Atp再生反應(yīng)系統(tǒng)、利用該系統(tǒng)的腺苷酸的檢驗方法、rna檢測方法和atp放大方法

專利名稱：Atp再生反應(yīng)系統(tǒng)、利用該系統(tǒng)的腺苷酸的檢驗方法、rna檢測方法和atp放大方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，以及利用該系統(tǒng)的腺苷酸的檢驗方法、RNA檢測方法以及ATP放大方法更詳細地講，本發(fā)明涉及在動植物的代謝和生物合成系統(tǒng)中生成的ATP、ADP、AMP或它們的混合物等所謂的腺苷酸的檢驗方法，本發(fā)明可應(yīng)用于例如通過生物發(fā)光來測定ATP(腺苷三磷酸)，在食品加工廠等中通過檢測肉眼看不見的微生物來檢驗清潔度，以及測定食用肉、鮮魚、蔬菜等食物的鮮度。
本發(fā)明還涉及用于檢測核糖核酸(RNA)的，特別是用于檢測存在于高等生物細胞中的與蛋白質(zhì)合成有重要關(guān)系的信使核糖核酸(mRNA)、核糖體核糖核酸(rRNA)、轉(zhuǎn)運核糖核酸(tRNA)的方法。
另外，本發(fā)明還涉及能使動植物的代謝和生物合成系統(tǒng)中生成的ATP量級聯(lián)放大的方法，通過利用該方法檢測生物發(fā)光，可以檢測出以往不能檢測的極微量的ATP，所以可應(yīng)用于在食品加工廠等中通過檢測肉眼看不見的微生物來檢驗清潔度，以及測定食用肉、鮮魚、蔬菜等食物的鮮度。
背景技術(shù)：
ATP(腺苷三磷酸)是活生物的指標。因此，通過將來自微生物的ATP用于生物發(fā)光，可進行以光作為指標的微生物的衛(wèi)生檢驗(例如特公平6-34757號公報、特許第1911659號)。然而，對于微量微生物，由ATP產(chǎn)生的生物發(fā)光不足以進行上述檢驗。
例如，將作為催化劑的酶(例如來自發(fā)光昆蟲的熒光素酶)作用于微生物污染的指標成分ATP時，已知可以產(chǎn)生熒光發(fā)光。然而，在上述熒光發(fā)光的測定中，存在著發(fā)光的穩(wěn)定性差、發(fā)出的光在非常短的時間內(nèi)就消失的缺點。因此為了獲得靈敏度和精度，需要對反應(yīng)時間進行嚴密控制，以及為了捕獲短時間內(nèi)就會消失的發(fā)光，需要特別的光度計等。
特開平8-47399號公報中公開了特征為“在測定熒光素酶作用下產(chǎn)生的生物發(fā)光的方法中，在共存多磷酸化合物或其鹽、以及巰基化合物的條件下進行生物發(fā)光反應(yīng)”的技術(shù)。利用該技術(shù)，可獲得生物發(fā)光的穩(wěn)定性等新型效果，進而有可能通過使用常規(guī)光度計進行生物發(fā)光的測定，并具有提高普及率的效果。上述特開平8-47399號公報中使用的多磷酸化合物是三多磷酸、焦磷酸等三磷酸、二磷酸或它們的鹽。
然而，上述特開平8-47399號公報公開的方法由于沒有ATP新的再生系統(tǒng)，所以存在著隨著ATP的消耗，發(fā)光隨時間推移而衰減的缺點。因此，為了使發(fā)光量不衰減并持續(xù)穩(wěn)定，人們不得不進行底物濃度、氧濃度、pH、溫度的研究。
另一方面，特開平9-234099號公報中公開了通過生物發(fā)光法對環(huán)AMP進行定量的方法。
該方法的特征在于，包括用3’5’-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶對環(huán)AMP進行水解，進而在反應(yīng)體系中生成AMP的“反應(yīng)1”；在鎂離子、微量ATP存在下，將腺苷酸激酶作用于該AMP，使AMP轉(zhuǎn)換為ADP的“反應(yīng)2”；在鎂離子、磷酸烯醇式丙酮酸存在下，將丙酮酸激酶作用于該ADP，使ADP轉(zhuǎn)換為ATP和丙酮酸的“反應(yīng)3”；在熒光素、鎂離子(或其它金屬離子)以及溶解氧的存在下，將熒光素酶作用于ATP，進而產(chǎn)生發(fā)光的“反應(yīng)4”；通過測定“反應(yīng)4”中產(chǎn)生的發(fā)光量，對環(huán)AMP進行定量的方法(Methods in Enzymology 38，62-65；1974)。
然而，該方法由于將由環(huán)AMP轉(zhuǎn)換的AMP轉(zhuǎn)換為ADP后，在磷酸烯醇式丙酮酸存在下，再將丙酮酸激酶作用于該ADP并最終生成ATP，所以存在以下問題。即，一分子的磷酸烯醇式丙酮酸中只含有一個磷酸基(-PO3--)，因此由ADP向ATP的轉(zhuǎn)換不充分，為了大量再生ATP，必須大量補充磷酸烯醇式丙酮酸，所以不經(jīng)濟。
另外，磷酸烯醇式丙酮酸具有非常不耐熱且容易分解的性質(zhì)，將餐飲場所等剛煮熟的食物作為被檢驗物時，將含有磷酸烯醇式丙酮酸的試劑加到被檢驗物中的話，磷酸烯醇式丙酮酸就會分解，進而有可能導(dǎo)致由ADP向ATP的轉(zhuǎn)換不充分(對于產(chǎn)品溫度處于60～70℃左右的被檢驗物，可以使用耐熱性酶進行測定)。就是說，有可能導(dǎo)致由ATP產(chǎn)生的熒光發(fā)光穩(wěn)定性差且發(fā)光在非常短時間內(nèi)消失的問題。
另外，被檢驗物中一般都存在著數(shù)種細菌，如果在該細菌中存在分解磷酸烯醇式丙酮酸的酶，就有可能導(dǎo)致無法補充磷酸，以及由ADP向ATP的轉(zhuǎn)換不充分的問題。
在特公昭53-5752號公報和再公表特許WO98/48031中，公開了利用ATP的再生反應(yīng)系統(tǒng)便宜地制備ATP的方法。特公昭53-5752號公報所述的方法的特征在于，將多磷酸合成酶以及腺苷酸激酶作用于AMP、ADP和多磷酸化合物。該方法是將多磷酸合成酶作用于1分子ADP和多磷酸化合物進而生成1分子ATP，然后將腺苷酸激酶作用于該1分子ATP和1分子AMP進而生成2分子ADP，再將多磷酸合成酶作用于該2分子ADP進而生成2分子ATP。由于該方法的目的是由AMP大量合成ATP，所以考慮到含有很多作為雜質(zhì)的ADP，不能應(yīng)用于通過檢測微量存在的ATP來檢驗清潔度以及測定食物的鮮度。
再公表特許WO98/48031所述的方法的特征在于，將多磷酸合成酶以及腺苷酸激酶作用于AMP和多磷酸化合物。利用該方法，在使用ATP的酶反應(yīng)體系中，不用添加高價的ATP，而是由便宜的AMP制備ATP，或可使消耗的ATP有效地再生。然而該ATP的制備方法即使在反應(yīng)當初不存在ATP時，也能由便宜的AMP制備ATP，因此該方法不能應(yīng)用于通過檢測微量存在的ATP來檢驗清潔度或測定食物的鮮度。
目前，已知存在于高等生物細胞中并參與蛋白質(zhì)合成的核糖核酸(RNA)起著將來自DNA的遺傳信息傳遞給其它細胞的介導(dǎo)作用(廣海啟太郎著《在實驗中學(xué)習(xí)生物化學(xué)》，p205，化學(xué)同人，1987.7.10)。已明確在細胞質(zhì)內(nèi)合成的蛋白質(zhì)是由核DNA的堿基序列次序決定的。遺傳密碼，即，已知為編碼三聯(lián)體(三聯(lián)子密碼)的3個不重復(fù)的堿基組合規(guī)定了各個氨基酸。并且，遺傳信息通過稱為信使(郵差)RNA(mRNA)的中介分子，從核傳遞到核糖體上的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。該分子攜有與核DNA互補的堿基序列，與編碼三聯(lián)體對應(yīng)的mRNA上的3個堿基的組合已知為密碼子，DNA首先在第1階段起著合成mRNA的“模板”的作用。
上述mRNA被轉(zhuǎn)運到核糖體，借助于tRNA的幫助，合成特定的蛋白質(zhì)。對于這樣的RNA在知道其組成后，可廣泛地應(yīng)用于與人們健康有關(guān)的領(lǐng)域(例如，疾病的診斷或治療藥的開發(fā))以及檢測食品中細菌污染的領(lǐng)域(清潔度檢驗)等，并且，最近在代謝和生物合成的領(lǐng)域也引起了人們的注目。
檢測RNA組成的技術(shù)眾所周知，例如，通過離心分離從酵母中分離RNA，然后用紫外分光光度計(色譜)測定吸收光譜的方法，以及在水解RNA后，通過電泳分離測定核苷酸的吸收光譜的方法等已廣為人知。
特公平8-2320號公報中公開了測定樣品中具有3’-末端多聚核糖腺苷酸片段的多核苷酸的方法。該方法包括以下步驟。(a)在無機磷酸存在下，用多核苷酸磷酸酶對樣品中的核酸進行消化，然后將3’-末端多聚核糖腺苷酸片段轉(zhuǎn)化為含有ADP的多聚核糖核苷二磷酸的步驟；(b)消化步驟(a)生成的ADP經(jīng)磷酸化后，制備ATP的步驟；以及(c)檢測磷酸化步驟(b)中生成的ATP或磷酸化步驟的副產(chǎn)物的步驟。具有3’-末端多聚核糖腺苷酸的多核苷酸是真核生物mRNA時，檢測ATP的步驟中，在熒光素酶的存在下與熒光素反應(yīng)，進而產(chǎn)生生物發(fā)光反應(yīng)并檢測ATP量的技術(shù)也已經(jīng)公開。
通過上述方法，可以通過ATP產(chǎn)生的生物發(fā)光來檢測真核生物mRNA的組成。另外，通過將mRNA消化為AMP或ADP，以及由ADP向ATP的磷酸化，可以定量各成分。
如上所述，通過依賴于ATP的酶反應(yīng)中的生物發(fā)光來檢測真核生物的mRNA組成的技術(shù)雖然在特公平8-2320號公報中已經(jīng)公開，但其中所述的生物發(fā)光的測定就象前面提到的那樣，存在著發(fā)光的穩(wěn)定性差且發(fā)光在非常短時間內(nèi)消失的缺點，以及存在著為了獲得靈敏度和精度，需要對反應(yīng)時間進行嚴密控制，以及為了捕獲短時間內(nèi)消失的發(fā)光，需要使用特別的光度計的問題。
特開平11-69997號公報中描述了除作為污染指標成分的ATP以外，還可以同時測定用以往的熒光素和熒光素酶發(fā)光試劑難以測定的ADP、AMP以及RNA，并且即使有少量污染也可以高靈敏度地進行檢測，并可精確地進行清潔度評價的清潔度檢驗試劑和使用該試劑的清潔度檢驗方法。利用該方法測定RNA時，通過RNA分解酶由RNA生成5’-單核苷酸(AMP、GMP、CMP和UMP)，將生成的單核苷酸中的AMP轉(zhuǎn)換為ATP，然后在熒光素存在下將熒光素酶作用于該ATP，并通過測定發(fā)光量來測定RNA。在該反應(yīng)體系中，在最終步驟中由于生成AMP和焦磷酸，而它們又可再生成ATP，所以在一系列的ATP轉(zhuǎn)換反應(yīng)體系中生成的發(fā)光沒有衰減，仍維持高水平，至少能穩(wěn)定10分鐘。該ATP再生系統(tǒng)是將丙酮酸正磷酸二激酶作用于AMP、焦磷酸以及磷酸烯醇式丙酮酸的系統(tǒng)。然而，就象上面提到的那樣，1分子磷酸烯醇式丙酮酸只含有一個磷酸基，使得由AMP向ATP的轉(zhuǎn)換不充分，因此為了大量再生ATP，必須大量補充磷酸烯醇式丙酮酸，所以不經(jīng)濟。另外，由于磷酸烯醇式丙酮酸具有非常不耐熱且容易分解的性質(zhì)，所以在添加到高溫的被檢驗物中時容易被分解，進而有可能導(dǎo)致由AMP向ATP的轉(zhuǎn)換不充分，ATP產(chǎn)生的熒光發(fā)光穩(wěn)定性差且發(fā)光在非常短的時間內(nèi)消失的問題。
發(fā)明的公開本發(fā)明的第一個目的在于，提供新型的ATP再生系統(tǒng)。
本發(fā)明的第二個目的在于，提供腺苷酸的檢驗方法。
本發(fā)明的第三個目的在于，提供RNA的檢測方法。
本發(fā)明的第四個目的在于，提供ATP的放大方法。
本發(fā)明提供如下所示的ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，以及利用該系統(tǒng)的腺苷酸檢驗方法，RNA的檢測方法以及ATP的放大方法。(1)ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，其特征在于，在微量ATP存在下，將腺苷酸激酶作用于AMP，使AMP轉(zhuǎn)換為2分子ADP，然后在多磷酸化合物(n)(式中n是該多磷酸化合物中存在的磷酸基數(shù))存在下，將多磷酸合成酶作用于該2分子ADP，使其轉(zhuǎn)換為2分子的ATP和1分子的多磷酸化合物(n-2)。(2)ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，其特征在于，在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))的存在下，將磷酸基轉(zhuǎn)移酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換為ADP和多磷酸化合物(n-1)，然后在該多磷酸化合物(n-1)的存在下，將多磷酸合成酶作用于上述ADP，使其轉(zhuǎn)換為ATP和多磷酸化合物(n-2)。(3)依賴于生物發(fā)光的腺苷酸的檢驗方法，該方法是在熒光素和溶解氧存在下，將熒光素酶作用于ATP，進而生成AMP并發(fā)光，通過測定生成的發(fā)光量對腺苷酸進行檢驗的方法；其特征在于，具備在微量的ATP存在下，將腺苷酸激酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換為2分子的ADP，然后在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))存在下，將多磷酸合成酶作用于該2分子ADP，使其轉(zhuǎn)換為2分子ATP和1分子多磷酸化合物(n-2)的ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，該ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的特征在于，微量ATP為來自污染的ATP。(4)依賴于生物發(fā)光的腺苷酸的檢驗方法，該方法是在熒光素和溶解氧存在下，將熒光素酶作用于ATP，進而生成AMP并發(fā)光，通過測定生成的發(fā)光量對腺苷酸進行檢驗的方法；其特征在于，具備在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))存在下，將磷酸基轉(zhuǎn)移酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換為ADP和多磷酸化合物(n-1)，然后在該多磷酸化合物(n-1)存在下，將多磷酸合成酶作用于上述ADP，使其轉(zhuǎn)換為ATP和多磷酸化合物(n-2)的ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)。(5)依賴于生物發(fā)光檢測RNA的方法，該方法是通過RNA分解酶對樣品中的RNA進行分解，進而得到單核苷酸，將該單核苷酸中的AMP轉(zhuǎn)換為ATP，并在熒光素和溶解氧存在下，將熒光素酶作用于該ATP，測定生成的發(fā)光量對RNA中的AMP進行定量的方法；其特征在于，具備在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))存在下，將磷酸基轉(zhuǎn)移酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換ADP和多磷酸化合物(n-1)，然后在該多磷酸化合物(n-1)存在下，將多磷酸合成酶作用于上述ADP，使其轉(zhuǎn)換為ATP和多磷酸化合物(n-2)的ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)。(6)級聯(lián)放大ATP的方法，其特征在于，反復(fù)進行在微量ATP存在下，將腺苷酸激酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換為2分子ADP，然后在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))存在下，將多磷酸合成酶作用于該2分子ADP，使其轉(zhuǎn)換為2分子ATP和1分子多磷酸化合物(n-2)的步驟。(7)腺苷酸的檢驗方法，該方法是在熒光素和溶解氧存在下，將熒光素酶作用于ATP，進而生成AMP并發(fā)光，然后通過測定生成的發(fā)光量對腺苷酸進行檢驗的方法；其特征在于，反復(fù)進行在被檢驗物中含有的ATP存在下，將腺苷酸激酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換為2分子ADP，然后在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))存在下，將多磷酸合成酶作用于該2分子ADP，使其轉(zhuǎn)換為2分子ATP和1分子多磷酸化合物(n-2)的步驟，將ATP級聯(lián)放大后，在熒光素和溶解氧存在下，將熒光素酶作用于放大的ATP，進而生成AMP并發(fā)光。
附圖的簡單說明

圖1是在本發(fā)明的第1個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)中ATP濃度為1.65μM時，本發(fā)明和以往系統(tǒng)之間的相對發(fā)光量隨時間的變化圖。
圖2是在本發(fā)明的第2個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)中，研究ATP濃度隨時間變化的圖。
圖3是在腺苷酸的測定中用或不用本發(fā)明的第2個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)時，相對發(fā)光量隨時間的變化圖。
圖4是用本發(fā)明的第2個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，并通過生物發(fā)光檢測RNA的結(jié)果圖。
圖5是用純化的多磷酸合成酶(PPK[1])(圖6(a))以及除去ADP的多磷酸合成酶(PPK[2])(圖6(b)，研究添加ATP(+ATP)和不添加ATP(-ATP)時發(fā)光隨時間變化的圖。
圖6是在改變多磷酸、AMP濃度的ATP再生系統(tǒng)中，研究添加ATP(+ATP)和不添加ATP(-ATP)時發(fā)光隨時間變化的圖。(a)中多磷酸為900μM、AMP為600μM，(b)中多磷酸為900μM、AMP為60μM，(c)中多磷酸為90μM，AMP為600μM。
圖7是通過本發(fā)明的ATP級聯(lián)放大反應(yīng)生成的ATP濃度隨時間的變化圖。
實施發(fā)明的最好的模式首先，就本發(fā)明的第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)進行說明。
本發(fā)明的第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的特征在于，在微量ATP存在下，將腺苷酸激酶作用于AMP，使AMP轉(zhuǎn)換為2分子ADP，然后在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))存在下，將多磷酸合成酶作用于該2分子ADP，使其轉(zhuǎn)換為2分子ATP和1分子多磷酸化合物(n-2)。
本發(fā)明中使用的多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))，優(yōu)選n為10～1000。作為這種多磷酸化合物的例子，例如化學(xué)合成的10～100個磷酸基聚合成直鏈狀的多磷酸。使用這種多磷酸化合物，由ADP可很容易地轉(zhuǎn)換為ATP，且再生ATP時只需補充少量多磷酸，所以經(jīng)濟。另外，這種多磷酸化合物由于磷酸基聚合成直鏈狀，所以具有耐熱性，即使添加到產(chǎn)品溫度為60～70℃左右的被檢驗物中也不容易分解，使得穩(wěn)定測定成為可能。另外，由于磷酸基直鏈狀聚合，所以細菌中存在酶時也難于分解。
本發(fā)明中使用的多磷酸化合物可以是來自細菌的多磷酸化合物。作為這種多磷酸化合物(n)的例子，例如n為10～1000的多磷酸化合物。這種多磷酸化合物由于10～1000個磷酸基直鏈狀聚合，所以具有優(yōu)良的耐熱性和抗菌性。
作為本發(fā)明中使用的多磷酸化合物的其它例子，例如將多磷酸合成酶作用于ATP而生物合成的產(chǎn)物。通過提高多磷酸化合物的收率，可以使多磷酸化合物的造價降低。
上述多磷酸化合物的生物合成，例如可以利用特開平5-153993號公報等公開的以往的多磷酸化合物的制備方法。使用該方法，在以抑制酶失活為目的的鎂等金屬離子存在下，將多磷酸合成酶作用于ATP和多磷酸化合物(n)，進而生物合成多磷酸化合物(n+1)。
本發(fā)明中使用的多磷酸合成酶具有作用于多磷酸和ADP進而合成ATP，并且不存在ADP、但ATP過剩時，可作用于ATP進而合成多磷酸和ADP的性質(zhì)。
本發(fā)明的第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)是必須要有微量ATP存在的反應(yīng)系統(tǒng)，并且，由于含有將ADP轉(zhuǎn)換為ATP的步驟，所以使用的多磷酸合成酶優(yōu)選不含雜質(zhì)、特別是不要含有ATP和ADP。通?？少彽玫奈⑸锒嗔姿岷铣擅钢杏捎诤蠥TP和ADP，所以優(yōu)選使用對其進行純化處理，盡可能地降低ATP和ADP濃度的酶。特別是將本發(fā)明的第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)用于本發(fā)明的依賴于生物發(fā)光的腺苷酸檢驗方法中時，使用的多磷酸合成酶中ATP或ADP的濃度越高，該檢驗方法的精度就越低。因此，其中的ATP濃度優(yōu)選在10pM以下，更有選在1pM以下，最優(yōu)選完全不含ATP，ADP濃度優(yōu)選在10pM以下，更有選在1pM以下，最優(yōu)選完全不含ADP。
通常，4分子多磷酸合成酶結(jié)合1分子ADP，這成了ADP混入的主要原因。因此，最好使用將多磷酸合成酶(10～100μg/ml)與0.1mM多磷酸化合物混合后，于37℃保溫10分鐘，進而將ADP轉(zhuǎn)換為ATP并除去ADP后，混合下述生物發(fā)光試劑盒，一直純化到檢測不出ATP為止的多磷酸化合物。
同樣，腺苷酸激酶也優(yōu)選使用經(jīng)純化處理，盡可能使ATP和ADP濃度降低的腺苷酸激酶。進而，其中的ATP濃度優(yōu)選在10pM以下，更優(yōu)選在1pM以下，最優(yōu)選完全不含ATP，ADP濃度優(yōu)選在10pM以下，更優(yōu)選在1pM以下，最優(yōu)選完全不含ADP。
本發(fā)明的第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的溫度通常為30～50℃，時間為10～100分鐘左右比較合適。第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的腺苷酸激酶的濃度為1000～30000單位(一個單位是在37℃、1分鐘內(nèi)生成1pmol的ADP所需的酶活性)、多磷酸化合物(n)的濃度為100～1000μM、多磷酸合成酶的濃度為100～10000單位(一個單位是在37℃、1分鐘內(nèi)生成1pmol的ATP所需的酶活性)。
以下，就本發(fā)明的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)進行說明。
本發(fā)明的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的特征在于，在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))的存在下，將磷酸基轉(zhuǎn)移酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換為ADP和多磷酸化合物(n-1)，然后在該多磷酸化合物(n-1)的存在下，將多磷酸合成酶作用于上述ADP，使其轉(zhuǎn)換為ATP和多磷酸化合物(n-2)。
在第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)中使用的多磷酸化合物(n)與在本發(fā)明的第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)中使用的多磷酸化合物(n)相同。
本發(fā)明的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)中使用的磷酸基轉(zhuǎn)移酶以及多磷酸合成酶也優(yōu)選使用經(jīng)純化處理，使ATP和ADP濃度盡可能降低的酶。因此，磷酸基轉(zhuǎn)移酶的ATP濃度優(yōu)選在10pM以下，更優(yōu)選在1pM以下，最優(yōu)選完全不含ATP，而ADP濃度優(yōu)選在10pM以下，更優(yōu)選在1pM以下，最優(yōu)選完全不含ADP。多磷酸合成酶的ATP濃度以及ADP濃度和上述相同。
本發(fā)明的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的溫度通常為30～50℃，時間為10～100分鐘左右比較合適。第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的多磷酸化合物(n)的濃度為100～1000μM，AMP的濃度為10～1000μM，磷酸基轉(zhuǎn)移酶的濃度為100～10000單位(一個單位是在37℃、1分鐘內(nèi)生成1pmol的ADP所需的酶活性)，多磷酸合成酶的濃度為100～10000單位(一個單位是在37℃、1分鐘內(nèi)生成1pmol的ATP所需的酶活性)比較合適。
以下，就本發(fā)明的腺苷酸的第一個檢驗方法進行說明。
本發(fā)明的腺苷酸的第一個檢驗方法是在熒光素和溶解氧存在下，將熒光素酶作用于ATP，進而生成AMP并發(fā)光，通過測定生成的發(fā)光量對腺苷酸進行檢驗的方法；其特征在于，具備本發(fā)明的第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)。
以下反應(yīng)過程給出了本發(fā)明的腺苷酸第一個檢驗方法。
(1)通過熒光素酶進行的發(fā)光反應(yīng)3ATP+熒光素+溶解氧→AMP+氧化型熒光素+發(fā)光+焦磷酸+CO2第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)(2)通過腺苷酸激酶進行的反應(yīng)微量ATP+AMP→2ADP(3)通過多磷酸合成酶進行的反應(yīng)
2ADP+多磷酸化合物(n)→2ATP+多磷酸化合物(n-2)在上述反應(yīng)過程中，如(1)所示，將熒光素酶作用于ATP、熒光素、溶解氧以及以抑制酶失活為目的的鎂離子等金屬粒子，產(chǎn)生生成AMP、焦磷酸、氧化型熒光素、二氧化碳及發(fā)光的反應(yīng)，通過測定由熒光素酶作用而產(chǎn)生的光，可以對作為污染指標成分的ATP進行檢測、以及對食品加工廠等的清潔度進行判定。
如果不存在ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，隨著ATP的消耗，反應(yīng)(1)終止，發(fā)光也消失。因此，在本發(fā)明中使用了新的第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)。
上述第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)包括將腺苷酸激酶(ADK)作用于ATP和反應(yīng)(1)生成的AMP，使其轉(zhuǎn)換為2分子ADP的反應(yīng)(2)，和在以抑制酶失活為目的的鎂離子等金屬離子、多磷酸化合物(n)存在下，將多磷酸合成酶(PPK)作用于上述2分子ADP，使其轉(zhuǎn)換為2分子ATP和1分子多磷酸化合物(n-2)的反應(yīng)(3)。
該反應(yīng)的要點敘述如下。首先，通過反應(yīng)(1)消耗ATP，發(fā)光并生成AMP。該AMP在腺苷酸激酶(ADK)存在下，與系統(tǒng)中殘存的ATP反應(yīng)，轉(zhuǎn)換為2分子的ADP(反應(yīng)(2))。該2分子ADP在多磷酸合成酶(PPK)存在下，與1分子多磷酸化合物(n)反應(yīng)，消耗2分子磷酸，生成2分子ATP和1分子多磷酸化合物(n-2)(反應(yīng)(3))。另外，該反應(yīng)可以認為是2分子ADP與2分子多磷酸化合物(n)反應(yīng)，消耗2分子的磷酸，進而生成了2分子ATP和2分子多磷酸化合物(n-1)。在本說明書中，按照前者的反應(yīng)式進行了說明，但本發(fā)明并不限定于該反應(yīng)式。
然后，該ATP再供給到反應(yīng)(1)，在消耗ATP并發(fā)光的同時，ATP的一部分供給到反應(yīng)(2)，用于AMP向ADP的轉(zhuǎn)換。以下，作為ATP消耗系統(tǒng)的反應(yīng)(1)和作為ATP再生系統(tǒng)的反應(yīng)(2)和反應(yīng)(3)同時連續(xù)反復(fù)進行，該反應(yīng)只要存在多磷酸化合物就可繼續(xù)進行。實際上持續(xù)至多磷酸化合物(n)的磷酸分子數(shù)n達到3左右。此時，作為起始原料使用的多磷酸化合物(n)是n為10以上的化合物，即，使用10個以上磷酸直鏈狀聚合形成的化合物。例如，如果在反應(yīng)系統(tǒng)中含有濃度為200～300μM左右的n在40～80左右的多磷酸化合物，發(fā)光就可以延續(xù)10分鐘以上、且穩(wěn)定，1小時以后也不會完全消失。但n小于9時，為了使發(fā)光長時間持續(xù)，必須要多加。
利用本發(fā)明的第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的腺苷酸檢驗方法的溫度通常為30～50℃，時間為10～100分鐘左右比較合適。在該方法中，熒光素和熒光素酶可以利用含有二者的市售試劑盒，溶解氧可以利用空氣中的氧。其它試劑的濃度與第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)中的濃度相同。
本發(fā)明的腺苷酸第一個檢驗方法由于具備本發(fā)明的第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，所以不僅生物發(fā)光的光量增大，而且可使發(fā)光時間大幅度增加。
在本發(fā)明的腺苷酸第一個檢驗方法中，優(yōu)選以被檢驗物中的微量ATP作為起始物質(zhì)，獨立進行本發(fā)明第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，進而預(yù)先增大ATP量，然后通過向其中添加生物發(fā)光試劑，可以顯著提高ATP的檢測靈敏度。
另外，以ATP的檢驗方法為例，對本發(fā)明的腺苷酸第一個檢驗方法進行說明，但本發(fā)明的腺苷酸第一個檢驗方法并不限定于ATP的檢驗，也可以應(yīng)用于ADP的檢驗。即，如果存在ADP，就象上述反應(yīng)過程表明的那樣，ADP成為觸發(fā)因素使得第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)運作，生成ATP。然而，由上述反應(yīng)過程可知，該方法不能作為AMP的檢驗方法。因此，該方法可應(yīng)用于食用肉、鮮魚、蔬菜等生物鮮度的測定。
以下，就本發(fā)明的腺苷酸的第二個檢驗方法進行說明。
本發(fā)明的腺苷酸的第二個檢驗方法是在熒光素和溶解氧存在下，將熒光素酶作用于ATP，進而生成AMP并發(fā)光，通過測定生成的發(fā)光量對腺苷酸進行檢驗的方法；其特征在于，具備本發(fā)明的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)。
本發(fā)明的腺苷酸的第二個檢驗方法表示在以下反應(yīng)過程中。
(1)通過熒光素酶進行的發(fā)光反應(yīng)ATP+熒光素+溶解氧→AMP+氧化型熒光素
+發(fā)光+焦磷酸+CO2第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)(2)通過磷酸基轉(zhuǎn)移酶進行的反應(yīng)AMP+多磷酸化合物(n)→ADP+多磷酸化合物(n-1)(3)通過多磷酸合成酶進行的反應(yīng)2ADP+多磷酸化合物(n-1)→ATP+多磷酸化合物(n-2)在上述反應(yīng)過程中，如(1)所示，將熒光素酶作用于ATP、熒光素、溶解氧以及以抑制酶失活為目的的鎂離子等金屬粒子，產(chǎn)生生成AMP、焦磷酸、氧化型熒光素、二氧化碳并發(fā)光的反應(yīng)，并通過測定由熒光素酶作用而產(chǎn)生的光，可以對污染指標成分ATP進行檢測，以及對食品工廠等的清潔度進行判定。
如果不存在ATP的再生反應(yīng)系統(tǒng)，隨著ATP的消耗，反應(yīng)(1)終止，發(fā)光也消失。因此，在本發(fā)明中使用了新的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)。
本發(fā)明的腺苷酸第二個檢驗方法由于具備本發(fā)明的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，所以不僅生物發(fā)光的光量增大，而且可使發(fā)光時間大幅度增加。
該反應(yīng)的要點敘述如下。首先，通過反應(yīng)(1)消耗ATP，發(fā)光并生成AMP。該AMP通過反應(yīng)(2)轉(zhuǎn)換為ADP后，通過反應(yīng)(3)由ADP再生成為ATP。然后，該ATP再供給到反應(yīng)(1)，消耗ATP并發(fā)光。以下，同時連續(xù)反復(fù)進行作為ATP消耗系統(tǒng)的反應(yīng)(1)和作為ATP再生系統(tǒng)的反應(yīng)(2)和反應(yīng)(3)。在該ATP再生系統(tǒng)中，不使用來自污染的ATP，而是由AMP經(jīng)ADP轉(zhuǎn)換為ATP，所以即使ATP濃度非常稀，由于不依賴于ATP量，而是依賴于多磷酸化合物的磷酸量，所以可以獲得生物發(fā)光時間的持續(xù)效果。
然而，在上述由AMP再生成ADP的反應(yīng)(2)中，如果在多磷酸化合物(n)存在下，將上述AMP與磷酸基轉(zhuǎn)移酶(APP)反應(yīng)，則可以從多磷酸化合物消耗掉一個磷酸，轉(zhuǎn)換為ADP和多磷酸化合物(n-1)。然后，在由上述ADP再生成ATP的反應(yīng)(3)中，如果在多磷酸化合物(n-1)存在下，將上述ADP與多磷酸合成酶(PPK)反應(yīng)，則可多磷酸化合物(n-1)再消耗掉一個磷酸，轉(zhuǎn)換為ATP和多磷酸化合物(n-2)。
通過進行本發(fā)明的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，在由AMP轉(zhuǎn)換為ATP的再生反應(yīng)系統(tǒng)中，不使用來自污染的ATP，而是由AMP經(jīng)ADP轉(zhuǎn)換為ATP，所以即使ATP濃度非常稀，由于不依賴于ATP量，而是依賴于多磷酸化合物的磷酸量，所以可以獲得生物發(fā)光的發(fā)光時間的持續(xù)效果。進而，可以使腺苷酸的檢測靈敏度提高，并且可以在食品加工廠等中通過檢測肉眼看不見的微生物來檢驗清潔度，以及測定食用肉、鮮魚、蔬菜等食物的鮮度。另外，除了測定污染指標成分ATP以外，也可以測定AMP或ADP。即，如果存在AMP或ADP，就象上述反應(yīng)過程所表明的那樣，通過本發(fā)明的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)可生成ATP。
利用本發(fā)明的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的腺苷酸檢驗方法的溫度通常為30～50℃，時間為10～100分鐘左右比較合適。在該方法中，熒光素和熒光素酶可以利用含有二者的市售試劑盒，溶解氧可以利用空氣中的氧。其它試劑的濃度與第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)中的濃度相同。
本發(fā)明的腺苷酸第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，可以更穩(wěn)定地對利用本發(fā)明第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)難以檢測的更少量的腺苷酸進行檢測。
即，在本發(fā)明第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的反應(yīng)(2)中，由AMP轉(zhuǎn)換為ADP時，使用腺苷酸激酶(ADK)和測定所需的少量來自污染的ATP，生成2分子ADP。然后，在反應(yīng)(3)中，在多磷酸合成酶(PPK)作用下由生成的2分子ADP生成2分子ATP。因此，在上述第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)中，測定所需的來自污染的ATP是測定系統(tǒng)(反應(yīng)(1))和再生系統(tǒng)(反應(yīng)(2)和反應(yīng)(3))兩者所必須的。因此，ATP量最初充足存在時，熒光發(fā)光的穩(wěn)定性好，維持長時間發(fā)光是沒有問題的，而測定濃度極稀薄的ATP時，最初的再生系統(tǒng)的反應(yīng)(反應(yīng)(2)和反應(yīng)(3))有可能無法順利進行(稀薄的ATP和稀薄的AMP遭遇的幾率小，難以引起反應(yīng))，且熒光發(fā)光的穩(wěn)定性差，發(fā)光也可能在非常短的時間內(nèi)消失。
與此相反，本發(fā)明的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，在再生系統(tǒng)中完全不使用來自污染的ATP時，也可以進行ATP的再生反應(yīng)，所以可以用于檢測濃度極稀薄的ATP。本發(fā)明的第二個腺苷酸的檢驗方法是通過結(jié)合該新型的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的生物發(fā)光來檢驗腺苷酸的方法。
以下，通過生物發(fā)光對本發(fā)明的RNA進行檢測的方法進行說明。本發(fā)明的通過生物發(fā)光檢測RNA的方法是通過RNA分解酶對樣品中的RNA進行分解，進而得到單核苷酸，將該單核苷酸中的AMP轉(zhuǎn)換為ATP，并在熒光素和溶解氧存在下，將熒光素酶作用于該ATP，測定生成的發(fā)光量對RNA中的AMP進行定量的方法；其特征在于，具備本發(fā)明的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)。
本發(fā)明的通過生物發(fā)光檢測RNA的方法由于具備本發(fā)明的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，所以可以有效地進行將由RNA得到的核苷酸中的AMP轉(zhuǎn)換為ADP，然后轉(zhuǎn)換為ATP的步驟。然后，生物發(fā)光時產(chǎn)生的AMP通過該ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)再生成ATP，結(jié)果不僅生物發(fā)光的發(fā)光量沒有衰減，而且可以穩(wěn)定地持續(xù)下去，進而有可能用便宜且結(jié)構(gòu)簡單的光度計來檢測RNA中的AMP。
在本發(fā)明中，樣品中RNA的分離方法可以用公知的方法進行。例如，通過水解、離心分離、電泳中任一種方法或它們組合來分離RNA的方法。
從細胞中分離RNA時，可以采用離心分離。例如，酵母總RNA的提取是通過用苯酚對細胞破碎物進行處理，切斷巨大分子的氫鍵，引起蛋白質(zhì)的變性。不透明的懸濁液經(jīng)離心分離分成2相，下面的苯酚相含有DNA，上面的水相含有碳水化合物和RNA。變性的蛋白質(zhì)再經(jīng)離心分離除去，然后用乙醇使RNA沉淀，得到的生成物不含有DNA，但夾雜著多糖類物質(zhì)，對此進行純化時，可以用淀粉酶進行處理。
將RNA分解為組成堿基時，可以采用水解方法。即，用RNA水解酶對RNA進行處理，生成5’-單核苷酸(AMP、GMP、CMP和UMP)。RNA水解酶可以使用已知的酶，例如可以使用核酸酶S1等。
以往，對通過上述步驟生成的堿基，可以通過紙層析進行分離，并用紫外線檢測。另外，由于在pH3.5的檸檬酸緩沖液中，組成堿基帶有分別完全不同的電荷，所以可以通過電泳分開。再者，通過強酸型離子交換柱層析進行分離，并利用其特定的紫外吸收光譜進行鑒定。
在本發(fā)明中，用RNA水解酶對RNA進行水解，并分解成組成堿基。將得到的5’AMP、GMP、CMP和UMP等核苷酸中的5’AMP轉(zhuǎn)換為ADP，然后轉(zhuǎn)換為ATP，將熒光素/熒光素酶與ATP反應(yīng)，推定存在的AMP量，并由此推定RNA的量。
利用本發(fā)明的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的RNA檢測方法的溫度通常為30～50℃，時間為10～100分鐘左右比較合適。在該方法中，熒光素和熒光素酶可以利用含有二者的市售試劑盒，溶解氧可以利用空氣中的氧。RNA水解酶的濃度，例如使用核酸酶S1時，其濃度為10～1000單位(一個單位為于37℃、一分鐘內(nèi)使1μgRNA成為酸可溶性時所需的酶活性)比較合適。其它試劑的濃度與第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)中的濃度相同。
以下，就本發(fā)明的級聯(lián)放大ATP的方法進行說明。
該方法是利用本發(fā)明的第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)級聯(lián)放大ATP的方法。即，本發(fā)明的ATP放大方法的特征在于，反復(fù)進行在微量ATP存在下，將腺苷酸激酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換為ADP，然后在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))存在下，將多磷酸合成酶作用于該ADP，使其轉(zhuǎn)換為ATP和多磷酸化合物(n-2)的步驟。
首先，在第一循環(huán)反應(yīng)中，通過腺苷酸激酶使ATP和AMP直接反應(yīng)，轉(zhuǎn)換為2分子ADP(第一個反應(yīng))。然后，該2分子ADP在多磷酸合成酶作用下與多磷酸化合物(n)反應(yīng)，轉(zhuǎn)換為2分子ATP和多磷酸化合物(n-2)(第二個反應(yīng))。然后，進行反應(yīng)系統(tǒng)的第二個循環(huán)反應(yīng)，此時，在反應(yīng)系統(tǒng)的第一次循環(huán)中生成的上述2分子ATP與2分子AMP反應(yīng)，轉(zhuǎn)換為4分子ADP(第一個反應(yīng))。然后，該4分子ADP在多磷酸合成酶作用下與多磷酸化合物(n-2)反應(yīng)，轉(zhuǎn)換為4分子ATP和多磷酸化合物(n-6)(第二個反應(yīng))。以下，通過反復(fù)多次進行反應(yīng)系統(tǒng)的第3次反應(yīng)、反應(yīng)系統(tǒng)的第4次反應(yīng)、反應(yīng)系統(tǒng)的第5次反應(yīng)...，使ATP量增加。該反應(yīng)是由反應(yīng)系統(tǒng)的第一次反應(yīng)中添加的微量ATP引發(fā)的，以后引起級聯(lián)反應(yīng)，只要存在AMP和多磷酸化合物，就可長時間持續(xù)下去，ATP隨著反應(yīng)系統(tǒng)的反應(yīng)次數(shù)呈2的冪指數(shù)倍增加。
利用本發(fā)明的第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的ATP放大方法的溫度通常為30～50℃，時間為10～100分鐘左右比較合適。該方法的AMP濃度為10～100μM比較合適。其它試劑的濃度與第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)中的濃度相同。
本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，在ATP級聯(lián)放大反應(yīng)中使用肌酸激酶和肌磷酸或丙酮酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸代替多磷酸化合物和多磷酸激酶時，也可發(fā)生同樣的反應(yīng)。即，只要是可以使2分子ADP轉(zhuǎn)換為2分子ATP的磷酸化合物和酶，從原理上講都可以發(fā)生ATP級聯(lián)放大反應(yīng)。然而，多磷酸化合物與多磷酸激酶的組合，具有通過一分子合成多個ATP的能力，所以對于連續(xù)發(fā)生的ATP放大反應(yīng)有利。
利用本發(fā)明的第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)對ATP進行放大后，以通過熒光素酶進行生物發(fā)光為特征的腺苷酸檢驗方法的溫度通常為30～50℃，時間為10～100分鐘左右比較合適。在該方法中，熒光素和熒光素酶可以利用含有二者的市售試劑盒，溶解氧可以利用空氣中的氧。其它試劑的濃度與第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)中的濃度相同。
本發(fā)明的ATP級聯(lián)放大方法可以使微量的ATP放大，然后在熒光素和溶解氧存在下與熒光素酶反應(yīng)，生成AMP并發(fā)光，測定生成的發(fā)光量，則可以得到相當于增加部分的ATP的光量，所以可以檢測以往不能檢測的極微量ATP。從原理上講，連存在于最初反應(yīng)系統(tǒng)的一分子ATP都可能檢測。
實施例以下結(jié)合實施例和比較例，進一步對本發(fā)明進行具體地說明。
圖1給出了上述①和②的結(jié)果。從該結(jié)果可以看出，在不具備ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的比較例1中，發(fā)光量在反應(yīng)初期達到頂峰，經(jīng)過10分鐘后減少至三分之一，以后隨著時間推移逐漸減少。因此，采用該比較例所示的以往的腺苷酸測定法時，需要精確的光度計。與此相反，在具備ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的本發(fā)明的實施例1中，在反應(yīng)開始20分鐘后的發(fā)光量是反應(yīng)初期的10倍，并且在發(fā)光量的增強的同時，可維持高水平、無衰減的長時間(30分鐘以上)穩(wěn)定。因此，在本發(fā)明的系統(tǒng)中，如果使用精確的光度計，即使微量的ATP也能夠檢測，進而可以顯著提高食品檢驗、衛(wèi)生檢驗的精度。另一方面，在食品檢驗、衛(wèi)生檢驗中，用以往精度進行ATP的檢測時，即使不使用高價且高精度的光度計，也能通過便宜且簡單的光度計對ATP進行檢測。
在該實施例中，作為多磷酸合成酶可以直接使用市售的酶，但在該市售酶中含有雜質(zhì)ATP和ADP。因此，樣品中完全不含ATP和ADP時，酶中作為雜質(zhì)含有的ATP和ADP也會引發(fā)上述的ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，進而即使樣品中完全不含ATP和ADP時，也能觀察到雜質(zhì)ATP和ADP引起的發(fā)光。因此，為了提高腺苷酸的測定精度，將使用的酶中的腺苷酸濃度盡可能降低是很重要的。
從發(fā)光量可以知道不同經(jīng)過時間時的ATP濃度。結(jié)果如圖2所示。從圖2可知，ATP的濃度在反應(yīng)后5分鐘、15分鐘、60分鐘，以及隨著時間的延長均在增加。該實驗表明，通過多磷酸合成酶(PPK)和磷酸基轉(zhuǎn)移酶(APP)兩個酶，可以由AMP生成ATP。因此，這些反應(yīng)可以用作ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，以及也可以利用該ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，通過生物發(fā)光來檢測AMP。實施例3對于包括本發(fā)明的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的檢驗腺苷酸的生物發(fā)光系統(tǒng)(本發(fā)明)和不包括ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的生物發(fā)光系統(tǒng)(比較例)，在以下條件下進行了生物發(fā)光隨時間變化的研究。①具備第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)時的情況(實施例3)(1)多磷酸合成酶緩沖液(PPK緩沖液) 3μl(2)0.1mM(濃度)腺苷一磷酸(AMP) 3μl(3)30mM(濃度)多磷酸化合物(n＝65) 3μl(4)離子交換水 19μl(5)多磷酸合成酶(PPK) 1μl(6)磷酸基轉(zhuǎn)移酶(APP) 1μl合計30μl(體積)沒有第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)時(對照)的情況(比較例3)(7)1.65μM(濃度)腺苷三磷酸(ATP) 3μl(8)離子交換水 27μl合計30μl(體積)將上述(1)～(6)的具有再生反應(yīng)系統(tǒng)的樣品和上述(7)～(8)的無再生反應(yīng)系統(tǒng)的樣品，分別于30℃的條件下溫育20分鐘，然后將全部樣品都添加到已經(jīng)添加了10μl熒光素和5μl的熒光素酶的測定用孔中，用光度計(ARVO公司生產(chǎn))測定生成的發(fā)光量，并研究發(fā)光隨時間的變化。發(fā)光量的測定是在反應(yīng)開始后至14分鐘的時間內(nèi)，通過測定反應(yīng)剛開始后、經(jīng)過6分鐘后、經(jīng)過13分鐘后的發(fā)光量的方法而進行的。
結(jié)果如圖3所示。從圖3可知，在沒有ATP的再生反應(yīng)系統(tǒng)的實驗中，反應(yīng)開始后就達到了高峰的發(fā)光量在經(jīng)過6分鐘后減少至六分之一以下，以后隨著時間變化逐漸減少。由此可知，使用以往的測定法時，需要精確的光度計。與此相反，具備依賴于多磷酸的ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)時，在反應(yīng)剛開始就達到高峰的發(fā)光量在經(jīng)過6分鐘后發(fā)光量的衰減受到抑制，維持在高水平且穩(wěn)定的狀態(tài)。因此，在本發(fā)明中使用精確的光度計時，能夠檢測微量的ATP，并可以提高食品檢驗、衛(wèi)生檢驗的精度。另一方面，在食品檢驗、衛(wèi)生檢驗中，如果在以往的ATP檢測范圍內(nèi)可以滿足標準，不使用高價且高精度的光度計，通過便宜且簡單的光度計也能夠?qū)TP進行檢測。
例如，想要對濃度在100nM以下的極稀薄的ATP進行測定時，由于不依賴于初期ATP濃度且ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)穩(wěn)定地發(fā)揮作用，所以可以高靈敏度地檢測腺苷酸。
4.核酸酶S1 0.5μl方法將市售的tRNA 2μl溶解于附帶緩沖液1μl、蒸餾水6.5μl、核酸酶S1 0.5μl中，于37℃溫育10分鐘。然后，在生成的5’-單核苷酸中，通過以下反應(yīng)將AMP轉(zhuǎn)換為ATP，通過測定生物發(fā)光來進行測定。③通過測定生物發(fā)光對AMP進行鑒定試劑1.多磷酸合成酶緩沖液(PPK緩沖液)3μl2.0.1mM(濃度)腺苷一磷酸(AMP) 3μl3.30mM(濃度)多磷酸化合物(n＝65)3μl4.離子交換水 19μl5.多磷酸合成酶(PPK)1μl6.磷酸基轉(zhuǎn)移酶(APP)1μl方法將上述1.～6.試劑于30℃條件下進行溫育，于反應(yīng)后5分鐘、15分鐘、60分鐘各取10μl樣品。然后，將全部樣品都添加到已經(jīng)添加了10μl熒光素和5μl的熒光素酶的測定用孔中，用光度計(ARVO公司生產(chǎn))測定生成的發(fā)光量。
從發(fā)光量可以知道不同經(jīng)過時間時的ATP濃度。結(jié)果如圖2所示。從圖2可知，ATP的濃度在反應(yīng)后5分鐘、15分鐘、60分鐘，以及隨著時間的延長均在增加。該實驗表明，通過多磷酸合成酶(PPK)和磷酸基轉(zhuǎn)移酶(APP)兩個酶，可以由AMP生成ATP，因此，這些反應(yīng)可用作ATP的轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，以及也可以通過生物發(fā)光檢測AMP，并鑒定RNA組成核苷酸AMP。
4.離子交換水 7μl5.多磷酸合成酶(PPK) 2μl6.磷酸基轉(zhuǎn)移酶(APP) 3μl方法將上述1.～6.試劑于30℃條件下進行溫育，反應(yīng)60分鐘后，將全部樣品都添加到已經(jīng)添加了10μl熒光素和5μl的熒光素酶的測定用孔中，用光度計(ARVO公司生產(chǎn))測定生成的發(fā)光量。
圖4的最上端給出了發(fā)光量。作為對照，使用添加沒有經(jīng)核酸酶水解處理的RNA樣品替代試劑2(圖4的第二段)的樣品，以及不添加RNA，只添加核酸酶樣品(圖4的第三段)的樣品。通過實驗可知，RNA分解是生物發(fā)光所必需的。即，RNA分解生成AMP的過程是必要的。
通過實際上以純AMP作為樣品時，可生成ATP并生物發(fā)光(圖4的第4段)的現(xiàn)象，也可了解到上述必要性。另外，添加RNA水解產(chǎn)物，但不添加多磷酸合成酶、磷酸基轉(zhuǎn)移酶的情況如圖4的第5段所示。此時，由于沒有通過AMP生成ATP，所以沒有生物發(fā)光。
從這些實驗可知，通過使RNA的組成核苷酸AMP生成ATP，并使其進行生物發(fā)光，可以對RNA進行檢測。RNA的檢測靈敏度由于依賴于通過生物發(fā)光的ATP的檢測靈敏度，所以其檢測靈敏度非常高。
使用純化酶PPK[1]和PPK[2]，研究在以下的條件下發(fā)光隨時間的變化。
另外，除去試劑(ホ)，其它都與上述一樣測定發(fā)光量。
測定結(jié)果如圖5所示。圖5(a)是使用純化的多磷酸合成酶(PPK[1])，研究添加ATP(+ATP)和不添加ATP(-ATP)時發(fā)光隨時間的變化圖。比較兩者，可知添加ATP(+ATP)的發(fā)光強度高。
上述結(jié)果表明，在實施例6a中不添加ATP(-ATP)時也發(fā)光，是由于來自多磷酸合成酶的ADP或ATP成了本發(fā)明ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的觸發(fā)因素，進而引起發(fā)光。在實施例6b中不添加ATP(-ATP)時的發(fā)光強度與實施例6a的情況相比明顯地低，是由于純化多磷酸合成酶后除去了ADP，使得ATP放大反應(yīng)的速度變得非常慢的緣故。因此，檢驗樣品中有無ATP時，要將使用的多磷酸合成酶充分純化后，盡可能使ADP和ATP濃度降低。經(jīng)過這樣操作，可將來自酶并作為雜質(zhì)的ATP和ADP引起的放大效應(yīng)抑制到最小限度，并可高精度地檢驗樣品中有無ATP。
(Boehringer Mannheim公司生產(chǎn))合計50μl(體積)將(1)～(5)混合，反應(yīng)規(guī)定時間后，添加(6)，測定發(fā)光量。
另外，除去試劑(5)，其它都與上述一樣測定發(fā)光量。
測定結(jié)果如圖6(a)所示。
另外，除了試劑(5)以外，其余都與上述一樣測定發(fā)光量。
測定結(jié)果如圖6(b)所示。
另外，除了試劑(5)以外，其它操作完全相同，測定發(fā)光量。
測定結(jié)果如圖6(c)所示。
參照圖6(a)可知，AMP和多磷酸化合物充分且存在ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)時發(fā)光強度高，持續(xù)時間長。而不存在ATP發(fā)光反應(yīng)系統(tǒng)時，發(fā)光強度低得多。參照圖6(b)可知，由于AMP濃度達到了十分之一，AMP中作為雜質(zhì)含有的ADP、ATP濃度也達到了十分之一，結(jié)果來自雜質(zhì)的ADP或ATP引起的發(fā)光(背景)受到抑制，由添加的ATP引起的發(fā)光能更顯著地被觀察到。值得注意的是，在這樣的條件下，如果不添 ATP，ATP的放大幾乎不會發(fā)生，發(fā)光也幾乎觀察不到。即，由于背景幾乎為零，樣品中的微量ATP的檢測可以達到更高的精度。
參照圖6(c)可知，AMP充分存且存在ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)時，若多磷酸化合物濃度低，則發(fā)光強度也低，如果不存在ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，則發(fā)光強度更低。這表明，為了使本發(fā)明的第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)充分發(fā)揮作用，AMP和多磷酸化合物的濃度最好分別為10～100μM、100～1000μM左右。
以上結(jié)果表明，通過將本發(fā)明的ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)中使用的酶中的ADP和ATP濃度盡可能地降低，可以明顯提高利用本發(fā)明的ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的腺苷酸的檢測靈敏度。
測定結(jié)果如圖7所示。從測定結(jié)果可以看出，添加ATP進行反應(yīng)時，從反應(yīng)后30分鐘開始ATP量急劇上升，經(jīng)過180分鐘后達到最高峰。與此相反，不添加ATP進行反應(yīng)時，ATP量沒有增加，維持在低水平。這表明，如果添加微量ATP，它可能成為觸發(fā)因素，引起ATP的級聯(lián)放大反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明的ATP放大方法，即使是極微量的ATP，也可以使其放大并可以高靈敏度地進行檢測，進而可以提高食品檢驗、衛(wèi)生檢驗的精度。另外，通過便宜且簡單的光度計就可以檢測ATP。
產(chǎn)業(yè)上的實用性本發(fā)明的第一個或第二個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)由于使用含有多個、優(yōu)選使用含有10個以上磷酸基的多磷酸化合物及多磷酸合成酶，所以將它們用于通過生物發(fā)光的腺苷酸檢驗方法和RNA檢測方法時，與以往的方法相比，可以使生物發(fā)光的光量大大增大的同時，也可以使發(fā)光時間的持續(xù)更久，其結(jié)果提高了腺苷酸和RNA的檢測靈敏度。另外，利用本發(fā)明的第一個ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)時，可以便宜且高效地級聯(lián)合成ATP。
權(quán)利要求
1.ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，其特征在于，在微量ATP存在下，將腺苷酸激酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換為2分子ADP，然后在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))存在下，將多磷酸合成酶作用于該2分子ADP，使其轉(zhuǎn)換為2分子ATP和1分子多磷酸化合物(n-2)。
2.ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，其特征在于，在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))存在下，將磷酸基轉(zhuǎn)移酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換為ADP和多磷酸化合物(n-1)，然后在該多磷酸化合物(n-1)存在下，將多磷酸合成酶作用于上述ADP，使其轉(zhuǎn)換為ATP和多磷酸化合物(n-2)。
3.依賴于生物發(fā)光的腺苷酸的檢驗方法，該方法是在熒光素和溶解氧存在下，將熒光素酶作用于ATP，進而生成AMP并發(fā)光，通過測定生成的發(fā)光量對腺苷酸進行檢驗的方法；其特征在于，具備在微量的ATP存在下，將腺苷酸激酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換為2分子的ADP，然后在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))存在下，將多磷酸合成酶作用于該2分子ADP，使其轉(zhuǎn)換為2分子ATP和1分子多磷酸化合物(n-2)的ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，該ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)的特征在于，微量ATP為來自污染的ATP。
4.依賴于生物發(fā)光的腺苷酸的檢驗方法，該方法是在熒光素和溶解氧存在下，將熒光素酶作用于ATP，進而生成AMP并發(fā)光，通過測定生成的發(fā)光量對腺苷酸進行檢驗的方法；其特征在于，具備在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))存在下，將磷酸基轉(zhuǎn)移酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換為ADP和多磷酸化合物(n-1)，然后在該多磷酸化合物(n-1)存在下，將多磷酸合成酶作用于上述ADP，使其轉(zhuǎn)換為ATP和多磷酸化合物(n-2)的ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)。
5.依賴于生物發(fā)光檢測RNA的方法，該方法是通過RNA分解酶對樣品中的RNA進行分解，進而得到單核苷酸，將該單核苷酸中的AMP轉(zhuǎn)換為ATP，并在熒光素和溶解氧存在下，將熒光素酶作用于該ATP，測定生成的發(fā)光量對RNA中的AMP進行定量的方法；其特征在于，具備在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))存在下，將磷酸基轉(zhuǎn)移酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換ADP和多磷酸化合物(n-1)，然后在該多磷酸化合物(n-1)存在下，將多磷酸合成酶作用于上述ADP，使其轉(zhuǎn)換為ATP和多磷酸化合物(n-2)的ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)。
6.級聯(lián)放大ATP的方法，其特征在于，反復(fù)進行在微量ATP存在下，將腺苷酸激酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換為2分子ADP，然后在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))存在下，將多磷酸合成酶作用于該2分子ADP，使其轉(zhuǎn)換為2分子ATP和1分子多磷酸化合物(n-2)的步驟。
7.腺苷酸的檢驗方法，該方法是在熒光素和溶解氧存在下，將熒光素酶作用于ATP，進而生成AMP并發(fā)光，然后通過測定生成的發(fā)光量對腺苷酸進行檢驗的方法；其特征在于，反復(fù)進行在被檢驗物中含有的ATP存在下，將腺苷酸激酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換為2分子ADP，然后在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基數(shù))存在下，將多磷酸合成酶作用于該2分子ADP，使其轉(zhuǎn)換為2分子ATP和1分子多磷酸化合物(n-2)的步驟，將ATP級聯(lián)放大后，在熒光素和溶解氧存在下，將熒光素酶作用于放大的ATP，進而生成AMP并發(fā)光。
全文摘要
本發(fā)明提供在微量ATP存在下，將腺苷酸激酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換為ADP，然后在多磷酸化合物存在下，將多磷酸合成酶作用于ADP，使其轉(zhuǎn)換為ATP和多磷酸化合物的ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)；在多磷酸化合物存在下，將磷酸基轉(zhuǎn)移酶作用于AMP，使其轉(zhuǎn)換為ADP，再將多磷酸合成酶作用于ADP，使其轉(zhuǎn)換為ATP的ATP再生反應(yīng)系統(tǒng)，以及利用該再生反應(yīng)系統(tǒng)的腺苷酸或RNA的檢驗方法；ATP放大方法。
文檔編號C12P19/00GK1395619SQ01803798
公開日2003年2月5日 申請日期2001年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月17日
發(fā)明者大竹久夫, 黑白章夫, 田中正太郎 申請人:株式會社佐竹, 大竹久夫, 黑田章夫