專利名稱：熒光共振能量轉移寡核苷酸微陣列的核酸檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種基于熒光共振能量轉移寡核苷酸微陣列的核酸檢測方法，利用新型基因芯片進行核酸檢測，用于疾病的臨床基因診斷，基因多態性分析和物種鑒定等，屬于生物檢測技術領域。
為實現這樣的目的，在本發明中，采用一種新的基因芯片—熒光共振能量轉移寡核苷酸微陣列，進行核酸種類與數量的檢測。寡核苷酸片段兩端分別用熒光供體基團與熒光受體基團標記，片段的中間用生物素標記。
本發明的具體步驟如下第一步，制備待測核酸樣品，利用各種分子生物學常規方法(DNA抽提、PCR擴增、mRNA抽提)制備各種待測核酸樣品。
第二步，待測核酸樣品與寡核苷酸微陣列在雜交緩沖液中雜交，用雜交洗脫緩沖液在特定條件下洗脫，那些不能與寡核苷酸探針完全配對的目標核酸將被洗脫，而那些能夠與寡核苷酸探針完全配對的核酸不會被洗去而結合在基因芯片上。寡核苷酸微陣列上寡核苷酸片段的序列特征是5’-末端的序列將與待測核酸樣品目標區域的3’-序列配對，3’-末端的序列將與目標區域的5’-序列配對，中間序列是寡聚胸腺核苷酸；這種片段的修飾特征是兩個末端分別用不同的熒光基團修飾，中間用生物素修飾。生物素的作用是將寡核苷酸固定于玻片表面；兩個熒光基團用于產生檢測信號，其信號產生原理基于兩個熒光基團在相互作用接近時將發生熒光能量共振轉移。
第三步，根據熒光供體基團的激發光波長與熒光受體基團的發射光波長選擇對應的光學檢測系統檢測微陣列的熒光信號及其位置，確定待測核酸樣品的結構特征及其含量。
本發明與現有的基因芯片技術相比有顯著的進步。主要優點如下(1)待測樣品無需預先用熒光基團標記；(2)能夠檢測出待測核酸一個位點的核苷酸差異；(3)可以同時檢測多個核酸序列，且樣品間干擾小；(4)目標分子可以是DNA、RNA、單鏈核酸、雙鏈核酸。
本發明利用熒光共振能量轉移寡核苷酸微陣列的核酸檢測方法，可用于檢測待測核酸的種類與含量，單核苷酸多態性分析以及疾病診斷等領域。與利用寡核苷酸微陣列檢測核酸種類與數量的其它方法相比，本發明的待測樣品不需要預先進行熒光標記，操作簡單，成本低。
具體實施例方式以下通過一個具體的實施例來進一步說明本發明的技術方案。
本實施例用熒光共振能量轉移寡核苷酸微陣列檢測胎兒性別，其寡核苷酸片段采用特異性堿基序列，其熒光供體基團是Fluorescein，熒光受體基團是Red640，利用生物素與streptavidin間相互作用固定探針分子于玻片上。用490nm波長激發Fluorescein，其發射光波長是518nm。如果存在熒光能量共振轉移，則Fluorescein的發射光進一步激發Red640，后者發射光的波長是640nm。在寡核苷酸微陣列檢測過程中，激發光波長是490nm，檢測微陣列在640nm波長處的信號強度。
現在胎兒性別檢測方法主要有B超、PCR檢測等。在PCR方法檢測胎兒性別操作中用兩對引物進行擴增反應，一對引物(primer1tgggttcatctttgctcacac，primer2cttgaactcctgacctcgtg)可以擴增X染色體的一段556bp長的特異性核苷酸序列，另一對引物(primer3atgccctcaatgtcctgacg，primer4gcgggaagatgagtttggc)可以擴增Y染色體的一段441bp長的特異性核苷酸序列。用PCR擴增這兩段特異性核酸序列后，進行PAGE膠電泳可以進行產前胎兒性別鑒定。其主要操作為抽取孕婦羊水，4000rpm離心收集細胞，從收集細胞中抽提DNA。以抽提的DNA為模板，分別用引物12進行PCR擴增X染色體片段，引物34進行PCR擴增Y染色體片段。將PCR擴增產物進行凝膠電泳，根據電泳的結果鑒別胎兒性別。如果只有引物12能夠擴增出DNA片段，表明待測對象女性；如果引物12，引物34都能夠擴增出DNA條帶，表明待測對象是男性。
PCR方法檢測胎兒性別的缺點是檢測靈敏度不高，而且定量測定效果差；B超檢測需待胎兒發育到一定階段才可以檢測。
本發明用寡核苷酸微陣列鑒別胎兒性別，可以克服這些缺點，且能測定性染色體的數目，其基本操作如下待測樣品用限制性內切酶酶切，然后將酶切產物直接與寡核苷酸微陣列雜交。根據雜交信號的位置與強度確定待測樣品的性別。微陣列的寡核苷酸特異性堿基序列如下
Fx(Fa)GTGAAGAAAGATGCTGAGGG(T15-Tbiotin-T15)TGCATCTCTGTGATACCTG(Fd)Fy(Fa)CTGGCTGCTCTTCCTTAGT(T15-Tbiotin-T15)CTCCTGGGCCTGAGACT(Fd)也可根據本發明提出的原理設計檢測胎兒性別的其它寡核苷酸探針。
根據寡核苷酸微陣列各個位點的信號強度，以及這些信號強度間的比值，不僅能夠判斷性別，而且能夠對染色體疾病進行診斷。胎兒性別檢測具體程序如下1.抽取孕婦羊水10mL，4000rpm離心收集細胞，從收集細胞中采用苯酚氯仿抽提法抽提DNA。
2.DNA酶解在20微升反應體積中用限制性內切酶EcoRI酶切DNA 2小時以上，使之徹底酶解。然后在95℃保溫30分鐘使酶失活，同時使DNA片段變性。
3.雜交溶液制備在DNA酶解溶液管中，加入25微升20×SSC，2微升1.0％SDS，53微升水。
4.雜交與洗脫將寡核苷酸微陣列置于Genomic Hybridization雜交室中，然后加入不含有核酸樣品的雜交溶液處理寡核苷酸微陣列(50℃，10分鐘)。在計算機提示下加入步驟3制備的100微升雜交溶液。按下列程序進行雜交和洗脫雜交50℃保溫8小時。
洗脫(1)5×SSC，0.1％SDS室溫洗滌5分鐘。
(2)1×SSC，0.1％SDS 42℃洗滌5分鐘。
(3)0.1×SSC，0.1％SDS 42℃洗滌5分鐘。
(4)0.1×SSC，42℃洗滌5分鐘。
(5)干燥。
5.用基因芯片掃描儀對洗脫后的基因芯片進行掃描，檢測熒光信號。在寡核苷酸微陣列檢測過程中，激發光波長是490nm，檢測微陣列在640nm波長處的信號強度。若基因芯片上只有一個探針分子(X)可以檢測到熒光信號，則胎兒性別為女性；若兩個探針分子(X，Y)都可以檢測到熒光信號，則胎兒性別為男性。若采用熒光強度定量分析的方法，還可以預測性染色體的數目。若熒光強度比值為Y/X接近0，則為女性；Y/X＝1，則為正常男性；Y/X＝1/2，則為異常男性(XXY男性)。
若抽提的DNA量過低，以DNA為模板，PCR擴增DNA片段。擴增用引物為兩對引物(引物1tgggttcatctttgctcacac，引物2cttgaactcctgacctcgtg，引物3atgccctcaatgtcctgacg，引物4gcgggaagatgagtttggc)，其中引物1與2用于擴增X染色體上的特異性核酸片段，引物3與4用于擴增Y染色體上的特異性核酸片段，進行PCR擴增反應。PCR的操作條件為95℃預變性10分鐘，95℃變性45秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，進行30個循環擴增反應后72℃延伸10分鐘。用擴增產物與基因芯片進行雜交檢測。
只要采用固定有其它寡核苷酸探針的熒光共振能量轉移微陣列，就可以進行其它的核酸序列檢測，例如鐮刀貧血病、病毒性疾病的檢測、物種鑒定和大通量基因多態性分析等。如果將多種疾病的寡核苷酸探針微陣化固定于同一張玻片上，就可以同時檢測多種疾病，并且病人的待測樣品不需進行熒光標記，檢測速度快。
特別是在病毒性疾病的檢測中，現今的基因芯片由于待測樣品需要用熒光標記，這種標記是一種酶促反應。因此，如果需要測定的目標核酸中既有RNA病原體又有DNA病原體時，熒光標記很難達到均一性，結果限制了待測目標樣品的檢測通量。用本發明設計的寡核苷酸進行檢測，不存在待測樣品的熒光標記，只需要簡單的核酸雜交就可以解決這個問題。
權利要求
1.一種熒光共振能量轉移寡核苷酸微陣列的核酸檢測方法，其特征在于采用熒光共振能量轉移寡核苷酸微陣列，將未進行熒光標記的待測核酸樣品與寡核苷酸微陣列雜交、洗脫，使能夠與寡核苷酸探針完全配對的核酸結合在基因芯片上，寡核苷酸微陣列上寡核苷酸片段的序列特征是5’-末端的序列與待測核酸樣品目標區域的3’-序列配對，3’-末端的序列與目標區域的5’-序列配對，中間序列是寡聚胸腺核苷酸，兩個末端分別用不同的熒光基團修飾，中間用生物素修飾，根據熒光供體基團的激發光波長與熒光受體基團的發射光波長，檢測微陣列的熒光信號及其位置，確定待測核酸樣品的結構特征及其含量。
2.如權利要求1所說的熒光共振能量轉移寡核苷酸微陣列的核酸檢測方法，其特征在于用于檢測胎兒性別的寡核苷酸片段采用特異性堿基序列，其熒光供體基團是Fluorescein，熒光受體基團是Red640，利用生物素與streptavidin間相互作用固定探針分子在玻片上，用490nm波長激發Fluorescein，其發射光波長是518nm。
3.如權利要求1所說的熒光共振能量轉移寡核苷酸微陣列的核酸檢測方法，其特征在于將多種疾病的寡核苷酸探針微陣化固定于同一張玻片上，同時檢測多種疾病。
全文摘要
一種熒光共振能量轉移寡核苷酸微陣列的核酸檢測方法,將未進行熒光標記的待測核酸樣品與寡核苷酸微陣列雜交、洗脫,使能夠與寡核苷酸探針完全配對的核酸結合在基因芯片上,寡核苷酸微陣列上寡核苷酸片段的序列特征是5′－末端的序列與待測核酸樣品目標區域的3′－序列配對,3′－末端的序列與目標區域的5′－序列配對,中間序列是寡聚胸腺核苷酸,兩個末端分別用不同的熒光基團修飾,中間用生物素修飾,根據熒光供體基團的激發光波長與熒光受體基團的發射光波長,檢測微陣列的熒光信號及其位置,確定待測核酸樣品的結構特征及其含量。本發明可用于檢測目標核酸的種類與數量、目標核酸的單核苷酸多態性、疾病的基因診斷等領域。
文檔編號C12Q1/68GK1358867SQ0113925
公開日2002年7月17日 申請日期2001年12月27日 優先權日2001年12月27日
發明者劉建華, 劉喜朋, 陳潔, 林志新 申請人:上海交通大學