專利名稱：采用空間定位的分析物繁殖檢測和定量樣品中的一種或多種目的分析物的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于如下目的的裝置和方法通過目視或光度測定來檢測樣品中一種或多種微生物目的分析物存在與否；當發現存在時，對樣品中的分析物進行記數。待分析的材料可能是生物材料；環境材料；食物材料；或可能藏匿目的分析物的其它材料。目的分析物是可能在待測樣品中發現的一種或多種特定的活的生物，例如微生物、細菌、真菌、支原體或原生動物；通過適當的生長培養基中一種或多種分析物的新陳代謝繁殖來檢測一種或多種分析物存在與否。可以在支持目的分析物選擇性生長、但限制樣品中可能存在的其它活生物生長的凝膠或半固體生長材料中進行分析。由此，在培養基中形成可檢測的目的分析物菌落。可以通過多種技術對菌落進行檢測和記數，包括使用可選擇性結合到目的分析物某部分的目視或光度測定可檢測的材料。
背景技術：
將樣品放在無菌的生長培養基上對樣品中目的細菌或其它活的生物(例如真菌和原生動物)的存在與否進行分析是大家所熟知的。通常通過它們的外觀、它們與生長或其它培養基的化學反應或采用酶的或免疫學的試劑來鑒別各種細菌。因為不同種的細菌菌落看起來相似，所以通常必須在建立正確的鑒定之前對許多菌落進行許多實驗。如果必須區分細菌亞種，例如查明大腸桿菌血清型0157H7在其它外觀上一致的大腸桿菌混合物中的存在，這將尤其成問題。具有專門特性的生長培養基有助于這種生物的快速可視的檢測，但是目的生物與背景的關系越緊密，僅采用化學方法來區分它們就越困難。如果能快速而特異地確定這種菌落，尤其如果技術人員不需要其它操作，將是更為理想的。
發明內容
本發明涉及檢測樣品中一種或多種目的微生物分析物存在與否的方法和裝置。通過在營養培養基中培養目的分析物以致其在培養基中形成菌落，然后對培養基中可能形成的、任何產生的目的分析物菌落進行檢測和記數，來進行目的分析物的檢測。
在可能還含有或者混合有一種或多種分析物特異性標記材料(LASMs)的培養基中進行分析。LASMs在整個培養基中均勻分布。LASMs包括一種結合因子，它可以是對目的分析物中或其上的結合位點特異的蛋白質、凝集素或核酸序列。標記可以是與結合因子接的染料或熒光團，包括膠體或顆粒。培養基中的LASMs可以穿過培養基向目的分析物菌落擴散和移動，并且結合到菌落中單個生物上，從而突出菌落與培養基的其余部分的差別。LASMs既可以直接結合到生物表面，也可結合到生物的產物上，例如它的莢膜物質或內在的分子結構，只要如此結合的LASM不會明顯離開這個位點。因為LASM的結合局部地損耗目的分析物菌落所占據的培養基區域中LASM的濃度，所以在每個目的分析物菌落的周圍將形成較低LASM濃度的“暈環”，在每個暈環的中心將是一個相應于標記菌落的高強度點。培養基中沒有任何目的生物存在就將不結合LASMs并顯示出這種特征。
將待分析的材料樣品接種到培養基中或涂布到培養基上。如果要求定量分析，就應測量樣品接種物的體積量。因為生物繁殖，將形成菌落并在培養基中或其上保持一個固定的位置。按大小選擇培養基中的LASMs以便能夠在培養基中或穿過培養基移動。因此，目的分析物菌落區域中的LASMs穿過培養基自由移動并結合在菌落中的目的生物或它們的產物上。這將導致目的分析物菌落比培養基中周圍的區域顯示出更強的標記信號。此處的原因是目的生物菌落富集了LASM，而周圍區域的LASM也漸漸損耗。培養基中毗連目的生物菌落的緊鄰周圍區域將趨向于發出減弱的標記信號。最終的結果是培養基中形成“亮”點，其周圍環繞著“暗淡的”暈環。如果樣品中沒有目的分析物存在，培養基將保持一個相對均勻水平的標記信號發射，似乎是平均“上色”的。
如果使用靈敏的光學機械光度測定讀出器(opto-mechanicalphotometric reader)，例如1999年2月提交的共同未決申請USSN09/255,673中所描述的，可在將樣品接種培養基后1到2小時之內完成測定，如果使用目視檢查，可在大約18小時之內完成。因為已知接種到或涂布到培養基上的樣品體積，通過對培養基中加亮的菌落數進行記數，可以確定每單位體積標本樣品中目的分析物的數量。這使得使用本發明可以獲得目的分析物的定量分析。可以將一部分含有LASM的培養基不接種樣品，這樣使得這部分培養基可作為陰性對照。一些樣品，尤其是那些采自“骯臟”來源的，例如環境樣品或那些含有大量其它材料的樣品，可能含有許多具有一定水平非特異信號的顆粒或其它材料，并且這些非特異的信號可能會與目的分析物所產生的信號混淆。但是可以通過目視或光度測定獲得培養基中相同區域的連續圖像來解決這一問題，這些圖像彼此相隔適當的時間區段。由于目的生物的連續生長，只有那些目的生物形成的菌落的信號強度會增加。連續圖像的比較，優選使用數字圖像處理來進行，可以將強度增加的這些區域與周圍的培養基區分開來。這種動力學分析的方法在可獲得合適的光度測定讀出裝置的任何情況下都是優選的，因為這種技術將提供完成此分析最高的靈敏度、最好的選擇性和最短的時間。
為了達到最大的信號/噪聲比，可使培養基盡可能薄，例如大約1毫米或更薄，優選小于約0.5毫米。標記的濃度應當使它發出的信號正好可從培養基的非接種區得到檢測。對于目視檢測，有用的信號是在合適的照明條件下用裸眼可些微辨認、而且不那么明顯以免使得菌落信號變得模糊的信號。對于自動檢測，應該控制濃度達到相對于“黑暗”背景具有一個適當的信號/噪聲比的強度，這樣將容許定量。確切的量必須基于所使用儀器的光度測定特性來確定。對于光度測定分析方案，可以使用熒光團，例如熒光素、硫羅丹明(sulforhodamine)、以及Cy-3、Cy-5和Cy-7作為標記。應當指出，如果能夠區別針對每個目標的LASMs標記，例如能通過LASMs顯示的顏色、和/或發射的光波來區別，則使用本方法可以檢測兩種或多種目的生物。
因此，本發明的目的是提供能夠用于測試標本樣品中目的分析物存在與否的方法和裝備。
本發明的另一個目的是提供具有所描述性質的方法和裝備，其中將樣品放于混合有能夠在培養基中遷移的、對目的分析物特異的標記材料的培養基上。
本發明的另一個目的是提供具有所描述性質的方法和裝備，其中目的分析物是活的生物。
本發明的另一個目的是提供具有所描述性質的方法和裝備，其中在同一培養基上能夠檢測兩種或多種目的分析物。
本發明另外的目的是提供具有所描述性質的方法和裝備，其中通過在培養基中生長目的分析物菌落，并由此在目的分析物的菌落中產生局部濃度逐漸增加的分析物特異性標記材料，來檢測目的分析物。
當與附圖聯合起來理解時，從以下本發明的詳述中，將更加容易明確本發明的這些或其它目的和優點，其中附圖簡述
圖1是依照本發明所形成的目的分析物特異的標記材料與目的分析物生長培養基混合物的平面視圖；圖2和3是與圖1相似的平面視圖，但顯示了由于待測試樣品中存在目的分析物，在混合物中各種程度的局部強烈標記區域的形成；以及圖4是采用光度測定的光發射信號檢測儀器掃描得到的樣品所發射的信號強度水平，或者目視所觀察的信號強度水平的象形曲線圖。
實施本發明的詳細實施例現在參考圖1，顯示通常用數字2表示的、適合實施本發明方法的培養基矩形部分的平面視圖。圖1顯示的培養基區域被均勻地加上陰影以表示在將樣品接種到培養基中之前或當樣品中沒有目的分析物存在時接種樣品和孵育之后，通過人眼或通過掃描儀器將檢測到的均勻分布的標記信號發射。培養基2的3區是不接種待測樣品的區域，但它含有樣品中所使用的所有試劑，因此可作為一個陰性對照區。圖2和3舉例說明當樣品中存有目的分析物時，培養基2中標記發射水平所得的變化。圖2表示樣品中目的分析物水平相對較低的結果，在培養基2中產生許多較為強烈標記的菌落4，其周圍是較低水平標記的暈環6。圖3表示樣品中含有相對高水平目的分析物時的結果。應當指出根據圖2和3可以將菌落4記數，而且因為可以知道樣品接種物的體積和培養基2的區域大小，通過以下本發明的程序可以得到每單位樣品體積中分析物的濃度。圖4是自動分析儀器對培養基進行線性掃描所檢測的標記發射強度的象形曲線圖。跡線8表示培養基中標記的發射水平。下降10表示“暗淡的”暈環6發出的低水平標記信號發射；峰12表示“明亮的”菌落4發出的高水平標記信號發射。
以下是利用本發明的技術能夠檢測的目的分析物和檢測每個分析物所用試劑的實例。
實施例1在從食物或環境來源檢測大腸桿菌0157H7的情況下，通過將熒光團，例如熒光素或Texas紅與對0157H7生物特異的抗體共價結合獲得LASM。將LASM與生長培養基例如Muller-Hinton瓊脂、MacConkey’sSorbital培養基等等混合，以便達到在適當波長光的照射下可見，或通過成像系統能夠容易測量的足夠LASM濃度。在目視檢測的情況下，優選熒光素作為標記。當使用光度測定分析方案時，標記可以是硫羅丹明標記、或Cy-3、Cy-5或是Cy-7標記，后者的Cy標記發出紅光、或接近紅外線的波長的信號，雖然人眼無法觀察到，但可以通過光度測定來檢測。
在平皿中倒入優選厚度為0.5毫米的適用于儀器檢測形式的培養基/LASM混合物；或倒入大約厚度為1.0毫米的混合物層以適用于目視檢測形式。如果樣品是臨床來源的，可將它直接平板接種到培養基上。如果樣品是食物來源的，將優選將食物源分散在無菌溶液中，然后過濾去除掉樣品中可見的顆粒物質。環境來源的樣品可采用與食物來源樣品同樣的方法處理。將樣品在大約35℃的溫度下孵育后，按照以上所描述的對平板接種的樣品進行定期檢測。對懷疑只含有少量生物的樣品，可通過如過濾大量的待測樣品，然后將濾膜放在培養基上來進行濃縮。因為濾膜是定義具有透性的，所以LASMs可穿過濾膜并附著到生長的生物上，就象該生物本身在培養基表面生長一樣。
實施例2在從例如乳酪樣品中檢測單核細胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的情況下，優選按照以上的實施例1進行分析，除了通過將熒光團或其它染料與對此利斯特氏菌屬生物特異的抗體共價結合來獲得LASMs。將LASM與生長培養基例如Esculin-基礎革蘭氏陽性選擇性瓊脂(Esculin-based gram positive selective agar)混合。將待分析的樣品接種到培養基上之后，將平板在35℃下孵育。然后按照以上所描述的對平板進行定期目視或光度測定上的檢測。
實施例3在從例如來自食物、水或臨床的樣品檢測傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)的情況下，優選按照以上的實施例1進行分析，除了通過將熒光團或其它染料與對傷寒沙門氏菌生物特異的的抗體共價結合來獲得LASM。將LASM與生長培養基例如亞硫酸鉍瓊脂或Hektoen腸瓊脂(Hektoen enteric agar)混合。在將待分析的樣品接種到培養基之上或之中后，將平板在35℃下孵育。然后按照以上所描述的對平板進行定期目視或光度測定上的檢測。
實施例3在從臨床樣品中檢測白假絲酵母(Candida albicans)的情況下，優選按照以上的實施例1進行分析，除了通過將熒光團或其它染料與對白假絲酵母生物特異的抗體或凝集素共價結合來獲得LASM。將LASM與生長培養基例如Sabouraud氏葡糖瓊脂(Sabouraud’s dextrous agar)培養基混合。將待分析的樣品接種到培養基上之后，將平板在35℃下孵育。然后按照以上所描述的對平板進行定期目視或光度測定上的檢測。
應當很容易理解，以上所描述的方法和裝置可以用來檢測可能存在于待分析樣品中的多種微生物的存在與否。可在生長培養基上形成的強烈標記的目的微生物菌落周圍出現局部微弱標記的暈環，使得可進行目視或光度測定上的檢測，并將在培養基上形成的任何目的微生物菌落記數。使用具有選擇性質的培養基可促進目的微生物菌落的生長并抑制非目的微生物菌落的生長。可使用此技術通過形成菌落的簡單記數以及接種到培養基上或其中的樣品體積的記錄來評價樣品中目的微生物的濃度。從培養基相同區域順序讀數以便檢測局部LASM濃度的變化，而此變化與目的分析物的生長相關。
因為在不違背發明概念的情況下，可在本發明的公開實施方案中進行許多改變和變化，故其并不旨在用來限制附及權利要求所要求保護的本發明。
權利要求
1.一種用于在懷疑含有目的微生物分析物的材料樣品中通過目視或光度測定檢測一種或多種目的微生物分析物的裝置，該裝置包含a)樣品容器；b)該樣品容器中的生長支持培養基，該生長支持培養基可限制該培養基中所形成的目的微生物分析物菌落在培養基中的遷移；和c)一種或多種均勻分布在整個該生長支持培養基中的分析物特異性標記材料(LASM(s))，所述的LASM(s)能夠在該生長支持培養基中向著在該生長支持培養基中或上形成的目的微生物分析物菌落移動。
2.權利要求1的裝置，其中所述的生長支持培養基可促進在該生長支持培養基內或上目的分析物微生物菌落的形成并抑制非目的分析物微生物菌落的形成。
3.權利要求1的裝置，其中所述的目的微生物分析物包括大腸桿菌0157H7；所述的LASM(s)包括與敏感標記偶聯的大腸桿菌0157H7特異性抗體；所述的生長支持培養基是選自Muller-Hinton瓊脂Kirby-Bauer培養基、MacConkey’s Sorbital培養基的生長支持培養基。
4.權利要求3的裝置，其中所述的敏感標記選自熒光團、Cy-3、Cy-5和Cy-7。
5.權利要求4的裝置，其中所述的標記是硫羅丹明。
6.權利要求4的裝置，其中所述的標記是熒光素。
7.權利要求1的裝置，其中所述的目的微生物分析物包括單核細胞增生利斯特氏菌；所述的LASM(s)包括與敏感標記偶聯的單核細胞增生利斯特氏菌特異性抗體；且所述的生長支持培養基是Esculin-基礎革蘭氏陽性選擇性瓊脂。
8.權利要求7的裝置，其中所述的敏感標記是熒光團。
9.權利要求8的裝置，其中所述的熒光團是硫羅丹明。
10.權利要求8的裝置，其中所述的熒光團是熒光素。
11.權利要求1的裝置，其中所述的目的微生物分析物包括傷寒沙門氏菌；所述的LASM(s)包括與敏感標記偶聯的傷寒沙門氏菌特異性抗體；且所述的生長支持培養基是一種選自亞硫酸鉍瓊脂和Hektoen腸瓊脂的瓊脂培養基。
12.權利要求11的裝置，其中所述的敏感標記是熒光團。
13.權利要求12的裝置，其中所述的熒光團是硫羅丹明。
14.權利要求12的裝置，其中所述的熒光團是熒光素。
15.權利要求1的裝置，其中所述的目的微生物分析物包括白假絲酵母；所述的LASM(s)包括與敏感標記結合的白假絲酵母特異性抗體或凝集素；且所述的生長支持培養基選自Muller-Hinton瓊脂Kirby-Bauer培養基。
16.權利要求15的裝置，其中所述的敏感標記是熒光團。
17.權利要求16的裝置，其中所述的熒光團是硫羅丹明。
18.權利要求16的裝置，其中所述的熒光團是熒光素。
19.一種用于在懷疑含有目的微生物分析物的材料樣品中通過光度測定來檢測一種或多種目的微生物分析物的裝置，該裝置包含a)樣品容器；b)該樣品容器中的生長支持培養基，該生長支持培養基可限制該培養基中所形成的目的微生物分析物菌落在培養基中的遷移；和c)一種或多種均勻分布在整個該生長支持培養基中的分析物特異性標記材料(LASM(s))，所述的LASM(s)能夠在該生長支持培養基中向著在該生長支持培養基中或上形成的目的微生物分析物菌落移動。
20.權利要求19的裝置，其中所述的生長支持培養基可促進在該生長支持培養基內或上目的分析物微生物菌落的形成，并抑制非目的分析物微生物菌落的形成。
21.權利要求19的裝置，其中所述的LASM(s)包括選自Cy-3、Cy-5和Cy-7的光度測定敏感的標記。
22.一種用于在懷疑含有目的微生物分析物的材料樣品中通過光度測定來檢測一種或多種目的微生物分析物的方法，該方法包括a)提供樣品容器的步驟；b)提供該樣品容器中的生長支持培養基的步驟，該生長支持培養基可限制該培養基中所形成的目的微生物分析物菌落在培養基中的遷移；c)提供一種或多種均勻分布在整個該生長支持培養基中的分析物特異性標記材料(LASM(s))的步驟，所述的LASM(s)是光度測定上可檢測的，并能夠在該生長支持培養基中向著在該生長支持培養基中或上形成的目的微生物分析物菌落移動；d)在該生長支持培養基上或其中接種待分析材料的步驟；以及e)光度測定掃描所接種的培養基以檢測強烈標記的目的分析物菌落存在與否的步驟。
23.權利要求22的方法，其中所述的生長支持培養基可促進在該生長支持培養基內或上目的分析物微生物菌落的形成，并抑制非目的分析物微生物菌落的形成。
24.權利要求22的方法，其中所述的LASM(s)包括選自Cy-3、Cy-5和Cy-7的光度測定敏感的標記。
25.權利要求22的方法，其中所述的強烈標記的目的分析物菌落周圍是該培養基中暗淡標記的暈環。
26.權利要求22的方法，其中從該培養基相同區域順序讀數以便檢測局部LASM濃度的變化，此變化與目的分析物的生長相關。
全文摘要
通過將樣品物質接種到生長培養基來測試該物質(例如生物或環境物質)中一種或多種目的微生物分析物的存在與否。可將培養基與分析物特異性標記材料(LASM)混合,此材料可穿過培養基移動并均勻分布在整個培養基中。LASM可預先與培養基混合,或在接種了所述物質之后再加入到培養基中。待測樣品加入到培養基中之后,樣品中目的分析物菌落的生長將導致結合的LASM的量逐漸增加,因此在培養基上形成局部強烈標記的區域,可通過目視或光度測定來檢測。
文檔編號C12M1/34GK1356549SQ01142438
公開日2002年7月3日 申請日期2001年11月28日 優先權日2000年11月28日
發明者斯蒂芬·C·沃德羅, 斯蒂芬·C·艾德伯格 申請人:斯蒂芬·C·沃德羅, 沃德羅合伙有限責任公司, 羅伯特·A·利費恩