編碼人成骨蛋白－1的重組核酸及其用途的制作方法

專利名稱：編碼人成骨蛋白－1的重組核酸及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及編碼人成骨蛋白-1的重組核酸及其表達。
背景技術：
OP-1(osteogenic protein-1)即成骨蛋白-1，是BMP即骨形態發生蛋白家族中的成員。有些文獻中稱之為BMP-7。人OP-1的cDNA編碼NQEALR肽段。人OP-1(hOP-1)的cDNA含有一個1293bp的開放讀框，編碼431個氨基酸的hOP-1蛋白。在編碼的第一個蛋氨酸后面分別為疏水性信號肽段、前體肽段和成熟肽段。成熟肽具7個Cys，形成三個鏈內二硫鍵，兩成熟肽單體通過一個鏈間二硫鍵形成二聚體。成熟肽單體有一個位點被糖基化。信號肽段、前體肽段參與OP-1表達的胞內翻譯后加工過程，這些加工過程只在真核細胞發生。在原核系統表達OP-1很難得到活性產物，國內外文獻尚未見到成功報道。OP-1已經在CHO、COS-1和昆蟲細胞中成功表達出有活性的成熟蛋白(Sampath TK，Maliakal JC，Hauschka PV，Jones WK，Sasak H，Tucker RF，White KH，Coughlin JE，Tucker MM，Pang RH，et al.J Biol Chem 1992 Oct 5；267(28)20352-62)。而且，上述表達所用僅限于OP-1的天然序列，至今尚為有關人工優化的報道。
OP-1具有廣泛的生理功能，對骨骼、眼、腎、腦的發育起著重要調節作用[JenaN，Martinseisdedos C，Mccue P，et al.Exp cell Res，1997，23028-37.]。尤其是，OP-1在誘導骨組織和腎組織形成方面起重要作用。至今已有大量報道證實OP-1有助于骨及軟骨組織缺損的修復，顯示了良好的臨床應用前景。骨折的治療常使用大量的骨移植以誘發缺損處的愈合，自體或異體骨移植是最常被使用的方法，但各有其使用上的限制。目前已知當利用自體或異體骨移植治療片段骨缺損，BMP蛋白能促進骨愈合。
但是，人們始終需要不斷提高目的蛋白例如OP-1蛋白的表達量，這對于科研和進一步的產業化應用無疑具有巨大的潛在價值。

發明內容
本發明的目的在于提供一種編碼hOP-1的重組核酸，能夠實現在哺乳動物，尤其是CHO細胞中的高表達。
本發明的目的還在于提供用于實現以上目的載體。
本發明的目的還載體提供用于實現以上目的宿主細胞。
為了實現以上目的，本發明提供了一種編碼hOP-1的重組核酸，其序列如SEQ ID NO1所述。
本發明的重組核酸可用多種方法獲得，其中包括，以公開的天然序列(例如的Genbank登錄號XM-030620)為模板進行定點誘變；或根據本發明給定的序列進行全合成。這些都已是本領域的常規技術。而且，核苷酸序列的鑒定也是本領域的常規技術，在現有文獻中多有記載。因此，根據本發明給定的核苷酸序列，本領域技術人員不難結合現有技術制備得到本發明的編碼hOP-1的重組核酸。
本發明還提供一種載體，其中含有本發明編碼hOP-1的重組核酸。在本領域中，通過適當的克隆技術，將目的核酸片段插入合適的載體以實現保存，擴增和/或表達等目的，已是一般常規技術。合適載體的選擇取決于克隆目的，載體容留，與宿主細胞的相容性，酶切位點等多種因素，本領域技術人員不難根據具體情況做出適當選擇。可用以本發明的載體例如但不限于pMSG，pGEM，pET15b，pET32b(Invitrogen公司產品)等。
本發明還提供了一種細胞，包含本發明編碼hOP-1的重組核酸，所述核酸處于與所述細胞相容的表達系統中。所述細胞選自哺乳動物細胞，尤其是CHO細胞。所述宿主細胞可以通過常規轉染或轉化而獲得所述核酸。挑選與宿主細胞相容的表達載體已是本領域的常規技術，結合大量已有文獻，不難做出此類選擇。
從后文實施例中可以看出，本發明編碼hOP-1的重組核酸顯著提高了hOP-1蛋白在宿主細胞內的表達，最大提高可達6.3倍。


圖1為本用于構建本發明表達載體的pMSG載體。
具體實施例方式
編碼hOP-1的重組核酸及其制備本發明對hOP-1的編碼核酸進行了重組設計，所得人工序列如SEQ ID NO1所述。用DNAstar軟件的MegAlign功能將本發明人工序列與發表的hOP-1基因的編碼區的DNA序列(自GeneBank登錄號XM_030620)進行比較，發現兩者有175個堿基的差異，均勻分布在這個編碼區。
有多種方法可獲得序列已知的聚核苷酸，這些都已是本領域的常規技術。例如，本發明的人工序列可通過長鏈PCR合成來制備(參見Chrisostomos Prodromouand Larurence H.Pearl，1992，ProtocolRecursive PCRa novel technique for totalgene synthesis，Protein Engineering，5827～829.)。具體的說，參照該文獻所述，根據本發明的人工序列設計重疊PCR引物，從序列的5′至3′，包括正向引物F1-18(SEQ ID NO2-19)，及反向引物B1(SEQ ID NO20)。其中，為了進行后續操作，在第一正向引物F1的5′端增加保護性堿基及Nhe I位點，即ctcgctagc；同理，在反向引物B1的5′端增加保護性堿基及位點Xho I catctcgag。合成引物(上海生化公司)并用PEGA純化，在無菌水中制備成500ng/μL的儲備液。
在如下PCR體系中進行反應F1和B1終濃度100ng/μL，其余片段為20nM/μL，1X PCR反應緩沖液，1.5mM MgCl2，200nM的dNTPs，Pfu DNA聚合酶10U。反應程序為94℃，預變性5分鐘；主循環為94℃變性1分鐘，55℃1分鐘，72℃5分鐘，循環30次；72℃，后延伸5分鐘。
上述PCR完畢后，在1％瓊脂糖電泳上鑒定合成產物。割取1300bp左右的明顯條帶，用Promega公司的膠回收試劑盒進行回收。人工序列的鑒定取5微升如上制備的本發明重組DNA，與1微升pGEM-T easy載體(Promega產品)混合，加入2微升10X連接緩沖液(Promega產品)和1微升NEB的T4 DNA連接酶，充分混合后在16℃反應10小時以上。按常規方法用所得重組載體轉化大腸桿菌DH5a菌株，經藍/白斑篩選獲得陽性克隆。酶切鑒定確認帶有目的插入片段的克隆，在ABI377全自動測序儀上對其進行雙向測序。確認序列與本發明設計的SEQ ID NO1完全相符。該克隆在本發明中命名為pGEM/rhOP-1，其中的“r”表示重組。天然hOP-1基因的制備為了進行后文表達水平比較試驗，另制備天然hOP-1基因。
取新鮮胎盤組織200mg(上海長海醫院提供)，剪碎后在液氮中研磨至極細，立即加入2ml TRIZOL勻漿(購自Invitrogene公司)，按廠家說明書提取總RNA。所提總RNA在1.5％瓊脂糖電泳上鑒定完整性，28sRNA、18sRNA兩條標志帶完整清晰，表明所需的RNA沒有降解。
根據已經發表的hOP-1 DNA序列(GenBank登錄號XM_030620)設計引物，其中引物F(SEQ IN NO21)設計在ORF上游6～20bp，并引入以斜體表示的HindIII位點。引物R(SEQ IN NO22)中引入以斜體表示的BamHI位點引物F5 GC AAGCTTAGCGCGTAGAGCCG 3引物R5 TA GGATCCCTAGTGGCAGGCC 3合成上述引物(上海生工公司)并進行PAGE純化。采用反轉錄試劑盒(Promega公司)，將以上提取的總RNA以隨機六核苷酸引物反轉錄成單鏈cDNA模板。對反轉錄模板用引物F和引物R擴增hOP-1完整基因。具體擴增條件為50微升反應體系，其中包含1X PCR反應緩沖液，引物F和引物R的濃度均為100pM，鎂離子1.5mM，模板cDNA濃度為100微摩爾，含5U Pfu DNA聚合酶(購自NEB公司)。擴增程序為預變性94℃2分鐘；主循環94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃2.5分鐘，共30個循環；后延伸72℃5分鐘。平行進行5管擴增以獲取足量的擴增產物。以上擴增產物在1％瓊脂糖電泳上進行鑒定。發現有一分子量約1kb的單一條帶，與預期大小相符。用膠回收試劑盒(Bio101產品)，按照產品說明書，進行凝膠回收，得到純化的DNA。
按照產品說明書，將上述所得純化DNA插入pGEM-T載體(Promega產品)，獲得重組DNA。然后，用上述重組DNA按常規操作轉化大腸桿菌DH5a菌株，通過藍/白斑篩選獲得陽性克隆。挑選陽性克隆進行酶切鑒定，確認帶有目的插入片段的轉化克隆。在ABI377全自動測序儀上對所得陽性轉化克隆進行雙向測序，確認與已知hOP-1天然基因序列完全一致。該克隆在本發明中命名為pGEM/hOP-1。hOP-1基因天然序列與人工序列的表達及比較用常規方法抽提前述天然hOP-1基因克隆pGEM/hOP-1和編碼hOP-1的重組核酸克隆pGEM/rhOP-1的DNA。分別用Nhe I和Xho I進行雙酶切。在0.8％瓊脂糖電泳上進行分離，各切取分子量約1.3kd左右的帶后用Promega公司的凝膠回收試劑盒回收該片段，即天然和重組hOP-1 DNA。
將上述回收的天然和重組DNA連接到pMSG表達載體(購自Pharmacia公司)的Nhe I/Xho I位點上，獲得含天然hOP-1基因的表達載體pMSG/hOP-1和含本發明重組hOP-1基因的載體pMSG/rhOP-1。
用購自Invitrogene公司的轉染試劑盒，按照說明書，采用脂質體法，用以上所得表達載體轉染CHO細胞。轉染后的CHO細胞經連續3個月的霉酚酸篩選，其濃度從0.05uM到10uM，每兩周增加一次濃度，每次霉酚酸的用量約為前一次的2倍，具體視細胞生長情況而定。
挑選陽性克隆進行細胞培養，培養基為15％胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME；37℃，5％CO2培養箱中培養72小時進行擴增。然后用極度稀釋法進行單克隆化。用ELISA方法檢測培養物上清液中的表達量，其中，一抗為鼠抗人OP-1單抗(購自深圳晶美公司)，二抗為HRP標記的兔抗鼠單克隆抗體(購自華美生物工程公司)。測定結果含天然hOP-1基因的CHO克隆最高表達強度為22.13mg/μL；含本發明編碼hOP-1的重組核酸即工序列的CHO克隆最高表達強度則高達139.43mg/μL，是天然基因表達強度的6.3倍。由此證明，本發明編碼hOP-1的重組核酸與天然hOP-1基因相比，顯著提高了其在CHO細胞中的表達。hOP-1表達產物的生物活性鑒定將CHO細胞株pMSG/hOP-1和pMSG/rhOP-1分別接種在50ml RPMI1640培養基，37℃，5％CO2培養箱中進行培養。7日后取25ml細胞培養液，500RPM離心10分鐘取上清。
將上述兩種來源培養上清分別置于Millipore Microcon MW15000的離心濃縮管中，5000rpm離心30分鐘，使其濃縮10倍左右。然后，以1∶5、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100的稀釋比加入成骨細胞MC3T3-E1細胞培養基(GIBCO BRL公司產品V0743)中。
將500μl上述加有不同濃度OP-1上清液的成骨細胞MC3T3-E1細胞培養基加入到96孔板中，每種濃度6個孔。以不加OP-1上清液的成骨細胞MC3T3-E1細胞培養基作為陰性對照。然后在每個孔中加入20微升細胞密度為1×106細胞/ml的成骨細胞MC3T3-E1，37℃培養72小時后取50微升細胞測定堿性磷酸酶(AP)活性。活性測定用NBT/BCIP法進行顯色反應，在酶標儀上讀取495nm處的光吸收。結果如下 從上述結果可以看出，無論是rhOP-1，還是rhHOP-1，其表達產物都有顯著的刺激成骨細胞AP表達的能力。由于AP水平是成骨細胞分化指征之一，說明我們獲得的含rhHOP-1細胞株能夠表達有生物活性的OP-1蛋白。其中，rhHOP-1上清液具有更高的生物活性，因為其表達強度較高。
序列表<110>上海中信國健藥業有限公司<120>編碼人成骨蛋白-1的重組核酸及其用途<130>020764<160>22<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1293<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<400>1atgcacgtgc gctccctgcg cgccgccgcc ccccactcct tcgtggccct gtgggccccc 60ctgttcctgc tgcgctccgc cctggccgac ttctccctgg acaacgaggt gcactcctcc120ttcatccacc gccgcctgcg ctcccaggag cgccgcgaga tgcagcgcga gatcctgtcc180atcctgggcc tgccccaccg cccccgcccc cacctgcagg gcaagcacaa ctccgccccc240atgttcatgc tggacctgta caacgccatg gccgtggagg agggcggcgg ccccggcggc300cagggcttct cctaccccta caaggccgtg ttctccaccc agggcccccc cctggcctcc360ctgcaggact cccacttcct gaccgacgcc gacatggtga tgtccttcgt gaacctggtg420gagcacgaca aggagttctt ccacccccgc taccaccacc gcgagttccg cttcgacctg480tccaagatcc ccgagggcga ggccgtgacc gccgccgagt tccgcatcta caaggactac540atccgcgagc gcttcgacaa cgagaccttc cgcatctccg tgtaccaggt gctgcaggag600cacctgggcc gcgagtccga cctgttcctg ctggactccc gcaccctgtg ggcctccgag660gagggctggc tggtgttcga catcaccgcc acctccaacc actgggtggt gaacccccgc720cacaacctgg gcctgcagct gtccgtggag accctggacg gccagtccat caaccccaag780ctggccggcc tgatcggccg ccacggcccc cagaacaagc agcccttcat ggtggccttc840ttcaaggcca ccgaggtgca cttccgctcc atccgctcca ccggctccaa gcagcgctcc900cagaaccgct ccaagacccc caagaaccag gaggccctgc gcatggccaa cgtggccgag960aactcctcct ccgaccagcg ccaggcctgc aagaagcacg agctgtacgt gtccttccgc 1020gacctgggct ggcaggactg gatcatcgcc cccgagggct acgccgccta ctactgcgag 1080ggcgagtgcg ccttccccct gaactcctac atgaacgcca ccaaccacgc catcgtgcag 1140accctggtgc acttcatcaa ccccgagacc gtgcccaagc cctgctgcgc ccccacccag 1200ctgaacgcca tctccgtgct gtacttcgac gactcctcca acgtgatcct gaagaagtac 1260cgcaacatgg tggtgcgcgc ctgcggctgc cac1293<210>2<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>2ctcgctagca tgcacgtgcg ctccctgcgc gccgccgccc cccactcctt cgtggccctg60tgggcccccc tg72<210>3<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>3ctgtgggccc ccctgttcct gctgcgctcc gccctggccg acttctccct ggacaacgag60gtgcac 66<210>4<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>4caacgaggtg cactcctcct tcatccaccg ccgcctgcgc tcccaggagc gccgcgagat60gcagcg 66<210>5<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>5cgagatgcag cgcgagatcc tgtccatcct gggcctgccc caccgccccc gcccccacct60gcaggg 66<210>6<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>6gcccccacct gcagggcaag cacaactccg cccccatgtt catgctggac ctgtacaacg60ccatgg 66<210>7<211>83<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>7ccgtggagga gggcggcggc cccggcggcc agggcttctc ctacccctac aaggccgtgt60tctccaccca gggccccccc ctg83<210>8<211>82<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>8cagggccccc ccctggcctc cctgcaggac tcccacttcc tgaccgacgc cgacatggtg60atgtccttcg tgaacctggt gg 82<210>9<211>83<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>9cgtgaacctg gtggagcacg acaaggagtt cttccacccc cgctaccacc accgcgagtt60ccgcttcgac ctgtccaaga tcc83<210>10<211>83<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>10tgtccaagat ccccgagggc gaggccgtga ccgccgccga gttccgcatc tacaaggact60acatccgcga gcgcttcgac aac83<210>11<211>82<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>11gagcgcttcg acaacgagac cttccgcatc tccgtgtacc aggtgctgca ggagcacctg60ggccgcgagt ccgacctgtt cc 82<210>12<211>82<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>12gtccgacctg ttcctgctgg actcccgcac cctgtgggcc tccgaggagg gctggctggt60gttcgacatc accgccacct cc 82<210>13<211>84<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>13gccacctcca accactgggt ggtgaacccc cgccacaacc tgggcctgca gctgtccgtg60gagaccctgg acggccagtc catc 84<210>14<211>84<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>14gacggccagt ccatcaaccc caagctggcc ggcctgatcg gccgccacgg cccccagaac60aagcagccct tcatggtggc cttc 84<210>15<211>89<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>15ggtggccttc ttcaaggcca ccgaggtgca cttccgctcc atccgctcca ccggctccaa60gcagcgctcc cagaaccgct ccaagaccc 89<210>16<211>90<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>16cgctccaaga cccccaagaa ccaggaggcc ctgcgcatgg ccaacgtggc cgagaactcc60tcctccgacc agcgccaggc ctgcaagaag 90<210>17<211>91<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>17ccaggcctgc aagaagcacg agctgtacgt gtccttccgc gacctgggct ggcaggactg60gatcatcgcc cccgagggct acgccgccta c 91<210>18<211>95<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>18gctacgccgc ctactactgc gagggcgagt gcgccttccc cctgaactcc tacatgaacg60ccaccaacca cgccatcgtg cagaccctgg tgcac 95<210>19<211>96<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>19cagaccctgg tgcacttcat caaccccgag accgtgccca agccctgctg cgcccccacc60cagctgaacg ccatctccgt gctgtacttc gacgac 96<210>20<211>84<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>20catctcgagt ggcagccgca ggcgcgcacc accatgttgc ggtacttctt caggatcacg60ttggaggagt cgtcgaagta cagc 84<210>21<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>21gcaagcttag cgcgtagagc cg 22<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>22taggatccct agtggcaggc c 2權利要求
1.一種編碼人成骨蛋白-1的重組核酸，其序列為SEQ ID NO1。
2.一種載體，其中包含權利要求1所述的序列。
3.一種細胞，包含權利要求1所述的重組核酸，所述基因處于與所述細胞相容的表達系統中。
4.根據權利要求3所述的細胞，選自哺乳動物細胞。
5.根據權利要求4所述的細胞，它是CHO細胞。
全文摘要
本發明提供了一種編碼人成骨蛋白－1的重組核酸，能夠實現在哺乳動物，尤其是CHO細胞中的高表達。本發明還提供了包含該重組編碼核酸的載體、宿主細胞。本發明還提供了一種利用人成骨蛋白－1的重組核酸治療骨損傷包括開放性骨折的方法。
文檔編號C12N15/63GK1443847SQ0211097
公開日2003年9月24日 申請日期2002年3月8日 優先權日2002年3月8日
發明者王皓, 李春澍, 王一棟, 劉慶法 申請人:上海中信國健藥業有限公司