專利名稱：谷物加工方法和其中有用的轉基因植物的制作方法
技術領域：
本發明涉及尤其是在玉米濕磨法和大豆加工過程中提高蛋白質和淀粉回收量的谷物加工的改進方法，以及在此類過程中有用的新轉基因植物。
硫氧還蛋白(TRX)和硫氧還蛋白還原酶(TR)是通過NADPH來還原蛋白質中二硫鍵的酶。蛋白質二硫鍵在谷物加工效率和谷物加工之后回收產物的質量上起了很重要的作用。消除或者減少谷物中蛋白質二硫鍵程度的有效方法的開發能夠提高加工效率。此外，分子間或分子內的二硫鍵也可影響谷物或源于谷物的產物在牲畜飼料中的表現。通過減少二硫鍵的程度可增加谷物的可消化性、營養物的可利用性和抗營養因子(例如蛋白酶和淀粉酶抑制劑等)的中和(見WO 00/36126，1999年12月15日申請)。
在玉米和大豆中表達轉基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶以及在谷物加工中(例如濕磨法)使用硫氧還蛋白是一種在工業加工過程中或之前減少種子蛋白質中二硫鍵的新的替代方法。因此本發明提供了經過改良的儲存蛋白質質量的谷物，以及在工業加工或動物消化過程(兩者隨后均稱為“加工”)中與正常谷物在質量上表現不同的谷物。
本方法通過傳送硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶消除了開發在加工過程中額外加入外源硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的來源的必要。通過谷物供應硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的第二個好處在于對種子完整性的物理破壞不必再讓酶在加工之前與種子中的儲藏蛋白或基質蛋白接觸，或作為額外加工步驟。
三種在谷物加工過程中使用硫氧還蛋白的方法如下1.在種子發育時通過表達該蛋白質，并使其發生作用，來改變收獲谷物的組成和質量；
2.在種子發育時通過表達該蛋白質(但無活性)來改變產物在加工時的質量；3.在谷物中生產硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶，通過在加工過程中添加該谷物來改變其他谷物產物的質量。
在此描述的本發明對于任何谷物都適用，尤其是玉米、大豆、小麥和大麥，特別是玉米和大豆，最特別是玉米。在谷物中表達轉基因的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶是一種具有以下作用的方法改變需要經過谷物加工的材料(種子)質量、改變從谷物加工而來的材料質量、在加工過程中使特別的種子成分的產率最大化(提高效率)、改變加工方法和為從研磨物流而來的種子組分或成分創造新用途。
因此本發明提供了一種表達硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶(如在植物體內非天然表達的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶)的植物，例如，含有編碼硫氧還蛋白的異源DNA序列的植物，該異源DNA序列穩定地整合入植物的核DNA或質體DNA，優選在一個可誘導的啟動子控制下(如化學試劑誘導的啟動子)，例如有效連接在可誘導的啟動子上或受反式激活蛋白調控的啟動子控制，其中相應的反式激活蛋白受可誘導的啟動子的控制或在另一種植物體內表達，以致通過與另一種植物雜交可激活該啟動子；其中硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶優選地為熱穩定的或真核還原酶；因此該植物也可包括經任選地處理(例如接觸過抗原的(primed)或包被的)和/或包裝的種子(例如連同使用說明書一起包裝在一個袋內)，以及從那里收獲的種子，例如用于以上曾提過的研磨加工過程。
本發明的轉基因植物可選擇地進一步包含提高硫氧還蛋白還原酶和/或NADPH產量的基因。
更進一步地本發明提供了一種生產硫氧還蛋白的方法，包括培育如上所述的表達硫氧還蛋白的植物；提供了一種生產淀粉和/或蛋白質的方法，包括從如上所述的植物收獲的種子中提取淀粉或蛋白質；還提供了一種濕磨法，包括浸泡來自如上所述的表達硫氧還蛋白的植物體的種子以及從其中提取淀粉和/或蛋白質。
更進一步地本發明提供了一種在植物中可表達的表達盒，包括硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶的編碼區，優選地為來自一個嗜熱生物的硫氧還蛋白，例如來自古細菌，如詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)或閃爍古生球菌(Archaeglobus fulgidus)，如下所述，其中編碼區優選地優化為含有植物的偏愛密碼子，并且將在植物中起作用的啟動子和終止子序列有效地與所述編碼區連接，其中啟動子優選地為種子特異啟動子或可誘導的啟動子，如一個化學試劑誘導的啟動子或反式激活蛋白調控的啟動子；例如，一個在質體或核中可表達的表達盒，包括一個啟動子，如受核反式激活蛋白調節的反式激活蛋白介導的啟動子(例如當反式激活蛋白為T7RNA聚合酶時，該啟動子可以是T7啟動子，并且T7RNA聚合酶的表達可以選擇性地受可誘導的啟動子的控制)。
更進一步地，本發明提供了包含此類在植物中可表達的表達盒的載體。
更進一步地，本發明提供了用此類載體轉化的植物或在其基因組中(如核或質體基因組)含有此類在植物中可表達的表達盒的轉基因植物。
本發明也包括了一種生產含有高含量的硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶的谷物的方法，該方法包括用含有異源表達盒的第二種植物的花粉給含有異源表達盒的第一種植物授粉，并從如此授粉的植物中回收谷物，其中第一種植物的異源表達盒含有受反式激活蛋白介導的啟動子調控的，并且與之有效地連接的編碼硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶的DNA序列，而且第一種植物優選是去雄的或雄性不育的，第二種植物的異源表達盒含有有效連接在DNA序列上的啟動子，其中上述DNA序列編碼能調控上述反式激活蛋白介導的啟動子的反式激活蛋白。
本發明也提供了一個核酸分子，包含編碼真核擬南芥(Arabidopsis)NADPH+依賴性的硫氧還蛋白還原酶(NTR)的核苷酸序列，其中該核苷酸序列優化為在單子葉植物中表達，優選地優化為在玉米中表達。該核苷酸序列優選為SEQ ID NO24的核苷酸序列，優選編碼SEQ ID NO25的氨基酸序列。
本發明也提供了分離的核酸分子，包含編碼真核水稻NADPH+依賴性的硫氧還蛋白還原酶(NTR)的核苷酸序列。該核苷酸序列優選地編碼SEQ ID NO27的氨基酸序列。該核苷酸序列優選地為SEQ ID NO25的核苷酸序列。
序列表的簡要描述SEQ ID NO1-來自詹氏甲烷球菌的硫氧還蛋白的蛋白質序列(gil 1591029)。
SEQ ID NO2-來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白的蛋白質序列(gil 2649903)(trx-1)。
SEQ ID NO3-來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白的蛋白質序列(gil 2649838)(trx-2)。
SEQ ID NO4-來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白的蛋白質序列(gil 2649295)(trx-3)。
SEQ ID NO5-來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白的蛋白質序列(gil 2648389)(trx-4)。
SEQ ID NO6-來自詹氏甲烷球菌的硫氧還蛋白還原酶(trxB)的蛋白質序列(gil 1592167)。
SEQ ID NO7-來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白還原酶的蛋白質序列(gil 2649006)(trxB)。
SEQ ID NO8-引物NMD 109。
SEQ ID NO9-引物NMD 110。
SEQ ID NO10-引物NMD 102。
SEQ ID NO11-引物NMD 103。
SEQ ID NO12-引物NMD 124A。
SEQ ID NO13-引物NMD 125A。
SEQ ID NO14-引物NMD 126。
SEQ ID NO15-引物NMD 127。
SEQ ID NO16-引物NMD 128。
SEQ ID NO17-引物NMD 129。
SEQ ID NO18-引物STRF 1A。
SEQ ID NO19-引物STRF 1B。
SEQ ID NO20-引物STRF 2A。
SEQ ID NO21-引物STRF 2B。
SEQ ID NO22-引物STR 3A。
SEQ ID NO23-引物STR 3B。
SEQ ID NO24-玉米中優化的編碼擬南芥NADPH依賴性的硫氧還蛋白還原酶的序列。
SEQ ID NO25-由SEQ ID NO24編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO26-編碼水稻NADPH依賴性的硫氧還蛋白還原酶(NTR)的序列。
SEQ ID NO27-由SEQ ID NO26編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO28-引物P9。
SEQ ID NO29-引物P10。
SEQ ID NO30-引物P4。
SEQ ID NO31-引物P1。
SEQ ID NO32-引物P2。
SEQ ID NO33-引物P5。
SEQ ID NO34-引物P12。
SEQ ID NO35-引物P11。
SEQ ID NO36-引物P27。
SEQ ID NO37-引物P28。
SEQ ID NO38-引物P29。
SEQ ID NO39-引物P26。
SEQ ID NO40-引物P31。
SEQ ID NO41-引物Thiorodoxubi 1603SEQ ID NO42-引物Thiorodox 2364
“聯結/有效連接”指兩段物理或功能相關的核酸序列。例如，如果有效連接或定位以致于調節DNA序列能夠影響編碼或結構DNA序列表達的水平，啟動子或調節DNA序列被認為與編碼RNA或蛋白質的DNA序列是“聯結”的。
“嵌合基因”為重組核酸序列，其中啟動子或調節核酸序列與編碼mRNA或表達為蛋白質的核酸序列有效連接或聯結，以至于該調節核酸序列能夠調節所聯結核酸序列的轉錄或表達。在自然界中，嵌合基因的調節核酸序列通常不是與它所聯結的核酸序列有效連接的。
“編碼序列”是可轉錄為RNA，如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有義RNA或反義RNA的核酸序列。優選地該RNA在生物體內可隨后被翻譯為蛋白質。
互補“互補”指兩條核苷酸序列(包含兩條反向平行的核苷酸序列)可在反向平行的核苷酸序列的互補堿基對之間通過形成氫鍵來進行配對。
DNA改組DNA改組是一種快速、簡單且有效的方法，以向DNA分子優選隨機地引入突變或重排，或在兩個或更多DNA分子之間優選隨機地產生DNA序列交換。DNA改組所產生的DNA分子為改組DNA分子，它是非自然出現的DNA分子，并且從至少一個模板DNA分子衍生而來。與模板DNA編碼的酶相比，該改組DNA編碼經修飾了的酶，優選地為具有改變了的生物學活性的酶。
酶/蛋白質活性在此指酶(或蛋白質)將底物催化轉化為產物的能力。酶的底物包括天然酶底物，也包括天然底物的類似物，酶可將該類似物轉化為產物或產物的類似物。酶活性可用諸如一定時間之后在反應中檢測產物的量，或一定時間之后檢測剩余底物的量的方法來測得。酶活性也可通過一定時間之后測定反應混合物中剩余未消耗的輔助因子的量或一定時間之后測定反應混合物中消耗的輔助因子的量來測得。酶活性還可以通過一定時間之后測定反應混合物中自由能供體或高能分子(例如ATP、磷酸烯醇丙酮酸、乙酰磷酸或磷酸肌酸)的剩余量或一定時間之后測定反應混合物中消耗的自由能供體或高能分子(例如ADP、丙酮酸、乙酸或肌酸)的量來測得。
表達盒在此使用的“表達盒”表示可在適當的宿主細胞中指導一段特定核苷酸序列表達的DNA序列，包含與目標核苷酸序列有效連接的啟動子，該目標核苷酸序列又和終止信號有效連接。通常它也包含該核苷酸序列適當翻譯所需的序列。編碼區通常編碼目標蛋白質，但也可編碼一段功能RNA，例如有義或反義方向上的反義RNA或非翻譯的RNA。包括目標核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的，即它組分中的至少一個相對于其它組分中的至少一個是異源的。表達盒也可以是天然出現的，但是以用于異源表達的重組形式獲得。然而，與宿主相比，表達盒一般為異源的，即該表達盒的特定DNA序列并非宿主細胞自然產生的，而是需要通過轉化導入宿主細胞或宿主細胞的祖先。表達盒中核苷酸序列的表達可受組成型啟動子或可誘導的啟動子的控制，對于可誘導的啟動子而言，只有當宿主細胞暴露于特定的外界刺激時，該啟動子才開始轉錄。在諸如昆蟲之類的多細胞生物中，啟動子可以是特定組織、器官或發育階段特異的。
基因術語 “基因”廣泛使用以指與生物學功能相關的任何DNA片段。因此，基因包括編碼序列和/或它們表達所需的調控序列。基因也可包括不表達的DNA片段，例如其他蛋白質的識別序列。可從多種來源得到基因，包括從目標來源克隆或從已知或預測的序列信息合成，也可以包括為得到所需參數而設計的序列。
異源DNA序列在此使用的“異源DNA序列”、“外源DNA片段”或“異源核酸”均指由外源(相對于特定宿主細胞)產生的序列，或者如果是從相同來源產生的，那就是對它產生時的形式進行了修飾。因此，在宿主細胞中的異源基因包括特定宿主細胞中的內源但已被修飾過的基因，例如用DNA改組。該術語還包括自然出現的DNA片段的非自然出現的多拷貝。因此，該術語指對于細胞來說是外源或異源的DNA片段，或者該片段雖然與細胞同源，但卻在宿主細胞的核酸中處于特殊的位置，通常情況下，在該位置是不會發現該片段的。表達外源DNA片段以產生外源多肽。
同源DNA序列與宿主細胞天然相關的DNA序列。
“同質體的”指在植物、植物組織或者植物細胞中所有的質體在遺傳上是相同的。這是植物體的正常狀態，當質體還未被轉化、突變或遺傳上被改變的時候。在不同組織或不同的發育階段，質體可以有不同的形式，如葉綠體、前質體、白色體、造粉體、有色體等等。
分離的在本發明的上下文中，分離的DNA分子或分離的酶指通過人工方法從原天然環境中分離出來的DNA分子或蛋白質，因而不是天然產物。分離的DNA分子或蛋白質可以純化的形式存在，或者存在于非天然環境中，例如在轉基因宿主細胞中。
成熟蛋白質正常定向于細胞器并且已被切除轉運肽的蛋白質。
最小啟動子不具有活性或啟動子活性大大降低的啟動子元件(尤其為TATA元件)，并且沒有上游激活序列。當存在合適的轉錄因子時，最小啟動子可行使功能以允許轉錄。
修飾的酶活性與在昆蟲體內自然出現的酶活性(即，在對此類活性缺乏人工直接或間接操縱的情況下，自然出現的酶活性)不同的酶活性，它對能抑制自然出現的酶活性的抑制劑具有耐受性。
天然的指在未經轉化的昆蟲細胞基因組中存在的基因。
自然出現的“自然出現的”用來描述與人工生產不同的并且能在自然界找到的物體。例如，在生物體中(包括病毒)存在的、可從自然來源分離出來并且還未在實驗室經過人為修飾的蛋白質或核苷酸序列，是自然出現的。
核酸“核酸”指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單鏈或雙鏈形式的多聚體。除非特別限定，該術語包括含有已知天然核苷酸類似物的核酸，它們與上面所述的核酸具有相似的結合性質，并且與自然出現的核苷酸以相似的方式代謝。除非特別說明，特定的核酸序列也包含其保守性修飾的變體(例如簡并密碼子的取代)、互補序列以及清楚說明的序列。特別的，簡并密碼子的取代可通過將一個或多個選定的(或全部)密碼子的第三位用混和堿基或脫氧次黃苷殘基取代而完成(Batzer等，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes891-98(1994))。術語“核酸”或“核酸序列”也可與基因、cDNA和由基因編碼的mRNA互換使用。
“植物”指在任何發育階段的任何植物，尤其為種子植物。
“植物細胞”為植物的結構和生理單元，包括原生質體和細胞壁。植物細胞可為分離的單細胞或培養細胞的形式，也可為更高級組織單位的一部分，例如植物組織、植物器官或整個植物體。
“植物細胞培養”指植物單元的培養，例如原生質體、細胞培養的細胞、植物組織中的細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、受精卵以及處于各個發育階段的胚。
“植物材料”指葉、莖、根、花或花的部分、果實、花粉、卵細胞、受精卵、種子、插條、細胞或組織培養或植物的任何其他部分或產物。
“植物器官”指植物體明顯的、具有可見結構和分化的部分，例如根、莖、葉、花蕾或胚。
“植物組織”在此指組織成一個結構和功能單元的一群植物細胞。包括植物活體或培養體系中的任何組織。該術語包括，但并不限于整個植物體、植物器官、植物種子、組織培養體系和任何組織成結構或功能單元的植物細胞群。該術語連同或不連同如上所列出或被該定義所涵蓋的任何特定植物組織類型的使用，并不旨在排除其他任何類型的植物組織。
“啟動子”為編碼區上游的非翻譯DNA序列，含有RNA聚合酶II的結合位點，并可啟動DNA轉錄。啟動子區域也可包含對基因表達起調控作用的其他元件。
“原生質體”為沒有細胞壁或僅有部分細胞壁的經分離的植物細胞。
“純化的”.當用來指核酸或蛋白質時，“純化的”意味著核酸或蛋白質基本上不含天然狀態下與其相連的其他細胞成分。盡管它可以是干燥或水溶液的狀態，但它優選地以同質狀態存在。可通過分析化學技術，例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜，來確定純度和同質性。在制備物中以主要成分存在的蛋白質可以認為是基本上純化的。術語“純化的”表示核酸或蛋白質在電泳膠中基本上呈現一條條帶。特別的，它意味著核酸或蛋白質純度為至少50％，更優選的為至少85％，最優選的為至少99％。
“調控元件”指涉及控制核苷酸序列表達的序列。調控元件包括與目標核苷酸序列有效相連的啟動子和終止信號。它們一般也包括核苷酸序列正確翻譯所需的序列。
“顯著增加”.酶活性的增加大于測量技術的固有誤差極限，優選地在抑制劑存在時比野生型酶活性增加約2倍或更多，更優選地增加大約5倍或更多，最優選地增加大約10倍或更多。
當用于兩條或更多的核酸或蛋白質序列時，“相同”或百分比“一致性”指當在最大對應時互相比較和比對，兩條或更多的序列或子序列為相同的或含有特定百分比相同的氨基酸殘基或核苷酸，可通過以下的比較算法或目視檢查得出。
基本上相同兩條核酸或蛋白質序列“基本上相同”，指在最大對應時互相比較和比對，兩條或更多的序列或子序列具有至少60％，優選的80％，更優選的90-95％，最優選的99％的核苷酸或氨基酸殘基的一致性，可通過以下的比較算法中的一種或目視檢查得出。優選地，基本上一致性存在于長度至少為50個殘基的序列區域，更優選地為至少100個殘基的區域，最優選地為在150個殘基的區域內都存在基本上一致性。在最優選的實施方案中，在編碼區的全長內都存在基本上一致性。此外，基本上一致的核酸或蛋白質序列行使基本上一致的功能。
在序列比較中，通常將一條序列作為參照序列，待測序列與其進行比較。使用序列比較算法時，將待測和參照序列輸入電腦(必要時標明子序列座標)，指定序列算法程序的參數。然后基于指定的程序參數，序列比較算法計算出待測序列相對于參照序列的序列一致性百分比。
可通過以下方法來進行序列比較的最佳比對Smith & Waterman在Adv.Appl.Math 2482(1981)中提出的局部同源性算法，Needleman和Wunsch在J.Mol.Biol.48443(1970)中提出的同源比對算法，Pearson和Lipman在Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 852444(1988)中提出的相似性尋找方法，這些算法的計算機化執行[Wisconsin遺傳軟件包(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA]，或目視檢查(可一般性參閱Ausubel等，見下文)。
適用于序列一致性百分比和序列相似性測定的工具的例子為BLAST算法，在Altschul等的J.Mol.Biol.215403-410(1990)中有描述。在國家生物信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)可得到公開的BLAST分析軟件。該算法首先通過確定在查詢序列中長度為W的短字串來確定高分值序列對(HSPs)，當與序列數據庫中具有相同長度的字串進行比對時，該高分值序列滿足某個正的閾值T或者與T匹配。T指相鄰字串閾值(Altschul等，1990)。這些起始的相鄰字串作為種子開始尋找含有這些字串的更長的HSPs。接著，這些字串沿著每條鏈向兩個方向延伸直至累積比對分值增加。對于核苷酸序列，累積分值是通過參數M(給一對配對殘基的獎勵分值，總為＞0)和N(對錯配殘基的懲罰分值，總為＜0)來計算的。對于氨基酸序列，使用分值矩陣來計算累積分值。當累積比對分值從它的最大值下降X時，或者當累積分值降至0或更低(由于一個或更多的負分值殘基比對)時，或者當任何一條序列到達了盡頭時，字串在每個方向的延伸就停止。BLAST算法參數W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)使用默認值字串長(W)為11，期望值(E)為10，截止為100，M＝5，N＝-4，兩條鏈的比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用默認值字串長(W)為3，期望值(E)為10和BLOSUM62分值矩陣(見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))。
除了計算序列一致性百分比，BLAST算法也可用于兩條序列之間相似性的統計分析(如見Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一種相似性測量為最小概率之和(P(N))，它提供了在兩條核苷酸或氨基酸序列之間隨機匹配的概率。例如，如果待測核酸序列與參照核酸序列對比的最小概率之和小于0.1，優選地為小于0.01，最優選地為小于0.001，則待測核酸序列可認為類似于參照序列。
兩條核酸序列為基本上一致的另一個標志是在嚴格條件下兩個分子可互相雜交。“特異性地雜交”指在嚴格條件下一個分子只和存在于DNA或RNA的復雜混合物中(例如總細胞)的特定的核酸序列結合、配對或雜交，。“基本上結合”指探針核酸和目標核酸的互補雜交，包括較小的錯配，該錯配可以通過降低雜交介質的嚴緊性來彌補，以達到對目標核酸序列的檢測。
“嚴格雜交條件”和“嚴格雜交洗脫條件”在核酸雜交實驗例如Southern和Northern雜交中的上下文均為序列依賴性的，且在不同環境參數下而不同。長序列特異雜交需要在較高的溫度下進行。在Tijssen(1993)的《生物化學和分子生物學實驗技術-核酸探針雜交》(Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes)第I部分第2章“雜交原理概述和核酸探針試驗策略”(Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assay)(Elsevier，紐約)中有關于核酸雜交的大量指導。總的來說，對于特定序列，在一定的離子強度和pH值下，高度嚴格的雜交和洗脫條件為低于熱解鏈溫度(Tm)約5℃。通常，在“嚴格的條件”下，一個探針會同其目標序列雜交，而不同其它序列雜交。
Tm為50％的目標序列與完全匹配的探針雜交時的溫度(在一定的離子強度和pH值下)。對于一個特定的探針，選擇非常嚴格的條件以與Tm相當。在Southern和Northern印跡中，兩條具有100個以上互補殘基的互補核酸在膜上雜交的嚴格條件的一個例子是50％甲酰胺和1mg的肝素，于42℃雜交反應過夜。高度嚴格的洗脫條件的一例為在0.15M的NaCl中于72℃洗脫15分鐘。嚴格的洗脫條件的一例為在0.2×SSC中于65℃洗脫15分鐘(見Sambrook，見下文中關于SSC緩沖液的描述)。通常地，在高度嚴格的洗脫前使用低嚴格性的洗脫去除背景的探針信號。中度嚴格的洗脫的一例為將具有例如100個以上堿基的雙螺旋鏈在1×SSC中于45℃洗脫15分鐘。低嚴格性的洗脫的一例為將具有例如100個以上堿基的雙螺旋鏈在4-6×SSC中于40℃洗脫15分鐘。對于短的探針(例如約10-50個核苷酸)，嚴格的洗脫條件通常涉及低于1.0M的Na離子濃度，通常約為0.01-1.0M的Na離子濃度(或者其他的鹽)，pH為7.0至8.3，溫度通常為至少約30℃。嚴格條件也可通過添加諸如甲酰胺之類的去穩定劑而達到。總之，特定雜交試驗中的信噪比比所觀察到的無關探針的信噪比高2倍(或更高)，即表明檢測到了雜交。在嚴格條件下互不雜交的核酸如果它們編碼的蛋白質是基本相同的，那么這兩條核酸仍是基本上相同的。例如在遺傳密碼允許的前提下，使用最大密碼子簡并性來產生核酸的拷貝時，這種情況會發生。
如下為雜交/洗脫條件組合的例子，可用于克隆與本發明中的參照序列基本上相同的同源核苷酸序列優選地，參照核苷酸序列與參照核苷酸序列的雜交條件為7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4，1mMEDTA，反應溫度50℃，洗脫條件為于50℃在2×SSC和0.1％SDS中；更理想的為7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA，反應溫度50℃，洗脫條件為于50℃在1×SSC和0.1％SDS中；更理想的雜交條件仍為7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA，反應溫度50℃，洗脫條件為于50℃在0.5×SSC和0.1％SDS中；優選的雜交條件為7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA，反應溫度50℃，洗脫條件為于50℃在0.1×SSC和0.1％SDS中；更優選的雜交條件為7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA，反應溫度50℃，洗脫條件為于65℃在0.1×SSC和0.1％SDS中。
兩條核苷酸序列或蛋白質為基本上相同的另一個標志是由第一個核酸編碼的蛋白質能夠與第二個核酸編碼的蛋白質發生免疫交叉反應或者特異性結合。因此，一個蛋白質通常與另一個蛋白質是基本上相同的，(例如)如果它們僅僅由于保守取代而不同。
當指蛋白質或者肽時，短語“與抗體特異性(或選擇性)結合”或“與……發生特異性(或選擇性)的免疫反應”，指一個結合反應，它能夠確定當異源蛋白質或其他生物制劑存在時蛋白質的存在與否。因此，在指定的免疫測定條件下，特定的抗體只和特定的蛋白質結合，而不與樣品中存在的其他蛋白質發生顯著量的結合。在這樣的條件下，與一個抗體發生特異性結合可能需要選擇一個對特定蛋白質具有特異性的抗體。例如，針對具有本發明中任何核酸序列編碼的氨基酸序列的蛋白質制備的抗體可以被選擇，從而得到與該蛋白質而不與其它蛋白質發生特異性免疫反應的抗體(多態變體除外)。
一系列的免疫測定方式可用于選擇對一個特定蛋白質具有特異免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫測定、Western印跡或免疫組織化學都是常規用于選擇對一個特定蛋白質具有特異免疫反應的單克隆抗體的方法。見Harlow和Lane(1988)《抗體，實驗室手冊》(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，紐約“Harlow和Lane”)，其中有關于測定特定免疫反應性的免疫測定方式和條件的描述。通常，一個特異性或選擇性的反應會比背景信號或噪聲高出至少兩倍，更通常地比背景高出10至100倍。
特定核酸序列的“保守性修飾變異”是指編碼相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸序列，或者當核酸序列不編碼氨基酸序列時，指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能相同的核酸都可編碼任何一個給定的多肽。例如，密碼子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG都編碼精氨酸。因此，在每個編碼精氨酸的密碼子位置，可按照如上描述的相應的密碼子將其替換而不會改變所編碼的蛋白質。這一類的核酸突變稱為“沉默突變”，為一種“保守性修飾變異”。除非特別標明，在此描述的每一種編碼蛋白質的核酸序列都可能為沉默突變。技術人員知道核酸中的每個密碼子(除了ATG，它是甲硫氨酸的唯一密碼子)都可通過標準技術經修飾后產生另一個功能相同的分子。因此，在每個描述的序列中都隱含有編碼蛋白質的核酸序列的“沉默突變”。
此外，技術人員也知道在編碼序列中，導致單個氨基酸或很小百分比(通常為小于5％，更通常地為小于1％)的氨基酸改變、增加或缺失的個別的取代、缺失或增加都可被稱為“保守性修飾變異”，其中這些改變導致一個氨基酸被其在化學上相似的氨基酸取代。提供功能相似的氨基酸的保守取代表在本領域中是熟知的。如下五組中每組都包括可互相保守性取代的氨基酸脂肪族甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)；芳香族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫氨基酸甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；堿性氨基酸精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H)；酸性氨基酸天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。也可見Creighton(1984)的《蛋白質》(Proteins)，W.H.Freeman and Company。此外，可導致編碼序列中一個氨基酸或很小百分比的氨基酸的改變、增加或缺失的單個的取代、缺失或增加也稱為“保守性修飾變異”。
“子序列”指分別含有較大核酸序列或氨基酸序列(如蛋白質)的一部分的核酸序列或氨基酸序列。
當另外的核苷酸(或者其他類似分子)整合入核酸時，核酸“延伸”。最普遍的是通過聚合酶(如DNA聚合酶)來實現的，例如在核酸3’末端添加序列的聚合酶。
當分別來自兩條核酸的序列組合為子核酸時，這兩條核酸為“重組的”。當兩條核酸都為重組底物時，這兩條序列是“直接”重組的。當兩條核酸通過中間物例如交換寡核苷酸來進行重組時，這兩條序列稱為“間接”重組的。在間接重組時，至多一條序列為重組的實際底物，在一些情況下，兩條序列都不是重組的底物。
“合成的”指具有在天然序列中不存在的結構特征的核苷酸序列。例如，一段與雙子葉和/或單子葉基因的G+C含量非常接近，并且具有其正常的密碼子分布的人工合成的序列稱為“合成的”。
“反式激活蛋白”是能使編碼區轉錄的蛋白質(獨自或結合一個或多個其它蛋白質)，其中該編碼區受相應的反式激活蛋白介導的啟動子的控制。反式激活蛋白系統的例子包括“噬菌體T7基因10啟動子，其轉錄激活依賴于特定的RNA聚合酶，例如噬菌體T7 RNA聚合酶。反式激活蛋白通常為能與特定啟動子相互作用以啟動轉錄的RNA聚合酶或DNA結合蛋白，它以直接激活啟動子或使抑制基因失活的方式(例如抑制阻遏蛋白的表達或積累)行使上述功能。DNA結合蛋白可以是一個含有與合適的轉錄激活因子區域相連的結合區(如GAL4結合區)的嵌合蛋白。一些反式激活蛋白系統可有多個反式激活蛋白，例如一些不僅需要聚合酶，也需要一個特定亞基(σ因子)來識別啟動子、結合DNA或激活轉錄的啟動子。反式激活蛋白相對于植物體優選是異源的。
轉化將異源DNA引入細胞、組織或昆蟲的方法。轉化的細胞、組織和昆蟲應該理解成不僅包含轉化方法的終產物，也包含其轉基因后代。
“轉化的”、“轉基因的”和“重組”指引入異源核酸分子的宿主生物，例如細菌或植物。核酸分子可以穩定地整合入宿主基因組，或者該核酸分子也可以染色體外分子的形式存在。這樣一個染色體外分子可以是自主復制性的。轉化的細胞、組織和昆蟲應該理解成不僅包含轉化方法的終產物，也包含其轉基因后代。“未轉化的”、“非轉基因的”或“非重組的”宿主指不含有異源核酸分子的野生型生物，例如細菌和植物。
按照如下標準縮寫用堿基來表示核苷酸腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和鳥嘌呤(G)。按照如下標準縮寫來表示氨基酸、丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、組氨酸(His，H)、異亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、賴氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和纈氨酸(Val，V)。此外，(Xaa，X)代表任何氨基酸。
濕磨法濕磨法是一種分離谷物中，尤其為谷類(如玉米)中淀粉、蛋白質和脂肪組分的方法。在此它和干磨法是有區別的，干磨法只是簡單地粉碎谷物。玉米濕磨法包括浸泡、磨碎谷粒和分離谷粒組分幾個步驟。濕磨法的第一個步驟通常為浸泡，其中將谷物在小心控制的條件下浸泡于水中，來達到軟化谷粒利于分離各組分的目的。通常將谷粒浸泡于盛有120°F回流水的浸泡缸中，其中含有約0.2％(重量)的二氧化硫。谷粒在浸泡缸中浸泡24至48個小時。而后將其去水，放入幾組磨碎機。第一組磨碎機將谷粒破裂并從谷粒的剩余部分釋放出胚芽和玉米油。通過離心將胚芽從剩余的谷物中分離出來。帶油的胚漂浮在水溶液的表面并被除去。其次，經過水化和去水、研磨、篩選、離心和洗滌，可從蛋白質中分離出淀粉并純化。去除胚后，剩余的谷物組分(包括淀粉、谷殼、纖維和谷蛋白)均被放入另一組磨碎機，經過一系列的洗滌篩，將纖維和淀粉、谷蛋白分離開來。淀粉和谷蛋白均能通過篩，而纖維不能。用離心或第三次研磨之后離心的方法將淀粉和蛋白質分開。離心產生含有淀粉顆粒的漿液，它經過去水、用新鮮水洗滌并干燥至約12％濕度。用這種方法就可從玉米谷粒中回收得到基本上純的淀粉組分。
關鍵的難點在于從復雜的蛋白質基質和組成谷物胚乳的細胞壁物質中釋放出淀粉顆粒。造成困難的一個原因是分子間或分子內二硫鍵的存在，使得蛋白質基質不易溶且對蛋白水解酶不敏感，并抑制了從谷物蛋白質基質中釋放出淀粉粒。現在減少這些二硫鍵的主要方法是在二氧化硫存在的情況下浸泡谷物，然而這樣操作是很昂貴、不環保的，并且效率也不是最優的。因為浸泡水中含有二氧化硫，因此該水被認為是有毒廢棄物，所以將產生的水量降到最低程度是有利的。選擇性地，可以不需要二氧化硫。降低胚乳基質中二硫鍵含量的另一個優點是在研磨之前減少谷物處理所需的浸泡時間。一些突變對玉米谷粒胚乳(粉狀的和不透明的)中的蛋白質基質有較有利的影響，但是破壞了谷物的完整性。轉基因硫氧還蛋白的表達提供了上述的幾個有利條件而并不產生一些與突變相關的谷粒完整性問題。
收割后或加工依賴性的硫氧還蛋白的活性有相同的有利影響。例如，在一個實施例中，硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶被定位和累積于細胞小室中。在種子物理破壞之后蛋白質還原。在另一個實施例中，通過浸泡，處于休眠中的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶被激活。在一個優選的實施例中，本發明提供了一種能夠表達熱穩定硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶(例如來自一個嗜熱生物的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶)的轉基因植物，從而使得硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶除了在高溫下均沒有顯著活性(例如高于50℃)。在一個實施例中，熱穩定的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶通過胚乳中其他熱穩定酶的表達可增強糖化作用。
飼料上的應用在谷物中表達轉基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶也可用于改良與可消化性相關的谷物特征，尤其在動物飼料中。飼料蛋白質對蛋白酶的敏感性是時間和蛋白質構象的函數。在飼料配方中經常使用谷物破裂和蒸汽剝落(Steam flaking)。這兩種方法都用來增加谷粒的可消化性。在動物的胃中其完整性更易被破壞的較軟的顆粒是優選的。對蛋白酶敏感性的主要決定因素為構象限制和蛋白質之間的交聯。通過增加硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的表達而修飾這些鍵，從而有助于消化。
玉米干磨法/濕潤粉糊蛋白質含量和質量是磨粉生產和濕潤粉糊生產的重要決定因素。二硫鍵的減少改變了玉米粉的性質，從而使得它適用作小麥的替代物，尤其是來自高蛋白質含量的白玉米變種的粉末。
大豆壓榨美國的大豆作物中有一半為壓榨或研磨處理的，產生的低脂肪豆粉或脫脂豆粉(或大豆粉)中的蛋白質質量對于以后的加工是很重要的。由大豆加工物流得到的蛋白質產量和質量在經濟上是重要的，并且在很大程度上依賴于蛋白質構象。通過表達轉基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶來提高硫氧還蛋白的活性可提高蛋白質的可溶性，進而提高水溶性蛋白質組分的產率。在堿性條件下通過在水溶液中提取脫脂大豆粉可提高回收量。通過表達轉基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶提高了硫氧還蛋白的活性，同時也降低了有效提取所需的pH值，因此減少了加入的氫氧化鈣或氫氧化鈉的量，同時減少了隨后酸沉降所需加入酸的量，使不經過堿的破壞就可有效回收蛋白質，進而減少水的消耗和加工植物產生的廢水(其包含大量生化耗氧負荷)。蛋白質氧化還原狀態影響了大豆蛋白質的重要功能特性，例如可溶性、吸水性、粘性、內聚力/粘附力、凝膠化和彈性。通過在此描述的提高硫氧還蛋白活性還可促進大豆蛋白質濃縮生產期間和蛋白酶對大豆蛋白質分離物的水解過程期間的纖維的去除。類似的，如同上述對玉米描述的一樣，通過表達轉基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶提高硫氧還蛋白的活性也增加了具有酶活性的豆粉的功能，以及在動物飼料中大豆粉組分和蒸汽剝落組分的可消化性。提供了在種子發育過程中或加工過程中對蛋白質質量的修飾，盡管優選的為如上所述的轉基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶定向至細胞小室且為熱穩定的，以避免種子發育過程中由于硫氧還蛋白的活性所導致的對儲存蛋白質累積的可能遇到的顯著負面效應。可選擇地，硫氧還蛋白可作為加工酶添加，因為直到谷物的完整性被破壞(壓碎和油提取)后才有必要破壞二硫鍵(與玉米濕磨法相反)。
用于異源表達的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶的選擇硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶和蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)基因存在于真核生物，包括植物、真細菌以及古細菌，其中包括如詹氏甲烷球菌和閃爍古生球菌等嗜高溫生物。對一個特定基因的選擇部分依賴于所需的應用。對于本發明的方法，優選的硫氧還蛋白具有如下的特征1.熱穩定性-來自嗜高溫細菌的硫氧還蛋白和相關蛋白在高溫下(＞50℃)均具有增加的熱穩定性，而在環境溫度下具有相對低的活性。在種子發育過程中優選表達來自嗜高溫細菌的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶，例如來自詹氏甲烷球菌和閃爍古生球菌或其他嗜高溫細菌，這樣除非谷物浸泡或在高溫下加工，硫氧還蛋白的活性不會有顯著增加。大部分谷物加工過程包括或者可兼容高溫的步驟。因此熱穩定的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶為優選的。熱穩定是指酶在高溫時具有較高的活性，例如在高于40℃的溫度下，最優選的溫度為高于50℃，如濕磨法為45-60℃，甚至更高，45-95℃。
2.底物特異性-通過選擇某一硫氧還蛋白，有可能降低對種子發育的不需要的作用，其中該硫氧還蛋白優先作用于某一蛋白質(如基質中的結構蛋白)，但對基本代謝酶具有低的活性。多種硫氧還蛋白顯示了與在氧化還原條件控制下的酶作用的不同活性。因此選擇能主要作用于目標的硫氧還蛋白是可能的，這樣可使過量表達產生的不需要的負面效應降至最低。
適當的硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶包括如下幾種●來自詹氏甲烷球菌的硫氧還蛋白氨基酸序列(gil 1591029)MSKVKIELFTSPMCPHCPAAKRVVEEVANEMPDAVEVEYINVMENPQKAMEYGIMAVPTIVINGDVEFIGAPTKEALVEAIKKRL(SEQ ID NO1)；●來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白氨基酸序列(gil 2649903)(trx-1)MPMVRKAAFYAIAVISGVLAAVVGNALYHNFNSDLGAQAKIYFFYSDSCPHCREVKPYVEEFAKTHNLTWCNVAEMDANCSKIAQEFGIKYVPTLVIMDEEAHVFVGSDEVRTAIEGMK(SEQ ID NO2)；
●來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白氨基酸序列(gil 2649838)(trx-2)MVFTSKYCPYCRAFEKVVERLMGELNGTVEFEVVDVDEKRELAEKYEVLMLPTLVLADGDEVLGGFMGFADYKTAREAILEQISAFLKPDYKN(SEQ ID NO3)；●來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白氨基酸序列(gil 2649295)(trx-3)MDELELIRQKKLKEMMQKMSGEEKARKVLDSPVKLNSSNFDETLKNNENVVVDFWAEWCMPCKMIAPVIEELAKEYAGKVVFGKLNTDENPTIAARYGISAIPTLIFFKKGKPVDQLVGAMPKSELKRWVQRNL(SEQ ID NO4)；●來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白氨基酸序列(gil 2648389)(trx-4)MERLNSERFREVIQSDKLVVVDFYADWCMPCRYISPILEKLSKEYNGEVEFYKLNVDENQDVAFEYGIASIPTVLFFRNGKVVGGFIGAMPESAVRAEIEKALGA(SEQ IDNO5)；●來自詹氏甲烷球菌的硫氧還蛋白還原酶(trx B)氨基酸序列(gil 1592167)MIHDTIIIGAGPGGLTAGIYAMRGKLNALCIEKENAGGRIAEAGIVENYPGFEEIRGYELAEKFKNHAEKFKLPIIYDEVIKIETKERPFKVITKNSEYLTKTIVIATGTKPKKLGLNEDKFIGRGISYCTMCDAFFYLNKEVIVIGRDTPAIMSAINLKDIAKKVIVITDKSELKAAESIMLDKLKEANNVEIIYNAKPLEIVGEERAEGVKISVNGKEEIIKADGIFISLGHVPNTEFLKDSGIELDKKGFIKTDENCRTNIDGIYAVGDVRGGVMQVAKAVGDGCVAMANIIKYLQKL(SEQ ID NO6)；以及●來自閃爍古生球菌的硫氧還蛋白還原酶氨基酸序列(gil2649006)(trxB)MYDVAIIGGGPAGLTAALYSARYGLKTVFFETVDPVSQLSLAAKIENYPGFEGSGMELLEKMKEQAVKAGAEWKLEKVERVERNGETFTVIAEGGEYEAKAIIVATGGKHKEAGIEGESAFIGRGVSYCATCDGNFFRGKKVIVYGSGKEAIEDAIYLHDIGCEVTIVSRTPSFRAEKALVEEVEKRGIPVHYSTTIRKIIGSGKVEKVVAYNREKKEEFEIEADGIFVAIGMRPATDVVAELGVERDSMGYIKVDKEQRTNVEGVFAAGDCCDNPLKQVVTACGDGAVAAYSAYKYLTS(SEQ ID NO7)。
使用植物偏愛密碼子通過反向翻譯(back-translation)來設計編碼用于本發明的這些蛋白質的基因，提高G-C的含量并去除有害序列，更詳細的見如下的敘述。可通過DNA改組或其他方法來提高蛋白質的活性，如下所述。因此本發明包括從這些蛋白質衍生而來的蛋白質，尤其為具有硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶活性并且基本相似的蛋白質。
為了在谷物發育過程中在種子中表達具活性的硫氧還蛋白，優選的是能指導硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶種子特異性表達的啟動子，由于目標是儲藏，從而使得酶對儲藏蛋白具有需要的作用，這在一些應用中是可取的。然而在本發明中，更普遍可取的為在種子中表達硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶，它們在谷物發育過程中累積并且無活性。很多策略可用于生產表達轉基因硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的種子，并且對正常種子發育過程不會產生很大的影響，例如(i)將具有活性的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶隔離，使其不能與目標蛋白質發生顯著相互作用，例如通過定位于或表達于造粉體中。質體定向序列可用于引導在造粉體中的累積。可選擇地，通過分泌信號可將硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶定位于細胞壁的細胞外空間。或者在單子葉植物中，在種子發育過程中在糊粉細胞等細胞類型中的表達，可將硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶與胚乳中其他儲存成分分離開來。
(ii)通過遺傳工程改造來自嗜熱生物的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的表達。在環境溫度中(在本領域中高至38-39℃)幾乎沒有活性的酶在發育過程中不太可能產生問題。因此優選地，酶主要在高溫下具有活性，例如高于40℃的溫度，對于濕磨法最優選的為45-60℃，甚至更高，如45-95℃。
(iii)將硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶置于一個可誘導的啟動子控制下，例如化學試劑誘導的啟動子，創傷誘導的啟動子或者反式激活蛋白介導的啟動子(它通過被表達該反式激活蛋白的植物花粉傳粉而激活)。
(iv)使用對特定硫氧還蛋白還原酶具有特定要求的硫氧還蛋白，從而使得硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶的活性可分別通過合適的硫氧還蛋白還原酶或硫氧還蛋白的獲得來調節。例如在不同植物中表達硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶，從而只有通過表達互補酶的植物傳粉，種子中才可發生有活性的結合。可選擇地，硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶在細胞中被隔離于如上所述的質體、液泡或質外體中，從而直到谷物加工時它才能相遇而具有活性。
谷物加工的方法因此本發明提供了一種通過硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶促進淀粉從蛋白質基質中分離的新方法。在第一個實施例中，在多個種子加工應用中，硫氧還蛋白的活性均有用途，包括濕磨法、干磨法、油料種子加工、大豆加工、小麥加工和面粉/面團品質，尤其是谷物(特別是玉米)的濕磨法。因此本發明提供了一種提高研磨效率或提高研磨產量，提高分離淀粉和蛋白質的效率，增大了谷物淀粉和可溶性蛋白質的產量，或者提高蛋白質在水溶液或其它溶劑中的溶解度的方法，包括在補充的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶存在時浸泡谷物，以及分離谷物中的淀粉和蛋白質組分。通常，在研磨之前浸泡，但也可在研磨之后浸泡，在加工提取過程中可有多次的研磨或浸泡步驟，在浸泡時或浸泡后種子的蛋白質產量會增加。優選地，補充的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶可通過收獲谷物的植物中轉基因的表達來提供。
本發明進一步提供了在某一方法中硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶提高研磨的效率或增大淀粉和蛋白質的研磨產量的用途，例如在如上所述的任何一種方法中，含有一定量的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的浸泡水，這一數量可促進谷物中淀粉和蛋白質的分離；用能促進淀粉從蛋白質中分離的有效量硫氧還蛋白處理的谷物；用如上所述的方法生產的淀粉或者蛋白質。在如上方法中的硫氧還蛋白的活性可通過補充含有硫氧還蛋白還原酶和/或NADPH的浸泡水來提高。濕磨法的浸泡水中正常存在的其它組分也可存在，例如生產乳酸的細菌。優選地，浸泡溫度為52℃左右，時間為22-50小時，因此就需要硫氧還蛋白在這些條件下是穩定的。
谷物可為雙子葉植物的種子，例如油料種子，如大豆、向日葵或油菜籽，優選的為大豆；或者也可為單子葉植物的種子，例如谷類的種子，如玉米、小麥、燕麥、大麥、黑麥或水稻，優選的為玉米。
硫氧還蛋白可為任何含硫醇基的蛋白質，它可被可逆氧化形成二硫鍵，并且在硫氧還蛋白還原酶的存在下，可被NADPH還原。優選的硫氧還蛋白來自如上所述的嗜熱生物。在本發明中使用的硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶是通過基因工程微生物適當生產的，例如酵母或者曲霉，或者如受控于在發芽期間活化的啟動子，如高pI的α-淀粉酶啟動子或其它依賴于赤霉素的啟動子，在具有高表達能力的基因工程植物(例如在大麥中)中產生。將硫氧還蛋白(以分泌或提取的形式或者與制造者生物或其部分相結合的形式)加入浸泡水中。
作為一種將硫氧還蛋白加入浸泡水中的可供選擇的辦法或補充方法，可在用于研磨的種子中直接表達該酶。優選地，在谷物成熟過程或條件加工過程中表達該酶。
因此，在另一個實施方案中，本發明提供了在轉基因生物中以工業規模生產硫氧還蛋白的方法，例如在植物或微生物中，植物的例子是諸如大麥或玉米的谷類，微生物的例子是酵母或曲霉，例如，包含培養具有表達硫氧還蛋白的嵌合基因之轉基因生物，并且可選擇性地分離或提取硫氧還蛋白的步驟的方法。
使用轉基因植物的方法，該植物在種子成熟或發芽時能夠產生增加量的硫氧還蛋白，從而使得種子中蛋白質的質量在種子發育過程中或者浸泡過程中受內源合成的硫氧還蛋白的影響，從而消除或減少了在研磨之前用外源化合物或酶處理的必要；生產轉基因植物的方法，該植物在種子成熟或發芽時能夠產生增加量的硫氧還蛋白，從而使得種子中蛋白質的質量在種子發育過程中或者浸泡過程中受硫氧還蛋白的影響，從而消除或減少了在研磨之前用外源化合物或酶處理的必要；使用含有硫氧還蛋白的轉基因種子研磨谷物的方法，可導致更高的淀粉和可溶性蛋白質的產量。
本發明進一步包括一個在其基因組中含有嵌合表達盒的轉基因生物，其中該嵌合表達盒包含編碼熱穩定或真核硫氧還蛋白或硫氧還蛋白還原酶的編碼區，該編碼區受啟動子的有效控制。
優選地，轉基因生物為以該種植物中天然不出現的形式表達硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的植物，或者是其中硫氧還蛋白的表達量要高于該種植物自然表達量的植物。優選地，硫氧還蛋白表達于處于發育過程的種子中，因此優選地受控于種子特異性的啟動子。可選擇地，硫氧還蛋白的表達受控于可誘導或反式激活蛋白調控的啟動子，從而使得在需要時可通過化學誘導或與反式激活蛋白雜交激活表達。通過與液泡定位序列發生融合，將硫氧還蛋白適當定位于植物液泡中。在本發明中，編碼硫氧還蛋白的序列是與植物中具有活性的啟動子相連的，它們轉化入核基因組或質體基因組。啟動子優選地為諸如γ-玉米醇溶蛋白啟動子之類的種子特異性的啟動子。該啟動子也可為化學試劑誘導的啟動子，例如煙草PR-1a啟動子；或者為化學試劑誘導的反式激活蛋白調控的啟動子，其中反式激活蛋白受控于一個化學試劑誘導的啟動子；然而在一定條件下，可使用組成型啟動子，例如CaMV35S或Gelvin啟動子。在化學試劑誘導的啟動子控制下，轉化入植物的硫氧還蛋白基因的表達可通過葉子上化學誘導劑的應用在適當時機激活。
可選擇地，硫氧還蛋白的編碼序列可以受控于反式激活蛋白調控的啟動子，通過將轉化了該序列的植物和另一種表達反式激活蛋白的植物雜交可激活表達。在這種方法的優選形式中，含有硫氧還蛋白編碼序列的第一種植物為種子親本，且為雄性不育，而表達反式激活蛋白的第二種植物為傳粉者。在種子中表達硫氧還蛋白是通過間作第一種和第二種植物實現的，例如第一種植物被第二種植物授粉，通過第二種植物反式激活蛋白基因表達的反式激活蛋白激活第一種植物中反式激活蛋白調控的啟動子，可使硫氧還蛋白在第一種植物種子中表達。
在本申請中所描述的核酸序列可通過傳統DNA重組技術整合入植物細胞。通常，該過程包括將本發明的編碼序列插入對該編碼序列來說是異源(即在正常情況下不存在的)的表達系統，使用的為本領域熟知的標準克隆方法。載體含有插入的編碼蛋白質序列轉錄和翻譯必需的元件。可使用多種本領域熟知的載體系統，例如質粒、噬菌體病毒或其它修飾了的病毒。適當的載體包括，但并不限于，病毒載體，例如λ載體系統λgt11、λgt10和Charon4；質粒載體，如pBI121、pBR322、pACYC177、pACYC184、pAR系列、pKK223-3、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pRK290、pKC37、pKC101、pCDNAII；以及其它類似的系統。表達系統的組分也可經修飾來增加表達。例如，可使用截短的序列、核苷酸取代或其它的修飾。在此所描述的表達系統可在適當條件下轉化任何作物植物細胞。轉化的細胞可再生為完整的植株，從而使得本發明的核苷酸序列可在轉基因植物中表達。
編碼序列和相鄰序列的修飾來自微生物源的基因在植物中的轉基因表達可能需要對這些基因進行修飾來達到和優化它們在植物中的表達。特別地，編碼分離酶但在天然微生物中被相同的轉錄本所編碼的細菌ORF在植物中分離的轉錄本上可被最佳表達。要達到此目的，每個細菌的ORF都被單獨分離出來并克隆入盒中，該組件提供了ORF5’端的植物啟動子序列和ORF3’端的植物轉錄終止子。分離出的ORF序列優選地包括起始的ATG密碼子和終端STOP密碼子，但還可在起始ATG和STOP密碼子外含有其它序列。此外，ORF可被截短，但仍具有其所需活性；對于特別長的ORF，具有活性的截短ORFs對于在轉基因生物中的表達是優選的。“植物啟動子”和“植物轉錄終止子”指在植物細胞中操作的啟動子和轉錄終止子。這包括來自非植物源例如來自病毒(如花椰菜花葉病毒)的啟動子和轉錄終止子。
在一些情況下，不需要對ORF編碼區及其相鄰序列進行修飾。分離出含有目的ORF的片段并將其插入植物啟動子下游就足夠了。例如，Gaffney等(Science261754-756(1993))已經在CaMV 35S啟動子和CaMV tml終止子控制下在轉基因植物中成功地表達了Pseudomonas nahG基因，其編碼區未經修飾，并且Pseudomonas基因ATG上游x bp和STOP密碼子下游y bp仍連接于nahG ORF上。ATG上游和STOP密碼子下游相連的微生物序列最好不要留下。實際上，此類構建依賴于限制性酶切位點的可獲得性。
在其它情況下，表達來自微生物源的基因可能導致表達中的問題。這些問題在本領域已經得到了很好的表征，尤其常見的為表達來自諸如芽孢桿菌屬(Bacillus)之類的基因。這些問題可在本發明中的核苷酸序列中出現，可通過現在本領域熟知的技術來對這些基因進行修飾。可遇到如下的問題1.密碼子利用植物中的偏愛密碼子利用與一些微生物的偏愛密碼子利用不同。對比目標克隆的微生物ORF中密碼子的利用和植物基因中密碼子的利用(尤其為來自目標植物的基因)能夠辨別ORF中應該改變的密碼子。通常對于單子葉植物來說，植物進化趨向于在第三個堿基位置對核苷酸C和G的強烈偏好，而在雙子葉植物中，在這個位置經常使用核苷酸A或T。通過修飾基因，使其整合特定目標轉基因物種的偏愛密碼子，很多如下描述的GC/AT含量和錯誤剪接之類的問題都可克服。
2.GC/AT含量植物基因通常具有35％以上的GC含量。富含A和T核苷酸的ORF序列在植物中會產生一些問題。第一，ATTTA基序會產生信息的不穩定，并且經常在許多短命mRNA的3’末端發現。第二，信息中在正確位置出現諸如AATAAA之類的聚腺苷酸化信號被認為會導致轉錄的早熟性截短。此外，單子葉植物可將富含AT的序列識別為剪接位點(如下)。
3.與起始甲硫氨酸相鄰的序列植物區別于微生物的一點在于它們的信息不具有一個固定的核糖體結合位點。據信，核糖體與信息的5’末端結合，搜尋第一個可用的ATG來起始翻譯。然而，據信對于與ATG相鄰的某些核苷酸具有偏愛性，并且微生物基因可通過在ATG包含真核的共同翻譯起始子來增強表達。Clontech(1993/1994目錄，第210頁)已經建議將一段序列作為大腸桿菌(E.coli)uidA基因在植物中翻譯的共有翻譯起始子。此外，Joshi(NAR156643-6653(1987))比較了許多與ATG相鄰的植物序列，并提出了另一個共同序列。當微生物ORF在植物中表達遇到困難時，在起始ATG處加入一個這樣的共同序列可能會改善翻譯。在這些情況下，共同序列的最后三個核苷酸可能不適合包括于該修飾的序列，因為它們對第二個氨基酸殘基的修飾。與起始甲硫氨酸相鄰的優選序列在不同植物種類中各不相同。對GenBank數據庫中14個玉米基因的分析提供了如下的結果在14個玉米基因中位于起始ATG之前位置-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1C3846256010 7T3034321110A2314323723G6360654615該分析可適用于要整合核苷酸序列的合意的植物種類，也適用于與ATG相鄰的并經過修飾以整合優選核苷酸的序列。
4.錯誤剪接位點的去除由非植物源克隆并且在植物中沒有經過表達優化的基因可能含有被植物識別為5’或3’剪接位點的基序，從而被剪切產生截短或刪除的信息。可通過本領域熟知的技術將這些位點去除。
修飾編碼區及其相鄰序列的技術為本領域熟知的。當微生物ORF的起始表達很低并且認為對上述的序列作修改是合適的，那么可通過本領域熟知的方法構建合成基因。例如，在已發表的專利公開內容EP0 385 962(授于Monsanto)、EP 0 359 472(授于Lubrizol)和WO93/07278(授于Ciba-Geigy)中所述的。在大部分情況下，優選的是在轉移到轉基因植物之前，通過瞬時分析方法(本領域熟知的)分析基因構建體的表達。
植物表達盒的構建用于在轉基因植物中表達的編碼序列首先組裝入表達盒，并且位于可在植物中表達的合適的啟動子下。該表達盒可更進一步包括轉基因表達所需或所造的任何序列。這樣的序列包括，但并不限于轉錄終止子、增強表達的外源序列如內含子、vital序列以及用來將基因產物定位于特定細胞器和細胞小室的序列。這些表達盒能很容易地轉入下面描述的植物轉化載體。以下為典型表達盒各種組分的描述。
1.啟動子對在表達盒中使用的啟動子的選擇將決定轉基因在轉基因植物中的時間和空間表達模式。選擇的啟動子能夠在特定的細胞類型中(例如葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞)，或在特定的組織或器官中(例如根、葉或花)表達轉基因，且該選擇反映了基因產物的合意的累積位置。可選擇的，選擇的啟動子可在不同的誘導條件下啟動基因的表達。啟動子在強度上，即驅動轉錄的能力上有區別。依賴于所使用的宿主細胞系統，任何適合的啟動子都可使用，包括該基因的天然啟動子。以下為可在表達盒中使用的啟動子的非限制性例子。
a.組成型表達，泛素啟動子泛素是一個在許多細胞類型中都累積的基因產物，它的啟動子已從許多種類中克隆出來用于轉基因植物(例如向日葵-Binet等，Plant Science7987-94(1991)；玉米-Christensen等，Plant Mol.Biol.12619-632(1989)；擬南芥-Norrij等，Plant Mol.Biol.21895-906(1993))。玉米的泛素啟動子已可用于轉基因單子葉系統中，為單子葉轉化所構建的序列和載體公開于公布的專利EP 0 342 926(授于Lubrizol)。Taylor等(Plant Cell Rep.12491-495(1993))描述了載體(pAHC25)，其包含玉米泛素啟動子和第一個內含子，也描述了通過微粒轟擊引入各種單子葉植物時該載體在細胞懸浮液中具有高活性。
擬南芥泛素啟動子與本發明中核苷酸序列一同使用是理想的。該泛素啟動子適合用于轉基因植物中的基因表達，包括單子葉植物和雙子葉植物。適當的載體為pAHC25的衍生物或任何在本申請中提及的轉化載體，并通過引入適當泛素啟動子和/或內含子序列進行修飾。
b.組成型表達，CaMV 35S啟動子質粒pCGN1761的構建在公布的專利申請EP 0 392 225(實施例23)有描述。pCGN1761含有“雙”CaMV 35S啟動子和tml轉錄終止子，在啟動子和終止子之間有一個EcoRI的單一酶切位點，pCGN1761具有pUC型的主鏈。構建了一個pCGN1761的衍生物，其含有包含NotI和XhoI位點以及已存在的EcoRI位點的多位點接頭。該衍生物記為pCGN1761ENX。pCGN1761ENX對于在它的多位點接頭內克隆cDNA序列或編碼序列(包括微生物ORF序列)是很有用的，這樣作是為了在轉基因植物中讓這些序列的表達受控于35S啟動子。這樣一個構建體中完整的35S啟動子-編碼區-tml終止子序列組件，可在啟動子的5’端被HindIII、SphI、SalI和XbaI切割，在終止子的3’端被XbaI、BamHI和BglI切割，以便于轉移到如下所述的轉化載體中去。此外，雙35S啟動子片段可在5’末端用HindIII、SphI、SalI、XbaI或Pstl切割，在3’末端可對任何一個多位點接頭的限制性位點(EcoRI、NotI或XhoI)切割，而后用另一個啟動子代替。需要的話，在克隆位點周圍的修飾可通過引入能夠提高翻譯的序列來實現。當需要過量表達時，這種方法尤其有用。例如，pCGN1761ENX可通過優化翻譯起始位點來修飾，如美國專利號5,639,949中實施例37所描述的。
c.組成型表達，肌動蛋白啟動子多種同種型肌動蛋白在大部分細胞類型中均有表達，因此肌動蛋白啟動子是組成型啟動子的一個好的選擇。特別地，來自水稻ActI基因的啟動子已被克隆并表征(McElroy等，Plant Cell2163-171(1990))。該啟動子中一個1.3kb片段含有在水稻原生質體表達所需的所有調節元件。此外，基于ActI啟動子構建了許多表達載體以特別用于單子葉植物(McElroy等，Mol.Gen.Genet.231150-160(1991))。它們整合了ActI-內含子1、AdhI側翼序列和AdhI-內含子1(來自玉米醇脫氫酶基因)以及CaMV35S啟動子。高表達的載體為35S和ActI內含子或ActI5’側翼序列和ActI內含子的融合。將起始ATG附近序列(在GUS報告基因中)優化后也可提高表達。McElroy等(Mol.Gen.Genet.，231150-160(1991))描述的啟動子表達盒能很容易地修飾以用于基因表達，并且尤其適用于單子葉宿主。例如含有啟動子的片段被從McElroy構建體中刪除，用于代替pCGN1761ENX中的雙35S啟動子，而后可將特定基因序列插入該pCGN1761ENX。如此構建的融合基因可以轉移至適當的轉化載體中。在另一篇獨立的報道中，水稻ActI啟動子連同它的第一個內含子也可以在培養的大麥細胞中指導表達(Chibbar等，Plant Cell Rep.12506-509(1993))。
d.可誘導的表達，PR-1啟動子pCGN1761ENX中的雙35S啟動子可用任何能夠導致適當高表達水平的啟動子來代替。例如，一個在美國專利號5,614,395中所描述的化學試劑調控的啟動子可代替雙35S啟動子。優選地，該啟動子可通過限制性內切酶從其原先位置上切除，但也可通過具有適當末端限制性酶切位點的引物經PCR擴增而得。如果用PCR擴增，在目標載體上克隆該擴增的啟動子之后，該啟動子應重新測序來檢查擴增錯誤。將化學試劑/病原體調節的煙草PR-1a啟動子從質粒pCIB1004上切除(用于構建，見EP 0 332 104中的實施例21)，并轉移至質粒pCGN1761ENX中(Uknes等，1992)。用NcoI切割pCIB1004后，用T4DNA聚合酶處理產生的線性片段的3’突出端為平末端。用HindIII切割該片段，用膠純化產物中含有PR-1a啟動子的片段，并將其克隆至pCGN1761ENX(其中雙35S啟動子已被切除)。這通過以下步驟來完成用XholI切割再用T4聚合酶補平，之后再用HindIII切割，將較大的含有載體-終止子的片段分離出來，其中在該片段中克隆了pCIB1004啟動子片段。這樣產生了一個pCGN1761ENX衍生物，含有PR-1a啟動子和tml終止子，以及具有單一EcoRI和NotI位點的間插多位點接頭。選擇的編碼區可插入該載體，融合產物(即啟動子-基因-終止子)隨后可轉移至任何選定的轉化載體，包括如下所述的載體。各種化學調控劑可用來誘導本發明中的轉化植物中選定的編碼序列，包括公開于美國專利號5,523,311和5,614,395中的苯并噻唑、異煙酸和水楊酸化合物。
e.可誘導的表達，乙醇誘導的啟動子可被諸如乙醇之類的醇或酮誘導的啟動子也可用于提供本發明中編碼序列的可誘導表達。這樣的啟動子的一個例子是來自構巢曲霉(Aspergillus nidulans)的alcA基因啟動子(Caddick等(1998)Nat.Biotechnol.16177-180)。在構巢曲霉中，alcA基因編碼醇脫氫酶I，它的表達在化學誘導劑存在時受AlcR轉錄因子的調控。為達到本發明的目的，包含與最小35S啟動子融合的alcA基因啟動子序列的質粒palcACAT的CAT編碼序列(Caddick等(1998)Nat.Biotechnol.16177-180)被本發明中的編碼序列取代，形成一個具有受控于alcA基因啟動子的編碼序列的表達盒。這通過本領域熟知的方法來實現。
f.可誘導的表達，糖皮質激素誘導的啟動子也提供了用基于類固醇激素的系統來誘導本發明中核酸的表達。例如使用了糖皮質激素介導的誘導系統(Aoyama和Chua(1997)ThePlant Journal 11605-612)，通過使用糖皮質激素誘導了基因表達，例如合成的糖皮質激素，優選地為地塞米松，優選的濃度為0.1mM至1mM，更優選的為10mM至100mM。為達到本發明的目的，可用本發明中的核酸序列代替熒光素酶基因，形成一個表達盒，該表達盒具有本發明的核酸序列，該核酸序列受控于與35S啟動子相連的六拷貝的GAL4上游激活序列。這通過本領域熟知的方法來實現。反式作用因子包括GAL4 DNA結合區(Keegan等(1986)Science，231699-704)，該GAL4 DNA結合區與皰疹病毒蛋白VP16的反式激活區融合(Triezenberg等(1988)Genes Devel.2718-729)，后者又與大鼠糖皮質激素受體的激素結合區融合(Picard等(1988)，Cell 541073-1080)。融合蛋白的表達受控于任何在本領域熟知或在此描述的適于植物表達的啟動子。含有與6×GAL4/最小啟動子融合的本發明的一段核酸序列的表達盒也可包含于植物中。因而得到了融合蛋白的組織或器官特異性，進而導致殺蟲毒素誘導的組織或器官特異性。
g.根特異表達另一種基因表達的模式為根的表達。de Framond(FEBS290103-106(1991))和已公布的專利申請EP 0 452 269中描述了一個合適的根啟動子。該啟動子轉移至一個適當的載體例如pCGN1761ENX，將一個選定的基因插入，隨后將完整的啟動子-基因-終止子序列組件轉移至目標轉化載體中。
h.創傷誘導的啟動子創傷誘導的啟動子也可適用于基因表達。有大量這樣啟動子的描述(例如，Xu等，Plant Molec.Biol.22573-588(1993)，Logemann等，Plant Cell1151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle，PlantMolec.Biol.22783-792(1993)，Firek等，Plant Molec.Biol.22129-142(1993)，Warner等，Plant J.3191-201(1993))，它們均適用于本發明。Logemann等描述了雙子葉植物馬鈴薯wunI基因的5’上游序列。Xu等提出來自雙子葉植物馬鈴薯的創傷誘導的啟動子(pin2)在單子葉植物水稻中也具有活性。此外，Rohrmeier和Lehle描述了玉米WipI cDNA的克隆，該cDNA為創傷誘導的，并可通過標準技術用來分離關連啟動子。類似地，Firek等和Warner等描述了從單子葉植物可刁柏(Asparagus officinalis)中而來的創傷誘導的基因，它在創傷和病原體侵入的位置表達。使用本領域熟知的克隆技術可將這些啟動子轉移至適當的載體上，與屬于本發明的基因融合，并用來在植物的創傷部位表達這些基因。
i.髓優選的表達專利申請WO 93/07278中描述了玉米trpA基因的分離，它優選在髓細胞中表達。提供基因序列和轉錄起始位點之前-1726bp的啟動子。通過標準分子生物學技術可將該啟動子或其部分轉移至例如pCGN1761的載體，它代替了其中的35S啟動子，并用于驅動外源基因以髓優選的方式表達。實際上，含有髓優選的啟動子或其部分片段可轉移入任何載體并被修飾以用于轉基因植物。
j.葉特異性表達Hudspeth和Grula提供了一個編碼磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因(Plant Molec.Biol.12579-589(1989))。通過標準分子生物學技術可將該基因的啟動子用于驅動轉基因植物中的任何基因以葉特異性方式表達。
k.花粉特異性表達WO 93/07278描述了在花粉細胞中表達的玉米鈣依賴性蛋白激酶(CDPK)基因的分離。該基因序列和啟動子從轉錄起始位點延伸至1400bp。通過標準分子生物學技術，該啟動子或其部分可轉移至例如pCGN1761的載體上，其中它可代替35S啟動子并用于驅動本發明的核酸序列以花粉特異性的方式表達。
2.轉錄終止子有多種轉錄終止子可用于表達盒。它們負責超出轉基因的轉錄終止以及轉基因的正確聚腺苷酸化。適當的轉錄終止子是那些在植物中起作用的，包括CaMV 35S終止子、tml終止子、胭脂堿合酶終止子和豌豆rbcS E9終止子。這些均可用于單子葉植物和雙子葉植物。此外，可使用基因的天然轉錄終止子。
3.提高或調節表達的序列已發現在轉錄單元中有大量的序列能夠增強基因表達，并且這些序列能與本發明中的基因相連來促進它們在轉基因植物中的表達。
許多內含子序列能夠增強表達，尤其在單子葉植物細胞中。例如，已發現玉米AdhI基因的內含子能顯著增強位于其關連啟動子下的野生型基因的表達，當該野生型基因導入玉米細胞時。在氯霉素乙酰轉移酶基因的融合構建體中內含子I特別有效并且促進了表達(Callis等，Gene Develop.11183-1200(1987))。在相同的實驗系統中來自玉米bronzeI基因的內含子在增強表達上具有類似的效果。內含子序列常常整合于植物轉化載體，通常位于非翻譯的前導區。
已知大量來自病毒的非翻譯的前導區序列能增強表達，在雙子葉植物細胞中尤其有效。特別地，來自煙草花葉病毒(TMV，“W序列”)、玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)和苜蓿花葉病毒(AMV)的前導序列在增強表達上均很有效(例如，Gallie等，Nucl.Acids Res.158693-8711(1987)；Skuzeski等，Plant Molec.Biol.1565-79(1990))。
4.基因產物在細胞中的定位已知各種定位基因產物的機制存在于植物中，控制這些機制行使功能的序列已經在某種程度上表征。例如，將基因產物定位于葉綠體是受控于各種蛋白質氨基端的信號序列，進入葉綠體時該信號序列被切除，產生成熟的蛋白質(例如Comai等，J.Biol.Chem.26315104-15109(1988))。這些信號序列可融合于異源基因產物來影響異源產物運輸進入葉綠體(van den Broeck等，Nature313358-363(1985))。編碼適當信號序列的DNA可由編碼RUBISCO蛋白、CAB蛋白、EPSP合酶、GS2蛋白以及其他定位于葉綠體的蛋白質的cDNA的5’端分離而得。也可見美國專利號5,639,949實施例37中題為“葉綠體定向表達”的部分。
其他基因產物定位于其他細胞器例如線粒體和過氧化物酶體(例如Unger等，Plant Molec.Biol.13411-418(1989))。也可操縱編碼這些產物的cDNA來影響異源基因產物定向于這些細胞器。此類序列的例子為核基因編碼的ATPase和線粒體中特定天冬氨酸轉氨酶同工酶。Rogers等提供了定向細胞蛋白質體(Proc.Natl.Acad.Sci.USA826512-6516(1985))。
此外，導致基因產物定位于其它細胞器的序列已被表征。氨基端序列負責定位于ER、質外體和從糊粉細胞的胞外分泌(Koehler和Ho，Plant Cell2769-783(1990))。此外，與羧基端序列相連的氨基端序列負責基因產物的液泡定位(Shinshi等，Plant Molec.Biol.14357-368(1990))。
通過將目的轉基因序列與如上所述的適當定位序列融合，有可能將轉基因產物引導進入任何細胞器或細胞小室。例如，對于葉綠體定位而言，來自RUBISCO基因、CAB基因、EPSP合酶基因或GS2基因的葉綠體信號序列與轉基因氨基端的ATG發生融合。選擇的信號序列應包括已知的切割位點，并且構建的融合體應考慮切割所需的切割位點以后的任何氨基酸。在一些情況下，這個要求可通過在切割位點和轉基因ATG之間添加少量氨基酸，或者將轉基因序列中一些氨基酸替換掉來滿足。
為葉綠體輸入而構建的融合體可以檢測葉綠體吸收效率，方法是使體外構建的轉錄體在體外翻譯，而后在體外測定葉綠體吸收，該方法由Bartlett在《葉綠體分子生物學方法》(Eldelmann等(Eds))，Elsevier出版社1081-1091(1981)和Wasmann在Mol.Gen.Genet.205446-453(1986)中描述。這些構建技術是本領域熟知的，并且對于線粒體和過氧化物酶體同樣適用。
以上描述的細胞定位機制不僅適用于與關聯啟動子相連，也適用于與異源啟動子相連，從而在一個啟動子的轉錄控制下影響特定細胞定位目標，而該啟動子與定位信號序列的來源啟動子具有不同的表達模式。
植物轉化載體的構建大量可用于植物轉化的轉化載體對植物轉化領域的普通技術人員來說是熟知的，并且與本發明相關的基因可以與任何這樣的載體相連使用。載體的選擇依賴于優選的轉化技術和轉化的目標物種。對于一些目標物種而言，不同的抗生素或除草劑選擇標記是優選的。常用的轉化選擇標記包括nptII基因，它具有對卡那霉素及其相關抗生素的抗性(Messing和Vierra，Gene19259-268(1982)；Bevan等，Nature304184-187(1983))；bar基因，它具有對除草劑膦絲菌素的抗性(White等，Nucl.Acids Res.181062(1990)，Spencer等，Theor.Appl.Genet.79625-631(1990))；hph基因，它具有對抗生素潮霉素的抗性(Blochinger和Diggelmann，Mol Cell Biol42929-2931)；dhfr基因，它具有對methatrexate的抗性(Bourouis等，EMBO J.2(7)1099-1104(1983))；EPSPS基因，它具有對草甘磷的抗性(美國專利號4,940,935和5,188,642)；甘露糖-6-磷酸異構酶基因，它提供了代謝甘露糖的能力(美國專利號5,767,378和5,944,629)。
1.適用于農桿菌(Agrobacterium)轉化的載體很多載體均可適用于根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)轉化。它們通常都帶有至少一個T-DNA邊緣序列，并包括例如pBIN19(Bevan，Nucl.Acids Res.(1984))和pXYZ之類的載體。如下描述了兩種適用于農桿菌轉化的典型載體。
a.pCIB200和pCIB2001二元載體pCIB200和pCIB2001用于農桿菌重組載體的構建，并按照如下順序構建。pTJS75kan用以下方法產生用NarI消化pTJS75(Schmidhauser和Helinski，J.Bacteriol.164446-455(1985))，以切除四環素抗性基因，而后插入具有NPTII的來自pUC4K的AccI片段(Messing和Vierra，Gene19259-268(1982)；Bevan等，Nature304184-187(1983)；NcBride等，Plant Molecular Biology14266-276(1990))。XhoI接頭與PCIB7的EcoRV片段相連，該片段含有T-DNA的左右邊緣序列、一個植物可選擇的nos/nptII嵌合基因以及pUC多位點接頭(Rothstein等，Gene 53153-161(1987))，并且將該Xhol消化片段克隆至SalI消化的pTJS75kan中去，形成pCIB200(也可見EP 0 332 104，實施例19)。pCIB200含有如下單一的多位點接頭限制性位點EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbalI和SalI。pCIB2001為pCIB200的衍生物，通過在多位點接頭中插入附加的限制性位點而形成。pCIB2001含有如下單一的多位點接頭限制性位點EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、MluI、BclI、AvrlI、ApaI、HpaI和StuI。pCIB2001除了含有這些單一的限制性酶切位點以外，還具有植物和細菌卡那霉素選擇、農桿菌介導的轉化所需的T-DNA的左右邊緣序列、由RK2衍生的trfA功能(用于大腸桿菌和其他宿主之間的轉移)以及來自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多位點接頭適用于具有自身調控信號的植物表達盒的克隆。
b.pCIB10及其潮霉素選擇性衍生物二元載體pCIB10含有用于在植物中選擇的編碼卡那霉素抗性的基因、T-DNA的左右邊緣序列以及來自廣宿主范圍的質粒pRK252的序列，使其在大腸桿菌和農桿菌中都能夠復制。它的構建可見Rothstein等的描述(Gene53153-161(1987))。構建了各種pCIB10的衍生物，其整合了編碼潮霉素B磷酸轉移酶的基因，見Gritz等的描述(Gene25179-188(1983))。這些衍生物可使轉基因植物只用潮霉素篩選(pCIB741)或者用潮霉素與四環素篩選(pCIB715和pCIB717)。
2.適用于非農桿菌轉化的載體不使用根癌農桿菌的轉化不要求在選定的轉化載體中有T-DNA序列，因而除了以上所述的含有T-DNA序列的載體，不存在這些序列的載體也可使用。不依賴于農桿菌的轉化技術包括通過微粒轟擊、原生質體吸收(例如PEG和電穿孔)和微量注射的轉化。載體的選擇大部分依賴于轉化物種的優選選擇。如下描述了適用于非農桿菌轉化的典型載體的構建。
a.pCIB3064pCIB3064為一個pUC衍生的載體，它適用于直接基因轉移技術，并結合除草劑basta(或膦絲菌素)的選擇。質粒pCIB246包括與大腸桿菌GUS基因和CaMV 35S轉錄終止子有效融合的CaMV 35S啟動子，在PCT公布的申請WO 93/07278中有描述。該載體的35S啟動子在起始位點的5’端含有兩個ATG序列。這些位點通過標準PCR技術來產生突變，去除了ATG序列并產生了SspI和PvuI的限制性酶切位點。這些新的限制性位點分別為距單SalI位點96和37bp，距實際起始位點101和42bp。pCIB246的衍生產物記為pCIB3025。通過SalI和SacI的消化將GUS基因從pCIB3025上切除，將末端補平并連接產生新質粒pCIB3060。由John Innes Centre，Norwich得到質粒pJIT82，切除含有來自產綠色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes)bar基因的400bp SmaI片段，并插入pCIB3060的HpaI位點(Thompson等，EMBO J.62519-2523(1987))。這樣產生了pCIB3064，它包含CaMV35S啟動子和終止子控制下的用于除草劑選擇的bar基因、氨芐青霉素抗性基因(大腸桿菌中選擇用)和具有SphI、PstI、HindIII和BamHI單一位點的多位點接頭。該載體適用于含有自身調控信號的植物表達盒的克隆。
b. pSOG19和pSOG35pSOG35是使用大腸桿菌二氫葉酸還原酶(DFR)基因的轉化載體，二氫葉酸還原酶是一個對氨甲蝶呤具有抗性的選擇性標記。用PCR擴增35S啟動子(-800bp)、來自玉米Adh1基因的內含子6(-550bp)和來自pSOG10的GUS非翻譯前導序列的18bp。一個編碼大腸桿菌二氫葉酸脫氫酶II的基因的250bp片段也通過PCR擴增，這兩段PCR片段和來自pB1221(Clontech)的SacI-PstI片段相連，該SacI-PstI片段包含pUC載體主干和胭脂堿合酶終止子。這些片段的組裝產生pSOG19，它含有與內含子6序列融合的35S啟動子、GUS前導區、DHFR基因和胭脂堿合酶終止子。用來自玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)的前導序列代替pSOG19中GUS前導區產生載體pSOG35。pSOG19和pSOG35具有氨芐青霉素抗性的pUC基因與HindIII、SphI、PstI和EcoRI位點(其用于外源物質的克隆)。
3.適用于葉綠體轉化的載體為將本發明中的核苷酸序列表達于植物質體，使用了質體轉化載體pPH143(WO 97/32011，實施例36)。將核苷酸序列插入pPH143，從而取代了PROTOX編碼序列。然后將該載體用于質體轉化和壯觀霉素抗性轉化體的選擇。可選擇地，核苷酸序列插入pPH143使得它取代了aadH基因。在這種情況下，通過PROTOX抑制劑抗性來篩選轉化體。
轉化一旦本發明的核酸序列克隆至一個表達系統，它就轉化入植物細胞了。植物轉化和再生方法為本領域所熟知。例如，使用Ti質粒載體、DNA直接攝取、脂質體、電穿孔、微量注射和微粒轟擊來傳送外源DNA。此外，來自農桿菌屬的細菌可用于轉化植物細胞。如下為轉化單子葉植物和雙子葉植物的具代表性的技術以及具代表性的質體轉化技術的描述。
1.雙子葉植物的轉化轉化雙子葉植物的技術為本領域熟知的，包括基于農桿菌的技術以及不需要農桿菌的技術。非農桿菌技術涉及原生質體或細胞直接攝取外源遺傳物質。這可通過PEG或電穿孔介導的攝取、微粒轟擊介導的傳送或微量注射來實現。這些技術的描述可見Paszkowski等，EMBOJ.32717-2722(1984)，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199169-177(1985)，Reich等，Biotechnology41001-1004(1986)和Klein等，Nature 32770-73(1987)。在每種情況下，通過本領域熟知的標準技術將轉化的細胞再生為完整的植株。
農桿菌介導的轉化是轉化雙子葉植物的優選技術，因為它的高轉化效率和對許多種類的廣泛適用性。典型的農桿菌轉化包括將帶有目標外源DNA的雙重載體(例如pCIB200或pCIB2001)轉移至適當的農桿菌株系，這一轉移可能依賴于vir基因的補充，其中vir基因是由宿主農桿菌株系攜帶的，它或者與Ti質粒共存或者存在于染色體上(例如，pCIB200和pCIB2001的CIB542株系)(Uknes等，Plant Cell5159-169(1993))。將重組的雙重載體轉移入農桿菌，可通過使用帶有重組雙重載體的大腸桿菌、帶有例如pPK2013質粒并能夠將重組雙重載體轉移入目標農桿菌株系的輔助大腸桿菌株系的三親雜交過程來實現。可選擇地，可通過DNA轉化將重組的雙重載體轉移入農桿菌(Hofgen和Willmitzer，Nucl.Acids Res169877(1988))。
用重組農桿菌對目標植物轉化通常包括將農桿菌和來自該植物的外植體共培養，依照本領域熟知的方法。雙重質粒T-DNA邊緣序列之間帶有抗生素或除草劑抗性標記的轉化組織在選擇性培養基上再生。
另一種用基因轉化植物細胞的方法涉及向植物組織或細胞推進惰性或具有生物學活性的微粒。該技術公開于美國專利號4,945,050、5,036,006和5,100,792(都是授于Sanford等人)。總的來說，該技術包括在有效穿透細胞外表面并且能夠與其內部結合的條件下，向細胞推進惰性或具有生物學活性的微粒。當使用惰性微粒時，該載體可通過用含有目標基因的載體包被微粒引入細胞。可選擇地，目標細胞可用載體包圍，當微粒進入的時候載體也被帶入細胞。具有生物學活性的微粒(例如干燥的酵母細胞、干燥的細菌或噬菌體，每個都含有需要引入的DNA)也可被推進植物細胞組織。
2.單子葉植物的轉化大部分單子葉植物的轉化都已成為常規方法。優選的技術包括通過PEG或電穿孔技術將基因直接轉入原生質體，以及通過微粒轟擊進入愈傷組織。轉化可使用單種DNA或多種DNA(即共轉化)，這兩種方法都適用于本發明。共轉化的優點是可避免完整的載體構建，以及產生將目的基因與選擇標記分離的轉基因植物，從而如果需要的話，在后代中可去除該選擇標記。然而，使用共轉化的一個不利因素為不同種DNA整合入基因組的頻率低于100％(Schocher等，Biotechnology41093-1096(1986))。專利申請EP 0 292 435、EP 0 392 225和WO 93/07278中描述了由玉米原種自交系制備愈傷組織和原生質體的技術，使用PEG或電穿孔轉化原生質體的技術，以及由轉化的原生質體再生為玉米植株的技術。Gordon-Kamm等(Plant Cell2603-618(1990))和Fromm等(Biotechnology8833-839(1990))發表了通過微粒轟擊轉化A188衍生的玉米系的技術。此外，WO 93/07278和Koziel等(Biotechnology 11194-200(1993))描述了通過微粒轟擊轉化玉米原種自交系的技術。該技術中使用1.5-2.5mm長的未成熟玉米胚，它來自授粉后14-15天的玉米穗，使用PDS-1000HeBiolistics設備用于轟擊。
也可通過原生質體或微粒轟擊的直接基因轉移來實現水稻的轉化。對于Japonia型和Indica型的原生質體介導的轉化均已有描述(Zhang等，Plan Cell Res.7379-384(1988))；Shimamoto等，Nature338274-277(1989)；Datta等，Biotechnology8736-740(1990))。兩種類型均可用微粒轟擊進行常規轉化(Christou等，Biotechnology 9957-962(1991))。此外，WO 93/21335描述了通過電穿孔轉化水稻的技術。
專利申請EP 0 332 581中描述了Pooideae原生質體增殖、轉化和再生的技術。這些技術允許轉化鴨茅屬(Dactylis)和小麥。此外，小麥轉化已由Vasil等描述過(Biotechnology10667-674(1992))，他使用的是微粒轟擊進入C型可長期再生的愈傷組織細胞的方法，在Vasil等(Biotechnology111553-1558(1993)和Weeks等(PlantPhysiol.1021077-1084(1993))的描述中使用微粒轟擊進入未成熟的胚和未成熟胚衍生的愈傷組織的方法。然而，小麥轉化的優選技術涉及用未成熟胚的微粒轟擊來轉化小麥和在基因傳送前的高蔗糖或高麥芽糖水平的步驟。在轟擊之前，任何數量的胚(長0.75-1mm)放置于含有3％蔗糖和3mg/l 2，4-D的MS培養基中(Murashiga和Skoog等，Physiologia Plantarum 15473-497(1962))，用于誘導體細胞胚，該步驟可在暗處進行。在轟擊的當天，將胚從誘導培養基中取出，并放于滲透劑中(即含有理想濃度的蔗糖或麥芽糖的誘導培養基，典型的為15％，)。將胚進行質壁分離處理2-3個小時而后進行轟擊。常規的為二十個胚每個目標平板，但這并不是十分重要的。通過標準方法將適當的攜帶基因的質粒(例如pCIB3064或pSG35)沉淀于微米級的金顆粒上。每個胚的平板用Dupont Biolistics氦設備轟擊，暴發壓力為～1000psi，使用標準的80目篩。轟擊后，將胚放回暗處恢復24小時左右(仍處于滲透劑中)。24小時之后，將胚從滲透劑中取出，放回誘導介質，在再生之前繼續放置一個月。大約一個月以后，將帶有正在發育的胚愈傷組織的胚外植體轉移至再生培養基(MS+1 mg/l NAA，5mg/l GA)，進一步含有適當的選擇劑(pCIB3064質粒為10mg/l basta，pSOG35質粒為2mg/l氨甲蝶呤)。大約一個月以后將發育出的根轉移至更大的名為“GA7s”的無菌容器中，其中含有一半離子強度的MS、2％蔗糖和相同濃度的選擇劑。
使用農桿菌轉化單子葉植物也已有描述。見WO 94/00977和美國專利號5,591,616。
3.質體的轉化在另一個優選的實施方案中，本發明的核苷酸序列直接轉化入質體基因組。質體轉化的主要優勢在于質體可在不經大量修飾的前提下表達細菌基因，并且在一個啟動子的控制下，質體可表達多個開放讀碼框。在美國專利號5,451,513、5,545,817和5,545,818中，PCT申請號WO 95/16783和McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA917301-7305中均有關于質體轉化技術的大量敘述。葉綠體轉化的基本技術包括將側翼帶有選擇性標記的克隆的質體DNA區域和目的基因引入適當的目標組織，例如，通過biolistics或原生質體轉化(例如氯化鈣或PEG介導的轉化)。1至1.5kb的側翼序列稱為定位序列，促進了質體基因組的同源重組，因此允許質體基因組特定區域的替換或修飾。首先，對葉綠體16SrRNA和rps12基因進行點突變，使其對壯觀霉素和/或鏈霉素具有抗性，可用于作為轉化的選擇標記(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA878526-8530；Straub，J.M.和Maliga，P.(1992)Plant Cell 439-45)。這導致了穩定的大約每100次轟擊目標葉子產生一個同質轉化體的速率。在這些標記之間的克隆位點允許構建質粒定位的載體以導入外源基因(Staub，J.M.和Maliga，P.(1993)EMBO J.12601-606)。通過將隱性rRNA或r蛋白抗生素抗性基因替換為一個顯性選擇性標記，細菌編碼壯觀霉素解毒酶氨基糖苷-3’-腺苷轉移酶的aadA基因，可大大提高轉化頻率(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90913-917)。之前，該標記已成功用于綠藻萊菌衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)質體基因組的高頻率轉化(Goldschmidt-Clermont，M.(1991)Nucl.Acids Res.194083-4089)。其他適用于質體轉化的選擇性標記為本領域熟知的，并包含于本發明的范圍之內。通常，轉化后需要大約15-20個細胞分裂周期達到同質體的狀態。質體表達(其中基因通過同源重組插入每個植物細胞中都存在的環狀質體基因組的數千個拷貝中)的巨大的拷貝數量大大超過了核表達的基因數量，允許超過植物總可溶蛋白質量的10％的表達水平。在一個優選的實施方案中，將本發明的核苷酸序列插入一個質體定位載體，并轉化至目標植物宿主的質體基因組中。可獲得質體基因組同型的植物，其中含有本發明的核苷酸序列，并且該植物具有高的核苷酸表達能力。
實施例依照如下詳細的實施例來進一步描述本發明。這些實施例僅用于舉例說明而已，除非指明，并非旨在限制本發明的應用。在此使用的標準DNA重組和分子克隆技術為本領域熟知的，并描述于Ausubel(ed.)《分子生物學現有技術》(Current Protocols in MolecularBiology)，John Wiley和Sons.，Inc(1994)；T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，《分子克隆實驗手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1989)；以及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，《基因融合實驗》(Experiments with Gene Fusion)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1984)。
實施例1使用熱穩定硫氧還蛋白轉化玉米表達來自詹氏甲烷球菌的熱穩定硫氧還蛋白的基因(具有SEQ IDNO1的序列)是通過使用如美國專利5,625,136中所述的玉米偏愛密碼子來制備的，該基因在種子特異的γ-玉米醇溶蛋白啟動子控制下，在pGIGUP質粒T-DNA邊緣之間整合入表達盒。
在這些實驗中使用根癌農桿菌株系LBA4404(pAL4404，pSB1)。pAL4404是一個卸甲輔助質粒。pSB1是一個具有廣宿主范圍的質粒，它含有pGIGUP的同源區和來自pTiBo542毒性區的一個15.2kb的KpnI片段(Ishida等，1996；根癌農桿菌介導的玉米(Zea mays L.)高效轉化，Nature Biotechnology 14745-750)。通過電穿孔將質粒pGIGUP引入LBA4404(pAL4404，pSB1)導致pGIGUP和pSB1共合體的產生。該質粒的T-DNA包括受泛素啟動子驅動的甘露糖-6-磷酸異構酶基因，提供了代謝甘露糖的能力，以及如上所述的硫氧還蛋白基因。
在YP培養基上(5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/l NaCl、15g/l瓊脂、pH6.8)培養農桿菌3天，培養基上還有50mg/l壯觀霉素和10mg/l四環素。用接種環收集細菌，并懸浮于N6液體培養基中，密度可為109至5109細胞/毫升。也可從YP培養基的過夜培養物中收集農桿菌細胞并在N6液體培養基中重新懸浮。
在大約自花授粉10至14天以后可獲得玉米的未成熟胚。在具有誘導和支持胚愈傷組織形成的平板培養基上分割未成熟的合子胚，密度為大約25個未成熟胚每平板。
將未成熟胚與含有Ti質粒(含有選擇性標記基因)的農桿菌在平板或液體中共同孵育。在與農桿菌孵育之前或之后，將未成熟胚置于含有硝酸銀(10mg/l)的愈傷組織誘導培養基上培養。大約每個平板上放置25個未成熟胚。在孵育16至72個小時之后，將未成熟胚轉移至含有硝酸銀和頭孢噻肟的愈傷組織誘導培養基上。按照如下步驟篩選轉化的細胞在體外使用甘露糖來選擇轉化的細胞。在侵染2至20天以后該選擇劑的濃度可低至1g/L并維持一共2-12周。由此獲得的胚胎愈傷組織在標準再生培養基上再生，存在或不存在甘露糖均可。所有植物都通過氯酚紅(CR)測驗來檢測對甘露糖的耐受性。該分析采用pH敏感的顯色劑來顯示哪些細胞在存在甘露糖時生長。活的細胞會在培養基中產生pH變化，從而使指示劑氯酚紅由黃色變為紅色。在這個測試中能很容易地鑒定對甘露糖有耐受性的植物。CR測驗為陽性的植物經PCR分析是否存在甘露糖基因。PCR測試為陽性的植物再經Southern印跡分析。
對再生的植物分析硫氧還蛋白的表達。植物為發育上正常的植物。來自具高表達能力的子代植物玉米經過小規模濕磨法加工分析，與不含有硫氧還蛋白轉基因的同一基因型對比確定淀粉的可提取性。在濕磨法加工過程中，表達硫氧還蛋白基因的玉米與同一基因型非轉化玉米相比，顯示了更高的淀粉可提取性。
實施例2使用熱穩定硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶轉化玉米通過實施例1中描述的方法，玉米用來自詹氏甲烷球菌編碼硫氧還蛋白(SEQ ID NO1)和硫氧還蛋白還原酶(SEQ ID NO6)的基因共轉化。兩個基因都處于種子特異的γ-玉米醇溶蛋白啟動子控制下。這兩個基因連接于pGIGUP質粒的左右邊緣序列之間，可提高兩個基因作為一個單一插件整合入植物染色體的可能性。
再生的植物經過表達硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶的分析。植物為發育上正常的植物。來自具高表達能力的子代植物玉米經過小規模濕磨法加工分析，與不含有硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶轉基因的同一基因型對比確定淀粉的可提取性。在濕磨法加工過程中，表達硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶基因的玉米與同一基因型非轉化玉米相比，顯示了更高的淀粉可提取性。
實施例3克隆硫氧還蛋白基因并構建植物轉化載體分別從水稻和小麥發芽的種子提取總RNA，通過RT-PCR克隆水稻和小麥硫氧還蛋白-h cDNA(trx-h)。通過引物NMD109-(5’-GGA TCCACC ATG GCC GCC GAG GAG-3’)(SEQ ID NO8)和NMD110(5’-GAGCTC TTA GGC AGA AGC AGA TG-3’)(SEQ ID NO9)擴增水稻的trxcDNA，引物NMD102-(5’-GGA TCC ACC ATG GCG GCG TCG G-3’)(SEQ ID NO10)和NMD103(5’-GAG CTC TTA CTG GGC CGC GTG T-3’)(SEQ ID NO11)擴增小麥的trx cDNA。為將該基因克隆至植物表達載體需要插入適當的限制性酶切位點，即在5’端插入BamHI，在3’端插入SacI，這些通過上面的反應也完成了。適當大小的PCR產物通過膠純化并用Topo PCR 2.1克隆載體(Invitrogen)克隆。含有正確插入的菌落在限制性分析后測序。水稻trx序列與已發表于GenBankAccession no.U92541的序列匹配。小麥trx序列與來自T.aestivium(GenBank Accession no.X69915)的trx-h序列匹配。克隆γ-玉米醇溶蛋白啟動子由Dr.Brian Larkins提供的質粒pGZ27.3中擴增出673 bp的γ-玉米醇溶蛋白啟動子。該序列與不透明2號修飾基因5’區(GenBank Accession no.S78780)和(Marzabal等，1998，PlantJ.，1641-52)完全匹配。γ-玉米醇溶蛋白啟動子具有胚乳特異性(Torrent等(1997)Plant Mol.Biol.，34139-149)。
pNOV 3401玉米泛素啟動子加上內含子-水稻trx-h -35S終止子，位于PMI選擇的農桿菌轉化載體中將水稻trx基因克隆至含有泛素啟動子加上內含子和35S終止子的植物表達載體。將產生的構建體pNOV 3400用限制性內切酶HindIII和KpnI消化并亞克隆至農桿菌轉化二元載體盒pNOV 2117，得到pNOV3401。
pNOV 3405位于PMI選擇的農桿菌轉化載體中的γ-玉米醇溶蛋白啟動子-水稻trx-h -35S終止子pNOV 3406位于PMI選擇的農桿菌轉化載體中的γ-玉米醇溶蛋白啟動子-小麥trx-h -35S終止子將水稻和小麥trx-h基因克隆至含有如上所述的γ-玉米醇溶蛋白啟動子和35S終止子的植物表達載體。用HindIII和KpnI消化得到的構建體得到啟動子、基因和終止子單元，并亞克隆至農桿菌二元載體pNOV 2117，分別得到pNOV 3405和pNOV 3406。pNOV 2117為具有磷酸甘露糖異構酶(PMI)基因以及內含子和NOS終止子的二元載體，磷酸甘露糖異構酶基因的表達受玉米泛素啟動子的驅動。
pNOV 3408位于PMI選擇的農桿菌轉化載體中的γ-玉米醇溶蛋白啟動子-γ-玉米醇溶蛋白信號序列-水稻trx-h -γ-玉米醇溶蛋白3’端-35S終止子
為了將水稻硫氧還蛋白定位于細胞內膜系統，使用了γ-玉米醇溶蛋白基因的N末端和C末端的信號序列(Torrent等(1994)Planta，192515-518)。插入Eco47AIII限制性酶切位點于水稻硫氧還蛋白基因第一個ATG之后的5’端，通過誘變引物NMD124A(5’-GAGCTCTTAGGCGCTAGCAG ATG-3’)(SEQ ID NO12)和NMD125A(5’-GGATCCACCAGCGCTGCCGA-3’)(SEQ ID NO13)經PCR誘變將NheI限制性酶切位點插入其3’端。所有突變均為沉默突變。將基因克隆至topo PCR2.1載體并測序。通過限制性內切酶Eco47AIII和NheI消化得到trx片段。四段寡核苷酸用來編碼γ-玉米醇溶蛋白信號序列和C端序列NMD126(5’-GATCCACCAT GAGGGTGTTG CTCGTTGCCC TCGCTCTCCT GGCTCTCGCTGCGAGCGCCA CCAGC-3’)(SEQ ID NO14)；NMD127(5’-GCTGGTGGCGCTCGCAGCGA GAGCCAGGAG AGCGAGGGCA ACGAGCAACA CCCTCATGGT G-3’)(SEQ ID NO15)；NMD128(5’CTAGCGCTCT GCAGCAGCCG ACTCCATGCCCCTACGCTGC TGCCGGCGGT GTCCCCCACT GAGAGCT-3’)(SEQ ID NO16)；和NMD 129(5’-CTCAGTGGGG GACACCGCCG GCAGCAGCGT AGGGGCATGGAGTCGGCTGC TGCAGAGCG-3’)(SEQ ID NO17)。使用標準方法用T4多核苷酸激酶將寡核苷酸對NMD126和127以及NMD128和129雜交并磷酸化。這兩對雜交并磷酸化的寡核苷酸對與如上所述的用Eco47AIII和NheI消化的trx片段和一個含有γ-玉米醇溶蛋白啟動子和35S終止子的植物表達載體盒以四向方式連接。用HindIII和KpnI消化產生的構建體得到啟動子、基因和終止子單元，并亞克隆至農桿菌二元載體pNOV 2117，得到pNOV 3408，其中pNOV 2117含有受玉米泛素啟動子驅動的磷酸甘露糖異構酶(PMI)基因作為選擇標記。
將pNOV 3401、pNOV 3405、pNOV 3406和pNOV 3408轉化入農桿菌株系LBA4404(pSB1)并用于穩定的玉米轉化。
在體外還原水稻硫氧還蛋白時擬南芥的硫氧還蛋白還原酶具有活性。因此構建一個玉米優化的NTR基因。
實施例4構建玉米優化的擬南芥依賴于NADPH的硫氧還蛋白還原酶基因擬南芥NADPH依賴的硫氧還蛋白還原酶基因(NTR)是一個35kD的蛋白質。設計該合成基因需要將該從NTR基因(GenBank Accession#Z23109)推理所得的多肽序列進行反向翻譯，通過Wisconsin大學GCG課題組建立的“反向翻譯”程序，使用玉米偏愛密碼子表(Murray等(1989)Nucl.Acids Res.，17477-498)。“玉米最優化”序列進一步經修飾插入單一位點來促進克隆。將該基因分為三部分克隆。每個片段都通過8-10對長為60-75個核苷酸的寡聚物(其代表基因的雙鏈)的雜交來構建。在順序寡核苷酸對之間設計一個15個核苷酸的重疊，用于正確的定向和組裝。寡核苷酸是通過Genosys Inc.(Texas)來合成的。基因的片段1(對應于核苷酸1-305)是通過擴增305bp片段來構建的，利用PCR技術通過Taq聚合酶以及由提供者推薦的標準條件，以8寡聚物的等摩爾混合物為模板，STRF1A(5’-ggATCCACCATgAACggCCT ggAg-3’)(SEQ ID NO18)和STRF1B(5’-CTCgAgAAgTCCACCTTggT CAC-3’)(SEQ ID NO19)為引物。基因的片段2是通過擴增346bp片段來構建的(對應于核苷酸299-645)，利用PCR技術，以10寡聚物的等摩爾混合物為模板，STRF2A(5’-CTCgAgCAAGCCgTTCAA-3’)(SEQ ID NO20)和STRF2B(5’-gACgTCgATCTTCgggTTgg A-3’)(SEQ ID NO21)為引物。基因的片段3是通過擴增382bp片段來構建的(對應于核苷酸639-1021)，利用PCR技術，以10寡聚物的等摩爾混合物為模板，STRF3A(5’-CgACgTCATCTggAACTCCT-3’)(SEQ ID NO22)和STRF3B(5’-gAgCTCAgATCTAgTCggAC TTg-3’)(SEQ ID NO23)為引物。將每個片段的擴增DNA克隆至topo PCR2.1 T-載體(Invitrogen)。具有正確序列的基因片段通過重疊限制性內切酶位點XhoI和AatII連接。玉米優化的擬南芥NADPH依賴性的硫氧還蛋白還原酶編碼序列為SEQ ID NO24，它編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO25。構建完整的基因并測序，再亞克隆至含有γ-玉米醇溶蛋白啟動子和35S終止子的植物表達載體盒。啟動子、基因、終止子單元再單獨亞克隆至一個農桿菌玉米轉化載體，并與水稻和小麥的硫氧還蛋白基因相連。
實施例5水稻NADPH依賴性的硫氧還蛋白還原酶(NTR)基因水稻NADPH依賴性的硫氧還蛋白還原酶(NTR)編碼序列為SEQ IDNO26，相應的氨基酸序列為SEQ ID NO27。
實施例6擬南芥NTR和如上所述的水稻序列的比對比對的序列參照分子arab trPG(SEQ ID NO25)，1-1002(334個氨基酸)序列2TRCONAA.TXT(SEQ ID NO27)，1-310(310個氨基酸)同源性70％排列類型球狀蛋白質參數錯配2；開放缺口4；延伸缺口1；保守Narab trPG(1) mnglethn--trlcivgsgpaahtaaiyaaraelkpllfegwmandiapgTRCONAA.TXT (1) .e.sagaplr....i....s...............v.....l.....a.
arab trPG(145) gqlttttdvenfpgfpegilgveltdkfrkqserfgttiftetvtkvdfsTRCONAA.TXT (51) .....................g..m.rc.a..l....s.is....a....
arab trPG(295) skpfklftdskailadavilaigavakwlsfvgsgevlgglwnrgisacaTRCONAA.TXT (101) ar..rvas..ttv.....vv.t....rr.h.a..----day.........
arab trPG(445) vcdgaapifrnkplavigggdsameeanfltkygskvyiidrrdafraskTRCONAA.TXT (147) .............i............s........h....h..nt.....
arab trpG(595) imqqralsnpkidviwnssvveaygdgerdvlgglkvknvvtgdvsdlkvTRCONAA.TXT (197) ...a........q.f.d.e......gegggp.a.v....l...ki...q.
arab trPG(745) sglffaighepatkfldggveldsdgyvvtkpgttqtsvpgvfaagdvqdTRCONAA.TXT (247) ................g.ql...a....a....s.h...k..........
arab trpG(895) kkyrqaitaagtgcmaaldaehylqeigsqqgksd*TRCONAA.TXT (297) ...........----------------------.gl
實施例7植物轉化載體PNOV4100-PTX5’-At PPO-35ST’和Ubq3(At)-內含子-NOS載體用EcoRI消化PBH28(擬南芥Ubq3int-NOS)，分離出4756bp的條帶，用Klenow補平，連接至pCTK2(PTX5’-At PPO-35ST)，用HindIII消化，分離出2386bp的條帶，用Klenow補平。pNOV4100含有PTX5’、At PPO、35ST’、amp、Ubq3(At)內含子NOS。將連接產物測序。
PNOV4101-在PPO載體pNOV4100中的β總大豆球蛋白(conglycinin)α’亞基啟動子-大豆硫氧還蛋白-NOS用HindIII消化pNOV4100。通過PCR克隆β總大豆球蛋白α’亞基啟動子(GenBank accession #M13759)，使用大豆葉基因組DNA和寡核苷酸P9(5’-gac taa gct tac aat tat tat atc aaa atg gc-3’(SEQ ID NO28))和P10(5’-gct ttt ccc aat acg caa tgc-3’(SEQ ID NO29))(Sylvain等(1992)Plant Mol.Biol.19937-949)。將該PCR產物克隆至PCR2.1 TOPO載體并測序。該構建體在PCR中用作模板，引物為寡核苷酸P4(5’-gac tag cgc tga cag aaa ctg atgcta gga a-3’(SEQ ID NO30))和P9(5’-gac taa gct tac aattat tat atc aaa atg gc-3’(SEQ ID NO28))。用HindIII和Eco47AIII消化。從大豆發芽的種子提取總RNA，通過RT-PCR克隆大豆硫氧還蛋白，使用P1(5’-cgt agg atc cac cat ggc tga aga aga ggg tca ggttgt c-3’(SEQ ID NO31))和P2(5’-cgt aga gct ctc aag aagaag cag cag cag cag at-3’(SEQ ID NO32))。將該PCR產物克隆至PCR2.1 TOPO載體并測序。該構建體在PCR中用作模板，引物為寡核苷酸P2(5’-cgt aga gct ctc aag aag aag cag cag cag cag at-3’(SEQ ID NO32))和P5(5’-gac tag cgc tga aga ggg tca ggt tgtcg-3’(SEQ ID NO33))。用Eco47III和SacI消化。將以上三個片段進行三向連接，序列經鑒定。
PNOV4102-在PPO載體pNOV4100中的β總大豆球蛋白α’亞基啟動子-大豆硫氧還蛋白-煙草殼多糖酶液泡信號序列-NOS。用HindIII和SacI消化pNOV4100。通過PCR克隆β總大豆球蛋白α’亞基啟動子，使用大豆葉基因組DNA和寡聚核苷酸P9(5’-gac taa gct tac aattat tat atc aaa atg gc-3’(SEQ ID NO28))和P10(5’-gct tttccc aat acg caa tgc-3’(SEQ ID NO29))。將該PCR產物克隆至PCR2.1 TOPO載體并測序。該構建體在PCR中用作模板，引物為寡核苷酸P4(5’-gac tag cgc tga cag aaa ctg atg cta gga a-3’(SEQID NO30))和P9(5’-gac taa gct tac aat tat tat atc aaa atggc-3’(SEQ ID NO28))。用HindIII和Eco47AIII消化。從大豆發芽的種子提取總RNA，通過RT-PCR克隆大豆硫氧還蛋白(GenBankaccession#AI441505)，使用P1(5’-cgt agg atc cac cat ggc tgaaga aga ggg tca ggt tgt c-3’(SEQ ID NO31))和P2(5’-cgtaga gct ctc aag aag aag cag cag cag cag at-3’(SEQ ID NO32))。將該PCR產物克隆至PCR2.1 TOPO載體并測序。該構建體在PCR中用作模板，引物為寡核苷酸P2(5’-cgt aga gct ctc aag aag aagcag cag cag cag at-3’(SEQ ID NO32))和P5(5’-gac tag cgctga aga ggg tca ggt tgt cg-3’(SEQ ID NO33))。用Eco47III和SacI消化。將以上三個片段進行三向連接，序列經鑒定。
PNOV4103-在PPO載體pNOV4100中的β總大豆球蛋白α’亞基啟動子加上β總大豆球蛋白的前肽部分-大豆硫氧還蛋白-NOS。通過PCR克隆β總大豆球蛋白α’亞基啟動子加上β總大豆球蛋白的前肽部分，使用大豆葉基因組DNA和寡核苷酸P9(5’-gac taa gct tac aattat tat atc aaa atg gc-3’(SEQ ID NO28))和P12(5’-cag taggct taa gga aat tgc aac gag-3’(SEQ ID NO34))。將該片段克隆至pCR 2.1 TOPO。用StuI和SacI消化該構建體，并將大豆硫氧還蛋白克隆至該載體。經PCR修飾大豆硫氧還蛋白的限制性酶切位點。寡核苷酸P2(SacI)(5’-cgt aga gct ctc aag aag aag cag cag cagcag at-3’(SEQ ID NO32))和P11(PvuII)(5’-cag tca gct gaagag ggt cag gtt gtc-3’(SEQ ID NO35))。在pCR 2.1 TOPO中產生β總大豆球蛋白啟動子加上前肽部分+硫氧還蛋白，其稱為A-6。用HindIII和SacI消化A-6和pNOV4100。來自A-6的1459bp的片段與pNOV4100連接。
PNOV4104-在PPO載體pNOV4100中的β總大豆球蛋白α’亞基啟動子加上β總大豆球蛋白的前肽部分-大豆硫氧還蛋白-煙草殼多糖酶液泡信號序列-NOS。用StuI和SacI消化pCR 2.1 TOPO中的β總大豆球蛋白α’亞基啟動子加上β總大豆球蛋白的前肽部分。用P11(5’-cag tca gct gaa gag ggt cag gtt gtc-3’(SEQ ID NO35))和P27(5’-cta gga gct cta cat ggt gtc cac cag cag-3’(SEQ IDNO36))為引物，以BTC4為模板(含有大豆硫氧還蛋白和煙草殼多糖酶液泡信號序列的pBluescript)得到PCR片段。用PVuII和SacI消化該片段，與StuI-SacI片段連接。產生A3-10(即帶有β總大豆球蛋白啟動子的pCR 2.1 TOPO+前肽-大豆硫氧還蛋白-煙草殼多糖酶液泡信號序列)。用HindIII和SacI消化A3-10和pNOV4100并連接。
PNOV4105-Ubq3(At)-內含子-煙草殼多糖酶ER信號序列-NOS和PTX5’-At PPO-35ST’。用BamHI和PstI消化PNOV4100，并連接至pCIB8418的煙草殼多糖酶ER信號序列再用BamHI和PstI消化得到PNOV4105。該載體含有Ubq3啟動子和內含子與煙草殼多糖酶ER信號序列。
PNOV4106-在PPO載體pNOV4105中的Ubq3(At)-內含子-煙草殼多糖酶ER信號序列-大豆硫氧還蛋白-煙草殼多糖酶液泡信號序列-NOS。用Eco47III和SacI消化pNOV4105和pNOV4102。來自pNOV4102的387bp的條帶連接至消化過的pNOV4105。
PNOV4107-在PPO載體pNOV4105中的Ubq3(At)-內含子-煙草殼多糖酶ER信號序列-大豆硫氧還蛋白-NOS。用Eco47III和SacI消化pNOV4105和pNOV4101。來自pNOV4101的360bp的條帶連接至消化過的pNOV4105。
PNOV4108-在二元載體pCIB200中的β總大豆球蛋白α’亞基啟動子-大豆硫氧還蛋白-煙草殼多糖酶液泡信號序列-NOS。用XbaI消化pCIB200，并用Klenow補平。用HindIII和SacI消化pNOV4101，用T4 DNA聚合酶將末端補平，并將1626bp條帶與消化過的pCIB200連接。
PNOV4109-在二元載體pCIB200中的β總大豆球蛋白α’亞基啟動子加上β總大豆球蛋白的前肽部分-大豆硫氧還蛋白-NOS。用XbaI消化pCIB200，并用Klenow補平。用HindIII和KpnI消化pNOV4103，用T4 DNA聚合酶將末端補平，并將1748bp條帶與消化過的pCIB200連接。
PNOV4110-β總大豆球蛋白α’亞基啟動子-大豆硫氧還蛋白-NOS。用XbaI消化pCIB200，并用Klenow補平。用PvuII和KpnI消化pNOV4102，用T4 DNA聚合酶將末端補平，并將1843bp條帶與消化過的pCIB200連接。
PNOV4111-在二元載體pCIB200中的β總大豆球蛋白α’亞基啟動子加上β總大豆球蛋白的前肽部分-大豆硫氧還蛋白-煙草殼多糖酶液泡信號序列-NOS。用XbaI消化pCIB200，并用Klenow補平。用PvuII和KpnI消化pNOV4104，用T4 DNA聚合酶將末端補平，并將1969bp的條帶與消化過的pCIB200連接。
PNOV4112-大腸桿菌蛋白質表達載體pET29a中的大豆硫氧還蛋白。從大豆發芽的種子提取總RNA，通過RT-PCR克隆大豆硫氧還蛋白，使用P1(5’-cgt agg atc cac cat ggc tga aga aga ggg tca ggt tgtc-3’(SEQ ID NO31))和P2(5’-cgt aga gct ctc aag aag aagcag cag cag cag at-3’(SEQ ID NO32))。用BamHI和SacI消化該PCR產物，并克隆至用BamHI和SacI消化的pET29a中去。該序列已經鑒定。
PNOV4113-大腸桿菌蛋白質表達載體pET29a中的水稻硫氧還蛋白。用BamHI和SacI消化pNOV3400，將水稻硫氧還蛋白(378bp)克隆至用BamHI和SacI消化的pET29a中去。該序列已經鑒定。
PNOV4114-大腸桿菌蛋白質表達載體pET29a中的小麥硫氧還蛋白。用BamHI和SacI消化pNOV3406，將小麥硫氧還蛋白(387bp)克隆至用BamHI和SacI消化的pET29a中去。該序列已經鑒定。
PNOV4115-大腸桿菌蛋白質表達載體pET29a中的擬南芥NADPH硫氧還蛋白還原酶.通過RT-PCR克隆擬南芥NADPH硫氧還蛋白還原酶(GenBank Accession # Z23109)。用Trizol(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)依照生產者提供的實驗方法，從擬南芥的葉子中提取出總RNA。在Superscript One Step RT-PCR系統(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)中使用一微克總RNA，來一步產生cDNA和PCR產物。在該反應中使用引物P28(5’-gca cgg ctt ggt ggt gaa tcc-3’(SEQ ID NO37))和P29(5’-ctc att ctg gtc cat caa tgt c-3’(SEQ ID NO38))。依照生產者提供的實驗方法。將PCR產物以1∶10稀釋，嵌套式PCR反應中使用1微升該產物，與引物P26(5’-gactgt cga ctc aat cac tct tac ctt gct gag-3’(SEQ ID NO39))和P31(5’-gac tgg atc caa tgg tct cga aac tca caa c-3’(SEQID NO40))進行反應。該嵌套式PCR反應產物(998bp)經膠純化，用BamHI和SacI消化后克隆至用BamHI和SacI消化的pET29a中去。該序列已經鑒定。PNOV4109-用XbaI消化pCIB200，并用Klenow補平。用HindIII和KpnI消化pNOV4103，用T4 DNA聚合酶將末端補平，并將1748bp條帶與消化過的pCIB200連接。該構建可用于大豆中的瞬時表達分析，也可與硫氧還蛋白連接用于擬南芥和其它雙子葉植物的穩定轉化。
PNOV4101、PNOV4102、PNOV4103、PNOV4104、PNOV4106、PNOV4107用于大豆子葉中的瞬時表達實驗。
通過Western印跡分析了硫氧還蛋白的表達PNOV4108、PNOV4109、PNOV4110、PNOV4111用于擬南芥的穩定轉化實驗。通過Western印跡分析了硫氧還蛋白的表達。檢測了硫氧還蛋白對表達的作用和種子特異性蛋白質的活性。
PNOV4112、PNOV4113、PNOV4114分別為大腸桿菌蛋白質表達載體pET29a(Novagen)中的含有大豆、水稻和小麥trx-h基因的構建體。這些構建體是用于制備適用于抗體生產和純化的硫氧還蛋白，該硫氧還蛋白也可在硫氧還蛋白的酶試驗中充當標準蛋白。
實施例8蛋白質表達和純化如下構建體用于大腸桿菌中的蛋白質表達PNOV4112(pET29a中的大豆硫氧還蛋白)、PNOV4113(pET29a中的水稻硫氧還蛋白)、PNOV4114(pET29a中的小麥硫氧還蛋白)和PNOV4115(pET29a中的擬南芥硫氧還蛋白還原酶)。將大腸桿菌株系BL21(DE3)pLysS用每個構建體轉化。在含有來自甘油原液的等分試樣、50mg/ml的卡那霉素、34mg/ml的氯霉素的LB培養基中于37℃培養直至在600nm的光密度達到0.6。培養體系在4℃中保存至第二天。將培養體系離心后在新鮮LB中重懸細胞。用每25ml大規模培養液使用1ml小規模培養液的方式來進行大批培養。細胞在含有50mg/ml的卡那霉素、34mg/ml的氯霉素的LB培養基中于37℃培養直至在600nm的光密度達到0.6。加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)使其終濃度為0.4mM，用于誘導蛋白質表達。繼續在37℃培養3個小時。取出培養液1/25體積的量，在3000g離心10分鐘，并將細胞在BugBuster中重新懸浮(Novagen，Madison，WI)。在每毫升BugBuster中加入5單位DNase。細胞在-20℃放置過夜。細胞融化后在室溫旋轉孵育30分鐘。通過在4℃以14,000g離心20min去除細胞碎片。
表達的蛋白為具有S-標記(15個氨基酸)和5’端凝血酶切割位點(6個氨基酸)的融合蛋白。通過cDNA的5’端克隆位點的BamHI位點，將另外的31個氨基酸加入目標蛋白的5’端。
用親和色譜純化該融合蛋白。將蛋白質提取物加入S-蛋白瓊脂糖漿液(Novagen，Madison，WI)。由于融合蛋白的表達量不同，每個實驗的S-蛋白瓊脂糖所需量也不同。產率為0.5mg純化的蛋白質/ml樹脂。依照生產者提供的實驗方法。要去除S-標記，依照生產者提供的實驗方法使用S-標記凝血酶純化試劑盒(Novagen，Madison，WI)。
實施例9抗體的生產大豆硫氧還蛋白抗體的生產經過親和色譜純化大豆硫氧還蛋白，使用S-蛋白瓊脂糖和如上所述的方法去除S-標記。在這種制備物中存在污染蛋白，因此將該蛋白在4-20％的Tris-甘氨酸膠(Novex，SanDiego)上電泳，并將大豆硫氧還蛋白的條帶從電泳膠上切除。將切下的膠條提供給Duncroft Inc.(Lovettsville，VA)，用于在山羊中生產抗體，使用如下標準操作過程CG1“兔、綿羊和山羊的多克隆抗體制備”。
水稻硫氧還蛋白特異性抗體的純化依照生產者提供的實驗方法用S-蛋白瓊脂糖親和色譜純化水稻硫氧還蛋白(Novagen，Madison，WI)。不去除S-標記。
Affi-Gel-10柱的制備在與Bio-rad Affi-Gel-10柱偶聯之前，將純化的水稻硫氧還蛋白置于2L含0.1M NaHCO3、pH為8.3的溶液中透析5小時，依照生產者提供的實驗方法操作。簡要地說，將大約2ml的Affi-Gel-10漿液轉移至與真空相連的玻璃過濾器，去除溶劑，并用冰預冷的dH2O(至少3倍體積)將膠洗滌兩次。然后將潮濕的膠轉移至含有透析過的水稻硫氧還蛋白的試管中，在4℃搖床上過夜。為了確保封閉所有未被占用的活性位點，向膠中加入0.1ml的1M乙醇胺HCl(pH7.0)，在4℃搖一個小時。再將膠轉移至柱中，經PBS洗滌，用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.5，0.4ml)預洗脫，再用PBS平衡。最終的柱體積為0.8ml。不使用時，將柱在含有0.2％疊氮化鈉的PBS中保存于4℃。
水稻硫氧還蛋白特異性抗體的純化通過水稻硫氧還蛋白Affi-Gel-10柱將大豆硫氧還蛋白山羊抗血清進行免疫親和純化。對于每輪反應，借助重力將2ml血清加入柱中，用PBS洗滌柱直至A280值＜0.015，然后用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.5)洗脫。收集組分(1ml)并用50μl 0.5M的Tris(pH8.5)中和。將A280為0.05或更大值的組分收集。
實施例10硫氧還蛋白分析胰島素還原分析(Arne Holmgren(1979)J.Biol.Chem.2549627-9632)。在該分析中，DTT(二硫蘇糖醇)還原硫氧還蛋白。還原了的硫氧還蛋白進而將胰島素中的二硫鍵還原，產生白色沉淀物。在650nm波長下記錄沉降速率。新鮮制備的胰島素溶液(1mg/ml，在0.1M的磷酸鉀溶液中，pH6.5)、2mM EDTA(乙二胺四乙酸)和100mM DTT在冰上預冷。在比色杯中制備分析混合物。每個比色杯中含有750微升1mg/ml胰島素、3.3微升DTT并用水加至終體積為1ml。空白對照不含有硫氧還蛋白，樣品中含有不同含量的硫氧還蛋白(適用于分析的最低量為10微摩爾)。在650nm讀出光密度之前，樣品必須在室溫制備和培養至少20分鐘。
DTNB[5，5’-二硫-雙-(2-硝基苯甲酸)]分析-(Oblong等(1993)Biochemistry 327271-7277)。在本分析中硫氧還蛋白還原酶和NADPH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)用于還原硫氧還蛋白，而還原的硫氧還蛋白進一步還原DTNB。在412nm處監控光密度變化4分鐘。需要新鮮制備的DTNB溶液(100mM，于DMSO二甲基亞砜中)、NADPH(20mM于H2O中)和含有100mM Tris(pH8.0)的緩沖液、0.1mg/mlBSA。在比色杯中制備分析混合物。每個比色杯中含有10微升DTNB、10微升NADPH、5微克硫氧還蛋白、2微克擬南芥或大腸桿菌硫氧還蛋白還原酶并用緩沖液加至終體積為1ml。一旦加入硫氧還蛋白，立即顛倒混勻，并立即開始測定412nm處的光密度。這是一個慢反應。Y軸設置為0至0.5A。空白對照不含硫氧還蛋白。
實施例11農桿菌介導的玉米轉化轉化質粒和選擇標記將用于轉化的基因克隆至適于玉米轉化的載體上。使用了含有磷酸甘露糖異構酶(PMI)基因的載體，以允許用甘露糖來篩選轉基因細胞。
根癌農桿菌的制備含有植物轉化質粒的農桿菌株系LBA4404(pSB1)在YEPC固體培養基上生長(酵母提取物(5g/L)、蛋白胨(10g/L)、NaCl(5g/L)、CaCl2·2H2O(1.029g/L))，其中含有適當的抗生素(壯觀霉素(100mg/L)、四環素(10mg/L))，在28℃培養2-4天。將大約0.75×108的農桿菌懸浮于LS修飾的液體感染培養基，其中含有100μM乙酰丁香酮(acetosyringone)(Negrotto等(2000)Plant Cell Rep.，印刷中用0.1×磷酸修改)。在使用前在該培養基中將細菌預誘導0.5-2個小時。于660nm檢測細菌濃度，并將其光密度調整至大約0.75。
孵育將來自A188、Hi-II或A188×Hi-II的8-9天的未成熟胚切割，直接放入含有LS修飾的液體感染培養基的1.5ml離心管中，其中含有100μM乙酰丁香酮。總切割時間為30分鐘。將胚旋渦振蕩5秒，使其沉降下來，并去除感染培養基。加入新鮮的感染培養基。將離心管置于45℃水浴中5分鐘，使胚熱休克。去除感染培養基，代替為農桿菌溶液。將胚旋渦振蕩30秒，使其與細菌結合5分鐘。將細菌/胚溶液倒入固化的LS修飾的感染培養基，其中含有500μM乙酰丁香酮(Negrotto等，ibid用0.1×磷酸修改)。小心地將菌液吸走，并將胚轉移至平板的干凈部位。將胚盾片朝上放置，于22℃共培養2-3天。
轉化細胞的選擇和轉化植物的再生在共培養之后，將胚置于JMS培養基之上[Suttie等(1991)第三次國際植物生長和發育的分子生物學大會海報#905(3rDInternational Congress Molecular Biologyof Plant Growth and Development Poster#905)]，其中含有AgNO3和200mg/l替卡西林用于誘導愈傷組織。在所有隨后的培養基中均含有替卡西林。于28℃在暗處培養10天之后，已誘導出胚發生的愈傷組織。將愈傷組織轉移至不含有銀卻含有用于選擇的10g/L甘露糖和5g/L蔗糖的JMS培養基。在2-3周以后，將仍存活的愈傷組織轉移至新鮮的選擇培養基。再過2-3周，將仍存活的愈傷組織轉移至MSAK+PO4培養基(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15473-439附加有20g/L蔗糖、5g/L/甘露糖、ancimidol(0.25mg/L)、細胞分裂素(0.5mg/L)和KH2PO4(170mg/L))用于再生(28℃，暗處，10-14天)。將愈傷組織轉移至新鮮的MSAK+PO4培養基，并轉移至光下培養(16小時光/8小時黑暗)。在1周以后，將再生的苗轉移至不含激素的MS培養基，其中附加有20g/L蔗糖和5g/L/甘露糖。將長出根的苗轉移至MagentaTMGA-7試劑盒中，其中含有0.75離子強度的MS培養基，并添加有10ml/L的Plant Preservative MixtureTM和10g/L蔗糖用于進一步的生長。可對直接來自GA-7試劑盒的植物或轉移至土壤中的植物進行分析。
實施例12大豆子葉瞬時表達系統S3911 Novartis育種系中滅菌的種子在MS固體培養基上萌發6天，5個/平板，條件為16/8光周期、25℃。將子葉外植并切成1-2mm的小條。將來自一對子葉的小條放置成直徑為1-2cm的圓圈，其處于含MS培養基的培養皿的中央，該MS培養基中含有1mg/l BAP和0.5mg/l NAA。用PDS-100 Helium槍轟擊該組織，依照DuPont手冊。每個平板均通過1550psi裂口盤轟擊兩次。依據手冊制備帶有DNA的金微載體。每個大載體上帶有0.6μg選定的質粒DNA。將一個不銹鋼屏幕作為轟擊波的擋板。在轟擊后，將平板置回16/8光周期，25℃的條件下。第一次取材為48小時。
實施例13用pNOV 3401轉化的轉基因植物分析A.PCR從GA-7盒中的轉基因植物中選取材料。在96孔板用Gentra DNA提取試劑盒，依照廠家的說明書來提取DNA。使用Jumpstart RedtaqReadymix(Sigma)和引物Thiorodoxubi 1603(5’-GCGGTCGTTCATTCGTTCTA-3’(SEQ ID NO41))和引物Thiorodox 2364(5’-ACGTGCTTCA CGATGGTGTT-3’(SEQ ID NO42))，其終濃度均為2.5μM，來進行PCR反應。經PCR鑒定含有硫氧還蛋白基因的轉基因植物轉移至溫室中。
B.通過Northern印跡分析來自轉基因植物的硫氧還蛋白RNA通過Lagrimini等((1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847542-7546)描述的方法，從轉基因植物的葉和種子組織中提取總RNA。探針是由完整的水稻trx-h基因制備而來的。用BamHI-SacI消化質粒pNOV 3401得到一個327bp的片段，再經膠純化并通過LifeTechnologies Inc.的隨機引物標記試劑盒用32P α-CTP標記。
來自代表性轉基因植物的葉和種子RNA的Northern印跡結果顯示硫氧還蛋白mRNA在葉和種子組織中的表達。
C.來自轉基因植物的硫氧還蛋白蛋白質的分析玉米葉的蛋白質提取和western分析從每片葉子材料上打孔取下一個eppendorf蓋大的小圓。將該組織放入eppendorf管中并用干冰冷凍。用一個小杵在eppendorf管中研磨組織。向研碎的組織加入400微升100mM Tris(pH8.0)，樣品在室溫下離心30分鐘，取上清。所有樣品均使用3000MW截止的Centriconsi濃縮。每個樣品上樣12.5微升于16％Tris-甘氨酸(Novex，San Diego CA)微型膠，以Tris-甘氨酸-SDS(24mM Tris、52mM甘氨酸、1％十二烷基硫酸鈉)為電泳緩沖液，而后將蛋白質轉移至PVDF上。雜交膜用TBS-2％Tween(TBS-150mM NaCl、30mM Tris、pH10.2)在室溫封閉15分鐘后，與水稻硫氧還蛋白抗體(從山羊抗大豆硫氧還蛋白血清中經親和純化)溫育，濃度為1微克抗體/1微升TBS-0.5％Tween，在4℃反應過夜。將雜交膜用TBS-0.05％Tween洗三次，每次5分鐘，而后與HRP(辣根過氧化物酶)兔抗羊IgG(50納克抗體每微升TBS-0.05％Tween)，在室溫反應1小時，再用TBS-0.05％Tween洗，最后與supersignalwest femto化學發光底物(Pierce，Rockford，IL)在室溫反應5分鐘。再將雜交膜與底片放置，一起曝光30秒。
玉米種子的蛋白質提取和western分析將來自每個樣品的每個種子切成兩半，取一半在干冰中冷凍，并用研缽和杵將其研磨，加入1.5微升Tris(pH8.0)，在室溫旋轉孵育30分鐘。將樣品離心，并用10,000MW截止的Centricons將蛋白質提取物濃縮。每個樣品上樣12.5微升于16％Tris-甘氨酸(與葉子樣品的條件相同)。膠轉移至硝化纖維素上，TBS-2％Tween封閉15分鐘，與水稻硫氧還蛋白抗體(1微克抗體每微升TBS-0.5％Tween)在室溫孵育1.5小時，洗凈后與HRP兔抗羊IgG孵育，步驟如上所述。最后將雜交膜與supersignal westpico化學發光底物(Pierce，Rockford，IL)在室溫反應5分鐘。再將雜交膜與底片放置，一起曝光5分鐘。Western雜交結果顯示水稻硫氧還蛋白在葉和種子組織中的表達。Western印跡結果也顯示，與同上樣于膠上的對照水稻硫氧還蛋白相比，在轉基因植物中表達的水稻硫氧還蛋白具有預期的大小。
實施例14大腸桿菌中表達的重組硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶的酶活性大腸桿菌中表達的重組大豆硫氧還蛋白通過使用S-蛋白瓊脂糖的親和色譜來純化，并用凝血酶切割S-標記。在上述的胰島素還原分析中檢測該蛋白質。檢測4、20、40和80微克的親和純化的硫氧還蛋白(存在一種污染蛋白)。在31分鐘之后，在650nm下測量到了光密度的變化。
硫氧還蛋白(μg)650nm的OD值(31沉降速率(Δ分鐘之后)A650/min)0.0000.0000001.0010.0000322.0077.000253.0084.000274.0117.00038在NADPH硫氧還蛋白還原酶DTNB分析中測定了以下重組蛋白質具有S-標記的大豆硫氧還蛋白、不具有S-標記的大豆硫氧還蛋白、具有S-標記的水稻硫氧還蛋白、具有S-標記的小麥硫氧還蛋白和不具有S-標記的擬南芥硫氧還蛋白還原酶。在此分析中也使用大腸桿菌硫氧還蛋白還原酶(T-7915，Sigma，St.Louis，MO)。在4分鐘之內監控412nm處的光密度變化。
硫氧還蛋白硫氧還蛋白還原酶ΔA4120μl 1.5μl(≈0.5μg)0.06擬南芥30μl(≈12μg)大豆2.3μg大腸桿菌 0.33330μl(≈12μg)大豆1.5μl(≈0.5μg)0.42擬南芥30μl(≈6μg)大豆 2.3μg大腸桿菌 0.2030μl(≈15μg)水稻1.5μl(≈0.5μg)0.66擬南芥30μl(≈15μg)水稻2.3μg大腸桿菌 0.3030μl(≈0.6μg)小麥 2.3μg大腸桿菌 0.3030μl(≈0.6μg)小麥 1.5μl(≈0.5μg)0.08擬南芥30μl(≈1.2μg)小麥 1.5μl(≈0.5μg)0.08擬南芥擬南芥的硫氧還蛋白還原酶和大腸桿菌的硫氧還蛋白還原酶可還原具有或不具有S-標記的大豆硫氧還蛋白。擬南芥和大腸桿菌的硫氧還蛋白還原酶也可還原水稻硫氧還蛋白。小麥硫氧還蛋白可被大腸桿菌的硫氧還蛋白還原酶還原，而不能被擬南芥的硫氧還蛋白還原酶還原。
序列表序列表<110>Syngenta Participations AG<120>谷物加工方法和其中有用的轉基因植物<130>A-31383A<140>
<141>
<150>US 09/598747<151>2000-06-21<160>42<170>PatentIn Ver.2.2<210>1<211>85<212>PRT<213>詹氏甲烷球菌<400>1Met Ser Lys Val Lys Ile Glu Leu Phe Thr Ser Pro Met Cys Pro His1 5 10 15Cys Pro Ala Ala Lys Arg Val Val Glu Glu Val Ala Asn Glu Met Pro20 25 30Asp Ala Val Glu Val Glu Tyr Ile Asn Val Met Glu Asn Pro Gln Lys35 40 45Ala Met Glu Tyr Gly Ile Met Ala Val Pro Thr Ile Val Ile Asn Gly50 55 60Asp Val Glu Phe Ile Gly Ala Pro Thr Lys Glu Ala Leu Val Glu Ala65 70 75 80Ile Lys Lys Arg Leu85<210>2<211>119
<212>PRT<213>閃爍古生球菌<400>2Met Pro Met Val Arg Lys Ala Ala Phe Tyr Ala Ile Ala Val Ile Ser1 5 10 15Gly Val Leu Ala Ala Val Val Gly Asn Ala Leu Tyr His Asn Phe Asn20 25 30Ser Asp Leu Gly Ala Gln Ala Lys Ile Tyr Phe Phe Tyr Ser Asp Ser35 40 45Cys Pro His Cys Arg Glu Val Lys Pro Tyr Val Glu Glu Phe Ala Lys50 55 60Thr His Asn Leu Thr Trp Cys Asn Val Ala Glu Met Asp Ala Asn Cys65 70 75 80Ser Lys Ile Ala Gln Glu Phe Gly Ile Lys Tyr Val Pro Thr Leu Val85 90 95Ile Met Asp Glu Glu Ala His Val Phe Val Gly Ser Asp Glu Val Arg100 105 110Thr Ala Ile Glu Gly Met Lys115<210>3<211>93<212>PRT<213>閃爍古生球菌<400>3Met Val Phe Thr Ser Lys Tyr Cys Pro Tyr Cys Arg Ala Phe Glu Lys1 5 10 15Val Val Glu Arg Leu Met Gly Glu Leu Asn Gly Thr Val Glu Phe Glu20 25 30Val Val Asp Val Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ala Glu Lys Tyr Glu Val35 40 45Leu Met Leu Pro Thr Leu Val Leu Ala Asp Gly Asp Glu Val Leu Gly
50 55 60Gly Phe Met Gly Phe Ala Asp Tyr Lys Thr Ala Arg Glu Ala Ile Leu65 70 75 80Glu Gln Ile Ser Ala Phe Leu Lys Pro Asp Tyr Lys Asn85 90<210>4<211>134<212>PRT<213>閃爍古生球菌<400>4Met Asp Glu Leu Glu Leu Ile Arg Gln Lys Lys Leu Lys Glu Met Met1 5 10 15Gln Lys Met Ser Gly Glu Glu Lys Ala Arg Lys Val Leu Asp Ser Pro20 25 30Val Lys Leu Asn Ser Ser Asn Phe Asp Glu Thr Leu Lys Asn Asn Glu35 40 45Asn Val Val Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Met Pro Cys Lys Met50 55 60Ile Ala Pro Val Ile Glu Glu Leu Ala Lys Glu Tyr Ala Gly Lys Val65 70 75 80Val Phe Gly Lys Leu Asn Thr Asp Glu Asn Pro Thr Ile Ala Ala Arg85 90 95Tyr Gly Ile Ser Ala Ile Pro Thr Leu Ile Phe Phe Lys Lys Gly Lys100 105 110Pro Val Asp Gln Leu Val Gly Ala Met Pro Lys Ser Glu Leu Lys Arg115 120 125Trp Val Gln Arg Asn Leu130<210>5<211>105
<212>PRT<213>閃爍古生球菌<400>5Met Glu Arg Leu Asn Ser Glu Arg Phe Arg Glu Val Ile Gln Ser Asp1 5 10 15Lys Leu Val Val Val Asp Phe Tyr Ala Asp Trp Cys Met Pro Cys Arg20 25 30Tyr Ile Ser Pro Ile Leu Glu Lys Leu Ser Lys Glu Tyr Asn Gly Glu35 40 45Val Glu Phe Tyr Lys Leu Asn Val Asp Glu Asn Gln Asp Val Ala Phe50 55 60Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Pro Thr Val Leu Phe Phe Arg Asn Gly65 70 75 80Lys Val Val Gly Gly Phe Ile Gly Ala Met Pro Glu Ser Ala Val Arg85 90 95Ala Glu Ile Glu Lys Ala Leu Gly Ala100 105<210>6<211>301<212>PRT<213>詹氏甲烷球菌<400>6Met Ile His Asp Thr Ile Ile Ile Gly Ala Gly Pro Gly Gly Leu Thr1 5 10 15Ala Gly Ile Tyr Ala Met Arg Gly Lys Leu Asn Ala Leu Cys Ile Glu20 25 30Lys Glu Asn Ala Gly Gly Arg Ile Ala Glu Ala Gly Ile Val Glu Asn35 40 45Tyr Pro Gly Phe Glu Glu Ile Arg Gly Tyr Glu Leu Ala Glu Lys Phe50 55 60Lys Asn His Ala Glu Lys Phe Lys Leu Pro Ile Ile Tyr Asp Glu Val
65 70 75 80Ile Lys Ile Glu Thr Lys Glu Arg Pro Phe Lys Val Ile Thr Lys Asn85 90 95Ser Glu Tyr Leu Thr Lys Thr Ile Val Ile Ala Thr Gly Thr Lys Pro100 105 110Lys Lys Leu Gly Leu Asn Glu Asp Lys Phe Ile Gly Arg Gly Ile Ser115 120 125Tyr Cys Thr Met Cys Asp Ala Phe Phe Tyr Leu Asn Lys Glu Val Ile130 135 140Val Ile Gly Arg Asp Thr Pro Ala Ile Met Ser Ala Ile Asn Leu Lys145 150 155 160Asp Ile Ala Lys Lys Val Ile Val Ile Thr Asp Lys Ser Glu Leu Lys165 170 175Ala Ala Glu Ser Ile Met Leu Asp Lys Leu Lys Glu Ala Asn Asn Val180 185 190Glu Ile Ile Tyr Asn Ala Lys Pro Leu Glu Ile Val Gly Glu Glu Arg195 200 205Ala Glu Gly Val Lys Ile Ser Val Asn Gly Lys Glu Glu Ile Ile Lys210 215 220Ala Asp Gly Ile Phe Ile Ser Leu Gly His Val Pro Asn Thr Glu Phe225 230 235 240Leu Lys Asp Ser Gly Ile Glu Leu Asp Lys Lys Gly Phe Ile Lys Thr245 250 255Asp Glu Asn Cys Arg Thr Asn Ile Asp Gly Ile Tyr Ala Val Gly Asp260 265 270Val Arg Gly Gly Val Met Gln Val Ala Lys Ala Val Gly Asp Gly Cys275 280 285Val Ala Met Ala Asn Ile Ile Lys Tyr Leu Gln Lys Leu290 295 300
<210>7<211>300<212>PRT<213>閃爍古生球菌<400>7Met Tyr Asp Val Ala Ile Ile Gly Gly Gly Pro Ala Gly Leu Thr Ala1 5 10 15Ala Leu Tyr Ser Ala Arg Tyr Gly Leu Lys Thr Val Phe Phe Glu Thr20 25 30Val Asp Pro Val Ser Gln Leu Ser Leu Ala Ala Lys Ile Glu Asn Tyr35 40 45Pro Gly Phe Glu Gly Ser Gly Met Glu Leu Leu Glu Lys Met Lys Glu50 55 60Gln Ala Val Lys Ala Gly Ala Glu Trp Lys Leu Glu Lys Val Glu Arg65 70 75 80Val Glu Arg Asn Gly Glu Thr Phe Thr Val Ile Ala Glu Gly Gly Glu85 90 95Tyr Glu Ala Lys Ala Ile Ile Val Ala Thr Gly Gly Lys His Lys Glu100 105 110Ala Gly Ile Glu Gly Glu Ser Ala Phe Ile Gly Arg Gly Val Ser Tyr115 120 125Cys Ala Thr Cys Asp Gly Asn Phe Phe Arg Gly Lys Lys Val Ile Val130 135 140Tyr Gly Ser Gly Lys Glu Ala Ile Glu Asp Ala Ile Tyr Leu His Asp145 150 155 160Ile Gly Cys Glu Val Thr Ile Val Ser Arg Thr Pro Ser Phe Arg Ala165 170 175Glu Lys Ala Leu Val Glu Glu Val Glu Lys Arg Gly Ile Pro Val His180 185 190Tyr Ser Thr Thr Ile Arg Lys Ile Ile Gly Ser Gly Lys Val Glu Lys195 200 205
Val Val Ala Tyr Asn Arg Glu Lys Lys Glu Glu Phe Glu Ile Glu Ala210 215 220Asp Gly Ile Phe Val Ala Ile Gly Met Arg Pro Ala Thr Asp Val Val225 230 235 240Ala Glu Leu Gly Val Glu Arg Asp Ser Met Gly Tyr Ile Lys Val Asp245 250 255Lys Glu Gln Arg Thr Asn Val Glu Gly Val Phe Ala Ala Gly Asp Cys260 265 270Cys Asp Asn Pro Leu Lys Gln Val Val Thr Ala Cys Gly Asp Gly Ala275 280 285Val Ala Ala Tyr Ser Ala Tyr Lys Tyr Leu Thr Ser290 295 300<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD109)<400>8ggatccacca tggccgccga ggag24<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD110)<400>9gagctcttag gcagaagcag atg 23<210>10<211>22
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD102)<400>10ggatccacca tggcggcgtc gg 22<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD103)<400>11gagctcttac tgggccgcgt gt 22<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD124A)<400>12gagctcttag gcgctagcag atg 23<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD125A)<400>13ggatccacca gcgctgccga 20
<210>14<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD126)<400>14gatccaccat gagggtgttg ctcgttgccc tcgctctcct ggctctcgct gcgagcgcca 60ccagc 65<210>15<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD127)<400>15gctggtggcg ctcgcagcga gagccaggag agcgagggca acgagcaaca ccctcatggt 60g 61<210>16<211>67<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD128)<400>16ctagcgctct gcagcagccg actccatgcc cctacgctgc tgccggcggt gtcccccact 60gagagct 67<210>17<211>59<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物NMD129)<400>17ctcagtgggg gacaccgccg gcagcagcgt aggggcatgg agtcggctgc tgcagagcg 59<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物STRF1A)<400>18ggatccacca tgaacggcct ggag 24<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物STRF1B)<400>19ctcgagaagt ccaccttggt cac 23<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物STRF2A)<400>20ctcgagcaag ccgttcaa 18<210>21<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物STRF2B)<400>21gacgtcgatc ttcgggttgg a 21<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物STR3A)<400>22cgacgtcatc tggaactcct 20<210>23<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物STR3B)<400>23gagctcagat ctagtcggac ttg 23<210>24<211>1021<212>DNA<213>鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)<400>24ggatccacca tgaacggcct ggagactcac aacacccgcc tctgcatcgt tggctccggc 60ccggctgccc acaccgccgc catctacgcc gcccgcgccg agctgaagcc gctcctcttc 120gagggctgga tggccaacga catcgccccg ggcggccagc tcaccaccac caccgacgtg 180gagaacttcc ccggcttccc ggagggcatc ctcggcgtgg agctgaccga caagttccgc 240aagcagagcg agcgcttcgg caccaccatc ttcaccgaga ccgtgaccaa ggtggacttc 300
tcgagcaagc cgttcaagct cttcaccgac tccaaggcca tcctcgccga cgccgtgatc 360ctcgccatcg gcgccgtggc caagtggctc tccttcgtgg gctccggcga ggtgctcggc 420ggcctctgga accgcggcat ctccgcctgc gctgtgtgcg acggcgccgc cccgatcttc 480cgcaacaagc cgctcgctgt gatcggtggc ggagacagcg cgatggagga ggccaacttc 540ctcaccaagt acggctccaa ggtgtacatc atcgaccgcc gcgacgcctt ccgcgcctcc 600aagatcatgc agcagcgcgc cctctccaac ccgaagatcg acgtcatctg gaactcctcc 660gtggtggagg cctacggcga cggcgagcgc gacgtgctcg gcggcctcaa ggtgaagaac 720gtggtgaccg gcgacgtgtc cgacctcaag gtgtccggcc tcttcttcgc catcggccac 780gagccggcca ccaagttcct cgacggcggc gtggagctgg actccgacgg ctacgtggtg 840accaagccgg gcaccaccca gacctccgtg cctggcgtgt tcgccgccgg cgacgtgcag 900gacaagaagt accgccaggc catcaccgcc gccggcaccg gctgcatggc cgccctcgac 960gccgagcact acctccagga gatcggctcc cagcagggca agtccgacta gatctgagct 1020c 1021<210>25<211>333<212>PRT<213>鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)<400>25Met Asn Gly Leu Glu Thr His Asn Thr Arg Leu Cys Ile Val Gly Ser1 5 10 15Gly Pro Ala Ala His Thr Ala Ala Ile Tyr Ala Ala Arg Ala Glu Leu20 25 30Lys Pro Leu Leu Phe Glu Gly Trp Met Ala Asn Asp Ile Ala Pro Gly35 40 45Gly Gln Leu Thr Thr Thr Thr Asp Val Glu Asn Phe Pro Gly Phe Pro50 55 60Glu Gly Ile Leu Gly Val Glu Leu Thr Asp Lys Phe Arg Lys Gln Ser65 70 75 80Glu Arg Phe Gly Thr Thr Ile Phe Thr Glu Thr Val Thr Lys Val Asp85 90 95Phe Ser Ser Lys Pro Phe Lys Leu Phe Thr Asp Ser Lys Ala Ile Leu100 105 110Ala Asp Ala Val Ile Leu Ala Ile Gly Ala Val Ala Lys Trp Leu Ser115 120 125
Phe Val Gly Ser Gly Glu Val Leu Gly Gly Leu Trp Asn Arg Gly Ile130 135 140Ser Ala Cys Ala Val Cys Asp Gly Ala Ala Pro Ile Phe Arg Asn Lys145 150 155 160Pro Leu Ala Val Ile Gly Gly Gly Asp Ser Ala Met Glu Glu Ala Asn165 170 175Phe Leu Thr Lys Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Ile Ile Asp Arg Arg Asp180 185 190Ala Phe Arg Ala Ser Lys Ile Met Gln Gln Arg Ala Leu Ser Asn Pro195 200 205Lys Ile Asp Val Ile Trp Asn Ser Ser Val Val Glu Ala Tyr Gly Asp210 215 220Gly Glu Arg Asp Val Leu Gly Gly Leu Lys Val Lys Asn Val Val Thr225 230 235 240Gly Asp Val Ser Asp Leu Lys Val Ser Gly Leu Phe Phe Ala Ile Gly245 250 255His Glu Pro Ala Thr Lys Phe Leu Asp Gly Gly Val Glu Leu Asp Ser260 265 270Asp Gly Tyr Val Val Thr Lys Pro Gly Thr Thr Gln Thr Ser Val Pro275 280 285Gly Val Phe Ala Ala Gly Asp Val Gln Asp Lys Lys Tyr Arg Gln Ala290 295 300Ile Thr Ala Ala Gly Thr Gly Cys Met Ala Ala Leu Asp Ala Glu His305 310 315 320Tyr Leu Gln Glu Ile Gly Ser Gln Gln Gly Lys Ser Asp325 330<210>26<211>1560<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)
<400>26aytcagatat gttatccaga ttctaaatgt gctatagggg wtaaatgtgt gttcatatgg 60gagatatatc agtttcagtt tttttggaag gtgtttatag gagttmggcg cgttttaaar 120ktgtggtatg catcgtgttg tgarttgttk gtgtgttycy ttaaaaaaaa awttgccatt 180tgtcaattat tgtggaattt ctgcaacttg ttgtccmaag kaaaaggaaa atagtttcgg 240tcaacaactc aacatccatc tgggggtatg accgaccgag cgcggtggcc gttgattggc 300tcgtcgcctc ctcccttctc ggtctgacgg tctgaccagt gccgggtagg aagcgtaatt 360ttgaggagag actccgaccc gcgccgccgc cgccgcagcc aagccatgga gggatccgcc 420ggggcgccgc tccgcacgcg cctgtgcatc atcgggagcg ggccgtcggc gcacacggcg 480gcgatctacg ccgcccgcgc ggagctcaag cccgtgctct tcgagggctg gctcgccaac 540gacatcgcgg cggggggcca gctcaccacc accaccgacg tcgagaactt cccggggttc 600cccgagggga tcctcggcgg cgagctcatg gatcggtgcc gcgcccagtc cctccggttc 660ggcaccagca tcatctccga gaccgtcacc gcggtcgact tctccgcccg ccccttccgc 720gtcgcctccg actccaccac cgtgctcgcc gacgccgtcg tcgtcgccac cggcgccgtc 780gcccggcgac tccacttcgc cggctccgac gcctactgga accgcggcat ctcagcctgc 840gccgtctgcg acggggccgc cccaatcttc aggaacaaac ccatcgccgt catcggcggc 900ggcgactccg ccatggagga gtccaacttc ctcaccaagt acggctccca tgtgtacatc 960atccaccgcc gcaacacctt ccgcgcctcc aagatcatgc aggccagggc gttgtcaaac 1020cccaagatcc aggttttctg ggactctgag gtcgtcgagg cctacggcgg cgagggtgga 1080ggtccattgg ctggtgtcaa ggtgaagaac ttggttactg ggaagatctc cgaccttcag 1140gtgtccggtc tcttcttcgc catcggacat gaaccggcga cgaagtttct cggcgggcag 1200cttgagctcg atgctgatgg gtatgtggcc accaagccag gctccacgca caccagtgtg 1260aagggggtct ttgctgctgg ggatgtgcag gacaagaagt atcgccaggc tattactgcc 1320gctggatcag gtttgtgaat tgatgatttt tcaggttacc tgtgattaat ttttttctgc 1380actttcttag agatcagtcg cttcatgggt tgctatttgc tagtgcgaat tgcaatagaa 1440attgttcagg gcttgagtat gtagtgagcg aatgatgatg gtcaaaatta gaaccttttt 1500aagctatcat agagttaacg tgtttgagtt tctgaaataa gtgctttcat tatgtatcta 1560<210>27<211>310<212>PRT<213>稻(Oryza satiya)<400>27Met Glu Gly Ser Ala Gly Ala Pro Leu Arg Thr Arg Leu Cys Ile Ile1 5 10 15Gly Ser Gly Pro Ser Ala His Thr Ala Ala Ile Tyr Ala Ala Arg Ala20 25 30Glu Leu Lys Pro Val Leu Phe Glu Gly Trp Leu Ala Asn Asp Ile Ala35 40 45Ala Gly Gly Gln Leu Thr Thr Thr Thr Asp Val Glu Asn Phe Pro Gly
50 55 60Phe Pro Glu Gly Ile Leu Gly Gly Glu Leu Met Asp Arg Cys Arg Ala65 70 75 80Gln Ser Leu Arg Phe Gly Thr Ser Ile Ile Ser Glu Thr Val Thr Ala85 90 95Val Asp Phe Ser Ala Arg Pro Phe Arg Val Ala Ser Asp Ser Thr Thr100 105 110Val Leu Ala Asp Ala Val Val Val Ala Thr Gly Ala Val Ala Arg Arg115 120 125Leu His Phe Ala Gly Ser Asp Ala Tyr Trp Asn Arg Gly Ile Ser Ala130 135 140Cys Ala Val Cys Asp Gly Ala Ala Pro Ile Phe Arg Asn Lys Pro Ile145 150 155 160Ala Val Ile Gly Gly Gly Asp Ser Ala Met Glu Glu Ser Asn Phe Leu165 170 175Thr Lys Tyr Gly Ser His Val Tyr Ile Ile His Arg Arg Asn Thr Phe180 185 190Arg Ala Ser Lys Ile Met Gln Ala Arg Ala Leu Ser Asn Pro Lys Ile195 200 205Gln Val Phe Trp Asp Ser Glu Val Val Glu Ala Tyr Gly Gly Glu Gly210 215 220Gly Gly Pro Leu Ala Gly Val Lys Val Lys Asn Leu Val Thr Gly Lys225 230 235 240Ile Ser Asp Leu Gln Val Ser Gly Leu Phe Phe Ala Ile Gly His Glu245 250 255Pro Ala Thr Lys Phe Leu Gly Gly Gln Leu Glu Leu Asp Ala Asp Gly260 265 270Tyr Val Ala Thr Lys Pro Gly Ser Thr His Thr Ser Val Lys Gly Val275 280 285Phe Ala Ala Gly Asp Val Gln Asp Lys Lys Tyr Arg Gln Ala Ile Thr
290 295 300Ala Ala Gly Ser Gly Leu305 310<210>28<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P9)<400>28gactaagctt acaattatta tatcaaaatg gc 32<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P10)<400>29gcttttccca atacgcaatg c 21<210>30<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P4)<400>30gactagcgct gacagaaact gatgctagga a 31<210>31<211>40<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P1)<400>31cgtaggatcc accatggctg aagaagaggg tcaggttgtc 40<210>32<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P2)<400>32cgtagagctc tcaagaagaa gcagcagcag cagat 35<210>33<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P5)<400>33gactagcgct gaagagggtc aggttgtcg 29<210>34<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P12)<400>34cagtaggctt aaggaggttg caacgag 27
<210>35<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P11)<400>35cagtcagctg aagagggtca ggttgtc 27<210>36<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(oligo P27)<400>36ctaggagctc tacatggtgt ccaccagcag30<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物P28)<400>37gcacggcttg gtggtgaatc c 21<210>38<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物P29)<400>38
ctcattctgg tccatcaatg tc22<210>39<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物P26)<400>39gactgtcgac tcaatcactc ttaccttgct gag33<210>40<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物P31)<400>40gactggatcc aatggtctcg aaactcacaa c 31<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物thiorodoxubi 1603)<400>41gcggtcgttc attcgttcta 20<210>42<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸(引物thiorodox 2364)<400>42acgtgcttca cgatggtgtt 20
權利要求
1.在研磨加工法中分離谷物淀粉和蛋白質組分的方法，包括(a)在高溫下，在添加的硫氧還蛋白還原酶存在的情況下，浸泡谷物；和(b)分離谷物中的淀粉和蛋白質組分，其中硫氧還蛋白還原酶為真核硫氧還蛋白還原酶。
2.權利要求1的方法，其中谷物包括從表達硫氧還蛋白還原酶的轉基因植物而來的谷物。
3.權利要求2的方法，其中植物是玉米。
4.含有編碼真核硫氧還蛋白還原酶的異源DNA的轉基因植物，其中該異源DNA穩定地整合入上述轉基因植物的核或質體基因組。
5.權利要求4的植物，其中該植物是玉米或大豆。
6.權利要求4的植物，其中硫氧還蛋白還原酶包含SEQ ID NO25或SEQ ID NO27。
7.含有真核硫氧還蛋白還原酶的編碼區的嵌合表達盒，其中上述編碼區與能在植物中行使功能的啟動子和終止序列有效連接。
8.權利要求7的嵌合表達盒，其中硫氧還蛋白還原酶包含SEQID NO25或SEQ ID NO27。
9.一種生產能表達增加的真核硫氧還蛋白還原酶表達量的谷物的方法，包括用權利要求7的表達盒轉化植物。
10.一種生產能表達增加的真核硫氧還蛋白還原酶表達量的谷物的方法，包括用權利要求8的表達盒轉化植物。
11.一種生產能表達增加的硫氧還蛋白還原酶表達量的谷物的方法，包括用含有異源表達盒的第二種植物的花粉給含有異源表達盒的第一種植物授粉，并從如此授粉的植物中回收谷物，其中第一種植物含有的異源表達盒包含有效連接于編碼真核硫氧還蛋白還原酶的DNA序列上的反式激活蛋白介導的啟動子，第二種植物含有的異源表達盒包含有效連接于編碼反式激活蛋白的DNA序列上的啟動子，該反式激活蛋白能調控上述反式激活蛋白介導的啟動子。
12.一種包含SEQ ID NO24或SEQ ID NO26的分離的核酸分子。
13.一種包含在植物中具有活性的啟動子的嵌合基因，并且該啟動子有效連接于權利要求12的核酸分子上。
14.含有權利要求13的嵌合基因的重組載體。
15.含有權利要求13的嵌合基因的轉基因宿主細胞。
16.根據權利要求15的轉基因宿主細胞，其為轉基因植物細胞。
17.含有權利要求16的轉基因植物細胞的轉基因植物。
18.權利要求17的轉基因植物，其為玉米或大豆。
19.根據權利要求17的轉基因植物的種子，含有權利要求13中的嵌合基因。
全文摘要
本發明提供了加工谷物(例如玉米和大豆)的新方法，通過使用硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶來提高淀粉和蛋白質的可提取性和回收量。本發明進一步提供了表達熱穩定硫氧還蛋白和/或硫氧還蛋白還原酶的新的轉基因植物。
文檔編號C12N15/53GK1606627SQ01811532
公開日2005年4月13日 申請日期2001年6月19日 優先權日2000年6月21日
發明者M·B·拉納翰, N·M·德賽, P·Y·伽斯達斯卡 申請人:辛根塔參與股份公司