專利名稱：玉米醇溶蛋白基因片段及引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及核酸，具體地講，本發明涉及玉米的特異性核酸。
不同來源的DNA例如各種加工食品的DNA，常常會受到蛋白質、脂肪、多糖、聚酚及其他物質的污染，這些物質可能與DNA聚合酶及核酸相互作用而影響PCR分析，甚至在某些情況下還會導致假陰性結果。
玉米非常廣泛地應用于食品上，如蛋糕、奶粉、朱古力、糖果、果汁、酒精類及非酒精類飲品、雪藏食物及各式各樣的醬料等。據估計，含有玉米的加工食物占所有食品的百分之20-40％。食物(包括轉基因食品)中是否含有玉米成份，目前尚未有簡單可行的測定方法。
以聚合酶鏈式反應(PCR)為基礎的DNA分析方法可用于檢測食品中是否含有玉米DNA。玉米醇溶蛋白并不存在于其他農作物中。玉米醇溶蛋白DNA序列與其他的醇溶蛋白不同。因此，可找出其中特有的一段序列，據此設計并合成引物用于PCR擴增。
本發明的發明人根據玉米醇溶蛋白基因(Genbank入藏號X07535)的核苷酸序列，設計了并合成了一段特定的DNA序列作為引物，使用該引物已成功地擴增出了玉米及其加工食品中所含的玉米DNA。具體地講，本發明包括如下方面一方面，本發明提供一種DNA，其包含如下SEQ ID NO1所示的序列或與SEQ ID NO 1所示序列具有至少99％序列同一性的序列ccattgggta ccatgaaccc atgcatgcag tactgcatga tgcaacaggg gcttgccagcttgatggcgt gtccgtccct gatgctgcag caactgttgg ccttaccgct tcagacgatgccagtgatga tgccacagat gatgacgcct aacatgatgt caccattgat gatgccgagcatgatgtcac caatggtctt gccgagcatg atgtcgcaaa tgatgatgcc acaatgtcactgcgacgccg tctcgcagat tatgct (SEQ ID NO1)另一方面，本發明提供一種引物，其具有如下SEQ ID NO2所示序列中的至少17個連續的核苷酸5’-ccattgggtaccatgaacc-3’(SEQ ID NO2)。
這些引物是用于擴增玉米醇溶蛋白基因片段的正向引物。其中，優選該引物優選具有SEQ ID NO2所示序列中的至少18個連續的核苷酸。最優選具有SEQ ID NO2所示的序列5’-ccattgggtaccatgaacc-3’。
再一方面，本發明提供一種引物，其具有如下SEQ ID NO3所示序列中的至少17個連續的核苷酸5’-agcataatctgcgagacgg-3’(SEQ ID NO3)。
該引物是用于擴增玉米醇溶蛋白基因片段的反向引物。其中，該引物優選具有SEQ ID NO3所示序列中的至少17個連續的核苷酸。更優選具有SEQ ID NO3所示序列中的至少18個連續的核苷酸。最優選該引物具有序列5’-agcataatctgcgagacgg-3’。
本發明的上述引物(下文中有時稱為“本發明引物”)具有高度的特異性。在不同的植物品種(玉米、番茄、土豆和大豆)中提取DNA。以所得DNA為模板并使用本發明的引物，進行PCR擴增，確定玉米醇溶蛋白基因片段引物的特異性。反應結果顯示只在玉米中擴增得到了266bp的DNA片段。
具體實施例方式
以下以實施例的方式對本發明做進一步的描述，但是無論在何種意義上實施例都不對本發明構成限制。
實施例玉米醇溶蛋白基因片段的引物的合成按照本領域公知的常規方法制備引物。例如，在DNA自動合成儀(例如在美國PE公司的ABI3949型全自動DNA合成儀)上按照制造商的說明進行合成。分別合成玉米醇溶蛋白基因的正向引物5’-ccattgggtaccatgaacc-3’(SEQ ID NO2)和玉米醇溶蛋白基因的反向引物5’-agcataatctgcgagacgg-3’(SEQ ID NO3)。
玉米醇溶蛋白基因的266bp的DNA片段的擴增以Qiagen DNeasy Plant Mini試劑盒，按照制造商的說明提取玉米DNA并溶于100微升雙蒸水中。取5微升DNA，加入PCR預混液(1倍PCR緩沖液，200微摩爾dNTP，200微摩爾玉米醇溶蛋白基因片段的正向和反向引物和0.25單位Taq DNA聚合酶)。所述PCR緩沖液為10mM Tris-HCl(pH 8.6)、50mM KCl、1.5mM MgCl2和0.1％TritonX-100。PCR反應在Applied Biosystems所生產的GeneampPCRSystem 9700儀上進行，反應程序為95℃2分鐘，隨后是94℃1分鐘，56℃1分鐘，72℃1分鐘，反應35個循環，外加10分鐘最終延伸反應。PCR產物由1％的瓊脂糖膠電泳分離。采用Perkin Elmer ABI 310測序儀對所擴增出的DNA進行測序，結果如SEQ ID NO1所列。
玉米醇溶蛋白基因片段引物的特異性以Qiagen DNeasy Plant Mini試劑盒所述方法提取DNA，在不同的植物品種(玉米、番茄、大豆和土豆)中提取DNA并溶于100微升雙蒸水。取5微升DNA，按以上PCR反應條件進行PCR擴增。PCR產物由1％的瓊脂糖膠電泳分離。實驗結果顯示，只在玉米中擴增得到了266bp的DNA片段。通過DNA測序，結果證實擴增得到了的該266bp的片段其序列如SEQ ID NO1所示。
對玉米加工食品進行PCR分析分別提取5％Bt-176玉米、粟米片、玉米粉、玉米油、玉米的DNA。其中采用Qiagen DNeasy Plant Mini試劑盒提取固體材料的DNA，采用乙烷和硫氰酸胍方法提取玉米油的DNA。向2克液體樣品中加入10毫升乙烷和1毫升提取液(提取液的組成為100毫摩爾Tris-HCl，pH6.4；500毫摩爾EDTA，pH8.0；2.6克Triton X100和120克硫氰酸胍；通過0.2微米微孔膜進行無菌過濾)，徹底混合均勻。然后5,000Xg離心20分鐘將上層和中間層移入新的離心管；加入等體積氯仿后震蕩成乳濁液狀，再15,000Xg離心10分鐘后取上層，移入新的離心管；加入2微升糖原溶液(20微克糖原/微升)和400至600微升的異丙醇，室溫中反應30分鐘。然后15,000Xg離心10分鐘沉淀DNA，并用70％的乙醇洗兩次。空氣干燥后加入50微升的0.2×TE(10毫摩爾Tris-HCl，pH8.0；1毫摩爾EDTA)緩沖液，此DNA溶液過Pharmacia Microspin S300柱除去殘留的RNA并脫鹽后保存在4℃。
從固體和液體樣品中所提取DNA均用下列方法進行PCR擴增。采用本發明的玉米醇溶蛋白基因片段的正向和反向引物對所提取的DNA進行PCR擴增并以PCR緩沖液為PCR陰性對照。反應程序為95℃2分鐘，隨后是94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，反應35個循環，外加10分鐘最終延伸反應。PCR產物用2％瓊脂糖凝膠電泳分離。結果表明，除陰性對照外，在所有被測試材料中均擴增得到了266bp的片段。
玉米醇溶蛋白基因引物的長度與PCR產物的序列同一性的關系分別合成具有SEQ ID NO2中至少17個連續核苷酸的DNA片段以及合成具有SEQ ID NO3中至少17個連續核苷酸的DNA片段。重復以上PCR反應的條件對玉米DNA進行擴增。所得PCR產物經1％的瓊脂糖膠電泳分離后測序。并以SEQ ID NO1為參考序列，計算所擴增的PCR產物與參考序列相比的序列同一性。結果如表1所示。
表1
注引物后的數字代表與正向引物(SEQ ID NO2)或反向引物(SEQ ID NO3)的序列相同的連續核苷酸數。
以上對本發明進行了詳細的描述，本領域的技術人員可在不背離本發明精神的前提下對本發明作出一些不脫離本發明范圍的修改或改變。只要在所附權利要求的范圍內，這些修改和改變就包括在本發明之中。
序列表<110>創念分子標簽有限公司(MolecularTaq Limited)<120>玉米醇溶蛋白基因片段及引物<130>SPI020273-09<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>266<212>DNA<213>玉米(Zea mays)<400>1ccattgggta ccatgaaccc atgcatgcag tactgcatga tgcaacaggg gcttgccagc 60ttgatggcgt gtccgtccct gatgctgcag caactgttgg ccttaccgct tcagacgatg 120ccagtgatga tgccacagat gatgacgcct aacatgatgt caccattgat gatgccgagc 180atgatgtcac caatggtctt gccgagcatg atgtcgcaaa tgatgatgcc acaatgtcac 240tgcgacgccg tctcgcagat tatgct 266<210>2<211>19<212>DNA<213>正向引物<400>2ccattgggta ccatgaacc 19<210>3<211>19<212>DNA<213>反向引物<400>3agcataatct gcgagacgg19
權利要求
1.一種DNA，其包含SEQ ID NO1所示的序列或與SEQ ID NO 1所示序列具有至少99％序列同一性的序列。
2.一種引物，其具有SEQ ID NO2所示序列中的至少17個連續的核苷酸。
3.權利要求2所述的引物，其具有SEQ ID NO2所示序列中的至少18個連續的核苷酸。
4.權利要求2所述的引物，其具有序列5’-ccattgggtaccatgaacc-3’。
5.權利要求1-4中任一項所述的引物，其為用于擴增玉米醇溶蛋白基因片段的正向引物。
6.一種引物，其具有SEQ ID NO3所示序列中的至少17個連續的核苷酸。
7.權利要求6所述的引物，其具有SEQ ID NO3所示序列中的至少18個連續的核苷酸。
8.權利要求6所述的引物，其具有序列5’-agcataatctgcgagacgg-3’。
9.根據權利要求7-9中任一項所述的引物，其為用于擴增玉米醇溶蛋白基因片段的反向引物。
全文摘要
本發明提供了在玉米中特有的PCR擴增得到的DNA片段以及用于該擴增的PCR引物。所述片段和引物可特異性地識別玉米DNA成分的存在。
文檔編號C12P19/34GK1438232SQ0210455
公開日2003年8月27日 申請日期2002年2月11日 優先權日2002年2月11日
發明者王駿, 黃蕙薇 申請人:創念分子標簽有限公司