專利名稱：采用益生菌治療內毒素血癥及相關疾病的制作方法
技術領域：
本發明涉及預防和治療內毒素血癥及相關疾病的方法，具體地，本發明涉及用益生菌預防和治療內毒素血癥及相關疾病的方法；本發明也涉及用于評價益生菌對內毒素血癥及相關疾病的預防和治療效果的方法。
背景本說明書通篇有關現有技術的討論決不應看作是承認該現有技術是普遍已知的或是本領域常識的一個部分。
內毒素是脂多糖，是位于革蘭氏陰性細菌細胞壁上具有熱穩定性的大分子(分子量200,000至1,000,000)。
革蘭氏陰性菌——尤其是大腸桿菌及其他物種在腸道中的寄居可以造成少量內毒素進入循環系統。改變寄居特征或者粘膜完整性的多種病理情況，會顯著地提高細菌的轉移，造成高水平的循環內毒素，即內毒素血癥。
由于內毒素會造成組織損傷，因此，內毒素血癥又與多種疾病狀態相關聯。實例包括從急性病癥，如“內毒素休克”到更加微妙的慢性組織損傷，例如肝細胞壞死/(炎癥)(肝炎)，特別是在同時存在已知與肝臟疾病有關的因素(如酒精和肝臟毒性病毒)的情況下。
近來，造成肝細胞損傷的共同途徑被聚焦在循環T淋巴細胞上。傳統上接受的引起肝細胞損傷的媒介是甲、乙、丙型肝炎以及自身免疫性肝炎(和推測的另外一些病毒感染，如EB病毒(EBV)，巨細胞病毒(CMV))。現在看來T淋巴細胞也與酒精性慢性肝臟疾病有關。已經發現，酒精可促進T淋巴細胞分泌腫瘤壞死因子(TNF)。在存在T細胞刺激物(特別是內毒素)時，這種“連擊”模式確保了肝細胞中高的TNF濃度，從而導致細胞死亡、肝炎以及，如果肝臟系統被打亂，則將導致肝硬化。
已經證明大腸桿菌可以提高酒精性肝炎患者的內毒素水平，當患者服用抗生素時，患者的內毒素水平會下降。
盡管(口服)抗生素能夠減少內毒素的水平，但尤其是從長期的角度出發，這不是一種理想的達到此目的的方法。另外一些被考慮用于治療的策略包括3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸合成抑制劑，多粘菌素B(一種多聚陽離子分子，可以結合內毒素)、血漿除去法、單克隆和多克隆免疫治療以及用內毒素拮抗劑治療(J Hurley(1995)在Clin.Microbiol.Rev.8268-292中的綜述)。這些策略每一個都有有利和不利之處，但至今仍沒有簡單且有效的內毒素血癥治療方法。
本發明的一個目的是克服或者改進現有技術中的至少一個缺點，或者提供有用的可選擇方案。
第一方面，本發明提供預防和/或治療內毒素血癥的方法，包括給需要治療的哺乳動物施用有效量的益生菌。
所述哺乳動物可以有出現內毒素血癥的危險，或者可以已經患有內毒素血癥，此哺乳動物可以患有急性病癥，例如危急病癥或者急性肝炎，或者可以患有慢性病癥，例如慢性肝疾病。
對本領域技術人員來說，顯而易見，本發明的方法和/或應用可以用于循環系統中出現內毒素的任何疾病。
第二方面，本發明提供治療酒精誘導的肝病的方法，此方法是給需要治療的哺乳動物施用治療上有效量的益生菌。
第三方面，本發明提供治療炎癥性腸病的方法，包括給需要治療的哺乳動物施用治療上有效量的益生菌。
第四方面，本發明提供益生菌在制備用于預防和/或治療哺乳動物內毒素血癥的藥物中的用途。
第五方面，本發明提供益生菌在制備用于治療酒精誘導的肝病的藥物中的用途。
第六方面，本發明提供益生菌在制備用于治療炎癥性腸病的藥物中的用途。
所述哺乳動物優選是人，但是，本領域技術人員將明了，其他哺乳動物也在考慮之中。
本領域技術人員可以確定適宜的益生菌，其包括如乳酸細菌，如乳桿菌屬(Lactobacillus)。優選地，所述益生菌是嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)或者發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)。最優選所述益生菌是嗜酸乳桿菌菌株(VRI-001)或者發酵乳桿菌菌株(VRI-002)，兩種菌種都可以從澳大利亞悉尼西南威爾士大學微生物和免疫學培養物保藏學院(University of New South Wales，School of Microbiology andImmunology Culture Collection，Sydney，Australia)獲得。
優選通過口服途徑施用益生菌或者藥物，但也可以考慮其他給藥途徑，例如通過栓劑或者利用插管通過胃部途徑給藥。
優選益生菌或者藥物采取片劑或膠囊形式，但益生菌或者藥物也可以采取食物組合物的形式，如奶制品或豆制品。
優選片劑或者膠囊中包含108至1012CFU益生菌。
第七方面，本發明提供評價益生菌在預防和/或治療哺乳動物內毒素血癥方面的效果的方法，包括(a)給哺乳動物施用內毒素和/或內毒素誘導劑，和/或在哺乳動物上造成內毒素引起的損傷；(b)給哺乳動物施用益生菌；和(c)確定益生菌對內毒素血癥的效果。
第八方面，本發明提供評價益生菌在預防和/或治療哺乳動物酒精誘導的肝病方面的效果的方法，包括(a)給哺乳動物施用酒精；(b)給哺乳動物施用益生菌；和(c)確定益生菌對動物肝臟疾病的效果。
第九方面，本發明提供了評價益生菌在預防和/或治療哺乳動物炎癥性腸病方面的效果的方法，包括(a)施用導致腸道炎癥的藥劑；(b)給哺乳動物施用益生菌；和(c)確定益生菌對腸道疾病的效果。
本領域技術人員明了，方法中步驟(a)和(b)可以同時或相繼進行，當相繼進行時，待評價的效果的性質將決定步驟(a)應該在步驟(b)之前還是之后進行。
所述哺乳動物可以是包括人在內的任何哺乳動物。哺乳動物也可以是例如實驗動物，例如大鼠。
遞送的酒精的濃度、數量以及方式取決于各種因素，如所監測的效果、哺乳動物的類型、益生菌的種類和配制等等。本領域技術人員將能夠容易地確定這些參數。例如，可以在一個適宜的時間段內，以遞增濃度給哺乳動物施用酒精。例如，酒精的量可以從如5％到40％，并可以通過飲用水施用。例如，可以給哺乳動物施用酒精數月，例如2個月。
作為選擇方案，為了誘發炎癥性腸疾病，可以將酒精遞送至哺乳動物結腸，本領域技術人員可以容易地確定酒精的適宜濃度和數量，例如可以是45％的乙醇。
優選地，所評價的益生菌是乳酸細菌，如乳桿菌。
更加優選地，益生菌是嗜酸乳桿菌或者發酵乳桿菌，最優選是嗜酸乳桿菌VRI-001菌株或者發酵乳桿菌VR1-002菌株。
兩種菌株都可以從澳大利亞悉尼西南威爾士大學微生物及免疫學院培養物保藏學院獲得。
優選地，益生菌通過口服途徑給藥，但是預計也可以采用其他的給藥途徑，例如栓劑或者插管法胃部給藥。優選地，益生菌是片劑、膠囊或者袋裝藥形式，但也可以是食物組合物的形式，如奶制品或豆制品。
優選地，片劑或者膠囊中包含有108至1012CFU的益生菌。
當所述哺乳動物是大鼠時，可以每隔兩天施用約5×1010CFU益生菌。優選地，益生菌存在于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中。益生菌可以通過如胃內喂食方式給藥。
益生菌的效果可以用任何適宜的方法來確定。一個方法是測量直接和/或間接指示循環內毒素水平的參數。例如，可以采用鱟變形細胞溶解物試驗(LAL)測定內毒素水平，從而確定益生菌的效果。
例如，可以通過測量指示損傷水平的參數來確定益生菌的效果，例如測量與肝臟損傷正相關的血漿丙氨酸氨基轉移酶(ALT)。
優選內毒素誘導劑是酒精。優選酒精誘導肝臟疾病。
本發明的說明書中，術語“預防和/或治療內毒素血癥”包括，但不限于，預防和/或治療內毒素水平增加和/或內毒素血癥造成的病癥/并發癥。
圖2顯示給大鼠喂食乙醇28天后，用鱟變形細胞溶解物試驗(LAL)測定的血液內毒素水平。
圖3顯示在患有酒精誘導的結腸炎癥的小鼠中益生菌對血液內毒素水平的控制。
圖4顯示，酒精攻擊后，在喂食益生菌的小鼠中，結腸內腸道細菌的寄居減少與缺少血液內毒素有關。
發明詳述下面僅通過舉例方式，參考附圖來描述本發明的優選實施方案。
實施例1已經有文獻描述了酒精誘導的肝損傷的大鼠模型(Cao Qi，Batey R，Pang G，Clancg R，1998，酒精中毒臨床和實驗研究(AlcoholismClinical and Experimental Reserch)22723-729)。采用這個模型，令人驚訝地發現施用益生菌可以減少肝臟損傷。
8-10周齡、體重約250克的雌性Wistar大鼠(n＝10-14)被單獨飼養在鐵絲網籠中，控制環境溫度并給予12小時光照黑暗周期，大鼠在整個研究過程中可以隨意進食鼠糧和飲水。根據澳大利亞紐卡斯爾大學(University of Newcastle)動物研究倫理委員會所制定的規定開展本研究工作。
從5％(體積/體積，V/V)的乙醇開始，4周內不斷增加喂食大鼠的蒸餾水中乙醇的濃度，當蒸餾水中的乙醇濃度達到40％(V/V)時，再保持這個濃度4周時間。后4周中，還以胃內飼喂途徑給每只大鼠口服嗜酸乳桿菌(每只大鼠5×1010CFU，每兩天一次)，所用細菌在磷酸緩沖鹽溶液(PBS0.01M磷酸緩沖液，0.020M氯化鉀和0.120M氯化鈉、pH7.4)。所用的嗜酸乳桿菌菌種是可從澳大利亞西南威爾士大學微生物及免疫學培養物保藏學院獲得的VRI-001。
對照大鼠(n＝8)除了僅僅給予PBS(沒有乳桿菌)外，采用上述相同的方式處理。
8周結束時采用標準光量法在雙色分析儀(澳大利亞紐卡斯爾約翰亨特醫院生化部(Department of Biochemistry，John Hunter Hospital，Newcastle，Australia))上測定血漿中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)水平(n＝8)。血漿ALT水平與肝損傷正相關，其中血漿中ALT水平的測量是一個公認的可用于評估肝臟損傷的標準方法學。
結果顯示在附
圖1中，其表明，喂食嗜酸乳桿菌的大鼠比不接受益生菌的大鼠有顯著少的ALT(P＜0.03)。因此，給予嗜酸乳桿菌能夠減少肝損傷。酒精誘導的肝損傷模型可以用作一般性的肝損傷模型，特別是，此模型與諸如病毒性肝炎等疾病不僅在肝損傷方面且在細胞反應方面都具有共同性。因此，所獲結果可以用于指示給患有這些疾病的患者施用益生菌的效果。
實施例2酒精誘導的肝損傷大鼠模型也可以用作內毒素血癥的一般模型，因為在這些大鼠的循環系統中有高水平的內毒素。
乳酸細菌是革蘭氏陽性菌，其短暫地寄居在胃腸道內。令人驚訝地發現，在上述動物模型中，補充乳酸細菌——嗜酸乳桿菌可減少循環的內毒素水平。
在(給予40％酒精的第一天之后)第0、14、28天對實施例1所描述的大鼠進行尾部取血，采用鱟變形細胞溶解物試驗(LAL)測定血漿中的內毒素水平(見J.C.Hurley(1995)內毒素血癥檢測方法和臨床相關性，Clin.Microbiol.Rev.8268-292中的討論)，LAL由美國馬薩諸塞州伍茲赫爾的卡普克德公司(Cape Code Inc.，Woods Hole，MA，USA)提供。如圖2所示，與喂食鹽水的大鼠相比，第14和28天在喂食嗜酸乳桿菌的大鼠中檢測到的內毒素水平較低。
不拘泥于理論，由此可以推測，嗜酸乳桿菌能夠調節內毒素的轉移。
實施例3為了證明降低內毒素水平的能力并不僅僅局限在上述酒精誘導的肝損傷大鼠模型中，用益生發酵乳桿菌預先處理酒精誘導的炎癥性腸病小鼠模型，以確定益生菌對此條件下誘導的內毒素的影響。
益生菌對循環內毒素的影響給雌性BALB/c小鼠(5只8周齡小鼠為1組)連續喂食1×109個發酵乳桿菌(VRI-002菌株，從澳大利亞悉尼西南威爾士大學微生物和免疫學培養物保藏學院獲得)三天，然后采用細管通過直腸向小鼠結腸部位施用45％乙醇溶液進行攻擊。對照小鼠喂食PBS。
攻擊后兩天，殺死小鼠并且用上面描述過的LAL試驗分析血漿中內毒素的水平。
如圖3所示，在未接受處理的小鼠(正常)或者施用酒精前喂食發酵乳桿菌的小鼠的血液中都沒有檢測到內毒素，而用酒精處理且喂食PBS的小鼠有顯著高的內毒素水平。結果指出，在這個乙醇誘導的炎癥性腸病小鼠模型中，在誘導炎癥性腸病之前施用益生菌可以阻止通常會伴隨該疾病出現的內毒素水平升高。
實施例4腸道菌群平衡和內毒素血癥的關系為調查血液內毒素的增加或減少與存在的腸道菌群的量是否有關，測定糞便中大腸菌(coliform bacteria)和腸細菌(enteric bacteria)的寄居水平。將實施例3所用小鼠的糞便懸浮在PBS中，將10倍逐級稀釋物分別接種在含McConkey CM7瓊脂培養基的培養板上，2-3天后，統計菌落數，結果表示為log10菌落形成單位(CFU)/克糞便。如圖4所示，盡管在喂食發酵乳桿菌的組中大腸菌增加(1log)，但觀察到結腸中腸細菌有6-7log減少，這與血液中檢測不到內毒素是相關的。
不拘泥于理論，這些數據顯示通過抑制脅迫后腸道中革蘭氏陰性腸細菌的生長，益生菌能夠控制血液中的內毒素水平。
盡管本發明已經通過具體的實施例加以描述，但本領域技術人員將明了，本發明可以以許多其他形式具體體現。
權利要求
1.預防和/或治療內毒素血癥的方法，包括給需要此治療的哺乳動物施用有效量的益生菌。
2.根據權利要求1的方法，其中哺乳動物患有肝臟疾病。
3.根據權利要求2的方法，其中肝臟疾病是肝炎。
4.根據權利要求2的方法，其中肝臟疾病是酒精誘導的肝臟疾病。
5.根據權利要求1的方法，其中哺乳動物患有炎癥性腸病。
6.治療酒精誘導的肝臟疾病的方法，包括給需要此治療的哺乳動物施用治療上有效量的益生菌。
7.治療炎癥性腸病的方法，包括給需要此治療的哺乳動物施用治療上有效量的益生菌。
8.根據權利要求1-7之任一項的方法，其中哺乳動物是人。
9.根據權利要求1-8之任一項的方法，其中益生菌是乳桿菌。
10.根據權利要求9的方法，其中乳桿菌是嗜酸乳桿菌。
11.根據權利要求10的方法，其中嗜酸乳桿菌是VRI-001菌株。
12.根據權利要求9的方法，其中乳桿菌是發酵乳桿菌。
13.根據權利要求12的方法，其中發酵乳桿菌是VRI-002菌株。
14.根據權利要求1-13之任一項的方法，其中益生菌通過口服、通過栓劑或利用插管法通過胃部途徑給藥。
15.根據權利要求14的方法，其中益生菌是片劑或者膠囊形式。
16.根據權利要求15的方法，其中片劑或者膠囊包含108至1012CFU的益生菌。
17.根據權利要求14的方法，其中益生菌采取食物組合物的形式。
18.根據權利要求17的方法，其中食物是奶制品或者豆制品。
19.益生菌在制備用于預防和/或治療哺乳動物內毒素血癥的藥物中的用途。
20.益生菌在制備用于預防和/或治療酒精誘導的肝臟疾病的藥物中的用途。
21.益生菌在制備用于預防和/或治療炎癥性腸病的藥物中的用途。
22.根據權利要求19至21中任一項的用途，其中哺乳動物是人。
23.根據權利要求19至22中任一項的用途，其中益生菌是乳桿菌。
24.根據權利要求23的用途，其中乳桿菌是嗜酸乳桿菌。
25.根據權利要求24的用途，其中嗜酸乳桿菌是VRI-001菌株。
26.根據權利要求23的方法，其中乳桿菌是發酵乳桿菌。
27.根據權利要求26的方法，其中發酵乳桿菌是VRI-002菌株。
28.根據權利要求19至27中任一項的用途，其中益生菌通過口服或直腸給藥，或者利用插管法通過胃內途徑給藥。
29.根據權利要求28的用途，其中益生菌是片劑或者膠囊形式。
30.根據權利要求29的用途，其中片劑或者膠囊含有108至1012CFU益生菌。
31.根據權利要求28的用途，其中益生菌采取食物組合物的形式。
32.根據權利要求31的用途，其中食物是奶制品或者豆制品。
33.評價益生菌在預防和/或治療哺乳動物內毒素血癥方面的效果的方法，包括(a)給哺乳動物施用內毒素和/或內毒素誘導劑，和/或在哺乳動物上造成內毒素引起的損傷；(b)給哺乳動物施用益生菌；和(c)確定益生菌對內毒素血癥的效果。
34.評價益生菌在預防和/或治療哺乳動物酒精誘導的肝臟疾病方面的效果的方法，包括(a)給哺乳動物施用酒精；(b)給哺乳動物施用益生菌；和(c)確定益生菌對動物肝臟疾病的效果。
35.評價益生菌在預防和/或治療哺乳動物炎癥性腸病方面的效果的方法，包括(a)施用造成腸道炎癥的藥劑；(b)給哺乳動物施用益生菌；和(c)確定益生菌對腸道疾病的效果。
36.根據權利要求33-36之任一項的方法，其中步驟(a)和(b)同時進行。
37.根據權利要求33-36之任一項的方法，其中步驟(a)和(b)相繼進行，其中步驟(a)可以在步驟(b)之前或之后進行。
38.根據權利要求33-37之任一項的方法，其中哺乳動物是人。
39.根據權利要求33-37之任一項的方法，其中哺乳動物是嚙齒類動物。
40.根據權利要求33-39之任一項的方法，其中將酒精在一段適宜的時間內以遞增的濃度施用給哺乳動物。
41.根據權利要求40的方法，其中酒精在飲用水中的量為5％到40％。
42.根據權利要求41的方法，其中在約2個月的時間段內給哺乳動物施用酒精。
43.根據權利要求33-39之任一項的方法，其中將酒精遞送到哺乳動物的結腸。
44.根據權利要求43的方法，其中酒精的濃度是45％。
45.根據權利要求33-43之任一項的方法，其中益生菌是乳桿菌。
46.根據權利要求45的方法，其中乳桿菌是嗜酸乳桿菌。
47.根據權利要求46的方法，其中嗜酸乳桿菌是VRI-001菌株。
48.根據權利要求45的方法，其中益生菌是發酵乳桿菌。
49.根據權利要求48的方法，其中發酵乳桿菌是VRI-002菌株。
50.根據權利要求33-49之任一項的方法，其中益生菌通過口服、通過栓劑或者利用插管法通過胃內途徑給藥。
51.根據權利要求50的方法，其中益生菌是片劑或者膠囊形式。
52.根據權利要求51的方法，其中片劑或者膠囊含有108至1012CFU益生菌。
53.根據權利要求50的方法，其中益生菌采取食物組合物的形式。
54.根據權利要求53的方法，其中食物是奶制品或者豆制品。
55.根據權利要求39的方法，其中每兩天一次施用5×1010CFU益生菌。
56.根據權利要求55的方法，其中益生菌存在于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中。
57.根據權利要求56的方法，其中益生菌通過胃內喂食方式給藥。
58.根據權利要求33-57之任一項的方法，其中通過測量直接和/或間接指示循環內毒素水平的參數，確定益生菌對內毒素血癥的效果。
59.根據權利要求58的方法，其中通過測量內毒素水平確定益生菌對內毒素血癥的效果。
60.根據權利要求34的方法，其中通過測量直接和/或間接指示肝臟損傷的參數，確定益生菌對肝臟疾病的效果。
61.根據權利要求61的方法，其中指示損傷水平的參數的測量是血漿丙氨酸氨基轉移酶(ALT)水平的測量，其中ALT的減少指示益生菌對內毒素血癥有積極的效果。
62.根據權利要求34的方法，其中通過測量直接和/或間接指示循環內毒素水平的參數，確定益生菌對肝臟疾病的效果。
63.根據權利要求62的方法，其中通過直接測量內毒素水平確定益生菌對肝臟疾病的效果。
64.根據權利要求63的方法，其中內毒素水平是通過鱟變性細胞溶解物試驗(LAL)測定的。
65.根據權利要求35的方法，其中將酒精施用到哺乳動物的直腸中。
66.控制哺乳動物的循環內毒素水平的方法，包括通過施用益生菌抑制革蘭氏陰性腸細菌的生長。
67.根據權利要求66的方法，其中益生菌是嗜酸乳桿菌。
68.根據權利要求67的方法，其中嗜酸乳桿菌是VRI-001菌株。
69.根據權利要求66的方法，其中益生菌是發酵乳桿菌。
70.根據權利要求69的方法，其中發酵乳桿菌是VRI-002菌株。
全文摘要
本發明涉及預防和治療內毒素血癥及相關疾病的方法，具體地，本發明涉及用益生菌預防和治療內毒素血癥及相關疾病的方法；本發明也涉及用于評價益生菌對內毒素血癥及相關疾病的預防和治療效果的方法。
文檔編號C12Q1/02GK1446103SQ01813695
公開日2003年10月1日 申請日期2001年7月3日 優先權日2000年7月3日
發明者G·龐, J·凱德, R·L·克蘭西, R·貝蒂, M·L·鄧克利, P·康威 申請人:普羅本多有限公司