專利名稱：肝癌診斷、監護及肝硬化監護試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬生物制劑技術領域，具體涉及一種肝癌診斷、監護及肝硬化監護試劑盒。
本發明提供了一種肝癌診斷、監護及肝硬化監護試劑盒。本發明的試劑盒是由試劑1和試劑2組成的，其中試劑1為(0.5-9％)檸檬酸三鈉 0-300mmol/L(0-5.5％)Na2HPO40-300mmol/L(0-4％) NaAc0-300mmol/L(0-7.8％)CAPSO 0-300mmol/LNaN30-0.1％(0-4.7％)NaH2PO40-300mmol/L試劑2為(0.5-6.5％)檸檬酸0-300mmol/L(0-10％) HAc 0-300mmol/L(0-0.3％) HCl 0-300mmol/L(0-0.2％) 苯甲酸0-12mmol/L(0.1-2％) CNPF 0-5mmol/L本發明的另一所要解決的技術問題是提供了上述肝癌診斷、監護及肝硬化監護試劑盒的制備方法，該方法包括下列步驟1.用不同種類、不同濃度、不同pH的緩沖系統，測定同份樣品中AFU活性，初選出相對滿意的緩沖系統；實驗研究中各物質濃度范圍如下檸檬酸三鈉 0-300mmol/L 檸檬酸 0-300mmol/LNa2HPO40-300mmol/L HAc 0-300mmol/LNaAc0-300mmol/L HCl 0-300mmol/LCAPSO 0-300mmol/L 苯甲酸 0-12mmol/LNaN30-0.1％ CNPF0-5mmol/LNaH2PO40-300mmol/L2.對初選出的緩沖系統，逐一完成緩沖液濃度和pH對酶活性的影響試驗，以及各系統中底物CNPF的穩定性實驗，進一步縮小緩沖系統的可選范圍；3.擇優選用能提高CNPF穩定性的緩沖系統，實驗求出該系統中酶反應產物CNP的摩爾吸光度(ε)，并求出該系統中CNPF濃度對AFU活性的影響曲線，在此基礎上確定下一步實驗的CNPF的濃度范圍；制備在此范圍內不同CNPF濃度的緩沖系統，經過對血清AFU活性測定，用Linewear-Burk雙倒數作圖法，求出在該系統中AFU對CNPF的米氏常數Km值；結合CNPF濃度對AFU活性的影響曲線，確定試劑中CNPF的配制濃度；4.經過上述選擇，配制成選定的緩沖系統和底物濃度的試劑，經37℃加熱試驗，并通過與其他糖苷類試劑的比較，進一步確定CNPF在該系統中的穩定性；
5.作重復性試驗和線性試驗；本發明的試劑盒既可作穩定的雙試劑(試劑1和試劑2)直接使用，也可將試劑1與試劑2按4∶1的比例混合，作穩定的單試劑直接使用。通常，本發明的試劑盒采用連續監測法，必要時也可加用終止液，改為兩點比色法。檢測參數為主波長405nm 次波長600nm光 徑1cm 溫度 37℃延滯時間 90秒 監測時間 90秒試劑1 200μl試劑2 50μl樣品 25μl 計算因數 3207如改用單試劑操作，只需將試劑1與試劑2按規定比例混合均勻，即得穩定的液體單試劑。
如所用儀器不含有405nm波長，可將主/次波長改為410nm/600nm，計算因數改為3337，其余測定參數不變。
本發明的檢測效果如下最低檢測限0.6U/L方法靈敏度ΔA405nm/min＝3.12×10-4/U，即F＝3207批內精密度CV＝1.72-3.7％天間精密度CV＝4.64％線性范圍達250U/L(正常參考范圍10-35.5U/L)方法比較與經典的PNPF兩點法比較，兩者結果顯著相關，r＝0.955，P＜0.01，y＝0.32x+0(y為PNPF兩點法，x為本法，均以U/L表示)。回歸分析表明，本法顯著提高了酶對底物的水解速率，達PNPF兩點法的三倍以上。
AFU測定試劑盒在臨床用于肝癌診斷的試驗如下1.我們以健康人血清中AFU X+3S為診斷臨界值，對原發性肝癌(PHC)的診斷敏感性為84.9％。但是，急性黃疸型肝炎、慢活肝、肝硬化病人血清中AFU水平與PHC病人有明顯交疊。為解決這一鑒別診斷中的問題，我們對這四組病人進行了隨訪觀察。除PHC組外，其余三組病人經過對癥治療約十天后，血清AFU逐漸下降，而未經抗癌治療或手術切除的PHC病人血清中AFU保持在持續高值，與其余三組病例的血清AFU水平明顯分離。這一現象的發現，顯著提高了血清AFU測定對PHC診斷的特異性。
2.血清AFU水平與肝癌大小不相關。有文獻報道，小肝癌病人組，血清AFU升高的陽性率在70％以上，而同組病人AFP升高者僅37.5％。說明血清AFU對小肝癌的診斷敏感性遠遠高于血清AFP。
3.血清AFU活性與AFP水平不相關，兩者同時檢測，互為補償，可明顯提高PHC的發現率。我們在34例AFP陽性的PHC病人中發現，AFU陽性29例，占85.3％；在19例AFP陰性的PHC病人中，AFU陽性16例，占84.2％。說明在無法借AFP檢出的PHC病人中，如同時檢測AFU，可以減少大約84.2％的病人被漏診。我們的資料還證明，同時測定AFU和AFP，可使PHC的陽性檢出率從單測AFP的64.2％提高到94.3％！4.對肝硬化等病人的隨訪監護具有重要價值。這些病人如果血清AFU由正常轉為持續升高，或者始終保持異常高值不降，應高度警惕并發肝癌。國外報道，凡有上述升高情況者，無一幸免肝癌，其中一例在確診PHC前66個月，已出現血清AFU升高，嗣后一直持續不降。就此而言，不僅其診斷特異性幾達100％，而且具有早期發現肝癌的價值。
5.對PHC的療效觀察和隨訪具有價值。PHC經手術切除后，血清AFU下降，再度升高提示PHC復發。
6.對影象診斷難以定性的肝占位病變，可協助診斷；不受AFP＞400μg/l持續四周，和＞200μg/l持續八周在時間上的限制，有利于肝癌的早期診斷。
7.其它臟器癌癥發生肝轉移時，血清中AFU活性也可明顯升高，盡管升高程度略低于PHC病人，但仍具有很好的輔助診斷價值。
本發明的試劑盒是一種體外診斷試劑，用來測定人血清(體液)中α-L-巖藻糖苷酶(AFU)活性，對原發性肝癌的診斷和監護，以及監護肝硬化病人是否并發肝癌，獨具價值。本發明的試劑盒既適用于全自動生化分析儀，也適用于半自動生化分析儀，需要時還可改為手工操作使用，操作十分簡便，適于各種實驗室，市場前景廣闊。
HAc 63mlNaN31gH2O加至 1000ml
權利要求
1.一種肝癌診斷、監護及肝硬化監護試劑盒，其特征在于該試劑盒是由試劑1和試劑2組成的，其中試劑1為(0.5-9％)檸檬酸三鈉 0-300mmol/L(0-5.5％)Na2HPO40-300mmol/L(0-4％) NaAc 0-300mmol/L(0-7.8％)CAPSO 0-300mmol/LNaN30-0.1％(0-4.7％)NaH2PO40-300mmol/L試劑2為(0.5-6.5％)檸檬酸 0-300mmol/L(0-10％) HAc 0-300mmol/L(0-0.3％) HCl 0-300mmol/L(0-0.2％) 苯甲酸 0-12mmol/L(0.1-2％) CNPF 0-5mmol/L
2.一種如權利要求1所述的一種肝癌診斷、監護及肝硬化監護試劑盒的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)用不同種類、不同濃度、不同pH的緩沖系統，測定同份樣品中AFU活性，初選出相對滿意的緩沖系統；實驗研究中各物質濃度范圍如下檸檬酸三鈉 0-300mmol/L檸檬酸 0-300mmol/LNa2HPO40-300mmol/LHAc 0-300mmol/LNaAc0-300mmol/LHCl 0-300mmol/LCAPSO 0-300mmol/L苯甲酸 0-12mmol/LNaN30-0.1％CNPF0-5mmol/LNaH2PO40-300mmol/L(2)對初選出的緩沖系統，逐一完成緩沖液濃度和pH對酶活性的影響試驗，以及各系統中底物CNPF的穩定性實驗，進一步縮小緩沖系統的可選范圍；(3)擇優選用能提高CNPF穩定性的緩沖系統，實驗求出該系統中酶反應產物CNP的摩爾吸光度(ε)，并求出該系統中CNPF濃度對AFU活性的影響曲線，在此基礎上確定下一步實驗的CNPF的濃度范圍；制備在此范圍內不同CNPF濃度的緩沖系統，經過對血清AFU活性測定，用Linewear-Burk雙倒數作圖法，求出在該系統中AFU對CNPF的米氏常數Km值；結合CNPF濃度對AFU活性的影響曲線，確定試劑中CNPF的配制濃度；(4)經過上述選擇，配制成選定的緩沖系統和底物濃度的試劑，經37℃加熱試驗，并通過與其他糖苷類試劑的比較，進一步確定CNPF在該系統中的穩定性；(5)作重復性試驗和線性試驗；
3.根據權利要求1所述的一種肝癌診斷監護及肝硬化監護試劑盒，其特征在于該試劑盒為液體型雙試劑或液體型單試劑。
全文摘要
本發明屬生物制劑技術領域。本發明公開了一種肝癌診斷、監護及肝硬化監護試劑盒。該試劑盒是一種體外診斷試劑，用來測定人血清中α－L－巖藻糖苷酶(AFU)活性，對原發性肝癌的診斷、監護以及肝硬化的監護具有廣泛的臨床意義。本發明提供了制備方法。
文檔編號C12Q1/25GK1428435SQ01139259
公開日2003年7月9日 申請日期2001年12月27日 優先權日2001年12月27日
發明者張抗 申請人:張抗