肉堿和氨基酸的富馬酸復鹽以及含有該鹽的食品添加劑、飲食添加劑和藥物的制作方法

專利名稱：肉堿和氨基酸的富馬酸復鹽以及含有該鹽的食品添加劑、飲食添加劑和藥物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一個穩定的不吸潮的“肉堿”和氨基酸的富馬酸復鹽(在下文稱做“富馬酸復鹽”)，其中的“肉堿”指L-肉堿或異戊酰L-肉堿。本發明也涉及含有該富馬酸復鹽的食品添加劑，飲食添加劑，營養制品和藥物。
富馬酸[(E)-2-丁烯二酸]在營養和醫療兩個方面都顯示出令人感興趣的應用。
富馬酸可以在飲料和發酵粉的制備中用作酒石酸(由于具有輕瀉的作用，酒石酸會帶來令人不快的腸胃副作用)的替代品，也可以用作果汁飲料中檸檬酸的替代品。
富馬酸保護心臟的作用已經在灌注的大鼠心臟(La Plante等人，“灌注的大鼠心臟中富馬酸鹽的作用及代謝一項13C同位素研究(Effects and Metabolism of fumarate in the perfused rat heartA13C mass isotopomer study)”，Am.J.Physiol.272E74-E82，1997)及不成熟的心肌中(Pearl等人，“富含富馬酸鹽的血液性心臟麻痹導致了不成熟的心肌功能的完全恢復(Fumarate enrichedblood cardioplegia results in complete functional recovery ofimmature myocardium)”，Ann.Thorac.Surg.571636-41，1993)進行了估定。
此外，富馬酸是一種“藥理學上可接受的酸”事實上其鹽類是在“FDA批準的商業上上市的鹽類”的列表中的，該列表發表在如藥物科學雜志(Journal of Pharmaceutical Sciences，Vol.66，No.1，(1977)pages 1-19)上。
將藥物轉化為各自藥理學可接受的鹽形式是一種廣為采用的手段，以優化藥物的施用形式或某些性質，如穩定性、吸水性、流動性等。
L-肉堿和異戊酰L-肉堿的富馬酸酸性鹽均為已知化合物。(富馬酸是一種二羧酸在前述的富馬酸酸性鹽中只有其中的一個羧基基團參與了鹽的生成。)在美國第4,602,039號專利中已經揭示了L-肉堿富馬酸酸性鹽的制備及理化性質，該鹽的開發是為了解決因L-肉堿內鹽的吸潮性而帶來的貯存及加工的復雜問題。事實上，L-肉堿的富馬酸酸性鹽非常穩定，不引起腸胃的副作用，并且顯示了甚至超過L-肉堿的酒石酸鹽的抗吸潮性，后者也是一種開發來克服L-肉堿吸水性的更不容易潮解的鹽。
然而，酒石酸鹽具有一有利條件，即它的兩個羧基都與L-肉堿形成了鹽，因而含有高百分比的L-肉堿(68％對58％)。
異戊酰L-肉堿的富馬酸酸性鹽也是一種對潮濕具有相當大抗性的穩定化合物，其制備如美國第5,227,518號專利所述。
到目前為止，使其中富馬酸酸性鹽的另一個羧基與L-肉堿或異戊酰L-肉堿形成了鹽的富馬酸酸性鹽的自由羧基也形成鹽的每一次努力都失敗了。例如，制備L-肉堿的富馬酸鹽(即一種具有高百分比L-肉堿有利條件的中性鹽，與酒石酸鹽相比約73.5％對68％，與富馬酸酸性鹽相比約為73.5％對58％)的嘗試結果得到了一種很可能由L-肉堿的富馬酸酸性鹽和L-肉堿內鹽混和組成的高吸水性物質。就是后一種鹽使得終產物整體具有了高的吸水性。
使富馬酸酸性鹽的自由羧基基團與烷酰基L-肉堿，如乙酰L-肉堿和丙酰L-肉堿形成鹽的嘗試也失敗了。
本發明的一個目的是提供一種穩定而不潮解的富馬酸復鹽，其中富馬酸的一個羧基基團與L-肉堿或異戊酰L-肉堿形成鹽，而另一個羧基也與一種化合物形成鹽，該化合物具有有用的營養、飲食及醫療性質。
因此，很明顯本發明中鹽的效用不僅在于其不潮解和高穩定性的方面，還在于其兩個陽離子部分一起對鹽營養的、能量的、和/或醫療的功效有貢獻。因而，這些新鹽類前述的功效就不只歸功于鹽中“肉堿”的部分。
通過L-肉堿或異戊酰L-肉堿和氨基酸形成的富馬酸復鹽實現了前述的目的，該復鹽分子式為(I) 其中R是氫或異戊酰；[A+]是從肌酸、鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸和組氨酸(hystidine)中選擇出來的一種帶正電的氨基酸。
應該認為本發明明確地包括具有分子式(I)的如下化合物-L-肉堿和肌酸的富馬酸鹽；-異戊酰L-肉堿和肌酸的富馬酸鹽；-L-肉堿和鳥氨酸的富馬酸鹽；-異戊酰L-肉堿和鳥氨酸的富馬酸鹽；-L-肉堿和賴氨酸的富馬酸鹽；-異戊酰L-肉堿和賴氨酸的富馬酸鹽；-L-肉堿和精氨酸的富馬酸鹽；-異戊酰L-肉堿和精氨酸的富馬酸鹽；-L-肉堿和組氨酸的富馬酸鹽；-異戊酰L-肉堿和組氨酸的富馬酸鹽；賴氨酸、精氨酸和組氨酸是在蛋白質中出現的氨基酸，即它們是可以通過有控制地水解天然蛋白質而得到的二十種氨基酸中的三種(例如，見J.Dayid Rawn，《生物化學》(Biochemistry)，第3章“氨基酸及蛋白質的一級結構”(Amino acids and the primarystructure of proteins)；McGraw-Hill，1990)。
盡管要大體上闡明氨基酸的營養和醫療功效要參考到目前為止在這方面發表的極大量的文獻(例如，見F.Fidanza和G.Liguori，Nutrizione umana，Chapter 3“Le proteine”，Casa EditriceLibraria Idelson，1995；以及I.Goldberg(Ed.)，《功能性食物》(Functional Foods)，第12章，“氨基酸、肽和蛋白質(Amino acids，peptides and proteins)”Chapman & Hall Inc.1994)，考慮到肌酸和鳥氨酸特殊的生理功能，相信簡單地討論一下兩者是很有用的。
肌酸是在脊椎動物的骨骼肌組織中相當大量存在的一種氨基酸，其中約2/3以磷酸肌酸形式存在。
肌酸主要在肝臟和腎臟中自三種氨基酸生物合成即甘氨酸提供碳骨架，精氨酸釋放脒基，以及甲硫氨酸釋放甲基。肌酸與尿以肌酸酐形式分泌。由于主要存在于肉類中，因而從食物中可以得到肌酸。然而，為了每天獲取10克肌酸，應該食用2.5千克肉。外源的供應和內源的生物合成應該補償每天由肌酸轉化為肌酸酐的損失，這個量對于一個70千克的男性估計約為2克。
肌酸的生理功能非常重要它通過可逆地吸收ATP的磷酸基團，主要在骨骼肌里，但也在腦、肝臟和腎臟里，充當高能磷酸基團的貯藏所。這一反應極其重要，這是因為在超過一個非常有限的閾值之后ATP就不能在組織中貯存。就是磷酸肌酸提供了磷酸基團，它在組織中的量為ATP的5倍。在一次中度疲倦的體育運動之后，骨骼肌中磷酸肌酸比ATP降低相應更多的量，這顯示當ATP脫磷酸化時，磷酸肌酸使得ADP重新磷酸化。
當ATP代謝合成的速率超過ATP使用速率時，將導致磷酸肌酸的形成。因此，磷酸肌酸是即時可用能量的貯藏所，適合于在代謝磷酸化過程中使超過ATP合成速率的能量需求平衡。
由于肌酸僅當其攝入伴隨持久的體育鍛煉時才可以增加骨骼肌肉系統，因此獲得肌酸的主要為運動員和運動家。肌酸的攝入導致脂肪的減少，但它可以使骨骼肌加強。最近研究表明同時攝入肌酸和糖類能促進肌酸的效果，這是因為單糖刺激的胰島素的產生在使肌酸轉運至肌肉細胞中起作用。
鳥氨酸是一種非蛋白源氨基酸，是賴氨酸的一種低級同系物，它是尿素生物合成循環的一個重要中間物，其中它由精氨酸轉胍基作用而生成。鳥氨酸也可以轉化為谷氨酸。
具有分子式(I)的富馬酸鹽完全實現了本發明的目的，其原因在于它們不僅是穩定且不潮解的化合物，這使得它們很容易制成在營養制品、營養及飲食添加劑中優選的固體形式，還在于它們在單個鹽分子中組合了“肉堿”和前述的氨基酸的互補的生理活性。
例如，那些在單個化合物中協同性組合了肌酸和“肉堿”的富馬酸鹽一方面刺激肌細胞中能量的產生，尤其是在I型肌纖維中，從而使得重要的能量載體(脂肪酸)進入線粒體；另一方面，它還可以刺激通過細胞呼吸(氧化磷酸化)形成的ATP離開同樣的細胞器。該ATP為肌肉收縮提供了需要的機械能。
下列非限制性實施例闡明了本發明中一些化合物的制備及理化性質。
實施例1L-肉堿和肌酸的富馬酸鹽(BS/231) C15H27N4O9分子量407.3514.9g(0.1摩爾)肌酸一水合物與16.1g(0.1摩爾)L-肉堿內鹽溶于500mL水中。
在所得的溶液里不斷攪動加入11.6g(0.1摩爾)富馬酸。待完全溶解后加入異丁醇，然后混合物于40℃在真空中蒸餾。所得殘余物用丙酮吸收，將混合物攪拌數小時。
然后將混合物在真空中過濾，將所得的固體在一個恒溫烤箱中30℃干燥過夜。得到了40.5g的L-肉堿和肌酸的富馬酸鹽，該鹽為一種已證明是不潮解的和味道舒適的白色結晶固體。
產率96％。
m.p. ＝134℃(dec.)K.F. ＝0.7％[α]20D＝-10.7(c＝1％ H2O)pH ＝5.5(c＝1％ H2O)比例L-肉堿 40％肌酸 32％富馬酸 28％元素分析 C％H％ N％計算值 44.22 6.67 13.75測量值 44.01 6.59 13.68NMRD2Oδ＝6.6(2H，s， )；4.6-4.4(1H，m， )；3.9(2H，s，N-CH2-COOH)；3.4-3.3(2H，d，N-CH2-CH)；3.2(9H，s，CH3)3-N)；2.9(3H，s，N-CH3)；2.5-2.4(2H，d，CH2-COOH)HPLC柱 Hypersil APS-2(5μm)200×4.6溫度＝30℃流動相 CH3CN/H2O+0.05M KH2PO4/CH3CN(65-35v/v)pH 4.7，用磷酸流動速度0.7mL/minRt＝ 富馬酸12.5；肌酸7.4；L-肉堿10.8。
實施例2異戊酰L-肉堿和肌酸的富馬酸鹽(BS/232) C20H35N4O10分子量49114.9g(0.1摩爾)肌酸一水合物與24.5g(0.1摩爾)異戊酰L-肉堿內鹽溶于500mL水中。
在所得的溶液里不斷攪動加入11.6g(0.1摩爾)富馬酸。待完全溶解后加入異丁醇，然后混合物于40℃在真空中蒸餾。所得殘余物用丙酮吸收，將混合物攪拌數小時。
然后將混合物在真空中過濾，將所得的固體在一個恒溫烤箱中30℃干燥過夜。得到了47.2g的異戊酰L-肉堿和肌酸的富馬酸鹽，該鹽為一種已證明是不潮解且可在95％乙醇中結晶的白色結晶固體。
產率 97％m.p.＝125-127℃(dec.)K.F.＝0.5％[α]20D＝-8(c＝1％H2O)pH ＝5.3(c＝1％H2O)元素分析 C％ H％ N％計算值 48.9 7.13 11.4測量值 48.7 7.11 10.98NMRD2Oδ＝6.6(2H，s， )；4.6-4.4(1H，m， )；3.9(2H，s，N-CH2-COOH)；3.4-3.3(2H，d，N-CH2-CH)；3.2(9H，s，(CH3)3-N)；2.9(3H，s，N-CH3)；2.5-2.4(2H，d，CH2-COOH)；2.4-2.2(2H，d，CH2- )；2.2-1.9(1H，m， )；1-0.8(6H，d， )
HPLC柱 Hypersil APS-2(5μm)200×4.6溫度＝30℃流動相 CH3CN/H2O+0.05M KH2PO4/CH3CN(65-35v/v)pH 4.7，用磷酸流動速度0.7mL/minλ 205nmRt＝ 富馬酸12.5；肌酸7.4；異戊酰L-肉堿6.3。
比例異戊酰L-肉堿 50％肌酸 27％富馬酸 23％。
實施例3L-肉堿和L-鳥氨酸的富馬酸鹽(BS/238) 分子量4098g(0.05摩爾)L-肉堿內鹽，5.8g(0.05摩爾)富馬酸和6.6gL-鳥氨酸在60℃溶于7.5L水中，將所得的透明粘稠物質在劇烈的機械攪動中緩緩倒入丙酮溶液中(800mL)。將沉淀的固體過濾出來并干燥。得到了17g白色不潮解的標題中所述的化合物固體。
產率 92％m.p.＝185-187℃(dec.)K.F.＝0.9％20D＝-7.5(c＝1％ H2O)pH ＝4.7(c＝1％ H2O)NMRD2O＝6.6(2H，s，CH＝CH)；4.6-4.4(1H，m，-CH-)；3.8-3.6(1H，t，-CH-NH2)；3.4-3.3(2H，d，N-CH2)；3.2(9H，s，(CH3)3)；3-2.9(2H，t，CH2-NH2)；2.6-2.5(2H，d，-CH2-COOH)；2-1.8(2H，m，CH2-CH2-NH2)；1.8-1.6(2H，q，CH2-CH2-CH).
HPLC柱 Hypersil APS-2(5nm)200×4.6溫度＝30℃流動相 CH3CN/H2O+0.05M KH2PO4/CH3CN(65-35v/v)pH 4.7，用磷酸流動速度0.7mL/minRt＝ 富馬酸12.5；L-肉堿10.8；L-鳥氨酸9。
比例富馬酸 28.3％L-肉堿 39.4％L-鳥氨酸 32.3％實施例4賴氨酸和L-肉堿的富馬酸鹽/賴氨酸和異戊酰L-肉堿的富馬酸鹽(BS/239，BS/240)遵循實施例1和實施例2的程序，用0.1摩爾賴氨酸替代0.1摩爾肌酸一水合物，分別得到了白色不潮解的化合物L-肉堿和賴氨酸的富馬酸鹽及異戊酰L-肉堿和賴氨酸的富馬酸鹽。
在下表1中，通過與L-肉堿內鹽和異戊酰L-肉堿內鹽及無水肌酸對比，將本發明中的一些化合物在一個25％時相對濕度為60.5±5％的環境中暴露24小時，顯示了它們重量的增加(％)及外觀。
參考文獻Pharmaeuropa，1996年11月。
表1化合物 重量的增加(％) 外觀L-肉堿內鹽 19 潮解異戊酰L-肉堿內鹽 20 潮解無水肌酸 3 易流動的實施例1的化合物(BS/231) 0.18無變化實施例2的化合物(BS/232) 0.19無變化實施例3的化合物(BS/238) 0.16無變化含有至少一種分子式為(I)的富馬酸復鹽的組合物的制備對藥物技術或藥劑學的任何專家而言都是顯而易見的。
該組合物可進一步含有其他成分如抗氧化劑、輔酶及礦物質，并且可以以片劑、可咀嚼的片劑、藥丸、藥片、錠劑、膠囊、顆粒或粉末等形式存在。
在單位劑量中，這些組合物可含有一定量的分子式為(I)的富馬酸鹽，能提供50-2000mg，優選100-1000mg的L-肉堿內鹽或異戊酰L-肉堿內鹽。
權利要求
1.一種分子式為(I)的富馬酸鹽 其中R是氫或異戊酰；[A+]是從肌酸、鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸和組氨酸中選擇出來的一種帶正電的氨基酸。
2.權利要求1中的富馬酸鹽，選自-L-肉堿和肌酸的富馬酸鹽；-異戊酰L-肉堿和肌酸的富馬酸鹽；-L-肉堿和鳥氨酸的富馬酸鹽；-異戊酰L-肉堿和鳥氨酸的富馬酸鹽；-L-肉堿和賴氨酸的富馬酸鹽；-異戊酰L-肉堿和賴氨酸的富馬酸鹽；-L-肉堿和精氨酸的富馬酸鹽；-異戊酰L-肉堿和精氨酸的富馬酸鹽；-L-肉堿和組氨酸的富馬酸鹽；-異戊酰L-肉堿和組氨酸的富馬酸鹽。
3.一種包含如權利要求1-2所述的化學通式為(I)的富馬酸鹽作為主要活性成分及一種藥學上可接受的賦形劑的組合物。
4.權利要求3中的組合物，進一步含有從抗氧化劑、輔酶及礦物質中選擇得來的一種或多種其他成分。
5.權利要求3或4中的組合物，以片劑、可咀嚼的片劑、藥丸、藥片、錠劑、膠囊、顆粒或粉末等形式存在。
6.權利要求3-5中以單位劑量形式存在的組合物，包含一種分子式為(I)的富馬酸鹽作為活性成分，包含50-2000mg，優選100-1000mg的L-肉堿內鹽或異戊酰L-肉堿內鹽。
7.權利要求3-6中的組合物，供人類用做食物添加劑、飲食添加劑或藥物。
8.權利要求3-5中的組合物，供獸醫用做飼料添加劑。
全文摘要
研究揭示L－肉堿和異戊酰L－肉堿與氨基酸的富馬酸復鹽可用作食品添加劑、飲食添加劑和藥物的活性成分。
文檔編號A23L1/302GK1436166SQ01811109
公開日2003年8月13日 申請日期2001年4月24日 優先權日2000年6月14日
發明者A·布昂納托 申請人:比奧薩爾茨有限責任公司