由真菌制備異源蛋白的方法

專利名稱：由真菌制備異源蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及由真菌制備異源蛋白或肽的方法。
背景技術：
在宿主如真菌中制備異源蛋白是公知的。EP-A-481,008公開了在葡萄糖中生長的酵母中制備異源蛋白。
由宿主生物體以補料分批發酵法工業大規模制備異源蛋白通常顯示三個期。
第一期是分批期，定義是其中細胞生長到所需濃度的期。在這個期，細胞以指數生長。描述分批期的模型假定細胞不死亡，氧氣過量存在，以及所有其它條件使得可無限生長。這意味著在分批期，以充足的量提供所有營養需要。總之，分批期是(異源)蛋白產量仍低的同時，細胞擴增的期。
第二期是補料期，定義是碳源和其它需要以相對濃縮的液體流以預先計算的速度“補料速度”補充到發酵罐。在這個期重點是由生長細胞制備蛋白和導致生物量增加的細胞生長。補充到發酵罐的底物在這個期通常用于細胞生長和產物合成。細胞生長由補料速度控制，以獲得最佳的細胞生長和異源蛋白制備。
最后到達第三期，定義是衰亡期，其中出現限制條件。在這個期，例如發酵罐中的氧氣濃度降低到零，有些情況下導致乙醇形成。在這個期，多數細胞將集中于維持且通常產物合成減少。盡管在這個期仍可以觀察到細胞生長，但是生長通常有限至零。在這個期細胞可能逐漸失去活力。
在包含普通碳源如基于葡萄糖或其它糖基的碳源的培養基上制備異源蛋白是令人滿意的，直到補料期末開始存在限制條件。限制條件的實例包括生長培養基中氧氣濃度降低，營養物如維生素、碳、氮減少，和有毒化合物的蓄積。
如果真菌，特別是酵母，在包含葡萄糖作為碳源的培養基中生長，限制條件一出現，異源蛋白產量就大大降低。
對于在包括糖作為碳源的普通培養基上生長的酵母，補料分批發酵中存在上述期。因此一旦衰亡期開始，比產量(其定義是每克生物量所產生的異源蛋白或肽量)維持或降低。盡管細胞密度很高，在衰亡期產物合成因此降低。通常含葡萄糖作為碳源的普通培養基的另一個缺點是轉變為生物量而不是轉變為產物的底物量高，該產物通常是本發明上下文中的異源蛋白。因此在這個系統中，生物量相對高不可避免地伴隨高水平異源蛋白的產生。這個高生物量導致粘性發酵培養基，例如容易產生氧氣限制。
因此，期望在宿主如真菌中制備異源蛋白的方法，如甚至在限制條件下可得到高異源的蛋白產量，其中會存在正常衰亡和比產量降低，然而同時生長系統的比產量維持或與已知生長系統相比增加。
本發明的方法克服了至少一個指出的問題。
發明概述已經驚奇地發現在含乙醇作為主要碳源和誘導劑如半乳糖控制異源蛋白產生的培養基上生長的真菌顯示出異源蛋白比產量高，甚至在限制條件下異源蛋白的比產量也驚人地高。
令人驚奇地，根據這個方法生長的真菌不顯示傳統葡萄糖基培養基上生長的真菌所遭遇的熟知衰減特性。連續補充含這個特殊碳源的培養基下，真菌維持或甚至增加異源蛋白的絕對和比產量水平。
因此，本發明涉及由真菌制備異源蛋白的方法，該所述真菌在包含在含碳源的培養基上生長，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇，其中培養基另外包含誘導劑。
發明詳述在本發明上下文中，術語真菌包括酵母和霉菌。
為了本發明的目的，術語異源蛋白是指包括蛋白和肽。
異源蛋白是不是真菌天然產生，但是僅在真菌修飾到這個程度而產生的蛋白。
除非另有說明，指出的重量百分比是基于總產物或總培養基重量的重量百分比。
使用術語氧氣濃度的地方，實施例中闡明的方法測定的溶解氧氣濃度作為參照。
分批期末定義是提供給細胞的所有碳底物已經耗盡的時刻。
誘導期定義是在分批期后開始的期，從異源蛋白誘導開始的時刻，直到所用特定誘導劑濃度獲得最大誘導的時刻。
碳源定義是給細胞提供碳和能量供應的底物。真菌主要從有機化合物得到它們的細胞碳源。這些通常用作碳源和能源它們部分被同化為細胞材料，部分被氧化提供能量。在本文中，H.Schlegel在General microbiology，劍橋大學出版社，1992，第7版，194頁作為參考。
本發明涉及由真菌制備異源蛋白的方法。為了制備蛋白，真菌被遺傳學修飾，使得可能進行這種異源蛋白或肽的控制生產。
任何合適的構建體或轉化方法可用于這個遺傳修飾。EP-A-481,008給出了合適的構建體和轉化方法實例，該專利引入作為參考。
通常，被修飾的真菌將在修飾后含有啟動子控制下的包括編碼異源蛋白的基因的(整合)載體。啟動子的活性由所謂的誘導劑調節。啟動子的實例包括半乳糖啟動子，如半乳糖誘導的GAL4，GAL7；甲醇誘導啟動子，由甲醇誘導；乙醇啟動子，由乙醇誘導；溫度調節啟動子，由溫度改變誘導；磷酸鹽調節啟動子，由磷酸鹽的存在誘導；和葡萄糖可抑制啟動子，由葡萄糖的存在誘導。
真菌在含碳源(50至100wt％是乙醇)的培養基中生長，同時培養基中存在誘導劑。
在本領域中，乙醇用作碳源通常認為是不好的，下面引用的公開物可以例證。總之，據報道乙醇代替葡萄糖用作碳源可降低生物量產量，需要更高氧氣消耗并因此在氧氣有限條件下不提供或提供有限生長。而且，菌株的乙醇毒性可導致活力受損和細胞死亡。這在如Theyeasts，第3卷，第2版，第6章的表1中公開。這個公開物的附錄1作為具體的參考，它公開了乙醇和葡萄糖上酵母的生長速度是0.1h-1∶0.35h-1。這個附錄還公開了在乙醇作為碳底物的培養基上，酵母顯示出比在含葡萄糖作為碳底物的培養基上更高的氧氣消耗。
Shiba等(J.of bioscience and bioengineering，89卷，426-430頁，2000)進一步描述了乙醇作為碳源的細胞的生長。Shiba公開了用GAL10啟動子在啤酒糖酵母ga180突變體中進行羧肽酶Y(CPY)的表達。生長培養基包含乙醇作為唯一碳源。在乙醇補料開始時，報道生長速度和CPY產量都降低。這個系統不在誘導劑的控制下。
本發明提供了一種方法，其中在含50至100wt％是乙醇的碳源的培養基存在下，特別是當限制生長條件出現時，蛋白產量維持或甚至增加。此外，根據本發明的方法適用于任何類型的真菌，生長不需要特殊的ga180突變體。通過誘導可以很好控制本發明的方法。
Saliola，M等(applied and environmental microbiology，1999年1月，53-60頁)公開了使用乙醇誘導型KIADH4啟動子在Kluyveromyces lactis中表達異源基因。這個文件教導了在補料分批系統中，當乙醇用作啟動子且同時作為唯一碳源時，表達最佳。這個生產系統不能夠控制補料期的基因表達。
根據本發明的方法的另外益處是控制熱產量，它對于熱不穩定蛋白的制備很重要。
優選含碳源的50至100wt％是乙醇的培養基，培養基中同時存在誘導劑，貫穿所有相中，但是發現在分批期使用不滿足這些需要的培養基是可能的，只要補料期培養基滿足需要。
在優選的實施方案中，本發明涉及由真菌制備異源蛋白的方法，該方法包括分批期和補料期，且其中補料期培養基包含50至100wt％是乙醇的碳源，和其中補料期培養基另外含有誘導劑。
與通常含有葡萄糖或其它糖作為主要碳源的已知生長系統相比，根據本發明的培養基能夠得到高水平比產量，甚至在限制條件下；即，優選沒有衰亡期。
甚至發現限制氧氣條件下，比產量在補料期最高，而對于基于葡萄糖的生長系統來說，發現最高的比產量通常在補料期，生物量的量仍相對較低。
不期望受任何理論的限制，申請人相信在本發明的方法中，由于使用含50至100wt％是乙醇的碳源的培養基，衰亡期延遲或甚至不存在。
在制備異源蛋白的方法中，優選優化補料條件，使得細胞生長速度和異源蛋白產量最佳。如上指出，如果真菌以工業規模生長，非常優選使用發酵罐的補料分批系統。
在另一個優選的實施方案中，本發明涉及由真菌制備異源蛋白的方法，該方法包括分批期、誘導期和補料期，其中在所述補料期a)真菌細胞在含任何碳源的培養基上生長到至少5g/l的細胞密度，沒有特殊優選，隨后真菌細胞生長到5g/l以上的細胞密度，優選10至90g/l，更優選40至60g/l，使用含誘導劑和碳源的培養基，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇，b)已經達到步驟a)的細胞密度后，產生限制生長條件，c)這些限制條件到來后，細胞進一步在含碳源的培養基上生長，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇。
在這個優選方法的第一步中，細胞在分批期生長直到碳底物已耗盡，在第二步中，細胞生長到足夠的細胞密度使得能夠高量制備異源蛋白。在這個第二期的第一個階段，向補料培養基中添加誘導劑誘導異源蛋白的產生。從零誘導，和由此很低水平異源蛋白產生，直到最佳誘導所花費的時間稱作誘導期。這個誘導期組成補料期的第一個階段。
發酵罐中的限制條件可以用幾種方法獲得。限制條件定義是不再可能進行指數細胞生長和細胞生長降低的那些條件。
本發明的方法中，優選培養基中的限制條件是由選自下組的方法產生的，包括a)發酵罐培養基中氧氣濃度降低，優選低于30％，更優選低于15％，b)給含乙醇的培養基過量補料，直到培養基中乙醇水平達到或超過培養基中生長的菌株細胞的生長限制濃度c)降低細胞生長的其它必要成分的水平，所述成分優選選自氮、磷、硫和維生素優選在分批期后，補料方案隨生物量產量呈指數增長。當出現氧氣限制和進入衰亡期，優選補料速度設置為維持發酵罐培養基中乙醇濃度低于10vol％的速度。這可例如通過線性補料速度或脈沖補料速度或分步補料速度來達到。
在甚至更優選的實施方案中，以重復補料分批方法來實施本發明的方法。
優選誘導劑適合啟動與用于轉化宿主真菌的基因構建體中的異源基因可操作連接的啟動子。優選誘導劑是半乳糖、甲醇、溫度和磷酸鹽。
最優選的誘導劑是半乳糖。
本發明不涉及乙醇用作誘導劑和(部分)碳源的表達方法。
當半乳糖是誘導劑時，優選培養基中半乳糖的量應該使得在其量很低的時候，啟動子啟動到期望水平，和半乳糖不分解代謝。為了防止這點，可能使用不能分解代謝誘導劑的菌株。
優選補料培養基的組合是使得發酵罐的培養基包含0.1-10wt％半乳糖，更優選0.05-1wt％，甚至更優選0.05-0.2wt％半乳糖。
根據本發明培養基中的碳源包含至少50wt％和至高100wt％乙醇。優選碳源包含80至100wt％乙醇。剩余碳源可以是例如糖如葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、果糖或其它化合物如甘油、醋酸鹽，或復合碳底物如乳清和糖蜜。
真菌可以是酵母或霉菌。合適的酵母屬實例包括糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、畢赤氏酵母屬、漢遜氏酵母屬。合適的霉菌實例包括曲霉屬、根霉屬、木霉屬。
特別優選的生物體是啤酒糖酵母。
異源蛋白可以是期望制備的任何蛋白或肽。發現根據本發明的方法特別適合抗凍肽、抗體或其片段，或酶如角質酶(cutinase)和半乳糖苷酶的制備。抗凍肽是具有改善冰雪下生長能力的蛋白，例如biotechnology advances，13卷，3期，375-402頁，1995年，Griffith等所述，其引入本專利作為參考。
真菌生長的各個期的培養基通常包含碳源，含有或不含有誘導劑，分批期后需要其存在，和含有或不含有另外成分如維生素、酵母提取物、微量金屬離子、酸化劑使pH保持在期望水平、磷酸鹽、硫酸鹽水和止泡劑。
根據另一個優選實施方案，本發明涉及制備異源蛋白或肽的方法，其中分批培養基含有1-40wt％葡萄糖、水、微量金屬、根據需要存在的止泡劑、酵母提取物、維生素、磷酸鹽和硫酸鹽和其中培養基中含有5-35體積％乙醇、0.1-10wt％半乳糖、水、微量金屬、和根據需要存在的止泡劑、酵母提取物、維生素、磷酸鹽和硫酸鹽和其中10升規模中，“補料速度”“”是0.25-4g/分，或較大規模發酵的相應值。
本發明進一步涉及根據本發明方法獲得的異源蛋白分離物，特別是抗凍肽分離物。
現在將以下列非限制性實施例闡明本發明。實施例培養基和培養所有培養基和培養數據基于10升規模乙醇發酵。
對于10m3規模，根據比例因子1000粗略相同調整。培養基預先培養培養基
分批和補料培養基在表1中列出，對于10升規模表1
*乙醇純度，96.2％v/v含量，不飽和所有培養基在121℃/1.2巴(Linden高壓鍋)滅菌25分鐘，糖單獨滅菌。自來水量在下面描述，總量是使得總重量如表1底行指出。Egli維生素和微量金屬組成表2
維生素用0.22μm濾器滅菌菌株使用的菌株是啤酒糖酵母CEN.PK102-3A。基礎CRN.PK2啤酒糖酵母菌株是從EUROSCARF，Institute for Microbiology，JohannWolfgang Goethe-University Frankfurt，Marie-Curie-Strasse 9；Building N250，D-60439 Frankfurt，德國商購得到的。
這個啤酒糖酵母菌株不能分解代謝半乳糖，因為來自啤酒糖酵母URA3基因的序列的插入已經打斷GAL1基因。用含下列元件的表達載體轉化宿主菌株啟動子GAL7啟動子，引導GAPDH。GAL7啟動子總是存在兩個上游活化序列。它們是作為連接的序列的一部分的2個天然元件。
選擇性標記Leu2d信號序列轉化酶(SUC2)整合靶具有為酵母染色體XII特定區域靶向整合的獨特的限制性酶切位點的rDNA重復片段。
異源基因實施例1編碼海洋鱈(ocean pout)HPLC12抗凍蛋白的抗凍蛋白基因(WO-A-9702343)實施例2K 609B，小豬中抗毒力因子的抗體。
實施例3蛋白VHH G，它是HGL11，是重鏈免疫球蛋白；EP-A-1,134,231公開的抗人胃脂肪酶的脂肪酶抑制劑。
實施例4蛋白VHHP，它是HPL18，是重鏈免疫球蛋白；EP-A-1,134,231公開的抗人胰腺脂肪酶的脂肪酶抑制劑。
實施例2-4的蛋白是根據EP-A-1,134,231公開的美洲駝免疫步驟得到的抗體。培養菌株保存菌株保存在-80℃，用脫脂牛奶和20％甘油的混合物1∶1稀釋的YNB生長培養物的單批中。接種50ml YNB接種1ml保存的菌株，在30℃，以150rpm培養48小時+2小時。
隨后接種物轉移到500ml 2％YPD，隨后在30℃，以150rpm培養24小時+2小時。發酵罐在標準發酵罐中進行發酵，所述發酵罐具有十升的工作體積。對于溫度控制，發酵罐裝配冷卻線圈和加熱指針。擋板是標準尺寸。帶有六個葉片的Rushton型葉輪用于攪拌。用Inglod DO2-電極(Mettler-Toledo)測定溶解的氧氣(DO2)，Inglod Impro 3000凝膠電極(Mettler-Toledo)測定pH。質譜分光光度計Prima 600(VG氣體分析系統)用于測定廢氣。整個發酵過程是自動的和軟件控制的，但是也可以在下面提供的指導基礎上手工操作。
利用補料分布控制發酵。用3M磷酸(Baker)和12.5％v/v氨(Merck)控制pH。用葉輪速度的自動調節將DO2控制在30％，直到產生最大攪拌速度(1000rpm)。
發酵過程中，用自動取樣器取出5ml樣品并冷卻在4℃，進行干重測定和產物濃度分析。分批期為啟動分批期，500ml YPD接種物加入到5.5L分批培養基中。發酵參數根據表3.1，當廢氣中乙醇含量降低到300ppm時，開始指數補料。補料期補料培養基分裝到同一泵連接的兩個補料瓶中。
一個補料瓶含乙醇和自來水至2升，通過底板補料到發酵罐中。第二個補料瓶含所有其它補料成分和水至2升，通過頂板補料。根據等式1給與一個泵連接的兩個瓶施加相同指數補料速度。對于兩個瓶，所得補料速度是泵速度的兩倍。Φv,t=μ*X0*eμ*tρfeed*Yx,s*60]]>[g/分](等式1)Φv，t＝補料速度g/分μ＝生長速度 h-1X0＝補料開始時的生物量g(Mw＝24.6g/mol)t＝從補料開始起的時間 分ρfeed＝補料密度 g乙醇/g補料Yx，s＝生物量的估計產量 g×/g底物60＝時間因子 分/小時補料參數根據表3。
表310升乙醇發酵的發酵補料參數
當氧氣濃度是0％時，限制條件到來，泵速度設置到線性補料速度。這個補料連續直到所有補料耗盡。結果
基于這些結果，結論是補料期限制條件出現后AFP的產量，繼續用含100wt％是乙醇的碳源的培養基進行補料，導致AFP的比產量驚人地高。
觀察到生物量產量是恒定的，沒有絕對AFP生產率的損失。對比實施例補料期的生長培養基不含有乙醇而是100wt％葡萄糖作為碳源。這個實驗的培養基在上面描述。發酵罐補料條件也在上面說明，除了下列例外補料培養基從一個補料瓶應用于發酵罐，該補料瓶含有所有成分并通過底板補料到發酵罐。根據等式1實施指數補料速度。
補料參數根據表3，除了X0值設置為2.11mol，使得一個補料瓶的補料速度與一個泵上兩個補料瓶的乙醇發酵相同。結果如下
結論是當生長培養基僅含葡萄糖作為碳底物時，AFP產量從限制條件到來的時刻降低。AFP產量不再增加且產量下降。結果-實施例2
*比產量mg異源蛋白/g干燥物質結論是使用乙醇作為碳源的異源蛋白的比產量大大高于葡萄糖作為碳源的產量。結果-實施例3
*比產量mg異源蛋白/g干燥物質結論是使用乙醇作為碳源的異源蛋白比產量大大高于葡萄糖作為碳源的產量。
結果-實施例4
*比產量mg異源蛋白/g干燥物質結論是使用乙醇作為碳源的異源蛋白比產量大大高于葡萄糖作為碳源的產量。
權利要求
1.由真菌制備異源蛋白的方法，包括所述真菌在含碳源的培養基上生長，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇，和其中培養基另外含有誘導劑。
2.權利要求1的方法，它包括分批期和補料期，其中補料期培養基包含50-100wt％是乙醇的碳源和其中補料期培養基另外含有誘導劑。
3.權利要求2的方法，其中補料期培養基包含50-100wt％是乙醇的碳源和另外含半乳糖作為誘導劑。
4.權利要求2或3的方法，其中該方法在發酵罐中實施，培養基以使得發酵罐中乙醇濃度維持在低于10vol％的補料速度進行補料。
5.權利要求1-4任一項的方法，該方法包括分批期，誘導期和補料期，其中在所述補料期a)真菌細胞在含任何碳源的培養基上生長到至少5g/l的細胞密度，沒有特殊優選，隨后真菌細胞生長到5g/l以上的細胞密度，優選10至90g/l，更優選40至60g/l，使用含誘導劑和碳源的培養基，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇，b)已經達到步驟a)的細胞密度后，產生限制生長條件，c)這些限制條件到來后，細胞進一步在含碳源的培養基上生長，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇。
6.前面任何一項權利要求的方法，其中該方法以重復補料分批方法實施。
7.前面任何一項權利要求的方法，其中誘導劑選自包括半乳糖、甲醇、溫度和磷酸鹽的組。
8.權利要求2-7任一項的方法，其中補料培養基包含0.1-10wt％的半乳糖。
9.前面任何一項權利要求的方法，其中碳源含80-100wt％的乙醇。
10.前面任何一項權利要求的方法，其中真菌是酵母，優選啤酒糖酵母。
11.前面任何一項權利要求的方法，其中異源蛋白或肽選自抗凍肽、抗體或其片段，和酶。
12.權利要求5的方法，其中分批培養基含1-40wt％葡萄糖、水、微量金屬、止泡劑存在或不存在下、酵母提取物、維生素、磷酸鹽和硫酸鹽，和其中補料培養基含5-35vol％乙醇、0.1-10wt％葡萄糖、水、微量金屬、和止泡劑存在或不存在下、酵母提取物、維生素、磷酸鹽和硫酸鹽和其中10升規模中的“補料速度”“”是0.25-4g/分。
13.異源蛋白，可根據權利要求1-12任一項的方法獲得。
全文摘要
當補料培養基含50－100wt％乙醇碳源和誘導劑時，由真菌細胞制備異源蛋白是好的。
文檔編號C12N9/00GK1481439SQ01820537
公開日2004年3月10日 申請日期2001年11月16日 優先權日2000年12月13日
發明者A·M·J·范德拉爾, N·M·林德納, P·紐夫波爾特, A M J 范德拉爾, 林德納, 蠆ǘ 申請人:荷蘭聯合利華有限公司