可降解的核酸探針和核酸檢測方法

專利名稱：可降解的核酸探針和核酸檢測方法
背景技術：
a)發明領域本發明涉及易于被化學劑或酶降解的核酸探針和在樣品的靶核酸序列檢測中使用該探針的試驗和方法。
b)相關領域的描述核酸，即脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，是遺傳信息的分子庫。總之，每個蛋白質是細胞的核酸中所包含的信息的結果。基因是含有諸如蛋白質或RNA的功能性生物學產品的信息的DNA片段。DNA的功能是儲存生物學信息，由于細胞一般具有許多基因，因此DNA分子一般極大。單個人細胞中所有DNA的總長有大約2米，由數十億個核苷酸組成。
在真核生物中，DNA大多存在于細胞核中。但蛋白質合成在細胞質中的核糖體上發生，因此，必須有一種非DNA的分子攜帶蛋白質合成的遺傳信息從細胞核進入細胞質。RNA在細胞核和細胞質中均有發現，它將DNA的遺傳信息攜帶到核糖體。存在幾種類型的RNA，它們分別具有不同的功能。核糖體RNA(rRNA)是進行蛋白質合成的核糖體的結構成分。信使RNA(mRNA)是將信息從基因攜帶到核糖體，并在那里制備相應的蛋白質的核酸。轉移RNA(tRNA)是將mRNA的信息翻譯成特定氨基酸序列的銜接分子。還有各種特殊功能的RNA在細胞中執行其它功能(Lehninger等，Principles of Biochemistry，第二版，1993，Worth Publishers，Inc.)。
雙螺旋DNA由兩個多核酸鏈互相纏繞組成。多核苷酸鏈的每個核苷酸單位由一個含氮堿基(A，T，C，或G)，一個脫氧核糖和一個磷酸基團組成。兩個多核苷酸鏈的方向反向平行，即其5’到3’的方向相反。通過氫鍵和疏水相互作用將鏈固定在一起。DNA的堿基對由諸如腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)的嘌呤和諸如胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)的嘧啶組成。A與T通過形成兩個氫鍵配對，而G通過形成3個氫鍵與C配對。這種堿基對的互補性是DNA分子的基本特征且取決于堿基的大小，形狀和化學組成。由于雙螺旋的幾何學結果，嘌呤必須始終與嘧啶配對。而且，G始終與C配對，A始終與T配對。這種簡單而精致的結構給雙螺旋提供了超常的穩定性。
在細胞中發現的溫度和離子濃度條件下，DNA通過A-T和G-C堿基對的氫鍵維持雙鏈結構。通過加熱它們(通常在例如0.01M NaCl的稀釋鹽溶液中)或通過將pH上升到11可解鏈雙螺旋(變性成單鏈)。如果溫度降低和溶液中的離子濃度升高，或者如果pH降低，單鏈將退火，或復性重建雙螺旋(如果其在溶液中的濃度足夠大)。該特性是稱為核酸雜交的技術基礎。在核酸混合物中，只有互補鏈復性；其復性的程度實際上不受存在的非互補鏈的影響。該分子雜交可在DNA或RNA的互補鏈之間或在RNA鏈與DNA鏈之間發生。
采用寡核苷酸探針檢測目的基因(和RNA)的各種雜交技術的應用在分子生物學領域是熟知的。一般來說，設計探針使其與含有互補核酸序列的片段雜交。形成的雜交體的存在和量根據使用的信號的特性通過測量放射(對于放射性探針)，酶產生的產物(對于酶標記的探針)，熒光(對于熒光標記的探針)等進行檢測。可計算各種實驗條件以評價探針-靶復合物的核酸雙螺旋的穩定性并減少探針與非靶DNA或RNA的非特異性(背景)結合。由于進行雜交試驗時需要考慮的許多變量，包括解鏈溫度或其它變性條件，退火溫度，鹽濃度，pH及其它變量，核酸探針與非靶核酸序列的非特異性結合的可能性在實施各種雜交技術時仍是一個主要的缺點。
一種重要的分子雜交應用是原位雜交。制備與樣品中的DNA或RNA的特定序列互補的標記DNA或RNA。該互補DNA或RNA稱為寡核苷酸探針。在該試驗中，寡核苷酸探針設計成可與諸如mRNA的特定靶RNA，或DNA中的特定天然或整合基因序列退火。細胞或組織切片可短暫地受熱或與酸接觸，在玻璃片，濾紙或其它材料上固定包括核酸的細胞成分。然后將固定的細胞或組織與標記的互補DNA或RNA探針接觸以便雜交。標記物可以是諸如32P的放射性同位素，熒光染料，生物素標記的核苷酸類似物，抗原，或任何其它常用的標記技術。溫育一段時間后，可去掉未雜交的標記DNA或RNA而檢測雜交復合物以顯示各個細胞或組織片內特定RNA或DNA的存在和/或位置。盡管該技術是常用的，但仍需要繼續努力以提高試驗的靈敏度和降低標記探針的非特異性結合(背景)(Darnell等，Molecular Cell Biology，第二版，1990，Scientific American Books，Inc.)。
本領域常用的另一雜交技術是標記探針與固定核酸的雜交。有許多方法可用于使標記探針與已固定在諸如硝酸纖維素濾膜或尼龍膜的固相支持物上的核酸雜交。這些方法在各方面均有區別，例如使用的溶劑和溫度；溶劑的體積和雜交長度；攪拌程度和方法；封閉探針與固相基質表面的非特異性附著的諸如Denhardt′s試劑或BLOTTO試劑的使用；標記探針的濃度及其比活；增加核酸復性率的諸如硫酸葡聚糖或聚乙二醇化合物的使用；雜交后洗滌的嚴格性。
在傳統試驗方法中，可使用一些不同類型的試劑封閉探針非特異性地附著到固相支持物的表面。該試劑包括Denhardt′s試劑，肝素，脫脂奶粉等。通常，這些試劑與變性的，片段化的鮭精或酵母DNA和諸如SDS的去污劑混合使用。當使用硝酸纖維素濾膜時在預雜交和雜交溶液中通常也都包括封閉劑。當使用尼龍膜固定核酸時，通常從雜交溶液中省去封閉劑，因為相信高濃度的蛋白質會干擾探針與其靶的退火。為了最小化背景問題，最好使用最少量的探針，雜交盡可能短的時間，然而，這通常不可能排除探針的所有非特異性結合，特別是如果核酸的可檢測量較低的情況(Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，1989，Cold SpringHarbor Laboratory Press)。
核酸雜交也是篩選cDNA文庫的目的克隆的最可靠的方法。通過使用核酸探針可同時和迅速分析大量克隆。不同技術使用不同長度和特性的探針。同源探針含有所需cDNA精確的核酸序列的至少部分。它們可以各種方式使用，例如使用已有cDNA的部分克隆從cDNA文庫分離全長克隆。與同源性探針的雜交在嚴格條件下進行。使用部分同源性探針檢測與探針序列相關但不相同的cDNA克隆。例如，如果相同基因已經從另一物種中克隆，或者相關基因已經從同一物種中克隆，可根據實驗測定該核酸序列是否足夠保守以便允許通過雜交篩選cDNA文庫。需要建立這樣的條件，即允許以前克隆的基因用作目的cDNA的探針，而沒有來自背景雜交的過多干擾導致非特異性信號產生。關于雜交試驗和條件的更詳細的信息，參見Sambrook等(出處同上)。
有一些不同的試劑可用于封閉雜交試驗中核酸探針與表面的非特異性結合(出處同上)。然而，需要提供在增加信噪比和減少非特異性信號產生的雜交技術中使用核酸探針的改進方法。本發明闡明了這些需要。
本發明的小結本發明涉及可降解的核酸探針和在樣品的靶核酸序列檢測中使用這些探針的試驗和方法。降解過程的目的是減少非特異性信號產生。
本發明包含使用可降解的探針檢測靶核酸序列的試驗。優選的是，該試驗是使用易于被化學或酶降解的核酸探針的溶液基質試驗或原位核酸雜交試驗。該試驗包含(1)標記的，可降解的核酸探針與靶序列雜交，從探針產生靶特異性產物，(2)從探針的標記區降解或分離靶互補區，及(3)檢測標記區的存在。
本發明的一個方面提供了通過至少一對核酸探針與靶核酸退火檢測樣品中靶核酸序列的方法。該探針的特征在于探針與靶核酸序列的鄰近區域堿基配對后兩個核酸區形成一個末端探針-探針分支或莖。能形成本文所述莖或探針-探針分支的探針區也稱為“莖區”或“探針-探針區”。該探針具有至少一個位于探針對的至少一個探針的莖區內的交聯化合物。探針對第二探針的莖區插入一個能與第一探針莖區的交聯化合物形成共價鍵的反應物。另外，兩個莖區都可插入一個交聯化合物，能通過兩個交聯化合物的反應，例如通過二聚體化形成共價鍵。共價鍵在探針與靶核酸序列堿基配對后產生，從而使探針對的莖區永久彼此交聯。另外，至少探針的一個莖區含有結合到莖區末端的可檢測的部分或產生信號的部分。信號在莖交聯后產生并檢測，而莖交聯又發生在探針與靶核酸序列配對后。以這樣的方式設計核酸探針，即探針的靶特異性雜交區或靶互補區可通過降解過程與可檢測的標記區分離。因此，探針的剩下部分由莖和標記組成。這一分離的目的是通過減少背景特異性或非特異性信號產生提高信噪比。
本發明的另一方面提供了含有一個核酸序列的核酸探針，該核酸序列包括設計成在至少兩個探針與靶核酸序列的鄰近區堿基配對后形成探針-探針分支或莖的修飾的或未修飾的核酸區。能形成莖的探針區也稱為“莖區”或“探針-探針區”。探針的至少一個莖區含有與莖區末端結合的可檢測的半分子，例如標記物。在本發明的一個優選實施方案中，探針對的探針莖區含有修飾的或未修飾的嘌呤核苷或衍生物，例如修飾的或未修飾的腺嘌呤殘基和至少一個交聯化合物，而探針對的另一探針的莖區含有用作交聯化合物反應物的修飾的或未修飾的嘧啶核苷或衍生物。一個優選的反應物由修飾的或未修飾的胸苷殘基組成。該探針與靶序列的鄰近區雜交且形成含有三臂連接的探針-探針分支或莖。因此，在探針與靶核酸的鄰近區堿基配對后，探針對的莖區交聯且形成末端莖或探針-探針分支。共價交聯可通過光照(photoirradiation)或其它方式誘導。然后交聯莖與靶互補區分離且隨后進行檢測。本文所指的交聯化合物是含有香豆基(coumarinyl)衍生物的非核苷的，穩定的，光敏化合物。與諸如修飾的或未修飾的嘧啶核苷或衍生物的交聯化合物反應物反應的交聯化合物的例子是香豆素衍生物，包括(1)3-(7-香豆基)甘油；(2)補骨脂素及其衍生物，例如8-甲氧基補骨脂素或5-甲氧基補骨脂素；(3)順式苯并二吡喃酮(cis-benzodipyrone)及其衍生物；(4)反式-苯并二吡喃酮；和(5)含有融合的香豆素-噌啉環系統的化合物。所有這些分子含有位于合適方向和合適距離的必需交聯基團以便與核苷酸交聯。另外，所有這些分子都是香豆素衍生物，均含有基礎香豆素環系統，分子的剩下部分以其為基礎。
在本發明的另一實施方案中，探針對的莖區包含修飾的或未修飾的嘌呤和/或嘧啶核苷或衍生物和第一交聯化合物，而探針對的另一探針的莖區包含修飾的或未修飾的嘌呤和/或嘧啶核苷或衍生物和第二交聯化合物。在探針與靶核酸的鄰近區堿基配對后，探針對的莖區通過在光照時交聯化合物的反應(例如，二聚體化)發生交聯，形成莖或探針-探針分支。本文所指的交聯化合物是包含芳香基烯烴衍生物的非核苷的，穩定的，光敏化合物。芳香基烯烴的雙鍵是與合適的反應物，例如位于探針-探針分支反向鏈上的適宜反應物，如另一芳香基烯烴衍生物共價交聯的光敏基團。因此，芳香基烯烴的雙鍵位于合適的方向和合適的距離上以便在探針與靶核酸的鄰近區堿基配對后與反向探針-探針區中非核苷反應物交聯。
在本發明的一個特別優選的實施方案中，探針的靶特異性雜交區或靶互補區在檢測前經過降解過程從探針的可檢測的，標記區分離。本發明的一個目的是通過形成標記的探針-探針分支或莖的兩個探針末端之間的交聯維持共價連接，而去掉直到交聯位點的探針的任何部分，特別是探針的靶互補區。具體地說，探針的靶互補區從探針的莖上被降解或分離下來(例如，切除)。降解或切除方法包括化學和酶方法，其中方法的選擇取決于探針的組成。探針的靶互補區可包括核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸或非天然取代物取代探針中的核苷酸單元。因此，該系統的總體設計是提供這樣的探針，即，探針的莖區對用于分離或去掉探針的靶互補區所需的降解或切除方法有抗性。降解后，探針的分離的且可檢測的部分由莖和隨后被測量(參見下文)和定量的標記物組成。靶互補區與探針的可檢測區的分離減少了探針的非特異性結合，從而提高了信噪比。結果，顯著降低了背景特異性或非特異性信號產生。
在本發明的另一優選實施方案中，探針的莖區含有與莖區末端結合的可檢測半分子和捕捉半分子。可檢測的半分子可以是任何信號報道基團，捕捉半分子可以是任何捕捉基團。具體地說，捕捉基團和信號報道基團可以分別是生物素和熒光素。在另一實施方案中，探針的一個或兩個莖區含有結合到莖區末端的可檢測的半分子。該可檢測的半分子可以由諸如熒光團，放射性同位素，抗原或酶的標記物組成。而且，可設計標記物使得在產生可檢測信號的兩個標記物之間發生相互作用。
在本發明的另一優選的實施方案中，探針選自SEQ ID NO.1，SEQ IDNO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ IDNO.7，和SEQ ID NO.8。
本發明還包含對靶序列的檢測，所述靶序列包括但不限于全長基因，診斷性標記基因，表達序列標記(ESTs)，單核苷酸多態性(SNPs)，基因組DNA，cDNA，cccDNA，重組基因和mRNA及rRNA。
本發明的詳細描述a)定義和一般參數提出下列定義以說明和限定用于描述本發明的特定術語的含義和范圍。
“多核苷酸”，“寡核苷酸”，“核酸”，或“核酸序列”包括，但不限于，含有天然核苷堿基腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶和尿嘧啶的mRNA，cDNA，cccDNA，基因組DNA，和合成DNA及RNA序列，也包含具有一個或多個修飾的或未修飾的核苷的序列。術語“核酸”或“核酸序列”包括寡核苷酸和多核苷酸。本文使用的這些術語中的任何一個對于長度或合成來源沒有限制。
術語“探針的靶特異性雜交區”或“探針的靶互補區”是指能與另一核酸序列，特別是特異性靶序列在雜交條件下，例如在緩沖的(pH.7.0-7.5)含水的，鹽溶液(例如，1mM到2M NaCl)中室溫下形成氫鍵的核酸探針序列。盡管雜交條件取決于涉及的多核苷酸的長度，但它們一般包括存在至少一種陽離子，例如Na+，K+，Mg2+，或Ca2+，近中性的pH，和不超過55℃的溫度。盡管與多核苷酸雜交的序列可以是與該多核苷酸大約90％-100％互補，但是如果該序列足夠長，在具有高鹽濃度的溶液中，和/或在低溫條件下，具有70％，或甚至只有50％互補的多核苷酸也可雜交。雜交到多核苷酸上的序列一般包含與靶多核苷酸互補的至少10個核苷酸，優選至少大約15-30個核苷酸，且不超過大約1000個核苷酸。
在“檢測樣品中的靶核酸序列的方法”中提及的“樣品”可以是組織或體液樣品或分離的樣品。本文使用的術語“組織”是指由一個細胞，多個細胞，細胞團或整個器官組成的任何生物學材料。本文使用的術語組織包含可以是正常或者異常(即，腫瘤)的一個或多個細胞。“體液”可以是從生物體或生物體的組織提取，排泄或分泌的任何液體物質。體液不必含有細胞。與本發明有關的體液包括，但不限于，全血，血清，血漿，尿，腦脊液，眼淚，和羊膜液。術語“分離的樣品”是指含有該樣品的材料已從其原始環境(例如，如果它是天然存在的則是天然環境)中取出。例如，存在于活體動物或組織切片中的天然存在的多核苷酸不是分離的，但相同的多核苷酸可以在其原始環境之外的溶液中分離地存在，或者是載體或組合物的一部分，且是分離的，因為該載體或組合物不是其原始環境的一部分。
術語“可檢測的半分子”是指與核酸序列或探針連接以幫助報道或檢測樣品中諸如DNA或RNA的目的靶核酸的任何產生信號的半分子，信號報道基團，標記試劑，或標記物。可檢測的半分子可連接到單獨或互相結合起作用的一個或多個核酸探針上。可檢測的半分子可以是直接可檢測的，例如放射性同位素，熒光團，或直接酶標記(例如，直接與探針連接的酶)；或者是間接可檢測的，例如，抗原，它隨后結合到可將酶底物轉變成可檢測的產物的酶-抗體偶聯物上。另外，可使用熒光素或任何其它可檢測的半分子。
本文使用的術語“捕捉半分子”或“捕捉基團”是與可檢測的半分子結合起作用的半分子，其中探針對中的一個核酸探針用可檢測的半分子標記，探針對中的另一探針用捕捉半分子標記。捕捉半分子可以是任何抗原，受體反應物(substrate)，或生物素，它導致該產物結合到含有抗體，受體，或抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的固相支持物上。由于捕捉基團連接到該產物上，因此發生該產物的捕捉。根據所用的半分子，生物素可結合到抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白上，抗原結合到抗體上，或受體反應物結合到受體上。
術語“可降解的探針”是指這樣的核酸序列或探針，其中該探針的可降解區通過化學或酶工具與探針的靶互補區分開以便通過降低背景特異性或非特異性信號的產生來提高信噪比。一對探針的可降解區和可分離區也指探針-探針分支或莖。探針-探針分支或莖由各探針的部分組成，這些部分不與靶互補，而是設計成與另一部分相互作用(見下文)。可降解的探針可用于，例如，諸如雜交試驗的核酸檢測試驗。本文所指的酶工具包括但不限于具有降解DNA和/或RNA的能力的酶試劑。降解或切割脫氧核糖核苷酸的酶試劑的例子是諸如DNaseI，微球菌核酸酶，核酸酶S1，或綠豆核酸酶的核酸酶；或諸如核酸外切酶III的核酸外切酶。降解或切割核糖核苷酸的酶試劑的例子是諸如RNase A，S1，磷酸二酯酶I，磷酸二酯酶II，或RNaseH的核糖核酸酶。本文所指的化學工具包括但不限于諸如氫氧化鈉的降解RNA的化學試劑；或諸如天然抗生素(例如，博萊霉素，新制癌菌素)的降解DNA的化學試劑或合成試劑(例如，丙基-EDTA甲基化鐵(II)復合物)(methidiumpropyl-EDTA iron(II)Complexes)。
術語“交聯化合物”是指位于本文所述探針的核苷酸序列內的化合物。交聯化合物可任選位于探針對或探針組的一個探針的探針-探針區或莖區內，其中一個探針可插入交聯化合物，而另一探針可由用作交聯化合物反應物的一個或多個修飾的或未修飾的嘌呤或嘧啶核苷或衍生物組成。交聯化合物設計成在探針與靶核酸序列堿基配對后與反應物形成共價鍵。作為選擇，可在兩個莖區插入在探針與靶核酸序列堿基配對后能通過反應(例如，二聚體化)形成共價鍵的交聯化合物。本發明包含的交聯化合物在WO00/27860；和美國專利號6,005,093；美國專利號5,082,934；和美國專利號4,826,967中進行了詳細討論。
術語“探針-探針分支”和“莖”在本文中可互換使用且描述了探針對的一個核酸區，該核酸區在兩個探針與靶核酸序列的鄰近區堿基配對后發生光交聯且隨后從各探針的靶特異性區域分離。能形成莖或探針-探針分支的探針區稱為“莖區”或“探針-探針區”。莖區首先通過氫鍵，鹽橋，和/或范德華力發生非共價相互作用。然后在探針對與互補靶序列雜交后發生莖交聯。這種交聯是可能的，因為該探針具有位于探針對的一個莖區內的至少一個交聯化合物。探針對的另一莖區插入在探針與靶核酸鄰近區堿基配對后與莖的交聯化合物形成共價鍵的反應物。作為選擇，兩個莖區可插入在探針與靶核酸序列堿基配對后能通過光反應(例如，二聚體化)形成共價鍵的交聯化合物。任一探針的莖區以未雜交形式存在，直到該探針與靶結合的區域與互補靶序列雜交。因此，任何給定探針的莖區可能與探針的剩下部分無法區分，直到形成了該莖。要求保護的術語探針-探針分支，莖，探針-探針區和莖區不應做過多限定。使用這些術語對大小或長度無限制。對本領域的技術人員而言顯而易見的是這些術語的變化形式將在權利要求書的范圍內。例如，當使用DNA或RNA探針檢測目的RNA時，所得的探針-探針分支或莖可不被分離，即只有莖結構被留下來。盡管靶互補區將基本上被降解，但靶的一些RNA堿基可留下連接到莖上，它們不會妨礙本發明的目的。作為選擇，當使用DNA或RNA探針檢測目的DNA時，所得的探針-探針分支或莖也可不被這樣分離，即僅留下莖結構。同樣，靶互補區將被大部分降解，但可保留該靶的一些DNA堿基連接到莖上，它們將不會妨礙本發明的目的。對于探針或靶含有修飾的核酸，核酸衍生物或核酸類似物的情況也是如此。交聯的探針-探針分支或莖可從靶互補區上分離且隨后被檢測，而不管該探針-探針分支或莖的長度和大小。
術語“N”用于描述一個或多個修飾的或未修飾的核酸，核酸衍生物，或核酸類似物。例如，本發明包含含有未修飾的嘌呤和/或嘧啶核苷或衍生物的探針，其中N可用于描述任何數目的該殘基。未修飾的殘基的例子是胸腺嘧啶或胸苷，胞嘧啶，腺嘌呤，鳥嘌呤和尿嘧啶。作為選擇，本發明也包括含有修飾的嘌呤和/或嘧啶核苷或衍生物的探針。同樣，N可用于描述任意數目的這類修飾的殘基。修飾的殘基的例子有脫氧胸苷，脫氧胸苷磷酸，5-氟尿嘧啶等。術語N的使用對大小或長度無限制。術語“N(a)”或“N(b)”用于描述諸如在探針或靶序列中的任意數目的修飾的或未修飾的核酸，核酸衍生物，或核酸類似物。下標“a”和“b”是指任何數目的整數，因而是指任意數目的殘基。例如，如果a等于0-20(a＝0-20)，那么術語N(a)無論何處都等于從0到20個修飾的或未修飾的核酸殘基，核酸衍生物，或核酸類似物。對本領域的技術人員而言顯而易見的是N(a)和N(b)用于描述探針或靶序列中殘基的近似數目。因此，術語N，N(a)，和N(b)在大小或長度上不必過多限制。
b)使用可降解探針的雜交試驗本發明公開了使用易于化學或酶降解的核酸探針的基于溶液的和原位的核酸雜交試驗。本發明的目的是使用核酸探針的序列特異性雜交特性檢測靶序列的存在，從探針產生靶特異性產物，降解或分離探針的靶互補區，且檢測靶特異性產物的存在。降解過程的目的是通過減少背景特異性或非特異性信號產生來提高信噪比。
本發明的一個方面提供了通過至少一對核酸探針與靶核酸退火來檢測樣品中靶核酸序列的方法。該方法通過在適合于堿基配對的介質中將靶核酸與探針或探針對結合來進行(參見下文)。該核酸可以是DNA或RNA，單鏈或雙鏈，或含有能堿基配對的嘧啶和/或嘌呤的其它分子。
具體地說，本發明的一個方面提供了可降解的探針。該探針的特征在于在至少兩個探針與靶核酸序列的鄰近區堿基配對后核酸區形成探針-探針分支或莖。優選的是，該核酸探針包含的核酸序列包括設計成在至少兩個探針與靶核酸序列的鄰近區堿基配對后形成探針-探針分支或莖的修飾的或未修飾的核酸區。探針對除了形成莖的探針區外與靶序列互補。各探針含有不與靶序列結合的莖區。莖區以未雜交形式存在，直到結合靶核酸的探針區雜交到互補靶序列上。因此，任何給定探針的莖區可與探針的剩下部分無法區分，直到形成了該莖。莖區首先通過氫鍵，鹽橋，和/或范德華力發生非共價相互作用。然后，在探針與靶核酸的鄰近區堿基配對后，探針對的莖區發生交聯并形成莖。這種交聯是可能的，因為該探針具有位于探針對的一個莖區內的至少一個交聯化合物。探針對的另一莖區插入與莖的交聯化合物形成共價鍵的反應物。作為選擇，兩個莖區可插入能通過光反應(例如，二聚體化)形成共價鍵的交聯化合物。在充分溫育后，探針雜交到樣品中的靶核酸上并激活交聯系統導致兩個探針之間的共價結合。因此，在探針與靶核酸序列堿基配對后形成共價鍵，從而莖區永久彼此交聯。然后將交聯的莖與靶互補區分離，隨后進行檢測。
各探針具有至少10個核苷酸的序列長，優選大約15至30個核苷酸且不超過大約1000個核苷酸，其中該序列與靶序列具有不小于80％的同源性，更優選與靶序列具有90-100％的同源性。存在于靶核酸上的堿基配對區一般不被10個以上的核苷酸分開，更常見的是不被5個以上的核苷酸分開，優選不被1個以上的核苷酸分開。在本發明優選的實施方案中，探針大約長20到30個核苷酸且與靶有大約95％的同源性，其中存在于靶核酸上的堿基配對區被大約1個核苷酸分開。應明白不管哪一探針對用于檢測給定的靶序列，該探針對內各探針的長度可以變化。各探針具有能與探針對的另一探針形成莖或探針-探針分支的區域。在探針與互補靶序列結合后，位于探針對一個莖區的莖內的交聯化合物被激活以便與位于探針對另一探針的莖區內的反應物形成共價鍵，從而探針對各成員的莖區彼此永久交聯。另外，探針對中至少一個探針含有任選與其莖區5’或3’端結合的可檢測的半分子或產生信號的半分子。信號在莖交聯后被檢測或產生，而莖交聯又在探針與靶核酸序列堿基配對后發生。
在本發明的一個特別優選的實施方案中，與樣品中目的靶核酸序列互補的探針區可從探針的可檢測區去掉。核酸探針以這樣的方式設計，即探針的靶特異性雜交區或靶互補區通過降解過程與可檢測的半分子或產生信號的半分子分離。在探針與靶核酸序列鄰近區結合并產生莖內交聯后，探針的靶互補區可通過化學或酶降解被去掉。因此，探針的剩下部分由莖和信號組成，該信號在完成合適的洗滌步驟(參見下文)后在試驗中容易被檢測到。該分離的目的是通過減少背景特異性或非特異性信號產生提高信噪比。標準雜交試驗在本領域中是已知的且通常遇到的問題是核酸材料與表面的非特異性結合并在試驗中產生非特異性信號。通過分離產生信號的半分子與核酸雜交區，可最小化非特異性信號。只有剩下的信號來自交聯的探針莖且連接的一個或多個半分子直接與任何給定樣品中的靶序列成比例。
本發明的一個目的是通過形成標記探針-探針分支或莖的兩個探針末端之間的交聯維持共價連接，而去掉直到交聯位點的任何探針部分，特別是探針的靶互補區。具體地說，探針的靶互補區被降解或與探針的莖區分離(例如，切掉)。降解或切割的方法包括化學或酶方法，其中該方法的選擇取決于探針的組成。探針的靶互補區可包含核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸或取代探針中的核苷酸單位的非天然取代物。因此，降解方法取決于試驗中使用的探針類型。
在本發明的一個實施方案中，探針的靶互補區包含脫氧核糖核苷酸，其中可單獨或結合使用許多核酸酶以選擇性降解或切割該探針。可使用諸如DNaseI或微球菌核酸酶的水解雙鏈DNA的具有核酸內切酶活性的酶在交聯步驟后直接降解探針的靶互補區。可在任何探針-靶雙鏈變性后在該方法中使用諸如核酸酶S1或綠豆核酸酶的水解單鏈DNA的具有核酸內切酶活性的酶。作為選擇，可結合使用兩個方向特異性核酸外切酶降解探針對的探針。例如，核酸外切酶III在雙鏈DNA上表現出3’→5’核酸外切酶活性，而噬菌體λ核酸外切酶表現出5’→3’核酸外切酶活性。在交聯步驟后可直接向樣品中導入這兩個核酸酶以完成所需的探針降解反應。同樣，需要單鏈DNA作為底物且需要在導入酶前變性樣品的其它核酸外切酶是已知的。任選的是，在脫氧核糖核苷酸降解中可使用化學DNA裂解試劑。其例子包括天然抗生素博萊霉素和新制癌菌素，以及諸如丙基-EDTA甲基化鐵(II)復合物的合成試劑。
在本發明的另一實施方案中，探針的靶互補區包含核糖核苷酸，其中可使用諸如強堿溶液的化學方法來降解或切割該探針。一般來說，將濃度為0.1M至5M的氫氧化鈉溶液與該探針接觸，所得的溶液在室溫下或在更高溫度，例如30-90℃下溫育。堿性溶液在RNA堿基位置導致在探針鏈上形成缺口，其中反應所需的時間期限取決于氫氧根離子的濃度和溫育的溫度。也可使用許多酶方法實現在核糖核苷酸位點的探針降解或切割。已知裂解單鏈RNA的酶包括，例如核糖核酸酶A，S1，磷酸二酯酶I，磷酸二酯酶II。如果酶選擇性作用于單鏈RNA，需要將該溶液處于變性條件下(例如，加熱到雙螺旋的解鏈溫度以上的溫度)，從而交聯的探針-靶雙螺旋在酶方法起動前與靶鏈分離。可單個使用諸如RNaseA和S1的具有核酸內切酶活性的酶以完成在探針組的各探針中所需的探針降解。優選成對使用僅具有方向依賴性核酸外切酶活性的酶以便完成各探針中所需的探針降解反應。例如，磷酸二酯酶I表現出5’→3’核酸外切酶活性，磷酸二酯酶II表現出3’→5’活性。優選結合使用這兩個酶以降解一組中的兩個探針，因為一個探針在其靶互補區以5’端終止，而另一探針在其靶互補區以3’端終止。作為選擇，可使用RNase H選擇性降解探針的RNA部分。RNase H表現出對RNA/DNA雙螺旋中的RNA的水解活性。在這種情況下，使用具有包含核糖核苷酸的靶互補區的探針檢測DNA靶。將探針與樣品接觸使其雜交和交聯后，可導入RNaseH以完成對雜交到DNA靶上的探針的核糖核苷酸單位的選擇性水解。
設計莖以便交聯位點以外的結構不被酶或化學試劑接近或識別，從而不被切割或降解。這點可用修飾或不修飾探針核酸序列的糖磷酸骨架實現。探針的莖區可包含核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的衍生物或非核酸成分。莖中使用的核酸或非核酸半分子的類型選自對用于降解探針靶互補區的試劑不敏感的任何上述基團。例如，當DNA核酸酶用于降解過程時，探針的莖部分可包含核糖核苷酸。相反，當RNA核酸酶用于降解過程時，莖部分可包含脫氧核糖核苷酸。然而，已知一些核酸酶對DNA和RNA底物都水解，例如S1，和磷酸二酯酶I和II，在這種情況下需要天然核苷酸或非核酸成分的核酸酶抗性衍生物。已知對天然核苷酸結構的許多化學修飾賦予了半分子對核酸酶的抗性。例如，在磷酸根半分子中硫原子與氧原子的交換產生硫代磷酸根半分子，這種交換一般阻止或停止酶性水解反應。同樣用甲基膦酸基團取代磷酸基團可賦予酶性抗性。非天然連接也不能被酶識別且可提供用于構建探針的莖部分的有用工具(means)。例如，已知肽鍵用作維持互補雙螺旋中堿基對形成能力的核酸結構中的骨架部分，但它們具有不被任何酶識別的非天然骨架。
本發明還包括天然存在的核酸半分子，它可在交聯劑與探針末端的任意標記物之間的，或交聯位點與探針末端的任意標記物之間的探針莖區使用，而不管使用的降解方法的類型。如果交聯劑或交聯位點與標記的探針末端之間的天然堿基數少于10個，更優選少于3個，那么核酸酶的活性被顯著阻礙，因為交聯和標記物半分子改變了酶的識別位點。
為了使莖形成事件發生，含有一半莖的探針的各莖區可包含至少2或3對核苷酸，且通常不超過大約20個堿基對。在優選的實施方案中，核苷酸對是A和T，其中該核苷酸在一個莖區可以相同或不同，即在一個莖區所有的都是T且在另一莖區所有的都是A，或者在探針對的兩個莖區是A和T的混合物。作為選擇，它們可使用G和C或者與A和T結合使用。最優選的是，莖由3個核苷酸單位組成，其中一個莖區由T組成，另一莖區由兩個A和一個交聯化合物組成；或者其中一個莖區由兩個T和一個交聯化合物組成，另一莖區由兩個A和一個交聯化合物組成。應明白的是，核苷酸的具體選擇取決于所需的親和性，合成的簡便性，與共價交聯化合物的相互作用，降解方法的類型等。
在本發明的一個優選的實施方案中，探針的莖區含有結合到莖區末端的可檢測的半分子和捕捉半分子。可檢測的半分子可以是任何信號報道基團，捕捉半分子可以是任何捕捉基團。具體地說，捕捉基團和信號報道基團可以分別是生物素和熒光素。在另一實施方案中，探針的兩個莖區含有結合到莖區末端的可檢測的半分子。可檢測的半分子由諸如熒光團，放射性同位素，抗原或酶的標記物組成。在另一實施方案中，該探針的兩個莖區含有的半分子聯合相互作用可提供可檢測的信號，例如熒光共振能量轉移對或激活劑/受體對。
在另一優選的實施方案中，探針對的一個探針的莖區含有諸如修飾的或未修飾的腺苷殘基的修飾的或未修飾的嘌呤核苷或衍生物和至少一個交聯化合物，而探針對的另一探針的莖區含有用作交聯化合物反應物的修飾的或未修飾的嘧啶核苷或衍生物。一個優選的反應物由修飾的或未修飾的胸苷殘基組成。該探針與靶序列的鄰近區雜交并形成含有3-臂連接的探針-探針分支或莖。因此，在探針與靶核酸的鄰近區堿基配對后，探針對的莖區交聯且形成莖或探針-探針分支。共價交聯可通過光照射或其它方法誘導。另外，共價交聯可導致標記物被激活且探針變成可檢測的探針。然后交聯的莖與靶互補區分離且隨后被檢測。本文提及的交聯化合物是含有香豆基衍生物的非核苷的，穩定的，光敏化合物。香豆基衍生物可通過連接香豆素分子或衍生物的苯環與羥基或多羥基烴分子，例如甘油分子的一個末端羥基來制備。所得化合物的(多)羥基烴半分子相當于核苷的糖，而香豆素半分子占據堿基的位置。因此，該化合物可插入多核苷酸區。香豆素環系統的3和4位之間的雙鍵是光敏基團，在探針對的探針與靶核酸的鄰近區堿基配對后，該光敏基團與含有探針-探針區的相反鏈中的核苷形成共價交聯。與諸如修飾的或未修飾的嘧啶核苷或衍生物的交聯化合物反應物反應的交聯化合物的例子是香豆素衍生物，包括(1)3-(7-香豆基)甘油；(2)補骨脂素及其衍生物，例如8-甲氧基補骨脂素或5-甲氧基補骨脂素；(3)順式苯并二吡喃酮(cis-benzodipyrone)及其衍生物；(4)反式-苯并二吡喃酮；和(5)含有融合的香豆素-噌啉環系統的化合物。所有這些分子含有位于合適方向和合適距離的必需交聯基團(活化的雙鍵)以便與核苷酸交聯。另外，所有這些分子都是香豆素衍生物，均含有堿性香豆素(苯并吡喃酮)環系統，分子的剩下部分以其為基礎。這些交聯化合物在美國專利號6,005,093中進行了詳細討論。
在本發明的另一實施方案中，探針對的一個探針的莖區包含修飾的或未修飾的嘌呤和/或嘧啶核苷或衍生物和第一交聯化合物，而探針對的另一探針的莖區包含修飾的或未修飾的嘌呤和/或嘧啶核苷或衍生物和第二交聯化合物。在探針與靶核酸的鄰近區堿基配對后，探針對的莖區通過在光照時交聯化合物的反應(例如，二聚體化)發生交聯，形成共價連接的莖或探針-探針分支。本文所指的交聯化合物是包含芳香基烯烴衍生物的非核苷的，穩定的，光敏化合物。芳香基烯烴衍生物可通過將芳香基半分子連接到功能性飽和或不飽和的烴分子，如甘油上來制備。所得化合物的功能性烴半分子相當于核苷的糖，而芳香基烯烴半分子占據堿基的位置。因此，該化合物可插入多核苷酸。芳香基烯烴的雙鍵是與合適的反應物，例如位于探針-探針分支的相反鏈中另一芳香基烯烴衍生物共價交聯的光敏基團。芳香基烯烴的雙鍵位于合適的方向和合適的距離上以便在探針與靶核酸的鄰近區堿基配對并隨后光照射后與相反的探針-探針區中非核苷反應物交聯。這些交聯化合物在WO 00/27860中進行了詳細討論。
在本發明的另一優選的實施方案中，探針選自SEQ ID NO.1，SEQ IDNO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ IDNO.7，和SEQ ID NO.8。
本發明還包括但不限于全長基因，診斷性標記基因，表達序列標記(ESTs)，單核苷酸多態性(SNPs)，基因組DNA，cDNA，cccDNA，重組基因和mRNA及rRNA的靶序列的檢測。靶序列可以是雙鏈或單鏈。而且，它們在性質上可以是天然存在的或人工合成的。靶序列可以是純化或未純化的，在溶液中或在體液或組織中存在。
本發明包含易于被化學和酶降解的核酸探針和在靶核酸序列檢測中使用該探針的方法。該系統的總體設計是提供這樣的探針，其中該探針的莖區對用于將探針的靶互補區與探針的標記區分離所需的降解或切割方法有抗性。降解后，探針分離的且可檢測的區域由莖和隨后被測量(參見下文)和定量的標記物組成。探針的靶互補區與可檢測區的分離減少了探針的非特異性結合，從而提高了信噪比。結果，背景特異性或非特異性信號產生顯著減少。
c)方案下面的方案對本發明進行了舉例說明，其中兩個DNA探針在探針-探針分支或莖內交聯且限制性核酸內切酶用作降解劑。
探針*1.樣品溶液中的結合探針(含有靶) (探針1) X T (探針2)A TAGCGCCAAAATTCGCAGTCCCCAAC CTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTGATGCTATTCGCGGTTTTAAGCGTCAGGGGTTG-GAGGTTAGTGAGTGGTTGGAGAACA(靶)2.兩個探針交聯在一起 (探針1) X＝T (探針2)A TAGCGCCAAAATTCGCAGTCCCCAAC CTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTGATGCTATTCGCGGTTTTAAGCGTCAGGGGTTG-GAGGTTAGTGAGTGGTTGGAGAACA(靶)3.使用限制性核酸內切酶降解該探針(和其它核酸材料) X＝T
*靶序列中的連字符僅用于保持兩條鏈中堿基的排列；連字符側面的兩個堿基通過正常的磷酸二酯鍵連接。
B代表生物素F代表熒光素X代表交聯化合物X和T之間的‘＝’表示共價交聯。
設計莖使得交聯位點之外的結構不能被酶接近或識別，從而不被酶切割。對糖磷酸骨架(例如，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，肽連接等)不做修飾或進行修飾可實現這點。
至此剩下的探針部分由兩個連接的標記物組成，在本實施方案中是生物素基團和熒光素基團，或者分別是捕捉基團和信號報道基團。作為選擇，兩個標記物可以是熒光團，它們相互作用以便通過熒光共振能量轉移提供信號。試驗如下進行將捕捉基團捕捉到固相支持物上的標記莖上，接著進行洗滌步驟以便從附近去掉未結合的材料和探針(探針消化物)，然后進行檢測信號報道基團存在的步驟(參見下文檢測方法)。莖被保留下來，因為諸如生物素的捕捉基團與莖連接。在該實施方案中，生物素結合到抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白包裹的珠上。
本文也公開了該具體實施方案的一些變化形式(見上文)。
對于RNA探針RNaseA用作降解探針的酶試劑。
氫氧化鈉用作探針降解的化學試劑。
對于DNA探針DNaseI用作降解探針的酶試劑。
核酸內切酶用作降解探針的酶試劑(即微球菌核酸酶)。
下面使用表1的探針舉例說明本發明。試驗了DNA探針組與目的核酸序列雜交的能力并通過標記的半分子進行檢測。比較了降解的和未降解的探針。
表1.探針序列
*＝硫代磷酸二酯(代替正常的磷酸二酯)X＝3-(7-香豆基)甘油P＝四甘醇(tetraethylene glycol)B＝生物素TEG(Glen Research)F＝熒光素亞磷酰胺(Cruachem)M＝A和CY＝C和T樣品方案通過將裂解溶液(119.2μl)，探針溶液(36.4μl)和中和溶液(44.4μl)在96-孔微量滴定板的孔中混合起來制備樣品。
裂解溶液是0.1875μM氫氧化鈉。制備兩種類型的裂解溶液。一種僅含有氫氧化鈉，另一種還含有24fmol的含有乙肝病毒基因組的質粒載體。將這些溶液煮沸30分鐘。所得的裂解物在分配進平板各孔之前通過Acrodisk0.45μlm的注射濾器過濾。
在探針溶液中，交聯探針的濃度(表1探針1，3，5或7)是54.9nM，反應物探針的濃度(表1探針2，4，6或8)是137.4nM。探針溶液還含有0.012％的牛血清白蛋白，1.815M氯化鈉，和0.001％酚紅作為pH指示劑。
中和溶液是0.15M的檸檬酸，0.31M的磷酸二氫鈉，1.5M氯化鈉，0.42％Tween 20和35％甲酰胺。
混合所有試劑后，將平板在40℃溫育15分鐘，然后用5個8W的燈泡(F8T5/350BL，Sylvania)池在300-370nm通過一個1.5mm的Pyrex濾光器光照射30分鐘，同時維持在40℃的溫育溫度下。
向各孔中加入鏈霉抗生物素蛋白包裹的順磁珠(75g，Dynal M280)，并在室溫下溫育30分鐘。
在每次下面的洗滌步驟中，將微量滴定板首先放在磁板上以便順磁珠聚集成小丸，吸去液體，將新溶液加入孔中，在該過程中重懸順磁珠。
首先，樣品用100μl洗滌液I(50mM氫氧化鈉和0.1％十二烷基磺酸鈉)洗滌。接著，樣品用200μl洗滌液II(1X SSC和0.1％ Tween 20)洗滌一次。
然后對樣品用不同組合的限制性酶進行兩次溫育和抗體偶聯物處理。使用的組合在表2中概括。在所有情況下使用相同的緩沖溶液，且限制性酶，微球菌核酸酶和抗體偶聯物，抗熒光素/堿性磷酸酶可以在溫育中省去或者分別包含，或者一起包含。
緩沖液是0.1M Tris(pH7.5)，0.1125M氯化鈉，0.5×SSC，1.0mM氯化鎂，1.0mM氯化鈣，0.1％Tween 20和0.25％牛血清白蛋白。使用的微球菌核酸酶的量是1個單位。抗熒光素/堿性磷酸酶以1/20,000的稀釋度使用。
在首次溫育中，向孔中加入50μl合適的緩沖液且在37℃下溫育30分鐘。然后用220μl洗滌液II洗滌樣品兩次。然后，在第二次溫育中，向孔中再加入50μl合適的緩沖液并在37℃下溫育30分鐘。
然后用220μl洗滌液II洗滌樣品4次。最后用100μl的AttophosTM替換洗滌溶液。底物在37℃溫育1小時，并在平板閱讀熒光計(PackardInstruments)中測量熒光信號。
I.用可檢測的半分子標記一個探針并使用下面的檢測方法1.通過熒光偏振分光術的均質性檢測。
2.質譜分析(MALDI，TOF，電噴射等)。
3.通過質量或電荷分離產物(即，色譜法或電泳)，接著熒光檢測，質譜分析，催化的報道分子沉積等。
II.用相互作用對的一個成員標記各探針并使用下面的檢測方法1.熒光共振能量轉移。
2.LOCI方法
III.用可檢測的半分子標記一個探針，用捕捉半分子標記另一個探針并使用下面的檢測方法1.捕捉半分子可以是，例如生物素，抗原，或受體反應物，這些物質可分別單獨導致該產物結合到含有，例如，抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，抗體或受體的固相支持物上。可檢測的半分子可以是直接可檢測的，例如，熒光團，放射性同位素或直接酶標記(例如，直接與探針結合的酶)或者是可間接檢測的，例如酶抗體偶聯物隨后結合到其上將酶的底物轉變成可檢測的產物的抗原。
探針對兩個探針含有一個探針對。在表1(參見上文)中，下列配對包含四個探針對(1，2)，(3，4)，(5，6)，和(7，8)。
設計探針對以便兩個探針與靶鄰近區雜交，這樣形成的探針-探針分支或莖包含一個三臂連接。在三臂連接的探針-探針分支或莖中，一個探針具有交聯的化合物和生物素標記，另一探針由胸苷堿基(交聯化合物反應物)，最后一個胸苷與四甘醇間隔區單位之間的硫代磷酸鍵和熒光素半分子組成。
以三種方式檢測各探針對，分別存在和不存在靶DNA(1)無酶消化。
(2)在消化后用抗體結合的酶消化。
(3)在消化期間用抗體結合的酶消化。
下面表2和3舉例說明了檢測探針的條件。
表2.下面概括了用于檢測各探針對的6種條件(A-F)。
表3.結果
對于所有這4個探針對，觀察到相似的結果。來自陰性樣品的非特異性信號減少(C和E與對照A相比)，在經過降解探針處理的樣品中靶特異性信號增強(D和F與對照B相比)。
比較不存在靶DNA(條件A，C，E)時觀察到的信號，用限制性核酸內切酶處理的樣品(C，E)產生的信號都較低且更均勻(C平均31.25；％ CV17.8.；E平均29.75；％CV14.1)。相反，在未處理的樣品中信號更強且變化更大(平均85.75；％CV42.4)。對樣品的酶消化在陰性樣品中產生更低的非特異性(“背景”)信號。
比較存在靶DNA(條件B，D，F)時觀察到的信號，用限制性核酸內切酶處理的樣品產生的信號比從未處理的樣品獲得的信號強50-300％。可推斷更強的信號，這歸功于作為酶降解過程的結果可檢測產物的大小和電荷顯著減小，從而為抗體偶聯物提供了更有利的結合配偶體或為隨后產生可檢測的熒光產物的酶反應提供更有利的環境。
本文提及的所有專利和出版物作為參考文獻引入本申請。
對本領域的技術人員顯而易見的是對本發明的各種修改和變化不會偏離本發明的范圍和實質。盡管結合具體的優選實施方案描述了本發明，應明白要求保護的本發明不應過分局限于該具體實施方案。事實上，對本領域的技術人員顯而易見的對于實施本發明的描述方式的各種修改包括在下面權利要求書的范圍內。
序列表<110> 魯埃爾，范阿塔(VanAtta，Reuel)戴維，阿爾巴格里(Albagli，David)邁克爾，伍德(Wood，Micheal)彼得，陳(Cheng，Peter)<120> 可降解的核酸探針和核酸檢測方法<130> 14251--0025<140> 09/551,305<141> 2000-04-18<160> 11<170> PatentIn version 3.0<210> 1<211> 25<212> DNA<213> cDNA<220><221> misc_feature<222> (25)..(25)<223> 生物素TEG連接到該序列的3’端。<220><221> misc_feature<222> (24)..(25)<223> 3-(7-香豆基)甘油插入位置24和25之間。<400> 1tctgccgatc catactgcgg aacaa25<210> 2<211> 26<212> DNA<213> cDNA<220><221> misc_feature<222> (11)..(11)<223> 字母m表示a或者c可在位置11處。<220><221> misc_feature<222> (1)..(1)<223> 熒光素亞磷酰胺和四甘醇通過硫代磷酸二酯鍵連接到5’端。<400> 2ttttcctagc mgcttgtttt gctcgc26<210> 3<211> 24<212> DNA<213> cDNA<220><221> misc_feature<222> (24)..(24)<223> 生物素TEG連接到該序列的3’端。<220><221> misc_feature<222> (23)..(24)<223> 3-(7-香豆基)甘油插入位置23和24之間。<400> 3tatatggatg atgtggtatt ggaa 24<210> 4<211> 24<212> DNA<213> cDNA<220><221> misc_feature<222> (20)..(20)<223> 字母r代表g或者a可在位置20處。<220><221> misc feature<222> (1)..(1)<223> 熒光素亞磷酰胺和四甘醇通過硫代磷酸二酯鍵連接到5’端。<400> 4tttgggccaa gtctgtacar catc 24<210> 5<211> 26<212> DNA<213> cDNA<220><221> misc_feature<222> (26)..(26)<223> 生物素TEG連接到該序列的3’端。<220><221> misc feature<222> (25)..(26)<223> 3-(7-香豆基)甘油插入位置25和26之間。<220><221> misc_feature<222> (19)..(19)<223> 字母y代表c或者t可在位置19處。<400> 5catttgttca gtggttcgya gggcaa26<210> 6<211> 27<212> DNA<213> cDNA<220><221> misc_feature<222> (1)..(1)<223> 熒光素亞磷酰胺和四甘醇通過硫代磷酸二酯鍵連接到5’端。<400> 6ttttttcccc cactgtttgg ctttcag 27<210> 7<211> 25<212> DNA<213> cDNA<220><221> misc_feature<222> (25)..(25)<223> 生物素TEG連接到該序列的3’端。<220><221> misc_feature<222> (24)..(25)<223> 3-(7-香豆基)甘油插入位置24和25之間。<400> 7cagagtctag actcgtggtg gacaa 25<210> 8<211> 22<212> DNA<213> cDNA<220><221> misc_feature<222> (1)..(1)<223> 熒光素亞磷酰胺和四甘醇通過硫代磷酸二酯鍵連接到5’端。<400> 8tttttctctc aattttctag gg22<210> 9<211> 27<212> DNA<213> cDNA<220><221> misc_feature<222> (26)..(27)<223> 3-(7-香豆基)甘油插入位置26和27之間。<220><221> misc_feature<222> (27)..(27)<223> 生物素TEG連接到該序列的3’端。<400> 9agcgccaaaa ttcgcagtcc ccaacaa 27<210> 10<211> 28<212> DNA<213> cDNA<220><221> misc_feature<222> (1)..(1)<223> 熒光素亞磷酰胺和四甘醇通過硫代磷酸二酯鍵連接到5’端。<400> 10tttctccaat cactcaccaa cctcttgt 28<210> 11<211> 58<212> DNA<213> cDNA<400> 11gatgctattc gcggttttaa gcgtcagggg ttggaggtta gtgagtggtt ggagaaca 58
權利要求
1.一種檢測樣品中靶核酸序列的方法，包括(i)在序列特異性雜交條件下將樣品與一對探針結合，其中每一探針在與所述靶核酸序列不互補的任一末端具有能通過與另一探針相互作用形成探針-探針分支的探針-探針分支形成區，與交聯化合物反應物在探針與所述靶核酸序列堿基配對后形成共價交聯的至少一個交聯化合物，和結合到至少一個探針上的至少一個可檢測的半分子，所述交聯化合物反應物位于探針對上一個探針的探針-探針分支形成區內，所述交聯化合物位于另一探針的探針-探針分支形成區內；(ii)光照射所述樣品以交聯鄰近探針對的探針-探針分支形成區；(iii)將探針的交聯的探針-探針分支形成區與靶互補區分離；和(iv)檢測至少一個分離的，交聯的探針-探針分支的存在，以作為在所述樣品中存在所述靶核酸序列的指示。
2.一種檢測樣品中靶核酸序列的方法，包括(i)在序列特異性雜交條件下將樣品與一對探針結合，其中每個探針在與所述靶核酸序列不互補的任一末端具有能通過與另一探針相互作用形成探針-探針分支的探針-探針分支形成區，位于探針對的第一探針上的探針-探針形成區內的第一交聯化合物，位于探針對的第二探針上的探針-探針分支形成區內的第二交聯化合物，和結合到至少一個探針上的至少一個可檢測的半分子；(ii)光照射所述樣品以交聯鄰近探針對的探針-探針分支形成區；(iii)將探針的交聯的探針-探針分支形成區與靶互補區分離；和(iv)檢測至少一個分離的，交聯的探針-探針分支的存在，以作為在所述樣品中存在所述靶核酸序列的指示。
3.權利要求1或2的方法，其中可檢測的半分子選自熒光素，熒光團，放射性同位素，抗原或酶。
4.權利要求1或2的方法，其中探針對由核糖核酸或脫氧核糖核酸組成。
5.權利要求1或2的方法，其中探針對的每個探針的探針-探針分支形成區含有至少兩個，優選大約2到大約8個形成堿基對的核苷酸。
6.權利要求1或2的方法，其中所述探針選自SEQ ID NO.1，SEQ IDNO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ IDNO.7，和SEQ ID NO.8。
7.權利要求1或2的方法，其中分離探針的交聯的探針-探針分支與靶互補區通過化學或酶降解實現。
8.權利要求1或2的方法，其中所述靶核酸序列是單鏈，雙鏈脫氧核糖核酸，或核糖核酸。
9.權利要求1或2的方法，其中所述靶核酸序列在與探針對同源的序列之間具有不超過大約2個核苷酸的缺口。
10.一種檢測樣品中靶核酸序列的方法，包括(i)在序列特異性雜交條件下將樣品與一對探針結合，其中每個探針具有能通過與另一探針相互作用形成探針-探針分支的在與所述靶核酸序列不互補的任一末端的探針-探針分支形成區，與交聯化合物反應物在探針與所述靶核酸序列堿基配對后形成共價交聯的至少一個交聯化合物，所述交聯化合物反應物位于探針對的一個探針的探針-探針分支形成區內，所述交聯化合物位于另一個探針的探針-探針分支形成區內，結合到一個探針上的至少一個信號報道基團，和結合到另一探針上的至少一個捕捉基團；(ii)光照射所述樣品以交聯鄰近探針對的探針-探針分支形成區；(iii)將探針的交聯的探針-探針分支形成區與靶互補區分離；和(iv)檢測至少一個分離的，交聯的探針-探針分支的存在，以作為在所述樣品中存在所述靶核酸序列的指示。
11.權利要求1或10的方法，其中交聯化合物選自香豆素，香豆素衍生物，3-(7-香豆基)甘油；補骨脂素，補骨脂素衍生物，8-甲氧基補骨脂素，5-甲氧基補骨脂素；順式苯并二吡喃酮，順式苯并二吡喃酮衍生物；反式-苯并二吡喃酮，反式-苯并二吡喃酮衍生物；和含有融合的香豆素-噌啉環系統的化合物。
12.權利要求1或10的方法，其中交聯化合物反應物選自嘧啶和嘧啶衍生物。
13.一種檢測樣品中靶核酸序列的方法，包括(i)在序列特異性雜交條件下將樣品與一對探針結合，其中每個探針具有能通過與另一探針相互作用形成探針-探針分支的在與所述靶核酸序列不互補的任一末端的探針-探針分支形成區，位于探針對的第一探針的探針-探針形成區內的第一交聯化合物，位于探針對的第二探針的探針-探針分支形成區內的第二交聯化合物，結合到一個探針上的至少一個信號報道基團，和結合到另一探針上的至少一個捕捉基團；(ii)光照射所述樣品以交聯鄰近探針對的探針-探針分支形成區；(iii)將探針的交聯的探針-探針分支形成區與靶互補區分離；和(iv)檢測至少一個分離的，交聯的探針-探針分支的存在，以作為在所述樣品中存在所述靶核酸序列的指示。
14.權利要求10或13的方法，其中該信號報道基團選自熒光素，熒光團，放射性同位素，抗原，或酶。
15.權利要求10或13的方法，其中捕捉基團選自生物素，抗原或受體反應物。
16.權利要求2或13的方法，其中交聯化合物選自芳香基烯烴和芳香基烯烴衍生物。
17.一種核酸探針，包含(i)與靶序列區堿基配對的靶互補區；(ii)不與靶序列雜交的探針-探針分支形成區；(iii)在探針與靶序列堿基配對后，與位于第二探針的探針-探針分支形成區內的至少一個交聯化合物反應物能形成共價交聯的至少一個交聯化合物，該交聯化合物位于探針-探針分支形成區內；(iv)結合到至少一個探針的探針-探針分支形成區上的至少一個可檢測的半分子；和(v)在靶互補區和探針-探針分支形成區之間的降解位點。
18.一種核酸探針，包含(i)與靶序列區堿基配對的靶互補區；(ii)不與靶序列雜交的探針-探針分支形成區；(iii)在探針與靶序列堿基配對后，與位于第二探針的探針-探針分支形成區內的第二交聯化合物能形成共價交聯的第一交聯化合物，該第一交聯化合物位于探針-探針分支形成區內；(iv)結合到至少一個探針的探針-探針分支形成區上的至少一個可檢測的半分子；和(v)在靶互補區和探針-探針分支形成區之間的降解位點。
19.權利要求17或18的核酸探針，其中所述核酸探針具有從大約15到大約50個核苷酸的序列長度。
20.一種核酸探針對，包含(i)與靶序列區堿基配對的各探針上的靶互補區；(ii)不與靶序列雜交的各探針上的探針-探針分支形成區；(iii)在探針與靶序列堿基配對后，與位于所述核酸探針對的另一探針的探針-探針分支形成區內的至少一個交聯化合物反應物能形成共價交聯的至少一個交聯化合物，該交聯化合物位于探針-探針分支形成區內；(iv)結合到所述核酸探針對的至少一個探針的探針-探針分支形成區上的至少一個可檢測的半分子；和(v)在靶互補區和探針-探針分支形成區之間的降解位點。
21.一種核酸探針對，包含(i)與靶序列區堿基配對的各探針上的靶互補區；(ii)不與靶序列雜交的各探針上的探針-探針分支形成區；(iii)在探針與靶序列堿基配對后，與位于所述核酸探針對的另一探針的探針-探針分支形成區內的至少一個交聯化合物反應物能形成共價交聯的至少一個交聯化合物，該交聯化合物位于探針-探針分支形成區內；(iv)結合到所述核酸探針對的一個探針的探針-探針分支形成區上的至少一個信號報道基團，和結合到所述核酸探針對的另一探針的探針-探針分支形成區上的至少一個捕捉基團；和(v)在靶互補區和探針-探針分支形成區之間的降解位點。
22.一種核酸探針對，包含(i)與靶序列區堿基配對的各探針上的靶互補區；(ii)不與靶序列雜交的各探針上的探針-探針分支形成區；(iii)在探針與靶序列堿基配對后，與位于所述核酸探針對的另一探針的探針-探針分支形成區內的第二交聯化合物能形成共價交聯的第一交聯化合物，該第一交聯化合物位于一個探針的探針-探針分支形成區內；(iv)結合到所述核酸探針對的至少一個探針的探針-探針分支形成區上的至少一個可檢測的半分子；和(v)在靶互補區和探針-探針分支形成區之間的降解位點。
23.一種核酸探針對，包含(i)與靶序列區堿基配對的各探針上的靶互補區；(ii)不與靶序列雜交的各探針上的探針-探針分支形成區；(iii)在探針與靶序列堿基配對后，與位于所述核酸探針對的另一探針的探針-探針分支形成區內的第二交聯化合物反應時能形成共價交聯的第一交聯化合物，該第一交聯化合物位于一個探針的探針-探針分支形成區內；(iv)結合到所述核酸探針對的一個探針的探針-探針分支形成區上的至少一個信號報道基團，和結合到所述核酸探針對的另一探針的探針-探針分支形成區上的至少一個捕捉基團；和(v)在靶互補區和探針-探針分支形成區之間的降解位點。
24.權利要求20-23中任一項的核酸探針對，其中所述核酸探針對的各探針具有從大約15到大約50個核苷酸的序列長度。
25.一種核酸探針對，包含下列探針-探針分支 X＝YN(b) N(b)(i)其中L和L’中至少一個存在且是一種標記物；(ii)其中N是核酸；(iii)其中a和b是表示N的數目的獨立的整數；(iv)其中X是第一交聯化合物；(v)其中Y是第二交聯化合物或交聯化合物反應物；和(vi)其中第一交聯化合物與第二交聯化合物或與交聯化合物反應物共價結合以永久連接所述探針-探針分支。
26.一種核酸探針對，包含下列探針-探針分支 X＝YP(b) P’(b)(i)其中L和L’中至少一個存在且是一種標記物；(ii)其中P是嘌呤或嘌呤衍生物；(iii)其中P’是嘧啶或嘧啶衍生物；(iv)其中a和b是表示P和P’的數目的獨立的整數；(v)其中X是交聯化合物；(vi)其中Y是交聯化合物反應物；和(vii)其中交聯化合物與交聯化合物反應物共價結合以永久連接所述探針-探針分支。
27.權利要求25或26的核酸探針對，其中L是信號報道基團且L’是捕捉基團。
28.權利要求25或26的核酸探針對，其中所述信號報道基團選自熒光素，熒光團，放射性同位素，抗原或酶。
29.權利要求25或26的核酸探針對，其中所述捕捉基團選自生物素，抗原，或受體反應物。
30.權利要求25或26的核酸探針對，其中探針對的每個探針具有其中a＝0-20和b＝0-80的序列長度。
31.權利要求25或26的核酸探針對，其中交聯化合物選自香豆素，香豆素衍生物，3-(7-香豆基)甘油；補骨脂素，補骨脂素衍生物，8-甲氧基補骨脂素，5-甲氧基補骨脂素；順式苯并二吡喃酮，順式苯并二吡喃酮衍生物；反式-苯并二吡喃酮，反式-苯并二吡喃酮衍生物；含有融合的香豆素-噌啉環系統的化合物；芳香基烯烴，和芳香基烯烴衍生物。
32.權利要求25或26的核酸探針對，其中交聯化合物反應物選自嘧啶，嘧啶衍生物，嘌呤，和嘌呤衍生物。
全文摘要
本文描述了易于被化學劑或酶降解的核酸探針。另外，公開了在靶核酸序列檢測中使用該探針的試驗和方法。可降解的探針的靶特異性雜交區或靶互補區可經過降解方法從可檢測區分離。可降解的探針的剩下部分可容易地被檢測到。使用本文所述可降解的探針通過降低核酸檢測試驗和方法中的背景特異性或非特異性信號可提高信噪比。
文檔編號C12N15/09GK1432069SQ01810638
公開日2003年7月23日 申請日期2001年4月18日 優先權日2000年4月18日
發明者魯埃爾·范阿塔, 戴維·阿爾巴格里, 邁克爾·L·伍德, 彼得·C·陳 申請人:納克斯科公司