專利名稱：高特異活性重組s－腺苷高半胱氨酸酶(sahh)的制備與高度表達及對s－腺苷甲硫氨酸 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的重組S-腺苷高半胱氨酸酶(SAHH)和其使用方法。本發明還涉及應用SAHH監測供試體的診斷方法，該供試體已給藥S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。本發明的改進方法可快速而又精確地評估SAM的濃度。
背景技術：
作為“nutraceutical”或處方藥給藥S-腺苷甲硫氨酸(SAM)最近顯示出SAM是一種抗抑郁劑，是一種緩解肝病的預防或治療組分，提供一種緩解關節炎癥狀的手段。SAM在此的作用機制尚未完全清楚，但是，已確信SAM和其代謝產物高半胱氨酸的相對濃度影響甲基化水平，而甲基化水平會產生更深的生理影響。由于該藥重要，因此期望找到一種可靠而又易實施的方法來監測所給藥的濃度。本發明提供一種改進的方法，該方法通過SAHH來評估給藥SAM的供試體中該藥的治療性水平。本發明還涉及重組產生的不同于以前報道的SAHH。
S-腺苷高半胱氨酸酶(S-腺苷高半胱氨酸水解酶；SAHH，EC.3.3.1.1)催化SAH到高半胱氨酸和腺苷的可逆性轉化(de la Haba和Cantoni，1959)。腺苷的各種結構類似物使許多生物體的SAHH失活，從而導致細胞毒性的產生(Ueland，1982)。核苷類似物對SAHH活性的抑制取決于抑制物的結構和酶的來源。SAHH最初從陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)基因克隆并且已鑒定特征(Bagnara等，1996)。
Minotto，L.，Ko，G.-A.，Edwards，M.R.和Bagnara，A.S.[重組S-腺苷高半胱氨酸酶的陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)表達和鑒定，ExperimentalParasitology 90，175-180，1998]進一步描述了陰道毛滴蟲(T.vaginalis)SAHH的特征。編碼陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)中S-腺苷高半胱氨酸酶的基因在大腸桿菌(Escherichia coli)pQE-30的表達有利于描述該酶的特征。6xHisN端標記表達系統(QIAGEN)可一步純化6毫克rSAHH，該rSAHH可通過使用鎳-NTA基質的親和層析于100ml細菌培養得到。測得重組酶的分子量約為56,000。rSAHH的特性包括與腺苷有相似的表觀Km20-25μM和與腺苷類似物例如阿糖腺苷(ara-A)有相似的抑制/失活模式。
Minotto等1998的研究結果不同于其他人所發現的水解酶根據酶的來源以各種寡聚形式存在。原核生物SAHH的活性形式是六聚體(Shimizu等，1984)或四聚體(Porcelli等，Biochim.et Biophys.Acta，1164，179-188，1993)。大鼠肝臟(Fujioka和Takata，J.Biol.Chem.，256，1631-1635，1981)和小牛肝臟(Richards等，253，4476-4480，1978)及其它動物源(Doskeland和Ueland，Biochem.et Biophys Acta708，185-193，1982)的SAHH是四聚體，不過不能確定亞基是否相同或相似。植物源的SAHH的功能形式是同型二聚體(Guranowski和Pawelkiewicz，Fur.J.Biochem.80，517-523，1977)。此文第一次報道以單體形式起作用的SAHH活性(Minotto等，1998)。
發明內容
本發明涉及一種分析樣品中SAM水平的改進新方法。一方面，本發明方法可用于分析供試體樣品中SAM的治療性水平，所述供試體例如但并不限于給藥此化合物的患者。本方法還可用于分析生物液體中SAM的水平，所述生物液體例如但并不限于供試體血液或其它生物液體。該方法可在體內例如血流或體外例如取自供試體的樣品里進行。所述方法可作為診斷方案或治療方案的一部分。作為治療方案的一部分，該方法一定程度上可監測治療情況或進展。
在本發明的一實施方案中，該試驗方法可通過樣品與甘氨酸N-甲基轉移酶(GMT)，甘氨酸及活性形式SAHH的接觸而得以進行。測量樣品中一種或更多種反應產物后就可得出樣品中SAM的水平，其中反應產物的量與樣品中SAM水平成正比。在本發明一實施方案中，直接或間接地測量反應產物高半胱氨酸(HC)。可用任何方法來間接測量HC，包括但并不限于用高半胱氨酸酶處理并且測量一種或更多種反應產物(例如α-酮戊二酸，H2S或NH3)的水平。通過測量吸光度或熒光可直接或間接地測定反應產物H2S。一種測熒光的方法是使用發熒光試劑。
本發明還提供一種新SAHH，編碼它的核酸，包含它的組合物及其制備和使用方法。所述SAHH含有SEQ ID NO1編碼的氨基酸序列。
編碼本發明SAHH的核酸可置于任何合適核酸載體上以增殖，擴增或表達。所述核酸還可與其它核苷酸操作性地連接以容許與一種或多種附加氨基酸共價連接的SAHH表達。附加氨基酸導致產生包含SAHH的雜交或嵌合蛋白。本發明的一優選實施方案中，附加氨基酸是指那些改進本發明中后面SAHH純化的組氨酸標記(His tag)。
本發明核酸可被導入任何合適的寄主細胞或生物體，例如但并不限于細菌，真菌和高等真核細胞。這些細胞可用于重組表達本發明的核酸，任選地，接著對表達蛋白進行分離和/或純化。或者，所述核酸還可應用體外表達系統來表達。
本發明的SAHH純化可由任何方便或合適的方法例如，但并不限于沉淀和/或層析法來完成。在本發明一優選的實施方案中，所述純化全部或部分是通過基于與組氨酸標記相互作用的親和層析來實現的。在本發明另一優選的實施方案中，這樣純化的SAHH，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯示為一條帶。
本發明SAHH還可被配制成組合物，例如包含藥劑或賦形劑(excipients)的組合物。所述SAHH還可用于本發明例如上述的試驗方法和其它方法中，所述其它方法例如由分析樣品中高半胱氨酸向SAH轉化來測定高半胱氨酸水平的方法。另一方面，本發明所述SAHH還可用于通過向SAH的轉化耗竭體內或體外樣品中過多高半胱氨酸的方法中。當然本發明所述樣品可以是任何相關生物液體。
圖1描述pTrcSAHH插入pTrc多克隆位點NcoI和BamHI。
圖2包含SAHH穩定性研究的結果。
圖3顯示SAHH克隆的篩選。
圖4描述pTrcHis·SAHH插入pTrc多克隆位點NcoI和BmaHT。
圖5包含His·SAHH穩定性研究的結果。
圖6a-c是本發明SAHH核苷酸序列與野生型序列的對比。
實施本發明的方式本發明提供一種分離和重組核酸，該編碼SAHH的核酸包括SEQ ID NO1，還提供相應SAHH氨基酸序列。另一方面，修飾所述SAHH的基因以編碼已修飾的His·SAHH，His·SAHH有6個額外組氨酸位于SAHH基因N-末端。
另一方面，本發明提供增殖和維持核酸的方法及它們在SAHH蛋白表達中的用途。本發明還提供通過一步或兩步純化法純化SAHH的方法。
在一實施方案中，本發明涉及生物液體中SAM的測量。其中所述“生物樣品”指的是從個體中分離出的組織或液體樣品，包括但并不限于例如血液，血成分，血漿，血清，腦脊液，淋巴液，尿液，皮膚外的部分，呼吸道，腸道，生殖泌尿道，身體分泌物，眼淚，唾液，乳，淋巴以及從動物，細胞(包括但不限于血細胞)，腫瘤，器官中提取出的其它成分，還包括體外細胞培養的組分樣品。優先選用的是在血漿或血清中測量。
其中所述“表達”包括轉錄和/或翻譯。
其中所述術語“包含”及其相關術語在此表示包含的意思。相當于術語“包括”及其相關術語。
除非特別說明，否則所有本發明用到的科學技術術語與本領域普通人員通常理解的意思相同。
SAHH是負責S-腺苷高半胱氨酸(SAH)向高半胱氨酸轉化的酶，最終降低SAM水平。由于與SAH或高半胱氨酸(HC)內源水平相比治療疾病所給藥SAM水平非常高，下述方案可用來分析給藥SAM的供試體中該化合物的水平。因此，所述試驗起到了藥物監測裝置功能，可用于試劑盒形式中。下圖中顯示了該試驗的大概情況。
正如此處描述的，由于有效地生成了SAHH或His·SAHH，而且高半胱氨酸酶對高半胱氨酸有高度專一的選擇性，從而使所述分析SAM的通常方法得到了改進。盡管高半胱氨酸相對低于SAM的水平，由此確信所估SAM的量沒有受到內源SAH或HC顯著干擾，如果所用酶專一性較低，體液中存在的半胱氨酸水平顯著高于高半胱氨酸的水平就會產生影響。存在熒光試劑時，本發明方法中測得終產物為硫化氫。
SAHH還催化高半胱氨酸到S-腺苷高半胱氨酸轉化的逆反應，最終升高SAM水平。該反應適用于另一類型試驗，一種測量高半胱氨酸的高半胱氨酸的酶-轉化免疫測定。具體地，本發明所述SAHH或His·SAHH將高半胱氨酸定量地轉化成SAH，并接著利用標準ELISA試驗測量終產物SAH。通過提供充足的或較高的(甚至過量的)SAH使其得以實現。或者，針對SAH的熒光抗體可用來定量生成的SAH。例如，該免疫測定可用于試劑盒并且在約為1-100μM的范圍內可用于血漿高半胱氨酸的測定。
本發明所述SAHH或His·SAHH還可用作藥劑，特別是在篩選酶的抑制物和失活物時用作藥劑并且可能用于例如癌癥，瘧疾，關節炎和其它疾病的治療。優選試劑盒形式的SAHH藥物，該試劑盒包括一種試驗，由于結合高半胱氨酸和利用二烷基苯二胺試劑例如DBPDA測量生成的硫化氫，所以該試驗比較簡單。
重組SAHH的其它用途包括與SAH類似物結合的治療性癌基因，充當激活有毒力前體藥物的酶，該前體藥物毒力由SAHH釋放的毒性腺苷類似物來提供。所述腺苷類似物在和Hcy結合成SAH類似物時沒有毒性。也可應用高半胱氨酸類似物，例如結合腺苷或腺苷類似物的硒代高半胱氨酸，其結合SAHH和rMETase基因治療在癌細胞中釋放由所述兩基因轉導的非常毒的硒醇及有毒腺苷類似物。
優選的實施方案包括分析樣品的試劑盒。優選的是，試劑盒中含有試驗操作說明，該說明可印在試劑盒中的包裝插頁(insert)上，包裝或標簽上。要印的還可印在試劑盒中的容器及樣品標簽上，并且試劑體積要在試驗容器上標明。精確說明隨所檢測物質和/或所用檢測方法而定，但是可包括下述說明的一項或多項如果必要，試劑盒組分和/或樣品稀釋說明，各試驗所用酶體積或濃度說明，試驗中所加樣品體積說明，所加發熒光試劑說明，產物測定說明，優選的是溫度條件，組分添加和混合時間及校準試驗結果用到的標準。
本發明可通過任何常規方法制備SAHH。通過實施例但并非對本發明范圍的限制，用編碼本發明SAHH的合適載體首先轉化表達該酶的細菌。接著，在液態培養基上培養(發酵)該轉化細菌許多小時，直至達到高密度。如果SAHH編碼序列受誘導啟動子調控，則可加入合適誘導物。結束培養后，接著就可離心收獲細胞，不用時冷凍儲存。
先解凍并融化冷凍細胞，然后添加組分沉淀細胞碎片。離心收集碎片，得到的上清中含有SAHH活性。在準備好的層析柱上上樣之前，先用合適緩沖液稀釋上清。梯度洗脫出所述SAHH，或更優選的是一步微體積洗脫。然后制成儲存制劑以備用。
除了上述提供的一步純化方法外，可用親和層析法純化含組氨酸標記的SAHH。通過實施例但并不限于本發明，按照上面所描述的來培養和收獲表達帶組氨酸標記的SAHH的細菌細胞。接著如上所述解凍并破碎冷凍細胞，制成細胞懸浮液，向懸浮液中加入固態硫酸氨，并將混合物置于冰上，然后離心。隨后收集含有SAHH活性的上清，并在預先準備好(已平衡)的Ni-NAT層析柱上樣，沖洗該柱，實施一步洗脫法。在制成制劑冷凍儲存之前，要先匯集活性成分并對其進行透析。
如下面實施例所述，根據下述步驟SAHH編碼序列從陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)克隆并在大腸桿菌中表達。在此提供編碼SAHH基因的核苷酸序列，與野生型序列比較，如圖6a-c所示與Minotto等，1998公開的序列相當。所述兩序列的比較顯示出11處點突變。在下面表1列出。
表1SAHH序列的比較有11處點突變野生型A/C′s氨基酸的變化No.19 (G)CT (A)CT Ala.→Thr.No.201GC(G) GC(C)No.207CT(T) CT(C)No210 AT(T) AT(C)No.501GT(C) GT(T)No.744 GT(G) TG(C)No.834 GG(G) GG(C)No.897 CC(T) CC(A)No.917 G(T)C G(C)C Val.→Ala.No.1314 GA(T) GA(A) Asp.→Glu.No.1346 G(T)T G(C)T Val.→Ala.
本發明SAHH酶具有良好性質。例如，SAHH有高度特異性活性至少為1.5U/ml。此外，本發明SAHH克隆高度表達20％總細胞蛋白。而且，附圖2和圖5顯示本發明方法制成的SAHH具備高度穩定性。例如，附圖2和圖5分別顯示SAHH和SAHH·His在45℃可保持三天穩定而無活性喪失。
下面實施例用于說明但并不限制本發明。實施例1在pQE-30表達載體里克隆SAHH基因使用寡核苷酸引物通過PCR擴增編碼陰道毛滴蟲(T.vaginalis)(Bagnara等，1996)SAHH的基因組序列，該寡核苷酸引物分別包含在上游(有義)和下游(反義)引物中改造的BamHI和Pstl的限制酶切位點(兩種情況中以下劃線標明限制位點)上游引物，5′TTTTGGATCCGCTTGCAAATCACCTGCTGGTGC 3′；下游引物，3′CTGCTATCGAGGGGGACGTCTTTT 5′。將重組表達載體pQE-30轉化入大腸桿菌(Escherichia coli)宿主菌株M15[pREP4](Villarejo和Zabin，1974)(QIAGEN)。實施例2重組SAHH的表達，純化和分析含pQE-30-SAHH構建體的克隆在含氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)大腸桿菌M15中過夜生長。0.1mM IPTG誘導表達，接著在39℃伴隨用力振蕩生長14小時。于50mM磷酸鈉，pH8.0，300mM NaCl中超聲處理以破碎收獲的細胞。隨后12000g離心20分鐘。用50mM磷酸鈉，pH6.0，300mM NaCl，含各種濃度咪唑的10％甘油從Ni-NTA柱上差異洗脫出該重組酶。純化重組酶級份不加甘油的于4℃儲藏。而其它級份與甘油混合后(終濃度50％)儲存在-20℃和-79℃以確定酶活性受到儲藏的影響。通過Pharmacia Biotech SMART層析系統的尺寸排阻毛細管層析法(Superdex200PC柱)在未變性情況下分析活性重組酶大小。實施例3SAHH在大腸桿菌里的表達在大腸桿菌里已獲得SAHH基因表達，該宿主大腸桿菌提供一種SAHH-陰性環境(Shimizu等，Eur.J.Biochem，141，385-392，1984)。在37℃用1-2mMIPTG誘導時，含重組SAHH基因序列大腸桿菌克隆高度表達該酶，但主要是不溶的“包涵體”。溫度降低到30℃并且IPTG濃度降列0.1mM會降低表達水平，導致較大比例地表達可溶性和有活性形式的酶。重組SAHH包含約12％總可溶蛋白。實施例4重組蛋白的純化和特征通過在Ni-NTA柱上親和層析來純化重組的SAHH。該酶分子量約為55,000-56,000(圖1)。利用Superdex 200 PC毛細管柱所得尺寸排阻層析法的結果顯示未變性條件下重組酶分子量約為55,000。在這些條件下該酶具有活性，SDS-PAGE顯示亞基分子量約為55,000-56,000，這些數據顯示T.vaginalis酶的功能形式是單體。該結果不同于其他人的發現，他們發現水解酶以寡聚形式存在，酶的來源決定四級結構。實施例5S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的發酵與純化發酵1.取肥大細胞庫10μl細菌接種到5ml L.B.上，37℃振蕩培養6小時。
2.取步驟1中0.5ml細菌轉移到3個含400ml L.B.的瓶中，37℃振蕩培養過夜。
3. 4℃，3000rpm離心收集細胞，將其懸浮于L.B.中并接種發酵。
4.細胞在發酵器中28℃培養約6小時至其密度為OD600為7。
5.加入0.1mM IPTG誘導細胞，28℃過夜培養。
6. 4℃，4000rpm離心收獲細胞，-80℃儲存以備純化。純化1.勻漿器中勻化3次以分解細胞。
2.細胞分解液與2％PEL，30％乙醇，8％PEG混合，在水浴鍋中加熱到37℃。
3. 15000rpm離心30分鐘去除細胞碎片，收集上清。
4.加入20mM磷酸鉀緩沖液，pH 8.3，1mM DTT和EDTA稀釋上清兩倍。
5.將上清加到預平衡的DEAE-瓊脂糖快速流柱上。
6.該柱預先要用20mM磷酸鉀緩沖液，pH 7.6，40mM NaCl，1mM DTT和1mM EDTA預沖洗至OD280低于0.2。
7.用20mM磷酸鉀緩沖液，pH 7.6，100mM NaCl，1mM DTT和EDTA洗脫SAHH。
8.向SAHH洗脫液中加入30％甘油和1mM NAD制得終產物。專一性高度表達的克隆表達SAHH占總蛋白20％，純化后，SAHH特異活性為1.64單位/毫克蛋白。純度超過90％。穩定性如下所述配制該酶20mM磷酸鉀緩沖液，pH 7.6，100mM NaCl，30％甘油，1mM DTT，1mM NAD和1mM EDTA。見圖2。實施例6SAHH活性的測量試劑分析緩沖液20mM磷酸鉀緩部液，pH 8.0，1mM DTT和1mM EDTA。
2mM S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)rHCYase(5毫克/毫升)L-高半胱氨酸(各種濃度)40mM DBPDA，溶于6M鹽酸中。
40mM高鐵氰化鉀試驗方法空白標準曲線試驗分析緩沖液(μl)940 970 920rHCYase(μl) 10 10 10L-高半胱氨酸(μl) --- 20 ---
SAH(μl) 50 --- 50樣品(μl) --- --- 20充分混勻，37℃培養5分鐘。
DBPDA(μl) 50 50 50高鐵氰化鉀(μl)50 50 50充分混勻，37℃培養10分鐘。讀取675nm吸光度或EX665nm/EM690nm熒光值。一個單位定義為37℃在rHCYase過量存在下1分鐘水解S-腺苷高半胱氨酸1μM。實施例7rSAHH·His標記的制備為構建表達載體，通過PCR修飾SAHH基因，5′引物為CATCATCATCATCATCACGCTTGCAAATCACCTACTGG6×His·Tag及3′引物為ATGCATGGATCCTTAATAACGGTAAGCATC。
BamHIpTrc99A(Pharmacia Biotech)用作表達載體。修飾的His rSAHH在SAHH基因N端有6個額外組氨酸密碼，在Nco I-鈍端和BamH I位點將其插入。大腸桿菌JM109為His·SAHH表達的宿主菌株。實施例8具有組氨酸標記的重組S-腺苷高半胱氨酸水解酶純化細胞破碎解凍500g表達SAHH的大腸桿菌冷凍細胞(-80℃)，將其懸浮于500ml20mM磷酸鉀緩沖液，pH 7.6，其中含有1mM DTT和1mM EDTA。用勻漿器(Hc-8000，Microfluidics International Corporation)于5000psi三次破碎細胞。硫酸銨沉淀向破碎細胞懸浮液中加入結晶硫酸銨(20％W/V)，冰上混合20分鐘后，在4℃，12000rpm離心30分鐘，然后收集上清以備進一步純化。Ni-NAT Superflow層析將含有10mM咪唑的澄清上清加到用結合緩沖液(Binding Buffer)(50mM磷酸鉀緩沖液，pH 7.6，0.5M NaCl，10mM咪唑，1mM EDTA和0.01％ α-巰基乙醇)平衡過的Ni-NAT Superflow柱中(2.0×20cm)。用3倍柱體積結合緩沖液沖洗該柱使其280nm的吸光度值達到基線，然后用沖洗緩沖液(50mM磷酸鉀緩沖液，pH 7.6，0.5M NaCl，50mM咪唑，1mM EDTA和0.01％ α-巰基乙醇)沖洗使其280nm的吸光度值達到基線。洗脫緩沖液(50mM磷酸鉀緩沖液，pH 7.6，0.5M NaCl，300mM咪唑，1mM EDTA和1mM DTT)洗脫酶。匯集活性級分并用含1mM DTT和1mM EDTA 50倍體積20mM磷酸鉀緩沖液透析。終產物用30％甘油和1mM NAD儲存在-80℃。
用硫酸銨和親和層析兩步程序來純化重組SAHase，該程序特別快而且有效。該制品通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳產生一條帶。上述方法純化rSAHase特異活性為1.79單位/毫克蛋白。
序列表序列表<110>抗癌公司(AntiCancer，Inc.)徐明旭(Xu，Mingxu)韓慶宏(Han，Qinghong)<120>高特異活性重組S-腺苷高半胱氨酸酶(SAHH)的制備與高度表達及對S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的改進分析<130>31276-20026.43<140>PCT/US 01/01114<141>2001-01-12<150>US 60/176,444<151>2000-01-14<160>6<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1461<212>DNA<213>陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)<400>1atggcttgca aatcacctac tggtgctcca ttcgagtaca gaattgccga catcaacctc 60catgttctcg gccgtaagga acttaccctt gctgagaagg aaatgccagg tcttatggtt120cttcgtgagc gttattccgc ttctaagcca ttgaagggtg tcagaatctc tggttccctc180cacatgacag tccagacagc cgtcctcatc gagacactca cagctcttgg tgctgatgtc240agatgggctt cctgcaacat cttctctaca caagatacag ccgctgctgc tatcgttgtc300ggcccaacag gcacaccaga gaagccagcc ggtatcccag tcttcgcctg gaagggcgaa360acactcccag aatactggga gaacacatac cgcgctctca catggccaga tggtcaaggc420ccacagcagg ttgtcgatga tggtggtgat gctacactcc tcatctccaa gggcttcgaa480ttcgaaacag ccggtgctgt tccagagcca acagaagctg acaacctcga ataccgctgc540gttcttgcta cactcaagca ggtcttcaac caagacaaga accactggca cacagttgct600gccggcatga acggtgtttc cgaagagaca acaacaggtg tccaccgcct ctaccagctc660gagaaggagg gcaaactcct cttcccagcc atcaacgtca acgacgctgt tacaaagtcc720aagttcgata acatctacgg ctgccgccac tcccttatcg atggtatcaa ccgtgcttcc780gatgtcatga tcggcggcaa gacagctctc gtcatgggtt acggcgatgt cggcaagggc840tgcgctcaat ccctccgtgg ccaaggcgct cgcgttatca tcacagaagt cgacccaatc900tgcgctctcc aggctgccat ggaaggctac caggtccgcc gcatcgagga agtcgtcaag960gatgtcgata tcttcgttac atgcacagga aactgcgata tcatctctgt tgacatgatg 1020gcccagatga aggataaggc tattgtcggt aacatcggcc acttcgataa cgaaattgat 1080acagatggcc tcatgaaata cccaggcatc aagcacatcc caatcaagcc agaatacgac 1140atgtgggaat tcccagatgg ccacgctatc ctccttcttg ctgagggccg ccttcttaac 1200cttggctgcg ctacaggtca cccatctttc gttatgtcaa tgtcattcac aaaccagaca 1260ctcgctcagc tcgacctcta cgaaaagaga ggaaatctcg agaagaaggt ttacacactt 1320ccgaagcatc tcgatgaaga agtcgctcgc ctccacctcg gatctctcga tgtccacctt 1380acaaagctta cacagaagca ggctgactac atcaacgttc cagttgaggg tccttacaag 1440tctgatgctt accgttatta a 1461<210>2<211>485<212>PRT<213>陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)<400>2Ala Cys Lys Ser Pro Thr Gly Ala Pro Phe Glu Tyr Arg Ile Ala Asp1 5 10 15Ile Asn Leu His Val Leu Gly Arg Lys Glu Leu Thr Leu Ala Glu Lys20 25 30Glu Met Pro Gly Leu Met Val Leu Arg Glu Arg Tyr Ser Ala Ser Lys35 40 45Pro Leu Lys Gly Val Arg Ile Ser Gly Ser Leu His Met Thr Val Gln50 55 60Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Asp Val Arg65 70 75 80Trp Ala Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp Thr Ala Ala Ala Ala85 90 95Ile Val Val Gly Pro Thr Gly Thr Pro Glu Lys Pro Ala Gly Ile Pro100 105 110Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu Thr Leu Pro Glu Tyr Trp Glu Asn Thr115 120 125Tyr Arg Ala Leu Thr Trp Pro Asp Gly Gln Gly Pro Gln Gln Val Val130 135 140Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr Leu Leu Ile Ser Lys Gly Phe Glu Phe145 150 155 160Glu Thr Ala Gly Ala Val Pro Glu Pro Thr Glu Ala Asp Asn Leu Glu165 170 175Tyr Arg Cys Val Leu Ala Thr Leu Lys Gln Val Phe Asn Gln Asp Lys180 185 190Asn His Trp His Thr Val Ala Ala Gly Met Asn Gly Val Ser Glu Glu195 200 205Thr Thr Thr Gly Val His Arg Leu Tyr Gln Leu Glu Lys Glu Gly Lys210 215 220Leu Leu Phe Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ala Val Thr Lys Ser Lys225 230 235 240Phe Asp Asn Ile Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Ile Asp Gly Ile Asn245 250 255Arg Ala Ser Asp Val Met Ile Gly Gly Lys Thr Ala Leu Val Met Gly260 265 270Tyr Gly Asp Val Gly Lys Gly Cys Ala Gln Ser Leu Arg Gly Gln Gly275 280 285Ala Arg Val Ile Ile Thr Glu Val Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala290 295 300Ala Met Glu Gly Tyr Gln Val Arg Arg Ile Glu Glu Val Val Lys Asp305 310 315 320Val Asp Ile Phe Val Thr Cys Thr Gly Asn Cys Asp Ile Ile Ser Val325 330 335Asp Met Met Ala Gln Met Lys Asp Lys Ala Ile Val Gly Asn Ile Gly340 345 350His Phe Asp Asn Glu Ile Asp Thr Asp Gly Leu Met Lys Tyr Pro Gly355 360 365Ile Lys His Ile Pro Ile Lys Pro Glu Tyr Asp Met Trp Glu Phe Pro370 375 380Asp Gly His Ala Ile Leu Leu Leu Ala Glu Gly Arg Leu Leu Asn Leu385 390 395 400Gly Cys Ala Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Met Ser Phe Thr405 410 415Asn Gln Thr Leu Ala Gln Leu Asp Leu Tyr Glu Lys Arg Gly Asn Leu420 425 430Glu Lys Lys Val Tyr Thr Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Glu Val Ala435 440 445Arg Leu His Leu Gly Ser Leu Asp Val His Leu Thr Lys Leu Thr Gln
450 455 460Lys Gln Ala Asp Tyr Ile Asn Val Pro Val Glu Gly Pro Tyr Lys Ser465 470 475 480Asp Ala Tyr Arg Tyr485<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>上游引物<400>3ttttggatcc gcttgcaaat cacctgctgg tgc 33<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>下游引物<400>4ttttctgcag ggggagctat cgtc24<210>5<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5catcatcatc atcatcacgc ttgcaaatca cctactgg 38<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6ctacgaatgg caataattcc taggtacgta 30
權利要求
1.評估生物液體樣品中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的治療性水平的方法，該方法包括將甘氨酸N-甲基轉移酶(GMT)，S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)或His·SAHH，以及甘氨酸加入該樣品中；測量所述樣品中一種或多種反應產物，其中所述一種或多種反應產物的水平與樣品中SAM水平成正比。
2.權利要求1的方法，其中被檢測的產物是高半胱氨酸(HC)。
3.權利要求2的方法，其中所述HC是由下述方法測得，該方法包括用高半胱氨酸酶(HCYase)處理樣品，并測定所述高半胱氨酸與HCYase反應得到的至少一種產物的濃度。
4.權利要求3的方法，其中測得的產物是H2S。
5.權利要求4的方法，其中所述H2S通過熒光或吸光度而測定。
6.權利要求1的方法，其中所述SAHH包含SEQ ID NO1編碼的氨基酸序列。
7.分析含SAM的樣品的試劑盒，該試劑盒包括SAHH或His·SAHH，GMT，甘氨酸及使用說明。
8.一種試驗，包括含SAM的生物樣品；和GMT，甘氨酸，以及SAHH或His·SAHH，其中SAHH或His·SAHH活性產生一種可測定的產物以確定樣品中SAM的量。
9.一種分離的包含SEQ ID NO1的核酸分子。
10.權利要求9中定義的核酸分子，還包括編碼N端6×His標記的序列。
11.有效制備S-腺苷高半胱氨酸水解酶的方法，所述方法包括使含有權利要求9定義的核酸分子的盒進行表達。
12.有效制備His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶的方法，所述方法包括使含有權利要求10定義的核酸分子的盒進行表達。
13.權利要求11的方法，其中所述盒在大腸桿菌中表達。
14.權利要求12的方法，其中所述盒在大腸桿菌中表達。
15.純化His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶的方法，包括用硫酸銨來沉淀含His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶的懸浮液以產生上清和沉淀，所述His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶由權利要求12的方法生成；和對該上清進行組氨酸標記識別型親和層析。
16.用單個層析步驟純化His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶的方法，包括使通過權利要求12的方法生成的His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶進行Ni-NAT親和層析。
17.測定生物液體中高半胱氨酸的方法，包括將所述液體與His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶接觸并且測定所述液體中高半胱氨酸向SAH的轉化，所述His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶由權利要求15的方法生成。
18.包含His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶的組合物，所述His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析為一條帶，其中所述His·S-腺苷高半胱氨酸水解酶由權利要求15的方法制成。
19.耗竭體內或來自體內的生物液體中過量高半胱氨酸的方法，包括使所述液體與權利要求15的方法生成的SAHH接觸。
20.一種大腸桿菌宿主細胞，包括權利要求9的核酸分子。
21.一種大腸桿菌宿主細胞，包括權利要求10的核酸分子。
全文摘要
本發明提供涉及SAM檢測和制備的新方法及新SAHH酶活性在該方法中的應用。還提供涉及新SAHH的其它方法，組合物及試劑盒。
文檔編號C12R1/19GK1416472SQ01803726
公開日2003年5月7日 申請日期2001年1月12日 優先權日2000年1月14日
發明者徐明旭, 韓慶宏 申請人:抗癌公司