用于鑒定牛脊椎畸形綜合征攜帶者的遺傳試驗的制作方法

專利名稱：用于鑒定牛脊椎畸形綜合征攜帶者的遺傳試驗的制作方法
技術領域：
本發明一般涉及在牛中發現的稱為脊椎畸形綜合征(CVM)的遺傳性疾病。更具體的說，本發明涉及用于鑒定潛在的CVM牛攜帶者和用于鑒定CVM基因座及其負責牛脊椎畸形綜合征的突變的分子標記。
背景技術：
脊椎畸形綜合征(CVM)是在Holstein-Friesian(HF)黑白花奶牛中發現的先天性脊椎病癥。該疾病在最近被描述(Agerholm等，2000)。在丹麥，至今(2000年10月17日)診斷的所有病例都在遺傳上與以前的原種美國Holstein公牛Carlin-M IvanhoeBell有親緣關系。根據現在的資料，CVM似乎是作為常染色體隱性疾病遺傳的。
該疾病的特征在于先天性遠側關節的兩側對稱性關節彎曲和脊柱畸形，主要發生在頸-胸會合處，并伴隨著體重下降(Agerholm等，1994)。
在外表上，有下列主要發現在許多病例中，脊柱的頸部和/或胸部部分似乎縮短。經常發現中度的腕關節兩側對稱性收縮和趾骨-掌骨關節(球節)嚴重收縮和旋后。還通常發現趾骨-跖骨關節的收縮和旋前及跗骨的輕微伸展。在大多數病例中觀察到頸-胸會合處周圍的脊柱路線不規則(irregular course)。可觀察到脊柱側凸，且在脊柱的其它區域存在病變。通常可通過對脊柱腹面的望診和觸診識別這種路線不規則。然而，病變可最小且局限于兩個或少數椎骨。在這種情況下脊柱可以是幾乎正常的長度。因此，建議對脊柱進行放射學檢查以排除疑似病例中的脊椎畸形。脊索具有正常的大小，位于椎管中，且沒有明顯的壓迫。使用放射學可發現各種程度的由半脊椎畸形，融合和異形脊椎，脊柱側凸和關節僵硬組成的脊椎畸形綜合征。在取出椎弓后可最好地證實這點。在有些病例中，存在心臟畸形，主要表現為高度室間隔膜缺陷和右心室偏心肥大。可能出現大血管畸形。在肺部，存在胎兒肺膨脹不全。大多數在胸腔存在漿液出血性液體。已經觀察到各種其它畸形，但是沒有恒定的或者共有的發現。通常發現由難產引起的損傷。
在流產的胎牛，早產牛犢和到期出生的死產牛犢中都觀察到畸形。在較大的牛犢中尚未觀察到這種情況。一般來說體重減小，且早產牛犢比到期出生的牛犢體重更低。
另外，似乎在用攜帶者公牛的精子授精的母牛中流產頻率增大。其原因至今還不清楚。
目前，可用于CVM診斷的唯一工具是根據上述出現主要發生在頸-胸會合處的遠側關節的兩側對稱性關節彎曲和脊柱畸形并伴隨著體重下降的病理解剖診斷。然而，四肢的對稱收縮是牛犢脊椎畸形中的常見和普遍發現。因此，存在鑒別診斷的問題，因為通常難以區分CVM和其它畸形。
該遺傳缺陷似乎通過已在全世界集中使用的公牛Carlin-MIvanhoe Bell傳播的事實使得能夠試驗當前的和潛在的育種公牛是否是缺陷攜帶者具有重大的經濟重要性。
為了獲得丹麥牛種群中潛在的CVM攜帶者動物的頻率的估計量，本發明人從丹麥國家牛數據庫提取了譜系信息。提取時(2000年10月)，登記有919，916頭純育母牛和小母牛，以及169，821頭純育公牛和雄性牛犢。在母牛和小母牛譜系中發現Bell707，915次，在雄性譜系中發現161，043次。在下面表1和2中，顯示了譜系每代中Bell的出現數。
表1丹麥Holstein母牛和小母牛譜系中Bell的出現次數世代NR 頻率百分率 累計頻率2212403.0212443202460 28.6 2237044321043 45.4 5447475133956 18.9 6787036273073.970601071869 0.3707879836 0.0707915
表2丹麥Holstein公牛譜系中Bell的出現次數世代 頻率百分率 累計頻率2436 0.3 43632014412.52058048239451.210297454454527.71475196124557.7 15997471040 0.6 161014829 0.0 161043盡管這些數值也包括一些在譜系中出現兩次和三次的Bell，但是該數據清楚地顯示了大多數丹麥Holstein牛是潛在的CVM攜帶者。很明顯，該問題在全球范圍內是非常普遍的。
因此，在牛工業中對于允許在各種品系的牛中鑒定潛在CVM攜帶者(例如，在可檢測的臨床癥狀出現前)的遺傳學試驗存在巨大的需求。
在本發明之前，小隨體(microsatellite)作圖法尚未應用于未被分離或鑒定的引起上述脊椎畸形綜合征的基因上。因此，就本發明人所知，在下面進一步詳細描述的根據本發明的診斷方法以前尚未被提出或公開過。
因此，包含CVM疾病基因座作圖的本發明提供了以位于牛染色體BTA3上的小隨體標記為基礎的DNA試驗。從下面的實施例顯示出該試驗確定Bell后代動物攜帶狀況的能力已得到證實。
發明概述在其最廣義的方面，本發明提供了一種檢測牛受試者中存在與牛脊椎畸形綜合征(CVM)相關的遺傳標記的方法，包括提供牛遺傳物質，并檢測該遺傳物質中是否存在與牛脊椎畸形綜合征疾病性狀連鎖的至少一種遺傳標記或引起脊椎畸形綜合征疾病性狀的特定核苷酸多態性的步驟。
在另一方面，本發明涉及用于檢測牛受試者中存在與牛脊椎畸形綜合征(CVM)相關的至少一種遺傳標記的診斷試劑盒，包含選自由SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ IDNO16，SEQ ID NO33，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ IDNO36，SEQ ID NO37和SEQ ID NO38及其組合組成的組中的至少一種寡核苷酸序列。另外，本發明涉及一種診斷方法，包括一種用于檢測作為牛CVM病因和診斷特征的牛SLC35A3基因中的G/T多態性的診斷試劑盒。
發明詳細描述本發明的一個首要目的是使得能夠鑒定攜帶牛脊椎畸形綜合征(CVM)的牛。通過檢測牛受試者中存在與牛CMV相關的遺傳標記的方法來實現這點。更具體地說，該遺傳標記可以是牛SLC35A3基因或甚至更具體地說是牛SLC35A3基因中的特定多態性。
本文使用的術語“牛受試者”是指任何品種的牛。因此，任何各種母牛或公牛品種，無論雌雄，都包含在該術語中，且成年的和新生的動物都打算包括在內。該術語不指示具體年齡。牛受試者的一個例子是Holstein-Friesian牛種群中的一個成員。
術語“遺傳標記”是指存在于染色體上的牛基因組DNA中且用特定寡核苷酸可鑒定的可變核苷酸序列(多態性)。例如，這種可變核苷酸序列通過核酸擴增并觀察由多態性引起的大小或核苷酸序列上的差異可進行辨別。在有用的實施方案中，該遺傳標記可通過本領域的技術人員已知的各種技術進行鑒定，且包括通過包括限制性片斷長度聚合酶鏈反應，等位基因特異性寡聚體雜交，寡聚體特異性連接試驗，微型測序，直接測序，檢測熒光的5’-核酸外切酶試驗，和用PNA和LNA探針雜交等的方法進行的小隨體或短串聯重復(STR)的分類，限制性片斷長度多態性(RFLP)，缺失或插入位點的檢測，和隨機擴增多態性DNA(RAPD)以及單核苷酸多態性(SNP)的分類。
如上所述，“牛脊椎畸形綜合征”(CVM)是一種先天性脊椎病癥。目前，該疾病僅在Holstein-Friesian(HF)黑白花奶牛中檢測到；然而，可預期其它的牛品種也會患病。最近Agerholm等，2000已經描述了該疾病。因此，在本文中CVM和牛脊椎畸形綜合征疾病特征理解為導致本文前面所述的，且如Agerholm等，2000報道和限定的臨床癥狀的疾病。
根據本發明的方法包括提供牛的遺傳物質，該物質包括可通過任何常規方法或手段提供的牛DNA材料。例如，牛DNA材料可從血液(例如，新鮮或冷凍的)，組織樣品(例如，脾臟，頰膜涂片)，含有毛囊細胞的毛發樣品和精子提取，分離和純化。
如前所述，本發明的方法還包括檢測遺傳物質中是否存在與牛脊椎畸形綜合征疾病性狀連鎖的遺傳標記的步驟。
為了檢測遺傳標記是否存在于遺傳物質中，可應用本領域的技術人員熟知的標準方法，例如，通過使用核酸擴增。為了確定該遺傳標記是否與脊椎畸形綜合征疾病性狀在遺傳上連鎖，可應用優勢對數得分(lod score)。優勢對數得分有時也稱為Zmax，表示遺傳標記座與特定基因座在特定距離連鎖的概率(可能性比率的對數)。例如，優勢對數得分可通過應用諸如LINKAGE軟件包的MLINK程序的計算機程序進行計算(Lathrop等，1985)。優勢對數得分大于3.0被認為是遺傳標記與脊椎畸形綜合征疾病性狀或基因座之間連鎖的重要證據。
在本發明的一個實施方案中，遺傳標記位于牛染色體BTA3上。圖2表示了含有在本發明方法中有用的遺傳標記的牛染色體BTA3區。
因此，根據本發明有用的遺傳標記位于牛染色體BTA3上的其兩側為多態性小隨體標記BM4129和BMS1266且包含它們的區域上。在一個具體實施方案中，至少一個遺傳標記位于牛染色體BTA3上從大約59.5cM到大約67.9cM的區域上。
在另一有用的實施方案中，至少一個遺傳標記位于牛染色體BTA3上的其兩側為多態性小隨體標記INRAA003和BMS937且包含它們的區域上。
在另一方面，至少一個遺傳標記位于牛染色體BTA3上的其兩側為多態性小隨體標記INRAA003和ILSTS029且包含它們的區域上。
在另一優選實施方案中，至少一個遺傳標記選自由小隨體標記BM4129，INRAA003，BMS2790，ILSTS029，INRA123，BM220，HUJ246，BMS862，BMS937，BL1048，BMS2095和BMS1266組成的組中。
如實施例中所述，至少一個遺傳標記與引起牛脊椎畸形綜合征疾病的基因連鎖。因此，在一個實施方案中，至少一個遺傳標記位于牛染色體BTA3上的其兩側為多態性小隨體標記BM4129和BMS 1266且包含它們的區域上并與CVM疾病性狀或CVM基因座在遺傳上連鎖，其優勢對數得分為至少3.0，例如至少4.0，包括至少5.0，例如至少6.0，包括至少7.0，例如至少8.0，包括至少9.0，例如至少10.0，包括至少11.0，例如至少12.0。
上述多態性小隨體標記的具體定義和座位參見USDA遺傳圖譜(Kappes等，1997)。
可預期為了檢測牛受試者中是否存在與CVM相關的遺傳標記，根據本發明可應用一個以上的遺傳標記。因此，至少一個標記可以是顯示出可提供更多信息從而可增強試驗精確度的兩個或多個遺傳標記的組合。
因此，正如下面進一步的舉例，在一個有用的實施方案中，可結合使用兩個或多個小隨體標記INRAA003，BMS2790，ILSTS029，INRA 123，BM220，HUJ246，BMS862，BMS937。
根據本發明，下面表4中描述了用于擴增上述小隨體標記的引物對的核苷酸序列。
比較圖譜(Solinas-Toldo等，1995)顯示大多數牛染色體BTA3相應于人染色體1的一部分(HSA1)。本文提供的CVM基因座的遺傳學作圖使得使用有關人基因的信息且集中尋找與人染色體1上存在的基因相對應的候選基因成為可能。這極大地限制了候選基因的數目且有利于尋找CVM致病基因。
本發明的遺傳標記可使用本領域的技術人員已知的不同方法來制備。因此，使用本文提供的知識可理解，將牛染色體BTA3的上述多態性小隨體標記的核苷酸序列鑒定為與CVM基因座在遺傳上連鎖，且可從已知序列或牛染色體BTA3上的指示位置產生其它標記用于本發明的方法。
例如，使用圖2所示的圖譜，可顯微解剖牛染色體BTA3上的CVM區域，并將片斷克隆進載體以分離DNA片斷，可試驗該片斷與CVM基因座的連鎖。另外，用表4提供的核苷酸序列，通過核酸擴增(例如，聚合酶鏈反應)或通過牛染色體BTA3有關區域的核苷酸測序(“染色體步查”)可從CVM區域獲得分離的DNA片斷。
另外，牛染色體BTA3和人染色體1(HSA1)之間的上述同源性表明，定位到人類該相似區域的任何基因或表達序列標記也可定位到牛染色體BTA3的CVM區域。因此，可使用常規方法分析定位到人染色體HSA1上的基因或保守序列與CVM基因座的連鎖。
基因型確定以基因組分析為基礎，使用本文所述的標準DNA提取方法可提供該基因組DNA。分離和純化該基因組DNA時，可使用核酸擴增(例如，聚合酶鏈反應)來擴增相應于各遺傳標記的DNA區域，該遺傳標記用于檢測牛受試者中存在與CVM相關的遺傳標記的分析中。因此，用于這類實施方案的診斷試劑盒包含分開包裝的選自由SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO1O，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ IDNO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO33，SEQ ID NO34，SEQID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37和SEQ ID NO38，及其組合組成的組中的至少一種寡核苷酸序列。
牛SLC35A3基因中的牛CVM病原性和診斷性突變的鑒定由于通過多態性小隨體標記限定的CVM基因的基因組定位已經確定，因此可進行研究以鑒定本文的結構基因和病原性突變用作CMV的最終遺傳標記。
鑒定了與CVM區域享有序列同源性的人基因組，確定為標記INRA003和ILSTS029之間的區域。標記BMS2790位于該間隔中(圖1)。最初，從牛BAC文庫(RPCI-42，由P.de Jonge及其同事構建和制備)鑒定了5個不同的克隆，各含有標記INRA003，ISLTS029，或BMS2790之一。使用從這些BAC克隆獲得的序列信息，使用公共序列數據庫的BLASTN程序鑒定了人染色體1上的單個區域，該區域含有與含標記的BAC同源的區域。該區域跨距大約6百萬個堿基對且位于大約107.4-113.5的位置(圖3)(ENSEMBL指示器，The Sanger Centre)。
SLC35A3 cDNA的分離和測序根據人(homo sapiens)和狗(canis familiaris)之間的SLC35A3基因的同源性序列對比，設計了2個寡聚體(SL1F和SL8R)用于擴增包括起始密碼子的牛SLC35A3的幾乎完整的cDNA。對分別從野生型動物，CVM攜帶者，和患病動物收集的心臟組織樣品分離的cDNA進行了PCR。為了獲得該基因3’-端的序列，測序所得的PCR片斷并設計新的寡聚體(SLSF)。為了擴增SLC35A3的3’-端，將SL5F與使用部分牛EST的公開序列(genbank，dbEST)設計的寡聚體(bSLCBVIR)結合使用。圖4顯示了牛SLC35A3的cDNA序列(SEQ ID NO18)和翻譯的肽序列(SEQ ID NO17)。牛SLC35A3編碼的蛋白質含有326個氨基酸且與以前已知的參與核苷酸糖類從細胞溶膠向高爾基腔運輸的蛋白質家族具有同源性。圖5描述的序列對比顯示了與以前在人類(Ishida等，1999)中和在狗(Guillen等，1998)中描述的SLC35A3蛋白質具有同源性。
檢測SLC35A3基因中的多態性為了檢測牛SLC35A3基因中潛在的多態性，使用分別從CVM攜帶者和患病動物收集的心臟組織樣品分離的cDNA進行該基因的PCR擴增。測序從患病動物分離的片斷揭示除了患病動物在核苷酸位置559是核苷酸T純合型而相比之下野生型動物在相應位置是G純合型外，其序列與野生型相同(見圖4)。測序來自CVM-缺陷攜帶者動物的cDNA表明該動物是在位置559具有T和G的雜合型。
位置559上G交換為T影響了所得肽的序列，導致在1 80位由纈氨酸改變成苯丙氨酸(見圖4)。
通過基于DNA測序的試驗分類SLC35A3多態性圖6顯示了測序從基因組DNA擴增的且含有包含G/T突變的區域(SLC35A3 cDNA的544位至572位，編號見圖4)的PCR片斷獲得的結果。左右組分別顯示了正向和逆向測序。上排(標記為-/-)顯示了野生型結果，顯示了使用正向測序的多態性位置上的G，和使用逆向測序在另一鏈的相似位置上的C(標記為星號)。下排+/+顯示了來自患病牛犢的結果，顯示了使用正向測序的多態性位置上的T，和使用逆向測序在另一鏈的相似位置上的A(標記為星號)。雜合型(+/-)在中間一組中表示且按預期表現為野生型和患病信號的混合體，因此具有使用正向測序的T和G信號及另一鏈上的A和C信號。
患CVM的所有牛犢都是T-等位基因純合型通過測序從基因組DNA擴增的PCR產物對患有CVM的39例牛犢進行基因型分類(見圖6和實施例6)。所有這些動物都是T-等位基因純合型，證實了開始的結果。
存與Bell無親緣關系的動物中沒有發現T-等位基因由于患有CVM的牛犢僅在含有廣泛使用的公牛BELL的譜系中報道，我們調查了T-等位基因是否在與BELL無親緣關系的動物中存在。利用丹麥牛數據庫，鑒定了496例在其譜系中無BELL的Holstein品系動物并取樣。通過測序從基因組DNA擴增的PCR產物對這些動物進行基因型分類(見圖6和實施例6)。這些動物中沒有一例含有T-等位基因，表明該等位基因專一性地在與BELL為近親的動物品系中發現。
通過測序，對12個不同品種的超過326例無親緣關系(至少在最近3代)的動物也進行了基因型分類。所有這些動物都是野生型等位基因(G-等位基因)純合型，再次證實在一般牛種群中無CVM-相關性等位基因。
通過等位基因特異性PCR試驗(AS-PCR)分類SLC35A3多態性為了有效分類G/T多態性，建立了使用Bioline的BIOLASEDiamond DNA聚合酶的等位基因特異性PCR試驗。該聚合酶需要3’端引物與模板的完全匹配，且在該位置的一個錯配將導致沒有(或極弱)擴增。以這種方式，通過鑒定是否存在等位基因特異性PCR產物可區分野生型，攜帶者或患病動物(圖7)。圖7的左部分顯示了編碼鏈的等位基因特異性PCR產物。正如預期，野生型動物顯示出用G-特異性引物擴增而用T-特異性引物則沒有。攜帶者顯示出G-和T-特異性引物都有擴增，而患病動物僅顯示出T-特異性引物擴增。右部分顯示了非編碼鏈的等位基因特異性PCR產物，正如預期，情況與編碼鏈相同。野生型動物為純合型C，攜帶者為雜合型C/A，且患病動物為純合型A。
根據上述使用定位候選基因研究的結果，鑒定了與編碼UDP-N-乙酰葡糖胺轉運蛋白的人基因SLC35A3同源的牛基因。在該基因內鑒定了改變該蛋白質氨基酸序列的G/T多態性。分析的所有患病牛犢(39例)都是T-等位基因純合型(T/T)且已知的攜帶者(108例)都是多態性雜合型(G/T)。對選擇與BELL無親緣關系的Holstein品種的超過500例動物的分析沒有鑒定出任何攜帶T-等位基因的動物。分析了在譜系中具有BELL的超過1500只動物，沒有發現任一未患病的動物是T-等位基因純合型。另外，分析了選自12個不同品種的超過300只牛，在這些動物的任一例中都沒有檢測到T-等位基因。綜合起來，本申請所述的發現證實了T-等位基因在CVM攜帶者動物中以單拷貝存在而在患有CVM的動物中以2個拷貝存在。因此，檢測559位的T-等位基因(按圖4的編號)是CVM的診斷特征和檢測CVM缺陷攜帶者的最終目標。
由于G/T多態性被鑒定為CMV的病因，因此與該多態性緊密相連的任何遺傳標記都可以是牛種群中CMV的診斷特征。因此，本發明描述了通過測定牛SLC35A3基因的559位G/T多態性的存在鑒定患有CMV或攜帶CMV的牛受試者的方法，通過分析與牛SLC35A3基因偶連的諸如本文所述的小隨體的任何遺傳標記來間接測定，或者通過分析諸如上文所述且在實施例中進一步詳細描述的牛SLC35A3基因的序列直接測定。
因此，檢測和/或定量牛受試者中與牛CVM相關的遺傳標記的存在以便能夠鑒定患有CMV的牛受試者或CMV攜帶者的方法在本發明的范圍內。該方法的步驟包括a)提供牛遺傳物質，和b)檢測所述的遺傳物質中是否存在與牛脊椎畸形綜合征疾病性狀連鎖的至少一種遺傳標記。
至少一種遺傳標記與引起牛CMV疾病的基因連鎖，本文鑒定的所述基因是牛SLC35A3基因，它編碼包含SEQ ID NO17所示氨基酸序列的牛SLC35A3蛋白質。
更具體地說，本發明涉及檢測牛CMV的方法，其中遺傳標記是相當于SEQ ID NO18的核苷酸559位置的單核苷酸多態性，所述的單核苷酸多態性是G/T多態性。
本申請還描述了使用等位基因特異性PCR對該多態性進行基因型分類的有效試驗。它僅是一組SNPs分類方法中的一種，可采用的其它方法包括，但不限于，微型測序(minisequencing)，引物延伸，熱-測序(pyro-sequencing)，PCR-RFLP，等位基因特異性滾動循環擴增，引物延伸接著進行MALDI-TOF質譜術以及各種其它以酶和雜交為基礎的方法。
已證實類似于CVM的表型存在于基因lunatic fringe突變的小鼠中(Evrad等，1998)。與患有CVM的牛犢相似，lunaticfringe無效突變純合的小鼠表現出體節分節和成型改變，具有縮短的身體軸線，椎骨和肋骨融合和未完全形成的脊柱(Evrad等，1998)。Fringe似乎通過調節Notch受體的活性參與邊界形成和體節成型的限定(Klein和Arias，1998；Moloney等，2000，Bruckner等，2000)。調節Notch的活性似乎由Fringe的N-乙酰葡糖胺基轉移酶活性調節，該酶活性在高爾基體中起動附著到Notch的EGF樣序列重復上的O-連接的巖藻糖殘基的延長(Moloney等，2000；Bruckner等，2000)。
而且，由于牛SLC35A3基因與人SLC35A3基因同源，因此根據本文提供的信息，在研究人發育缺陷，特別是涉及體節分節和成型的缺陷時分析人SLC35A3基因編碼序列的致病性和診斷性突變是顯而易見的。
可預期影響N-乙酰葡糖胺從胞質溶膠轉運進高爾基體腔的位于高爾基體上的N-乙酰葡糖胺基轉運蛋白(SLC35A3)的突變結果會奪去Fringe蛋白質家族的底物。這將影響Fringe調節Notch活性的能力，從而引起類似于CVM的分節缺陷。因此，SLC35A3上的突變除了是CVM的診斷特征外，也是引起該普遍性遺傳缺陷的突變似乎非常合理。
在下面的實施例中進一步詳細描述本發明
實施例實施例1脊椎畸形綜合征(CVM)的遺傳圖譜本實施例說明了CVM基因座位于牛染色體BTA3上。另外，該實施方案描述了與CVM基因座連鎖的標記的鑒定，從而鑒定了牛染色體BTA3的CVM區。
為了定位導致CVM的基因座，從參與育種研究的動物獲得樣品。簡單地說，選擇來自公牛T Burma后代且用公牛KOL Nixon的精子授精的大約300頭母牛和小母牛用于育種研究。根據Agerholm等，2000所述的死后檢查法選擇13頭患病牛犢。這13頭牛犢及其親代總共28頭動物用于起始基因組掃描。牛犢與其共同的祖先，即純種公牛Carlin-M Ivanhoe Bell間隔4代。
使用從USDA基因組圖譜(Kappes等，1997)挑選的一組小隨體標記對覆蓋所有29對常染色體的基因組進行掃描。在10和20cM之間逐對距離選擇標記。在低標記信息的懷疑區，包含且確定了新標記。使用了總共194個標記。在ABI 877 PCR自動儀(Applied Biosystems)中，在含有12ng基因組DNA，1×PCR緩沖液，0.4 U AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)，引物各20pmol和2.0mM MgCl2的5μl體積中以一式兩份進行PCR反應。所有標記以相同的接通PCR條件運行94℃溫育12分鐘以活化酶，以94℃ 30秒；Ta，45秒；72℃，20秒進行35個循環，以72℃最后延伸10分鐘結束。前10個循環Ta從67℃下降到58℃，每個循環下降1度，剩下的25個循環Ta固定在58℃。合并PCR產物且在ABI 377(Applied Biosystems)上每個泳道上運行5至9個不同的標記，用所附軟件分析凝膠。用Genotyper程序(Version2.1，Applied Biosystems)指定等位基因。
對于3個標記，使用LINKAGE軟件包中的MLINK程序(Lathrop等，1985)計算兩點優勢對數得分。由于譜系結構(圖1)具有多個近交回路，因此將譜系分成13個小家族，各患病牛犢的小家族包括雄親(KOL Nixon)，雌親和雌親祖先(T Burma)。假定該疾病是隱性遺傳的，具有基因型的完全外顯。
發現所有三個標記都明顯連鎖。用BMS2790和ILSTS029觀察到最高優勢對數得分(Z)，為Z＝10.35，θ＝0。而且，附近標記INRA003也與CVM基因座明顯連鎖(表3)。
表3CVM基因座與牛染色體3標記的連鎖分析的兩點優勢對數得分(Z)和重組分散(θ)
根據USDA遺傳圖譜(Kappes等，1997)，上述結果將CVM基因座定位于BTA3(圖2)。
● 11頭牛犢 INRA003，BMS2790，ILSTS029，BMS862 和 HUJ246限定的間距是純合型，而只有BMS2790和ILSTS029在所有13頭牛犢中為純合型，如圖1所示。可構建這些標記的單元型，它允許我們推斷最可能的CVM單元型(圖1)。單元型定義為從1到N編號的標記等位基因的大小，其中1定義為擴增標記的最短等位基因，N定義為最長的等位基因。Bell中與CVM相關的等位基因的實際長度如下INRA003(等位基因編號3)176個堿基對BMS2790(等位基因編號3)118個堿基對ILSTS029(等位基因編號2)164個堿基對BMS862(等位基因編號1)130個堿基對HUJ246(等位基因編號3)262個堿基對等位基因的實際長度取決于擴增標記所用的引物，且上述片斷長度以使用表4所述的引物為基礎。
另外，本試驗包含作為用于遺傳缺陷的Danishsurveil-lance程序的一部分被取樣的其它17頭患病牛犢。所有患病動物具有純種公牛Bell作為共同的祖先。使用標準方法從血液樣品或精液提取DNA。
用跨越BTA3上從大約59.5cM到67.9cM區域的8個標記INRA003，BMS2790，ILSTS029，BM220，INRA123，BMS862，BMS937，和HUJ246對該17頭牛犢及其母親進行基因型確定，且類似于起始育種試驗，由于假定另外17頭牛犢的CVM基因來源于共同祖先公牛Bell，因此預期血統標記(IBD)的相似區域存在于所有患病牛犢中。結果也是如此在17頭牛犢中17頭由INRA003和BMS2790定義的染色體片斷是純合型，與來自育種試驗的動物具有相同的等位基因。在19頭動物中有兩頭觀察到在ILSTS029和BMS862基因座為雜合型，可解釋為BMS2790和ILSTS029之間的單個重組事件。因此，根據組合基因型確定的結果，我們發現CVM遺傳缺陷很可能位于不超過6cM的間距中，兩側為標記INRA003和ILSTS029，如圖2所示，且稱為“CVM區”。
8個標記INRA003，BMS2790，ILSTS029，BM220，INRA123，BMS862，BMS937，和HUJ246采用的引物序列在下面表4中描述。
表4
實施例2鑒定CVM攜帶者的診斷試驗通過測定Bell后代是否是疾病相關性單元型的攜帶者建立了測定CVM牛攜帶者的診斷試驗。
該試驗以8個小隨體標記INRA003，BMS2790，ILSTS029，BM220，INRA123，BMS862，BMS937和HUJ246為基礎，且依賴于對Bell后代動物的疾病特異性等位基因或單元型(見圖1)的識別。
因此，如果它們遺傳了由來自Bell或來自Bell后代動物的標記INRA003，BMS2790，ILSTS029，和BM220限定的區域中的疾病特異性等位基因，可確定該動物為攜帶者。如果動物沒有遺傳來自Bell或來自Bell后代動物的疾病相關性單元型，可確定它們是非攜帶者。如果Bell單元型被重組分開，該動物命名為不能確定者。只有當由于不能區分母系和父系遺傳導致試驗標記的信息含量下降時可使用4個其它標記。
與基于連鎖DNA標記的所有診斷性遺傳試驗一樣，CVM試驗具有不能檢測雙重重組事件(在病原性基因的每一側發生一次，發生在基因與側翼標記之間)的缺點。在本例中，該事件極其稀少，因為標記與CVM基因之間緊密連鎖，可估計該試驗的可靠性高于99％。
實施例3組織解剖和RNA分離及cDNA合成在分娩3小時內從死產牛犢解剖出大約5克心臟組織，立即在液氮中冷凍并在-80℃下貯存。使用250mg組織用于RNA分離。使用來自Stratagene(目錄號200345)的RNA分離試劑盒分離RNA。
通過混合2.5μg總RNA與1μl寡聚(dT)12-18(500μg/ml)，1μl的10mM dNTP混合物和H2O以產生12μl的最終體積來合成cDNA。所得的混合物在65℃下加熱5分鐘，在冰上冷卻并簡單旋轉。加入4μl的5×第一鏈緩沖液，2μl的0.1M DTT和1μl的H20之后，混合內容物并在42℃下溫育2分鐘，隨后加入1μl(200 U)的Superscript II(GibcoBRLLifetechnologies)并在42℃下繼續溫育1.5小時。反應在70℃下滅活15分鐘。為了去掉RNA，用1U RNase H(Roche MolecularBiochemicals)在37℃下溫育cDNA 20分鐘。
實施例4SLC35A3的測序
根據人(homo sapiens)與狗(canis familiaris)之間SLC35A3基因的同源性對比，設計了2個寡聚體(SL1F和SL8R)用于擴增包含起始密碼子的牛SLC35A3的幾乎完整的cDNA。為了獲得該基因的3’端，測序所得的PCR片斷并設計了一個新的寡聚體(SL5F)。為了擴增SLC35A3的3’端，根據牛EST的公開序列，使用SL5F與寡聚體(bSLCBVIR)的組合。
對于兩個引物組采用相同的PCR條件。
在GeneAmpPCR System 9700(Applied Biosystems)中在由1μl 10xNH4反應緩沖液，0.5μl 50mM MgCl2，0.8μl dNTPs(各2.5mM)，5.65μl H2O，1μl正向和反向引物(各5pmol)和0.05μl5 U/μl BIOTAQ DNA聚合酶(Bioline)組成的10μl最終體積中進行PCR反應。
運行的PCR反應由95℃ 2分鐘的起始熱激活步驟及隨后10個循環的95℃變性30秒，62℃退火30秒(下降0.5℃)，和72℃延伸20秒，加上另外30個循環的95℃ 30秒的變性步驟，57℃的退火溫度30秒和72℃ 30秒的延伸步驟組成。
下列引物用于擴增完整的SLC35A3 cDNASL1F5’-GGA GGC AAA TGA AGA TAA AAC-3’(SEQID NO19)SL8R5’-CTA TGC TTT AGT GGG ATT3-’(SEQ ID NO20)SL5F5’-GAG TTG CTT TTG TAC AGT GG-3’(SEQ ID NO21)bSLCBVIR5’-ACT GGC TAC TAT CTA GCA CAG GA-3’(SEQ ID NO22)使用純化的PCR產物作模板通過采用這些引物在4個獨立的循環測序反應中獲得了完整的cDNA序列。使用SPIN-X(Corning公司)從0.8％ Seakem瓊脂糖凝膠中純化PCR產物。
循環測序反應在GeneAmpPCR System 9700(AppliedBiosystems)中進行且包括96℃ 2分鐘的起始步驟，接著99個循環的96℃ 10秒，55℃ 5秒和60℃ 4分鐘。測序產物用2倍體積的乙醇和1/10體積的3 M NaAc(pH 5.5)沉淀，用70％的乙醇洗滌，重懸于5μl上樣緩沖液中并使用ABI377自動測序儀在4％丙烯酰胺測序凝膠上運行。
牛SLC35A3的cDNA序列在圖4中顯示(SEQ ID NO18)。
實施例5含小隨體標記的BACs的鑒定和分離濾膜雜交濾膜在雜交溶液[6xSSC(每升含52.6g NaCl，26.46g檸檬酸鈉)]，5x Denhardt[2g Ficoll(400型，Pharmacia)]，5g聚乙烯吡咯烷酮，5g牛血清白蛋白(Fraction V，Sigma)，0.5％ SDS和50μg/ml SS-DNA)中65℃下轉動預雜交3小時。然后將100μl5’-端標記的寡核苷酸與該濾膜在65℃下溫育16小時。至于末端標記，將5pmol的寡核苷酸與5μl(50μ Ci)的γ-32P-ATP(比活＞5000Ci/mmole)，2μl 10x激酶緩沖液，11μl H2O和1μl(10U)的T4多核苷酸激酶(New England Biolabs Inc.)混合，混合物在37℃下溫育1.5小時，接著煮沸5分鐘以便熱滅活酶。使用標準方法以NaAc/乙醇沉淀標記探針，在70％乙醇中洗滌一次后，探針重新溶解于100μl的H2O中。雜交后，用洗滌溶液I(2xSSC，0.2％ SDS)洗滌濾膜一次，用洗滌溶液II(0.1xSSC，0.5％ SDS)在65℃下洗滌兩次，并在-80℃下對柯達BIOMAXTM MS膠片曝光2天。
使用下列5’-端標記的寡核苷酸鑒定ILSTS029和INRA003陽性BAG克隆ILSTS029寡聚體5’-CAC ACC GCT GTA CAG GAA AAA GTG TGCCAA CCC TGG TCT AAA TCC AAA ATC CAT TATCTT CCA AGT ACA T-3’(SEQ ID NO23)INRA003寡聚體5’-CGT CCC CTA TGC GCT TAC TAC ATA CACTCA AAT GGA AAT GGG AAA ACT GGA GGT GTGTGA GCC CCA TTT A-3’(SEQ ID NO24)牛BAC文庫的PGR篩選從BAC文庫制備BAC庫并通過PCR篩選。在GeneAmpPCRSystem 9700(Applied Biosystems)中在由1μl 10xNH4反應緩沖液，0.5μl 50mM MgCl2，0.8μl dNTPs(各2.5mM)，5.65μlH2O，1μl正向和反向引物(各5pmol)和0.05μl 5U/μl BIOTAQDNA聚合酶(Bioline)組成的10μl最終體積中進行PCR反應。
使用下列引物通過PCR鑒定含有BMS2790的BAC克隆BMS2790F5’-AAG ACA AGG ACT TTC AGC CC-3’(SEQ ID NO25)BMS2790R5’-AAA GAG TCG GAC ATT ACT GAG C-3’(SEQ ID NO26)運行的PCR反應由95℃ 2分鐘的起始熱激活步驟及隨后10個循環的95℃變性30秒，70℃退火30秒(下降0.5℃)，和72℃延伸20秒，加上另外30個循環的95℃ 30秒的變性步驟，65℃退火30秒和72℃延伸20秒組成。
BAC DNA的分離和測序按照Qiagens Large Construct試劑盒制備BAC DNA，使用大約1μg的BAC DNA作為循環測序的模板，測序用BigDyelM終止子循環測序試劑盒(PE Applied Biosystems)進行。循環測序反應在含有1μl Big DyeTM終止子混合物，1μl引物(5pmol)，1μl反應緩沖液和2μl H2O的6μl最終體積中進行。循環測序反應在GeneAmpPCR System 9700(Applied Biosystems)中進行且包括96℃ 2分鐘的起始步驟，接著130個循環的96℃ 10秒，55℃ 5秒和60℃ 4分鐘。測序產物用2倍體積的乙醇和1/10體積的3 M NaAc(pH 5.5)沉淀，用70％的乙醇洗滌，重懸于2μl上樣緩沖液中并使用ABI377自動測序儀在4％丙烯酰胺測序凝膠上運行。
測序引物T75’-TTA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’(SEQ ID NO27)SP65’-ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3’(SEQ ID NO28)INRA003F5’-CTG GAG GTG TGT GAG CCC CAT TTA-3’(SEQ ID NO29)INRA003R5’-CTA AGA GTC GAA GGT GTG ACT AGG-3’(SEQ ID NO30)實施例6通過測序確定CVM狀態
使用Primus HT(MWG Biotech AG)在96孔平板中無油條件下進行PCR反應(2μl純化的模板/樣品基因組DNA，2μl 10xPCR緩沖液，2μl 25mM MgCl2，3.3μl各0.2mM的dNTP(UltrapuredNTP，27-2033-01；Amersham Pharmacia Biotech)，6pmol引物(正向CBFEX1，5’-GGC CCT CAG ATT CTC-3’(SEQ ID NO31)；反向CBTEXR，5’-GTT GAA TGT TTC TTA-3’)(SEQ ID NO32)，0.165 U Taq聚合酶(Biotaq，M95801B；Bioline)，加dH2O至總體積)。循環條件95℃ 120秒，35x[95℃ 60秒，60℃ 30秒，72℃ 110秒]。通過使用Sephadex G-50 Superfine(17-0041-01，Amersham Pharmac ia Biotech)按照產品介紹進行的凝膠過濾(Millipore Filtration System)實現反應后的純化，對于最終樣品洗脫液使用50μl的dH2O。正向和反向測序反應使用與產生PCR產物所用的引物相同的引物進行(2μl PCR產物，8μl測序混合物，0.6μl 6pmol引物(見上文)，加dH20至20μl；DYEnamic ETDye終止子循環測序試劑盒(US81095))。熱循環(30x[95℃ 20秒，55℃ 15秒，60℃ 70秒])后，基本上如上所述通過凝膠過濾純化樣品并使用LPA long-read模型和如下測序條件即在3kV下注射90秒和在9kV下電泳35分鐘，在MegaBACE1000(AmershamPharmacia Biotech)上分析。
實施例7等位基因特異性PCR試驗從cDNA序列設計引物且4個等位基因特異性引物設計成在突變位置具有3’堿基。
引物序列T_fwd5’-CAG TGG CCC TCA GAT TCT CAA GAG CTT AAT TCTAAG GAA CTT TCA GCT GGC TCA CAA TTT GTA GGT CTCATG GCA T-3’(SEQ ID NO33)G_fwd5’-CAC AAT TTG TAG GTC TCA TGG CAG-3’(SEQ ID NO34)A_rev5’-GCC ACT GGA AAA ACA TGC TGT GAG AAA-3’(SEQ ID NO35)C_rev_link*5’-aat gct act act att agt aga att gatgcc acc ttt tca gct cgc gcc cca aatgaa aat ata gct aaa cag gtt att gac catttg cga aat gta tct aat ggt caa actttt ttC TGG AAA AAC ATG CTG TGA GAA C-3’(SEQ ID NO36)Fwd5’-GGC CCT CAG ATT CTC AAG AGC-3’(SEQ ID NO37)Rev5’-CGA TGA AAA AGG AAC CAA AAG GG-3’(SEQ ID NO38)C_rev_link引物含有M13噬菌體的接頭序列(以小寫字母表示)。加入該接頭可獲得更長的PCR產物以便能夠在一個PCR反應中多重反應C-和A-引物。突變位置的3’堿基以黑體字表示。C-和G-引物對野生型等位基因是特異性的，而T-和A-特異性引物對突變是特異性的。
引物對C-和A-特異性多重反應Fwd+A_rev+C_rev_link(下鏈)
T-特異性反應T_fwd+Rev(上鏈)G-特異性反應G_fwd+Rev(上鏈)AS-PCR條件在含有20-100ng基因組DNA，0.025單位/μl BIOLASEDiamond DNA聚合酶，0.75mM dNTPs，3mM MgCl2，溶于1x NH4緩沖液(Bioline)中的0.25pmol/μl引物(在多重反應中兩個反向引物為0.125pmol/μl)的10μl體積中進行各PCR反應。在如下條件下在GeneAmpPCR System 9700(PE Applied Biosystems)中進行PCR95℃ 4分鐘，35個循環的94℃ 30秒，62℃(對于T-和G-反應為56℃)以80％的坡度處理30秒，及72℃ 30秒，接著72℃下最后延伸7分鐘并在4℃下貯存。PCR后在2％瓊脂糖凝膠中以200V電泳30分鐘。
兩個野生型，兩個攜帶者，和兩個患病動物的等位基因特異性PCR分析的結果在圖7中顯示。


圖1顯示了用于定位牛脊椎畸形綜合征(CVM)基因座和牛染色體3上的5個小隨體標記的單元型的譜系。最可能的CVM單元型以黑體表示。實心黑框表示患病牛犢。雄親和雌親之間的雙線表示近交回路。N表示動物數目。13個不同雌親的基因型為了簡明而未顯示。
圖2顯示了牛染色體3的遺傳圖譜。旁邊的數字是指沿染色體以厘摩(cM)給出的遺傳距離。表示了牛脊椎畸形綜合征(CVM)基因座最可能的位置。
圖3顯示了按美國肉類動物研究中心(Kappes等，1997)描繪的牛3號染色體上3個小隨體標記ILSTS029，BMS2790和INRA003(在線上顯示，表示為牛3號染色體上的連續標記)之間以cM表示的相對距離。通過與高密度復制濾膜雜交(ILSTS029和INRA003)，或者通過PCR篩選RPCI-42牛BAC文庫(BMS2790)分離含有這3個標記的BACs。鑒定的BACs以黑色線段表示且注明平板號/孔號。使用SP6和T7引物對這些BACs進行末端測序或者使用從小隨體延伸的引物進行測序。使用Sanger中心的Ensemble服務器將所得的序列對人1號染色體進行blast檢索。來自blast檢索的登錄號在人1號染色體下面以登錄號表示且命中者之間的相對距離以MB給出。該區域中的選定基因以方框表示。
圖4顯示了SLC35A3基因(SEQ ID NO18)的cDNA序列和翻譯及其編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO17)。位置559上的多態性核苷酸和受影響的纈氨酸-180以黑體字表示。
圖5顯示了奶牛SLC35A3推斷的氨基酸序列與人(AB021981)(Ishida等，1999)和狗(AF057365)(Guillen等，1998)序列的比較。點表示與Bos Taurus序列匹配的殘基。破折號表示為優化序列對比而插入的間隔。
圖6顯示了通過測序確定CVM狀態時在559位置顯示G/T多態性的區域(SLC35A3的核苷酸544至572，見圖4)的測序結果。左右組分別顯示了正向和反向測序。上排(-/-)顯示了對野生型動物的測序，中排顯示了對攜帶者(雜合型)的測序，下排顯示了對患病動物的測序。
圖7是顯示來自兩個野生型，兩個攜帶者和兩個患病動物的等位基因特異性PCR產物的照片。注解WT野生型，C攜帶者，S患病者，neg陰性對照，M標記(大小梯度)。箭頭顯示了等位基因特異性PCR產物C220bp，A98bp，T；340bp，和G288bp。
參考文獻1.Agerholm JS，Bendixen，C.，Andersen O.，Arnbjerg，J.(2000)LK meddelelser October 2000。
2.Barendse W，Vaiman D，Kemp SJ，Sugimoto Y，ArmitageSM，Williams JL，Sun HS，Eggen A，Agaba M，Aleyasin SA，BandM，Bishop MD，Buitkamp J，Byrne K，Collins F，Cooper L，Coppettiers W，Denys B，Drinkwater RD，Easterday K，ElduqueC，Ennis S，Erhardt G，Li L，Lil L(1997)牛基因組中等密度的遺傳連鎖圖譜。Mamm Genome 8，21-28。
3.Brückner，K.，Perez，L.，Clausen，H.，& Cohen，S..(2000)，Fringe的糖基轉移酶活性調節Notch-Delta的相互作用，Nature 406，第411-415頁。
4.Evrad，Y.A.，Lun，Y.，Aulehla，A，.Gan，L.，& Johnson，R.L.(1998)，Lunatic fringe是體節分節和成型的重要調節劑。Nature 394，第377-381頁。
5.Guillen，E.，Abeijon，C.，& Hirschberg，C.B.(1998)，哺乳動物高爾基器UDP-N乙酰葡糖胺轉運蛋白通過酵母突變體表型校正的分子克隆，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95，第7888-7892頁。
6.Ishida，N.，Yoshioka，S.，Chiba，Y.，Takeuchi，M.，& Kawakita，M.(1999)，人高爾基體UDP-N乙酰葡糖胺轉運蛋白的分子克隆和功能表達，J.Biochem.126，第68-77頁。
7.Kappes SM，Keele JW，Stone RT，McGraw RA，SonstegardTS，Smith TP，Lopez-Corrales NL，Beattie CW(1997)，牛基因組的第二代連鎖圖譜，Genome Res 7，235-249。
8.Klein，T.，& Arias，M.(1998)，果蠅翅膀發育期間Delta，Serrate與Fringe之間的相互作用調節Notch活性，Development125，第2951-2962頁。
9.Lathrop GM，Lalouel JM，Julier C，Ott J(1985)，人多基因座連鎖分析連鎖的檢測和重組的估計，Am J Hum Genet37，482-498。
10.Moloney，D.J.，Panin，V.M.，Johnston，S.H.，Chen，J.，Shao，L.，Wilson，Y.，Stanley，P.，Irvine，K.D.，Haltiwanger，R.S.，& Vogt，T.F.(2000)，Fringe是修飾Notch的糖基轉移酶，Nature 406，第369-375。
11.Solinas-Toldo S，Lengauer C，Fries R(1995)，人和牛的比較基因組圖譜，Genomics 27，489-496。
序列表<110>丹麥糧食、農業、漁業部農業科學研究院丹麥丹麥畜牧協會丹麥<120>用于鑒定牛脊椎畸形綜合征攜帶者的遺傳試驗<130>25652<160>38<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>1ctggaggtgt gtgagcccca ttta24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>2ctaagagtcg aaggtgtgac tagg24
<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>DNA引物<400>4aaagagtcgg acattactga gc 22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>DNA引物<400>6tggatttaga ccagggttgg 20<210>7<211>20
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<223>DNA引物<400>14atggaaaaat aagatgtggt atgtg 25<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物
<400>15gtagccatgg agactggact g 21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>16cattatcccc tgtcacacac c 21<210>17<211>326<212>PRT<213>牛SLC35A3蛋白<220>
<223>DNA引物<400>17Met Ser Ala Asn Leu Lys Tyr Leu Ser Leu Gly Ile Leu Val Phe Gln15 10 15Thr Thr Ser Leu Val Leu Thr Met Arg Tyr Ser Arg Thr Leu Lys Glu20 25 30Glu Gly pro Arg Tyr Leu Ser Ser Thr Ala Val Val Val Ala Glu Leu35 40 45Leu Lys Ile Met Ala Cys Ile Leu Leu Val Tyr Lys Asp Ser Lys Cys50 55 60Ser Leu Arg Ala Leu Asn Arg Ile Leu His Asp Glu Ile Leu Asn Lys65 70 75 80Pro Met Glu Thr Leu Lys Leu Ala Ile Pro Ser Gly Ile Tyr Thr Leu85 90 95Gln Asn Asn Leu Leu Tyr Val Ala Leu Ser Asn Leu Asp Ala Ala Thr100 105 110Tyr Gln Val Thr Tyr Gln Leu Lys Ile Leu Thr Thr Ala Leu Phe Ser115 120 125Val Ser Met Leu Ser Lys Lys Leu Gly Val Tyr Gln Trp Leu Ser Leu130 135 140Val Ile Leu Met Thr Gly Val Ala Phe Val Gln Trp Pro Ser Asp Ser145 150 155 160Gln Glu Leu Asn Ser Lys Glu Leu Ser Ala Gly Ser Gln Phe Val Gly165 170 175Leu Met Ala Val Leu Thr Ala Cys Phe Ser Ser Gly Phe Ala Gly Val180 185 190
Tyr Phe Glu Lys Ile Leu Lys Glu Thr Lys Gln Ser Val Trp Ile Arg195 200 205Asn Ile Gln Leu Gly Phe Phe Gly Ser Ile Phe Gly Leu Met Gly Val210 215 220Tyr Val Tyr Asp Gly Glu Leu Val Ser Lys Asn Gly Phe Phe Gln Gly225 230 235 240Tyr Asn Arg Leu Thr Trp Ile Val val Val Leu Gln Ala Leu Gly Gly245 250 255Leu Val Ile Ala Ala val Ile Lys Tyr Ala Asp Asn Ile Leu Lys Gly260 265 270Phe Ala Thr Ser Leu Ser Ile Ile Leu Ser Thr Leu Ile Ser Tyr Phe275 280 285Trp Leu Gln Asp Phe Val Pro Thr Ser Val Phe Phe Leu Gly Ala Ile290 295 300Leu Val Ile Thr Ala Thr Phe Leu Tyr Gly Tyr Asp Pro Lys Pro Ala305 310 315 320Gly Asn Pro Thr Lys Ala325<210>18<211>1217<212>DNA<213>牛SLC35A3 cDNA<220>
<223>DNA引物<400>18caggcaaatg aagataaaac aatgtcagcc aacctaaaat acctttcttt aggaattttg 60gtctttcaga ctaccagttt ggttctgacg atgcgttatt ctaggacatt aaaagaagag 120gggcctcgtt atctgtcatc tacagctgtg gttgttgctg aacttttgaa gataatggcc 180tgcattttat tagtctacaa agatagcaaa tgtagtctaa gagcactgaa tcgaatacta 240catgatgaaa ttcttaataa acctatggaa acgcttaaac ttgctattcc atcagggata 300tatactcttc agaataattt actctatgtg gcactgtcaa atctcgatgc agctacttat 360caggtcacat atcagttgaa aattcttaca actgcactat tttctgtgtc aatgcttagt 420aaaaaattag gtgtgtacca gtggctctcc ctagtaattt tgatgacagg agttgctttt 480gtacagtggc cctcagattc tcaagagctt aattctaagg aactttcagc tggctcacaa 540tttgtaggtc tcatggcagt tctcacagca tgtttttcca gtggctttgc tggggtttac 600tttgagaaaa tcttaaaaga aaccaaacaa tcagtgtgga taagaaacat tcaacttggt 660ttctttggga gtatatttgg attaatgggt gtatatgttt atgatggaga actggtatca 720aagaatgggt tttttcaggg atataaccga ctgacctgga tagttgttgt tcttcaggca 780ctgggaggcc ttgtaatagc tgctgttatt aagtatgcgg ataacatttt gaaaggattt 840gcaacctctt tgtccataat attatcaaca ctaatatctt atttttggct acaagatttt 900gtaccaacca gtgtcttttt ccttggagcc atccttgtaa taacagctac tttcctatat 960ggttatgatc ccaaacctgc aggaaatccc actaaagcat agtggtaact tacctggttt 1020ttcacagtgg tgcactggga atctcaacat taatgctgca cagaggactt ctacagattc 1080
taagagaaaa tcatcatgct gaatctgatc atgatgttca aatggtttga aaatataaaa 1140gtttaaggat aaaatataca tatatgtaac aaaatgccta ttgcatctaa aaatcaaaac 1200ttgaacattt ccaggga1217<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>19ggaggcaaat gaagataaaa c 21<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>20ctatgcttta gtgggatt 18<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>21gagttgcttt tgtacagtgg20<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>22actggctact atctagcaca gga
<210>23<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>23cacaccgctg tacaggaaaa agtgtgccaa ccctggtcta aatccaaaat ccattatctt 60ccaagtacat 70<210>24<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>24cgtcccctat gcgcttacta catacactca aatggaaatg ggaaaactgg aggtgtgtga 60gccccattta 70<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>25aagacaagga ctttcagccc 20<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>26aaagagtcgg acattactga gc 22
<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>27ttatacgact cactataggg 20<210>28<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>28atttaggtga cactatag 18<210>29<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>29ctggaggtgt gtgagcccca ttta24<210>30<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>30ctaagagtcg aaggtgtgac tag 24<210>31<211>15<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>31ggccctcaga ttctc 15<210>32<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>32gttgaatgtt tctta 15<210>33<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>33cagtggccct cagattctca agagcttaat tctaaggaac tttcagctgg ctcacaattt 60gtaggtctca tggcat 76<210>34<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>34cacaatttgt aggtctcatg gcag24<210>35<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>DNA引物<400>35gccactggaa aaacatgctg tgagaaa 27<210>36<211>139<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>36aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac ttttttctgg 120aaaaacatgc tgtgagaac 139<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>37ggccctcaga ttctcaagag c 21<210>38<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>38cgatgaaaaa ggaaccaaaa ggg 2權利要求
1.檢測牛受試者中牛脊椎畸形綜合征(CVM)的方法，其中鑒定存在與牛脊椎畸形綜合征(CVM)相關的遺傳標記，所述的方法包括a)提供牛遺傳物質，和b)在所述的遺傳物質中檢測是否存在與牛脊椎畸形綜合征疾病性狀連鎖的至少一個遺傳標記。
2.根據權利要求1的方法，其中至少一個遺傳標記位于牛染色體BTA3上。
3.根據權利要求2的方法，其中所述的至少一個遺傳標記位于兩側為多態性小隨體標記BM4129和BMS1266且包含它們的區域中。
4.根據權利要求3的方法，其中至少一個遺傳標記位于從大約59.5cM到大約67.9cM的區域中。
5.根據權利要求4的方法，其中至少一個遺傳標記位于兩側為多態性小隨體標記INRAA003和BMS937且包含它們的區域中。
6.根據權利要求5的方法，其中至少一個遺傳標記位于兩側為多態性小隨體標記INRAA003和ILSTS029且包含它們的區域中。
7.根據權利要求2的方法，其中至少一個遺傳標記是小隨體標記INRAA003。
8.根據權利要求2的方法，其中至少一個遺傳標記是小隨體標記BMS2790。
9.根據權利要求2的方法，其中至少一個遺傳標記是小隨體標記ILSTS029。
10.根據權利要求2的方法，其中至少一個遺傳標記是小隨體標記INRA123。
11.根據權利要求2的方法，其中至少一個遺傳標記是小隨體標記BM220。
12.根據權利要求2的方法，其中至少一個遺傳標記是小隨體標記HUJ246。
13.根據權利要求2的方法，其中至少一個遺傳標記是小隨體標記BMS862。
14.根據權利要求2的方法，其中至少一個遺傳標記是小隨體標記BMS937。
15.根據權利要求1的方法，其中至少一個遺傳標記與引起牛脊椎畸形綜合征疾病的基因連鎖。
16.根據權利要求15的方法，其中引起牛脊椎畸形綜合征疾病的基因是牛SLC35A3基因。
17.根據權利要求16的方法，其中牛SLC35A3基因編碼包含SEQ ID NO17所示的氨基酸序列的牛SLC35A3蛋白質。
18.根據權利要求17的方法，其中牛SLC35A3蛋白質由包含SEQ ID NO18的核苷酸序列的cDNA序列編碼。
19.根據權利要求18的方法，其中遺傳標記是相當于SEQ IDNO18的核苷酸559位置的單核苷酸多態性。
20.根據權利要求19的方法，其中單核苷酸多態性是G/T多態性。
21.根據權利要求20的方法，其中通過選自由等位基因特異性PCR，微型測序，引物延伸，熱-測序，PCR-RFLP，等位基因特異性滾動循環擴增和引物延伸接著進行MALDI-TOF質譜術組成的組中的一種技術進行G/T多態性檢測。
22.根據權利要求2的方法，其中所述的至少一個遺傳標記與引起牛脊椎畸形綜合征疾病的基因或疾病性狀在遺傳上連鎖，其優勢對數得分為至少3.0，例如至少4.0，包括至少5.0，例如至少6.0，包括至少7.0，例如至少8.0，包括至少9.0，例如至少10.0，包括至少11.0，例如至少12.0。
23.根據權利要求1的方法，其中至少一個標記是遺傳標記的組合。
24.根據權利要求7的方法，其中用于擴增小隨體標記INRAA003的引物對是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
25.根據權利要求8的方法，其中用于擴增小隨體標記BMS2790的引物對是SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。
26.根據權利要求9的方法，其中用于擴增小隨體標記ILSTS029的引物對是SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。
27.根據權利要求10的方法，其中用于擴增小隨體標記INRA123的引物對是SEQ ID NO7和SEQ ID NO8。
28.根據權利要求11的方法，其中用于擴增小隨體標記BM2 20的引物對是SEQ ID NO9和SEQ ID NO10。
29.根據權利要求12的方法，其中用于擴增小隨體標記HUJ246的引物對是SEQ ID NO11和SEQ ID NO12。
30.根據權利要求13的方法，其中用于擴增小隨體標記BMS862的引物對是SEQ ID NO13和SEQ ID NO14。
3 1、根據權利要求14的方法，其中用于擴增小隨體標記BMS937的引物對是SEQ ID NO15和SEQ ID NO16。
32.用于檢測牛受試者中存在與牛脊椎畸形綜合征(CVM)相關的至少一個遺傳標記的診斷試劑盒，包含選自由SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO33，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37和SEQ ID NO38，及其組合組成的組中的至少一個寡核苷酸序列。
全文摘要
本發明描述了用于鑒定脊椎畸形綜合征(CVM)疾病基因的牛攜帶者的遺傳標記。該遺傳標記包括小隨體標記BM4129，INRAA003，BMS2790，ILSTS029，INRA123，BM220，HUJ246，BMS862，BMS937，BL1048，BMS2095和BMS1266以及牛SLC35A3基因，它們位于牛染色體BTA3上。牛SLC35A3基因559位的G/T多態性被鑒定為牛CVM的病因和診斷特征。
文檔編號C12Q1/68GK1503847SQ01821716
公開日2004年6月9日 申請日期2001年11月15日 優先權日2000年11月16日
發明者克里斯蒂安·本迪克森, 瑟倫·斯文森, 黑勒·延森, 弗蘭克·帕尼茨, 安德斯·奧斯博格, 拉爾斯-埃里克·霍爾姆, 佩爾·霍恩, 阿內特依·霍伊, 博·湯姆森, 梅特·耶珀森, 維維·胡尼科克·尼爾森, 馬蕾·瓊克, 奧斯博格, 帕尼茨, 依 霍伊, 克里斯蒂安 本迪克森, -埃里克 霍爾姆, 姆森, 延森, 斯文森, 瓊克, 耶珀森, 胡尼科克 尼爾森, 霍恩 申請人:丹麥糧食、農業、漁業部農業科學研究院, 丹麥畜牧協會, 丹麥糧食、農業、漁業部農業科學研究