEQ ID NO3)和P45’-GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC(SEQ ID NO4)，分別擴增SZ-2的VH和VL基因。以常規方法純化并回收這些PCR擴增產物后，將他們連接到pUC-Tm(上海生工生物工程公司)載體上。用所得到的連接反應產物轉化感受態大腸桿菌TG1細胞，并于培養后在X-gal和IPTG顯示標志下挑選白色菌落。選擇陽性克隆進行DNA測序(VH和VL基因序列見GenBank，基因序列登錄號為VHAF468835；VLAF468836)。
(b)SZ-2單鏈抗體表達載體的構建將如上得到的克隆載體VH-Tm和VL-Tm并分別用Pst I/Bst EII和Sac I/Xho I雙酶切，回收并純化VH、VL片段后，依次將它們克隆到PSW1-ScFv(英國劍橋大學MCR實驗室Winter博士惠贈)載體中。用所得到的重組質粒轉化感受態TG1細胞并從被轉化的細胞中抽提質粒DNA，然后以酶切法初步鑒定陽性重組子。以陽性重組子為模板，并使用引物P55’-CCAGGTCGACCTGCAGGAGTCAGG(SEQ ID NO5)和P65’-TATGCGGCCGCCTCGAGCTTGGTCC(SEQ ID NO6)，擴增如上得到的VH-VL連接片段。將所得到的連接片段克隆到pUC-Tm載體中，以酶切法篩選陽性克隆。測序并用Sal I/Not I雙酶切后，回收并純化所需的小片段。然后將它們與已用同樣酶切的表達載體pET22b連接，得到定名為pET22-2scFv的重組質粒。
(2)重組質粒pET20-21scFv的構建(a)SZ-21可變區基因的克隆使用Triol試劑盒(Gibco BRL)，從能夠分泌SZ-21抗體并生長良好的雜交瘤細胞(阮長耿等，中華醫學雜志，67(2)76-78，1987)中提取總RNA。使用隨機引物，逆轉錄合成cDNA。然后以此合成的cDNA為模板，使用(1)中所述的同樣引物和方法擴增VH和VL基因。以常規方法純化并回收PCR擴增產物后，將他們連接到pUC18(Invetrogen)載體上。用連接反應產物轉化TG1感受態大腸桿菌，然后在X-gal和IPTG顯示標志下挑選白色菌落。選擇陽性克隆進行DNA測序(VH和VL基因序列見GenBank，基因序列登錄號為VHAF354053；VLAF354054)。
(b)SZ-21單鏈抗體表達載體的構建將如上得到的VH和VL基因片段先后克隆到PSW1-ScFv載體中，并用所得到的重組質粒轉化感受態TG1細胞。從被轉化的細胞中抽提質粒DNA，并以酶切法初步鑒定陽性重組子。以陽性重組子為模板，使用引物P75’-ATTCTGCAGTCGGATCCGGAGTCAGGACCTGAGCTG(SEQ ID NO7)和P85’-TTAGCGGCCGCGAGCTTGGTCCCCCCTCC(SEQ ID NO8)擴增VH-VL連接片段。將所得到的連接片段克隆到pUC18載體中，得到重組載體VHVL-pUC18。用BamH I/Not I雙酶切該克隆后，回收并純化所需的小片段。然后，將它們與已用同樣酶切處理的表達載體pET20b連接，得到定名為pET20-21scFv的重組質粒。
(3)pET22-21-L-2表達載體的構建簡單地說，按照圖1所示的構建流程，首先基于SZ-2單鏈抗體的氨基酸序列和待引入的接頭序列[(Gly4Ser)3]設計并合成一對引物P95’-CACGAATTCCGTCTCCTCAGGTG(SEQ ID NO9)和P105’-GGTGTCGACGATGTCCGATCCG(SEQ ID NO10)，并以已知攜帶SZ-2編碼序列的表達載體pET22-2scFv作為模板，擴增所需的接頭片段基因。PCR反應中所使用的擴增體系為pET22-2scFv載體1μg，P9和P10引物各10pmol，10mM dNTP 1μl，Taq plus聚合酶2U，10×反應緩沖液5μl，加水至50μl。熱循環條件為94℃5分鐘，94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃30秒，共35個循環，然后72℃延伸7分鐘。1.5％Agarose電泳檢測擴增產物約70bp，與預期大小一致(圖2)。使用QIAEX II膠回收試劑盒(Qiagen)回收并純化PCR產物。然后，使用含有PUC-Tm載體1μl，PCR純化產物6μl，T4連接酶1μl(3U)，50％PEG 1μl，10×Buffer 1μl的聯接混合物連接18小時。用此連接產物(5μl)轉化感受態大腸桿菌TG1(100μl)。將被轉化的細菌均勻涂布于含氨芐青霉素及X-gel和IPTG顯色標志的瓊脂平皿上，37℃保溫過夜后挑取白色菌落并以常規堿裂解法抽提重組質粒。根據酶切片段大小，篩選陽性重組子。測序結果表明，擴增產物即為目的基因片段。PCR產物純化后，用Sal I/EcoR I雙酶切，回收并純化小片段，與同樣酶切處理的pET22-2scFv單鏈抗體表達載體連接后，轉化感受態大腸桿菌JM109菌株。將被轉化的細菌涂布于含100μg/ml氨芐青霉素平皿上，選擇陽性克隆并篩選陽性質粒。
以SZ-21單鏈抗體表達載體為模板并使用引物P115’-TATTGGCCATGGCGGAAGTCAGGA(SEQ ID NO11)和P125’-TGATCGGAATTCGCCGCGAGCTTGGTCC(SEQ ID NO12)，擴增其中的SZ-21單鏈抗體片段基因。反應中所使用的擴增體系為SZ-21單鏈抗體表達載體1μg，P11、P12引物各10pmol，10mM dNTP 1μl，Taq plus聚合酶2U，10×反應緩沖液5μl，加水至50μl。PCR循環條件為94℃預變性5分鐘，然后94℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分30秒，共35個循環后72℃延伸7分鐘。電泳檢測(1.0％Agarose)結果表明，擴增產物具有預期的大小(約750bp)(見圖2)。將該片段與PUC-Tm載體連接后，進行測序分析以驗證之。純化此PCR產物并用BamH I/EcoR I雙酶切，然后回收并純化酶切片段。將所需的片段與同樣酶切處理的上述陽性載體連接后，用連接產物轉化感受態大腸桿菌JM109菌株。將被轉化的細菌涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的平皿上，選擇陽性克隆并酶切篩選陽性質粒(見圖2)。結果獲得了含完整SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體基因的重組表達載體pET22-21-L-2。SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體的DNA編碼序列如SEQ ID NO13所示。
實施例2SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體在大腸桿菌中的誘導表達及表達產物的分離和純化(1)SZ-2/SZ-21雙特異單鏈抗體在大腸桿菌中的誘導表達按照常規方法，用pET22-21-L-2質粒轉化感受態大腸桿菌菌株BL21(DE3)plys(Novagen)。然后將被轉化的細胞涂布于含有100μg/ml氨芐青霉素和34μg/ml氯霉素的平皿中。基于抗生素抗性挑取單個陽性菌落(Ampr)并接種至2ml LB培養液(含100μg/ml氨芐青霉素，34μg/ml氯霉素)中，37℃振搖培養過夜。培養后收集細菌細胞，并按1∶20(V/V)接種于50ml含相同濃度抗生素的LB中，37℃繼續振搖培養。待A600＝0.6時，加IPTG(1mmol/L)誘導，37℃振搖培養4.5小時。培養完成后，離心收集細菌細菌，進行電泳(10％SDS-PAGE)分析。結果在分子量約64kDa處可見一條明顯的蛋白條帶(見圖3)。
(2)表達產物的Western印跡分析離心收集誘導的和非誘導的細菌并用加樣緩沖液裂解后，離心收集上清并將裂解產物轉移至硝酸纖維薄膜上。2％BSA封閉后，以Penta-His(Qiagen)為第一抗體，以辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體(GAM-HRP)(上海華美公司)為第二抗體，并以氯奈酚為顯色劑進行Western印跡分析。結果表明誘導表達的多肽即為本發明的目的多肽(見圖3)。
(3)表達產物(包涵體)的分離離心(5000rpm，4℃，10分鐘)收獲細菌。用含有NaCl(0.15mol)的Tris-HCl(20mmol/L)洗滌液洗1次后，加入1/10(V/V)溶菌液(20mmol/L Tris-HCl，1％Triton X-100，250μmol/LPMSF，100μg/ml溶菌酶)，30℃處理15分鐘，然后在冰上超聲處理(輸出功率80％)10秒鐘并以10秒鐘間隔反復3～5次，至細胞懸液不再粘稠。再次離心(15000rpm，4℃，20分鐘)收集上清及沉淀。向沉淀物中加2.5ml Binding緩沖液(5mM咪唑，0.5mM NaCl，20mM Tirs-HCl，6M尿素)，冰中攪拌溶解1小時，4℃離心(16000rpm)20分鐘后收集上清并用0.45μm濾膜(Millipor)過濾之。
(4)表達產物的純化和復性取His-Bind Rasine凝膠(Novagen)1ml裝柱，并依次用3倍體積的雙蒸水、5倍體積的Charge緩沖液(50Mm NiSO4)和3倍體積的結合(5mM咪唑，0.5mM NaCl，20mM Tris-HCl)緩沖液上柱處理凝膠。然后將上述包涵體提取液上柱(流速為10倍柱床體積/小時)，并依次用10倍體積的結合緩沖液和6倍體積的洗滌緩沖液(60mM咪唑，0.5mM NaCl，20mM Tris-HCl)洗柱。最后用6倍體積的洗脫緩沖液(300mM咪唑，0.5mM NaCl，20mM Tris-HCl)洗脫所需的蛋白質。本發明的SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO14所示。
收集洗脫的蛋白質，分別在400ml下列溶液中透析①2mol/L尿素，1mmol/L氧化型谷胱甘肽；②2mol/L尿素+0.5mmol/L還原型谷胱甘肽；③0.15M NaCl，50mM Tirs-HCl。用PEG20000初步濃縮后，再次超濾(MicroconTM10)濃縮。以Bradford法定量蛋白質，結果純化SZ-2/SZ-21雙特異單鏈抗體的產量達65mg/L。
實施例3SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體的血小板結合活性本實施例描述分別以酶聯免疫吸附法(ELISA)、流式細胞術和Western印跡法，檢測本發明SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體的血小板結合活性。
(1)ELISA法用TEN溶液(Tris，EDTA，)將得自健康人全血的富含血小板血漿(PRP)洗3次，然后以2×105血小板/孔的濃度包被微量滴定板。4℃封閉過夜并用0.5％戊二醛固定。洗滌(PBS)后，向其中加入稀釋至不同濃度的SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體，并于37℃下保溫2小時。然后，以Penta-His作為第一抗體并以GAM-HRP作為第二抗體，進行常規ELISA檢測，結果以A492值表示。同時，以BSA-PBS作為陰性對照，并分別以SZ-2和SZ-21單克隆抗體作為陽性對照。結果如下列表1所示。
表1 SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體與血小板結合的ELISA法檢測結果(OD492)抗體濃度(μg/ml)10 1 0.1 0.01SZ-2 mAb1.1971.066 0.839 0.171SZ-21 mAb 1.3201.242 1.185 0.985SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體0.8370.558 0.445 0.0872％BSA-PBS 00 0 0從表1所示的結果可以看出，SZ-2/SZ-21雙特異單鏈抗體具有良好的與血小板結合活性。
(2)流式細胞術向SZ-2/SZ-21雙特異單鏈抗體(1μg)在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中形成的溶液(總體積為100μl)內，加入3μl PRP(血小板濃度為3×108/ml)并于室溫下放置30分鐘。洗滌后，以Penta-His作為第一抗體并以熒光素標計的GAM作為第二抗體，在流式細胞儀上進行流式細胞分析。同時，以BSA作為陰性對照，并分別以SZ-2和SZ-21單克隆抗體作為陽性對照。由圖4所示結果可以看出，1μg SZ-2單抗與血小板結合率為86％，1μgSZ-21單抗與血小板結合率為87％，而1μg SZ-2/SZ-21雙特異單鏈抗體與血小板結合率為79％，且熒光強度明顯高與SZ-2或SZ-21單抗。這些結果表明，本發明的SZ-2/SZ-21雙特異單鏈抗體具有與血小板結合的能力。
(3)Western印跡法從抗凝全血中分離富含血小板血漿(PRP)，用TEN溶液洗3次后，將血小板數調整至1×108/ml。向該血小板懸液中加入1mmol/L PMSF、1％TritonX-100裂解血小板后，離心收集上清，按40μl/孔的加樣量，進行還原性SDS-PAGE(8％)電泳。轉移至硝酸纖維薄膜上并用2％BSA-PBS封閉后，加SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體37℃溫育2小時。以Penta-His為第一抗體，并以GAM-HRP為第二抗體，進行Western印跡分析。同時，以SZ-2或SZ-21單抗作為陽性對照。由圖5可見，SZ-2/SZ-21雙特異單鏈抗體既表現有與SZ-2單抗相同的血小板膜糖蛋白(GP)Ib結合活性，又表現有與SZ-21單抗相同的血小板膜糖蛋白(GP)IIIa結合活性。
實施例4SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體的血小板粘附和聚集抑制活性本實施例描述分別以瑞斯托霉素誘導的血小板聚集試驗、凝血酶誘導的血小板聚集試驗和ADP誘導的血小板聚集試驗，檢測本發明的SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體的血小板聚集抑制活性。
(1)瑞斯托霉素誘導的血小板聚集試驗取健康人枸櫞酸鹽抗凝全血，從中分離富含血小板血漿(PRP)，并調整血小板濃度至3×108/ml。取20μl不同濃度的SZ-2/SZ-21雙特異單鏈抗體加入180μl PRP中。同時取SZ-2作為陽性對照，并以PBS作為陰性對照。37℃孵育5分鐘后，加入瑞斯托霉素(Sigma，終濃度為1.25mg/ml)以誘導血小板聚集。使用血小板聚集儀檢測聚集結果。由圖6可見，PBS陰性對照中血小板最大聚集率為74％，SZ-2單抗陽性對照(10μg/mL)中血小板最大聚集率為30％，而SZ-2/SZ-21雙特異單鏈抗體(20μg/mL)中血小板最大聚集率為34％。這些結果清楚地表明，本發明的SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體可有效地抑制瑞斯托霉素誘導的血小板聚集。
2)凝血酶誘導的血小板聚集試驗取健康人EDTA抗凝全血，從中分離富含血小板血漿(PRP)。使用血小板洗滌液(0.5％EDTA-Na2，NaCl 0.137M，KCl 2.7mM，NaHCO312mM，NaH2PO40.36mM，葡萄糖5mM)洗滌后，調整血小板濃度至3×108/ml。取20μl不同濃度的SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體加入180μl血小板懸液中。同時，取SZ-2作為陽性對照，并以PBS作為陰性對照。37℃孵育5分鐘后，加入凝血酶(珠海Dalte，終濃度為10u/ml)以誘導血小板聚集，并以血小板聚集儀檢測聚集結果。由圖7可見，PBS陰性對照中血小板最大聚集率為70％，SZ-2單抗陽性對照(10μg/mL)中血小板最大聚集率為13％，而SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體(20μg/mL)中血小板最大聚集率為19％。因此這些結果表明，SZ-2/SZ-21雙特異單鏈抗體可有效地抑制凝血酶誘導的血小板聚集。
(3)ADP誘導的血小板聚集試驗取健康人枸櫞酸鹽抗凝全血，從中分離富含血小板血漿(PRP)，并調整血小板濃度至3×108/ml。取20μl不同濃度的SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體加入180μl PRP中，同時取SZ-21作為陽性對照，并以PBS作為陰性對照。37℃孵育5分鐘后，加入ADP(Sigma，終濃度為2μM)以誘導血小板聚集，并使用血小板聚集儀檢測聚集結果。由圖8可見，PBS陰性對照中血小板最大聚集率為73％，SZ-21單抗陽性對照(10μg/mL)中血小板最大聚集率為21％，而SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體(30μg/mL)中血小板最大聚集率為29％。這一結果也同樣表明，本發明的SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體可有效地抑制凝血酶誘導的血小板聚集。
序列表(1)一般信息(I)申請人江蘇省血液研究所(II)發明名稱具有血小板粘附和聚集抑制活性的雙特異性單鏈抗體(III)序列數14(IV)通訊地址(A)聯系人阮長耿(B)街道十梓街96號(C)城市蘇州(D)國家中華人民共和國(E)郵編215006(V)計算機可讀形式(A)介體類型3.5英寸軟盤(B)計算機IBM PC(C)操作系統WINDOW9(D)軟件WORD98(VI)電訊信息(A)電話86-0512-5101708(B)電傳86-0512-5101708(2)SEQ ID NO1的信息(I)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO1AGGTCCAGCTGCAGGAGTCTGG(2)SEQ ID NO2的信息(I)序列特征(A)長度34堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO2TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG(2)SEQ ID NO3的信息(I)序列特征(A)長度34堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO3GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA(2)SEQ ID NO4的信息(I)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO4GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC(2)SEQ ID NO5的信息(I)序列特征(A)長度24堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO5CCAGGTCGACCTGCAGGAGTCAGG(2)SEQ ID NO6的信息(I)序列特征(A)長度25堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO6TATGCGGCCGCCTCGAGCTTGGTCC(2)SEQ ID NO7的信息(I)序列特征(A)長度36堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO7ATTCTGCAGTCGGATCCGGAGTCAGGACCTGAGCTG-(2)SEQ ID NO8的信息(I)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO.8TTAGCGGCCGCGAGCTTGGTCCCCCCTCC(2)SEQ ID NO9的信息(I)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO9CACGAATTCCGTCTCCTCAGGTG(2)SEQ ID NO.10的信息(I)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO10GGTGTCGACGATGTCCGATCCG(2)SEQIDNO11的信息(I)序列特征(A)長度24堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO11TATTGGCCATGGCGGAAGTCAGGA(2)SEQ ID NO12的信息(I)序列特征(A)長度28堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO12TGATCGGAATTCGCCGCGAGCTTGGTCC(2)SEQ ID NO13的信息(I)序列特征(A)長度1494堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型基因(III)序列描述SEQ ID NO13GAG TCA GGA CCT GAG CTG GTG AAC CCT GGA GCT TCA ATG AAG ATT TCCTGT AAG GCA TCT GGT TAC TCA TTC ACT GGC TAC ACC ATG AAC TGG GTGAAA CAG AGC CAT GGA AAG AAC CTT GAG TGG ATT GGA CTT ATT AAT CCTTAC CAT GGT GGT TCT AGC TAC AAC CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACATTG ACT GTA GAC AAG TCA TCC AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTC CTC AGTCTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TTC TGT GCA AGA AGG GAT GCTAAC TAC GTT TTT TTC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACCGTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGCGGA TCG GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCA CTC ATG TCT GCA TCTCCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGT TCA GGT GTA AGTTAC ATT CAC TGG TAC CAG CAG AAG TCA GGC ACC TCC CCC AAA AGA TGGATT TAT GAC ACA TCC AAA CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGTGGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AAC ATG GAGGCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT AGT AAA CCACCC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTC GCG GCG AAT TCC GTC TCC TCAGGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GACATC GTC GAC CTG CAG GAG TCA GGT GGA GGA TTG GTG CAG CCT AAA GGGTCA TTG AAA CTC TCG TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AAT ACC TACGCC ATG AAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTG GAA TGG GTTGCT CGC ATA AGA AAT AAA AAT AAT AAT TAT GCA ACG CAT TAT GCC GAGTCA GTG AAA GAC AGG TTC ATC ATC TCC AGA GAT GAT TCA CAA AGC ATGCTC TAT CTG CAA ATG AAC AAC TTG AAA ACT GAG GAC ACA GCC ATG TATTAC TGT GTG AGG CCC TTT AGT ACG GCT ACA GGG GCT ATG GAC TAC TGGGGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGCGGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCTCCA TCC AGT CTG TCT GCA TCC CTT GGA GAC ACA ATT ACC ATC ACT TGCCAT GCC AGT CAG AAC ATT AAT GTT TGG TTA AGC TGG TAC CAG CAG AAACCA GGA AAT ATT CCT AAA CTA TTG ATC TAT AAG GCT TCC AAC TTG CACACA GGC GTC CCA TCA AGG TTT AGT GGC AGT GGA TCT GGA ACA GGT TTCACA TTA ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAC ATT GCC ACT TAC TACTGT CAA CAG GGT CAA AGT TAT CCT CTC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAGCTC GAG(2)SEQ ID NO14的信息(I)序列特征(A)長度498氨基酸(B)類型多肽(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型多肽(III)序列描述SEQ ID NO14Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Asn Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser GlyTyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu TrpIle Gly Leu Ile Asn Pro Tyr His Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala ThrLeu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu AspSer Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Thr Arg Asp Ala Asn Tyr Val Phe Phe Phe Asp Tyr TrpGly Gln Gly Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly GlyGly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu LysVal Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser GlyThr Ser Pro Lys Arp Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe SerGly Ser Gly Ser Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Gly Thr SerTyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ala AlaAsn Ser Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser AspIle Val Asp Lle Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu SerCys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Aln Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro GlyLys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Asn Lys Asn Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr AlaGlu Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met Leu Tyr Leu GlnMet Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Pro Phe Ser Thr AlaThr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser SerLeu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val TrpLeu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu IIe Tyr Lys Ala Ser AsnLeu HisThr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu ThrIle Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro LeuThr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
權利要求
1.具有血小板粘附和聚集抑制活性的SZ-2/SZ-21雙特異性單鏈抗體。
2.根據權利要求1的雙特異性單鏈抗體，其中所說的雙特異性單鏈抗體是由具有抗GPIbα活性的SZ-2單鏈抗體和具有抗GPIIIa活性的SZ-21單鏈抗體融合而成的，并且兩者之間存在有接頭序列。
3.根據權利要求1的雙特異性單鏈抗體，其中所說的雙特異性單鏈抗體基本上具有如序列表中SEQ ID NO14所示的氨基酸序列。
4.根據權利要求1的雙特異性單鏈抗體，其中所說的接頭序列是(Gly4Ser)1-3.
5.如序列表中SEQ ID NO13所示的編碼SZ2/SZ21雙特異性單鏈抗體的DNA序列及其功能等同物。
6.攜帶權利要求5所限定的DNA序列的重組表達載體。
7.被權利要求6的重組表達載體轉化或轉染的宿主細胞。
8.生產如權利要求1所限定的雙特異性單鏈抗體的方法，該方法包括(1)提供SZ2和SZ21的重鏈和輕鏈可變區DNA編碼序列；(2)通過接頭序列(Gly4Ser)1-3將步驟(1)得到的SZ2或SZ21輕、重鏈可變區的DNA編碼序列連接成單鏈抗體編碼序列；(3)將步驟(2)得到的SZ2、SZ21單鏈抗體DNA編碼序列通過接頭序列(Gly4Ser)1-3可操作地連接到適當的表達載體上；(4)用步驟(3)的重組表達載體轉化或轉染適當的宿主細胞；(5)培養步驟(4)的宿主細胞，并從所說的細胞和其培養基中回收所需的目的蛋白質。
9.如權利要求1所限定的雙特異性單鏈抗體在生產抗血小板粘附和聚集的藥物中的應用。
10.如權利要求1所限定的雙特異性單鏈抗體在免疫成像診斷中的應用。
全文摘要
本發明涉及由已知分別對血小板表面糖蛋白GPIbα和GPIIIa具有特異結合活性的SZ－2和SZ－21單鏈抗體融合而成的雙特異性單鏈抗體。本發明的雙特異性單鏈抗體同時具有單鏈抗體SZ－2和SZ－21的雙重活性，其不僅可抑制血小板始動活化環節(即血小板粘附功能)，還可抑制血栓的最終形成過程(即血小板聚集功能)。因此，本發明的新型單鏈抗體作為一種新的抗血栓候選藥物，具有常規抗血栓藥物不可比擬的優點和潛在應用價值。
文檔編號C12N15/11GK1445241SQ0211110
公開日2003年10月1日 申請日期2002年3月20日 優先權日2002年3月20日
發明者阮長耿 申請人:蘇州大學附屬第一醫院