專利名稱：一種重金屬解毒藥劑、其制法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種緩解重金屬中毒的生物藥劑。具體地說，本發明涉及以人金屬硫蛋白L(Metallothionein-L，簡稱為“MTL”)為主要成分的重金屬解毒藥劑。本發明還涉及該藥劑的生產方法和應用。
本發明的藥劑主要成分是人MTL，它是金屬硫蛋白(MT)家族成員之一。MT能解毒金屬，在發育過程中調節鋅和銅的體內平衡，參與金屬代謝和解毒，MT在消除自由基方面也有作用(Temopleton，D.M.et al 1991.Riordan JF and Vallee BL ed.Methods of Enzymology.Vol.205，11-24)，在門克氏綜合癥(Menkes disease)、鼠花斑狀表型、肝豆狀核變性(Wilson’s disease)中，MT可能保護機體免受銅毒害。MT與某些抗腫瘤化療藥物，特別是順二胺二氯鉑(cDDP)相互作用，可減輕其細胞毒性(Saijo，N.et al Mrtallothionein 111，BaselBirkhauser Verlag，1993.279-292)。此外它還與肝臟疾病有一定關系(周杰昊等，1995.生理科學進展.2629-34)。
因此，本發明的藥劑作為腫瘤治療輔助藥劑，可增強細胞的抗氧化作用，降低腫瘤藥物對細胞的毒性。
本發明的另一個目的是提供一種利用重組技術生產所述藥物的方法。
本發明還提供了該藥物的應用。
在本發明的一個方面，提供了一種重金屬解毒藥劑，它含有SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
在本發明中，術語“人MTL蛋白多肽”指具有人MTL蛋白活性的SEQ IDNO.2序列的多肽。該術語還包括具有與人MTL相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-15個，較佳地1-10個，更佳地1-5個，最佳地1-3個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為15個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人MTL蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人MTL DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人MTL多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人MTL多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了人MTL多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人MTL多肽序列的至少約20個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約40個連續氨基酸，更佳地至少約50個連續氨基酸，最佳地至少約60個連續氨基酸。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明的另一個方面，提供了一種生產上述重金屬、半金屬解毒藥劑的一種方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人MTL蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成人MTL蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸35-220位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人MTL蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人MTL蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人MTL蛋白活性的多肽。
(e)把步驟(d)中所述多肽與適當的物質連接，制成藥劑。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發明還包括對人MTL DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人MTL基因產物或片段。較佳地，指那些能與人MTL基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制人MTL蛋白的分子，也包括那些并不影響人MTL蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人MTL基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人MTL基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人MTL或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷人MTL功能的抗體以及不影響人MTL功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人MTL基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人MTL基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
本發明的人MTL核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。在本發明的人MTL的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人肝λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A5’-TCGCTTGAGATCTCCAGCCTTAC-3’為正向引物，寡核苷酸B5’-ACATCTGGGAGAAGAGCTGTTGC-3’為反向引物，進行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、60℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片斷約為250bp的目的片段。最后通過測序驗證為SEQ ID NO1所述核苷酸序列。
以上述核苷酸序列為模板，將編碼人MTL的cDNA序列用對應于該DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人MTL cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5’寡核苷酸引物序列為5-CAAGGTCGACATGGACCCCAACTGCTCCT-3’，該引物含有SalI限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的人MTL編碼序列的19個核苷酸；3’端引物序列為5’-TAGGAAGCTTTCAGGCACAGCAGCTGCAG-3’，該引物含有HindIII限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和人MTL的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應于細菌表達載體pQE-9(QiagenInc.，Chatsworth，CA)上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復制起點(ori)、一個IPTG-可調啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內切酶克隆位點。
用SalI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細菌RBS起始。隨后用連接混合物轉化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質粒pREP4，其表達lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養皿上篩選轉化子，抽提質粒測序驗證人MTL的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。過夜(O/N)培養物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養基中，培養細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續培養細胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞并將細胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人MTL。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人MTL。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質被結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質用PBS進行透析，然后將蛋白質保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為約6kDa。
此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.2的序列一致。
本發明蛋白在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質和藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的人MTL蛋白可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。通常，其中pH為約5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內、腹膜內、皮下、皮內、或局部給藥。
由于本發明的藥物源自人的天然氨基酸序列，因此，與源于化學合成的同種藥物相比，預計在施用于人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內的免疫原性更低或沒有)。
本發明的藥物含有金屬硫蛋白，是減緩重金屬對細胞毒性的有效工具。作為重金屬、半金屬腫瘤藥物的輔助成分，可以保護正常機體，減輕重金屬、半金屬成分對正常細胞DNA的損傷；制成保健藥品，可以增強正常人機體對環境中重金屬物質損傷的抵抗；還可制成化妝品美白成分添加劑，目前市售的美白產品中不可避免的會含有一些重金屬成分，加入本發明所含的重金屬解毒藥劑，可以使此類化妝品、護膚品更加安全有效。
此外，還可將本發明用于生產MTL抗體，然后把該抗體特異性的引入腫瘤細胞，降低其對重金屬、半金屬藥物的耐受性，從而起到增強藥效的作用。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
由于偶氮芳香聚合物能保護蛋白免受胃與小腸中的酸解與酶解，故包衣復合物不會在小腸中立即全部分解；當包衣到達大腸部位時，包衣層受內生菌群的作用而分解，使MTL蛋白進入結腸發揮局部作或吸收。
實施例2將MTL蛋白制成微球制劑取MTL蛋白500ug-50mg與明膠60-100mg，水1ml，混合加熱至60℃為內水相，油相為聚乳酸(PLA)、聚丙交酯-乙交酯(PLGA)或聚乳酸乙醇酸共聚物，溶于二氯甲烷，然后將油相在攪拌或超聲處理逐漸倒入水相中制成微乳劑，此乳劑冷卻至15℃，在5000rpm下用噴嘴加入到0.5ml的聚乙烯醇水溶液中攪拌1-4分鐘使之形成乳劑。最后在室溫下攪拌2小時或旋轉蒸發除去二氯甲烷，得到硬化圓形微球(或膠囊)。
將此微球制劑用肌內注射的方法施藥，根據油相共聚物成分的不同，可以在不同時間之內在體內持續釋放藥物成分。
實施例3制成試劑盒首先將MTL蛋白透析去鹽，-70℃冷凍一小時，然后凍干機抽真空過夜，制成凍干粉。隨后，配以磷酸緩沖液、注射用水、滴注用葡萄糖鹽水及0.1％的三氧化二砷溶液，制成試劑盒。
該試劑盒可用于治療腫瘤復發患者，如急性早幼粒細胞性白血病復發患者。治療時，取三氧化二砷溶液用葡萄糖鹽水稀釋成0.002％，每天靜脈滴注2-3小時，檢測其臨床表與細胞形態學變化。如若出現中毒癥狀，立即停止靜脈滴注，并將MTL蛋白凍干粉溶解于磷酸緩沖液中、用注射用水稀釋，向病人注射。對于肝功能障礙的病人應每天注射，其用量視病人肝細胞損傷情況而定，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。
實施例4制備抗體將MTL重組蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉淀人MTL基因翻譯產物的能力加以評估。結果發現，抗體可特異性地與本發明蛋白發生沉淀。
將MTL重組蛋白抗體引進腫瘤細胞該抗體將與細胞中MTL蛋白結合，降低腫瘤細胞對重金屬、半金屬藥物的耐受性，從而達到增強藥效的功能。
本發明涉及序列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度247bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO.1TCGCTTGAGA TCTCCAGCCT TACCGCGGCT CGAAATGGAC CCCAACTGCT CCTGCACCAC 60TGGTGTCTCC TGCGCCTGCA CCGGCTCCTG CAAGTGCAAA GAGTGCAAAT GCACCTCCTG 120CAAGAAGAGC TGCTGCTCCT GCTGCCCCGT GGGCTGTGCC AAGTGTGCCC ACGGCTGTGT 180CTGCAAAGGG ACGTTGGAGA ACTGCAGCTG CTGTGCCTGA TGTGGGAACA GCTCTTCTCC 240CAGATGT 247(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度61個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(iii)序列描述SEQ ID NO.2Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Thr Thr Gly Val Ser Cys Ala Cys 15Thr Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys 30Lys Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala 45His Gly Cys Val Cys Lys Gly Thr Leu Glu Asn Cys Ser Cys Cys 60Ala 6權利要求
1.一種藥劑，其特征在于，編碼其主要多肽成分的核苷酸序列與SEQID NO.1中從35-220位的核苷酸序列有至少70％的同源性，它可以降低、緩解重金屬藥物的毒副作用。
2.如權利要求1所述藥劑，其特征在于，它含有SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.如權利要求1所述藥劑主要多肽成分的一種生產方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人MTL蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成人MTL蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸35-220位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人MTL蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人MTL蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人MTL蛋白活性的多肽。
4.一種如權利要求1所述藥劑的蛋白成分的抗體，其特征在于，它能與SEQ ID NO.2中氨基酸序列特異性互補結合。
全文摘要
本發明涉及一種緩解重金屬中毒的生物藥劑,具體地說,本發明涉及一種以人金屬硫蛋白L(Metallothionein－L,簡稱為“MTL”)為主要成分的重金屬解毒藥劑。本發明的MTL是金屬硫蛋白家族成員之一,它含有SEQ ID NO 2所述氨基酸序列的多肽,其核苷酸編碼序列與SEQ ID NO 1所述核苷酸序列具有至少70%的同源性。它能緩解重金屬、半金屬中毒,在發育過程中調節鋅和銅的體內平衡,參與金屬代謝和解毒,在消除自由基方面也有作用。此外它還與肝臟疾病有一定關系。因此,本發明的藥劑作為腫瘤治療輔助藥劑,可降低腫瘤藥物中重金屬成分對細胞的毒性,增強細胞的抗氧化作用。本發明還涉及該藥劑的生產方法和該藥各種劑型的應用。
文檔編號C12N15/12GK1367247SQ01139049
公開日2002年9月4日 申請日期2001年12月4日 優先權日2001年12月4日
發明者余龍, 唐麗莎, 孫璐虹, 楊玉美, 萬波 申請人:復旦大學